DE3888459T2

DE3888459T2 - Zellzüchtung in kontinuierlicher Dispersionskultur mit einem System zur Gewinnung von Zellprodukten.

Info

Publication number: DE3888459T2
Application number: DE3888459T
Authority: DE
Inventors: Detmar Redeker; Juergen Trawinski
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1987-11-27
Filing date: 1988-11-15
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2008-11-16
Also published as: DE3888459D1; EP0317874A2; EP0317874B1; US4921792A; EP0317874A3; JPH022336A; JP2728469B2

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft allgemein Zellzüchtungssysteme und insbesondere ein System, das zur Herstellung und Extraktion biologischer Substanzen auf kontinuierlicher Basis aus kontinuierlich dispergierten Zellen ohne wesentliche Schädigung der Zellen angepaßt ist.
Die Züchtung ausgewählter Zellen zu Herstellung nützlicher Substanzen wird seit vielen Jahrhunderten durchgeführt. Verbesserungen sind mit den Jahren entwickelt worden, und viele dieser Verbesserungen richten sich auf Systeme oder Vorrichtungen, die zur kontinuierlichen Herstellung einer gegebenen biologischen Substanz aus einer Zellkultur angepaßt sind. Beispiele derartiger kontinuierlicher Systeme werden z.B. in US-4 166 768 (Tolbert et al., kombinierte Reaktor- und Substanzfiltereinheit) und US- 4 178 209 (Tolbert et al.; dieses Patent betrifft ebenfalls eine kombinierte Zellkultur- und Substanzfiltereinheit); vergleiche auch die neueren US-Patent 4 639 422 (Geimer et al.; Zellkultur-Filtervorrichtung für die kontinuierliche Züchtung und Gewinnung biologischer Produkte aus einer Dispersion von Säugerzellen), "Large Scale Cell Culture in Biotechnology", W.R. Arathoon und J.R. Birch, Science, Bd. 232 (1986), S. 1390-1395 (es werden Probleme erörtert, die mit der Maßstabsvergrößerung der Säugerzellproduktion verbunden sind) und "A Radial Flow Hollow Fiber Bioreactor for the Large-Scale Culture of Mammalian Cells", J.P. Tharaken und P.C. Chau, Biotech. & Bioeng. , Bd. XVIII (1986), S. 329-342.
Weitere Systeme für die Züchtung biologischer Substanzen werden z.B. in EP-A-0 201 086, EP-A-0 229 289, EP-A-0 139 592 und EP-A-0 065 895 beschrieben. Mit den relativ kürzlich erfolgten Entdeckungen, die auf der rekombinanten DNA-Technologie und der monoclonalen Antikörpertechnologie basieren, ist eine erhöhte Aufmerksamkeit darauf gerichtet worden, Zellzüchtungssysteme bereitzustellen, die nützliche biologische Substanzen auf kontinuierlicher Basis herstellen können. In einem idealen System wird der größte Teil der Zellen nicht geschadigt, in einer optimalen Umgebung zur Expression der biologischen Substanzen gehalten, ist die Substanzausbeute angemessen, und weist das System eine ausreichend lange und wirtschaftlich nützliche Lebensdauer auf. Obwohl viele der bis heute beschriebenen Zellzüchtungssysteme ein oder mehrere der vorstehend genannten Ziele erreichen, ist es schwierig, alle der vorstehend genannten Ziele gleichzeitig in einem einzigen System zu erreichen. Dies gilt insbesondere für Säugerzellzüchtungssysteme, und zwar aufgrund ihrer bekannten Empfindlichkeit, insbesondere bei Veränderungen der Umgebungsbedingungen. Ausgehend von der erhöhten Aufmerksamkeit, die nun auf Säugerzellinien zur Herstellung sowohl von monoclonalen Antikörpern als auch von biologischen Substanzen auf der Grundlage der rekombinanten DNA-Technologie gerichtet ist, ist die Erzielung aller der vorstehend genannten Ziele in einem einzigen Säugerzellzüchtungssystem sehr erwünscht.
Obwohl die Maßstabsvergrößerung bei Säugerzellen immer noch als schwierig angesehen wird, sind mehrere weitere Zellzüchtungssysteme vorgeschlagen worden. Um gleichzeitig hohe Zelldichten zu erreichen und das in das Zellzüchtungsmedium freigesetzte Produkt zu gewinnen, stehen Systeme zur Verfügung, um auf die eine oder andere Weise die zu züchtenden Zellen zu suspendieren oder immobilisieren. Hohlfaserpatronen für suspendierte Zellen (vgl. europäische Patentanmeldung Nr. 0 112 155, BioResponse, Inc.) sowie keramische Patronen für immobilisierte Zellen (vgl. B.G.D. Bodeker et al., Develop. Biol. Standard, Bd. 66, S 473-479; S. Karger, Basel, 1987) werden nun für suspendierte Zellen oder zur Immobilisierung von Zellen verwendet, die anschließend mit dem Zellzüchtungsmedium übergossen werden. Ein Vorteil dieser Systeme besteht darin, daß das Produkt aus dem Medium gewonnen werden kann daß nir eine geringe Anzahl von Zellen oder überhaupt keine Zellen enthält.
Es sind mehrere Versuche unternommen worden, um die Tieftank- Fermentertechnologie, die für die mikrobielle Fermentation verwendet wird, für die Züchtung von Säugerzellen anzupassen. Sowohl verankerungsabhängige als auch verankerungsunabhängige Zellen werden in Tieftank-Fermentern gezüchtet worden. Unter anderem besteht ein Hauptproblem jedoch darin, eine kontinuierliche Zuchtung zu etablieren. Abscheidevorrichtungen und rotierende Eilter werden verwendet, um das das Produkt enthaltende Medium von den Zellen zu trennen und ein lange andauerndes Züchtungsverfahren zu ermöglichen. Allerdings haben sich jedoch beide Verfahren als weniger wirksam als erwartet erwiesen. Die rotierenden Filter neigen zur Verstopfung und lassen dann kein Medium mehr hindurchtreten. Die Verwendung von Reaktoren mit derartig hoher Dichte ist daher schwierig, wenn nicht unmöglich, bei Anwendung bestehender Techniken.
Der in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Ansatz vermeidet viele der vorstehenden Probleme. Gemäß einer Ausführungsform beschränkt das System der vorliegenden Anmeldung die Menge an dispergierter Zellkultur und ihre Verweilzeit außerhalb des Reaktors. Ein bevorzugtes System erleichtert auch die kontinuierliche Dispersion von Zellen durch kontinuierliches Aufbrechen von Zellaggregaten und verwendet eine externe Filtervorrichtung, wie eine Hohlfaserfiltermembran mit einer kontrollierten mittleren Porengröße (z.B. einer Porengröße von 0,6 µm), um die zu gewinnende Substanz mit dem Medium von den zirkulierenden Zellen abzutrennen. Die Anordnung der Filtervorrichtung oder der Filtervorrichtung mit porösen Hohlfasern außerhalb des Reaktors erlaubt die Steuerung des Volumens des Kultur außerhalb des Reaktors zu einem beliebigen Zeitpunkt und die Länge, für die eine beliebige dispergierte Zelle sich außerhalb des Reaktors befindet. Die Vorrichtung ist außerhalb des Eermenters angeordnet und kann in einfacher Weise ersetzt werden, wenn die Membran verstopft ist und die Substanz und das Medium nicht länger hindurchtreten. Einzelheiten unseres Systems werden nachstehend beschrieben.
Das Zellzüchtungssystem der vorliegenden Anmeldung umfaßt einen Reaktor, der angepaßt ist, um eine Dispersion von Zellen in einem Züchtungsfluid unter Bedingungen zu halten, die geeignet sind, eine kontinuierliche Expression einer nützlichen biologischen Substanz, wie monoclonaler Antikörper oder anderer Proteine, aus den Zellen sicherzustellen. In ständiger Verbindung mit dem Reaktor, aber getrennt davon, befindet sich eine Substanztrennvorrichtung, die geeignet ist, die exprimierte Substanz (z.B. Antikörper), nicht jedoch die dispergierten Zellen aus dem Züchtungsfluid, das durch sie hindurchtritt und zurück in den Reaktor strömt, abzutrennen. Ein vergleichsweise kleines Volumen des Züchtungsfluids (und der dispergierten Zellen) befindet sich zu jeder Zeit außerhalb der gesteuerten Umgebungsbedingungen des Reaktors. Eine gegebene dispergierte Zelle befindet sich für weniger als 2 Minuten außerhalb des Reaktors.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden im Züchtungsfluid Nährstoffe ersetzt und Abfallprodukte entfernt, und zwar durch eine in Reihe geschaltete Dialyseeinheit, bevor das Züchtungsfluid in den Reaktor zurückströmt. Darüber hinaus ist das System angepaßt, um zelluläre Aggregate gegebenenfalls zu dispergieren, und zwar ohne Schädigung der Zellen, da ein minimales Volumen an Züchtungsfluid aus dem Reaktor durch die Trennvorrichtung und die Dialysevorrichtung und zurück in den Reaktor strömt.
Im allgemeinen beträgt das Volumen an Züchtungsfluid, das sich zu einem beliebigen gegebenen Zeitpunkt außerhalb des Reaktors befindet, weniger als etwa 5 % (im allgemeinen im Bereich von 2 bis 5 %) des gesamten Züchtungsfluids im System. Das tatsächliche Volumen an Fluid außerhalb des Reaktors hängt natürlich vom gesamten Eermentervolumen ab. In unserem beispielhaften System beträgt dieses Volumen (außerhalb des Reaktors) im Bereich von etwa 200 bis 300 ml. Dies bedeutet, daß zu einem gegebenen Zeitpunkt eine gegebene suspendierte Zelle sich für weniger als etwa 2 Minuten außerhalb des Reaktors befindet (bei Anwendung einer Pumpgeschwindigkeit von etwa 100 bis 150 ml/min für ein außerhalb befindliches Volumen an Züchtungsfluid (Vo) von 200 bis 300 ml). Diese wichtige Beziehung kann wie folgt ausgedrückt werden:
Vo(ml)/Pumpgeschwindigkeit (ml/min) ≤ 2 Minuten
Bei Verwendung des vorstehend angegebenen geringen Volumens und der kurzen Zeit außerhalb des Reaktors ermöglicht das System der vorliegender Anmeldung eine minimale Beeinträchtigung der Steuerung von so wichtigen Variablen, wie O&sub2;, pH-Wert, Nährstoffverlust, Abfallproduktanreicherung und dergl. In unserem System befindet sich die Nährstoffquelle so weit entfernt von der Stelle des Nährstoffverlusts (Substanzsammelvorrichtung) wie möglich. Dies minimiert den Nährstoffverlust durch die Substanzsammelvorrichtung.
Eine bevorzugte Trenn- oder Filtriervorrichtung umfaßt poröse Hohlfasern wobei der mittlere Porendurchmesser dieser porösen Hohlfasern ein Durchtreten und eine Ableitung der exprimierten Substanz und des Züchtungsfluids ermöglicht, nicht jedoch der exprimierenden Zellen, die weiterhin zurück in das System strömen. Da die porösen Fasern Säugerzellen vom kontinuierlichen Sammelverfahren ausschließen, sollte der mittlere Porendurchmesser der Hohlfasern im Bereich von 0,2 bis 0,6 betragen. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen werden mindestens 40 % und vorzugsweise etwa 100 % der Substanz, die durch derartige Filter tritt, aus dem Züchtungsfluid mit den dispergierten Zellen, das in die Hohlfaservorrichtung eintritt, entfernt.
Fig. 1 ist eine schematische Ansicht eines bevorzugten Systems der vorliegenden Anmeldung.
Fig. 2 ist ein Graph, der die Variation der Zelldichte abhängig von der Zeit im Reaktorsystem der vorliegenden Anmeldung betrifft.
Fig. 3 ist ein Graph, der die Lebensfähigkeit der Zellen abhängig von der Zeit im Reaktor der vorliegenden Anmeldung betrifft.
Fig. 4 ist ein Graph, der die Antikörperbildung abhängig von der Zeit im Reaktor der vorliegenden Anmeldung betrifft.
Fig. 5 ist ein Graph, der die Bildung von Glucose und Lactat abhängig von der Zeit im Reaktor der vorliegenden Anmeldung betrifft.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Anmeldung besteht darin, daß sie einen Fermentationsreaktor betrifft, der für Säugerzellkulturen geeignet ist, sowie ein System außerhalb des Fermenters zur Abtrennung und Gewinnung eines exprimierten biologischen Produkts (oder einer biologischen Substanz). Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Anmeldung besteht darin, daß die Menge an Züchtungsfluid außerhalb des Fermentationsreaktors gering gehalten wird (weniger als etwa 5 % des Gesamtvolumens des Züchtungsfluids). Darüber hinaus werden die dispergierten Zellen in weniger als etwa 2 Minuten in die Reaktorumgebung zurückgeführt, was durch die vorstehend angegebene Beziehung zwischen der Pumpgeschwindigkeit und dem außerhalb befindlichen Volumen (Vo) des Züchtungsfluids bestimmt wird. Wenn bestimmte Säugerzellen in dem System verwendet werden, dann werden die Zellen nicht geschädigt und in einigen Fällen scheint ihre Funktion durch das gesteuerte Aufbrechen von Zellaggregaten bei ihrer Bewegung durch das System sogar verstärkt zu sein.
Obwohl angenommen wird, daß unser System für eine Reihe von Säugerzellinien in verschiedenen Reaktoren geeignet ist, haben wir in den nachstehenden Beispielen einen gerührten Tieftankreaktor im Perfusionsmodus verwendet. In einem Satz von Beispielen wurden mit EBV transformierte menschliche Lymphozyten, die monoclonale IgM-Antikörper absonderten, in einem gerührten Tieftankfermenter unter serumfreien Bedingungen gezüchtet.
Der gesamte Fermenterinhalt wurde mit einer peristaltischen Pumpe durch eine äußere Schlaufe und zurück in den Fermenter gepumpt. In dieser Schlaufe wurde eine im Handel erhältliche poröse Hohlfaserpatrone installiert. Die Hohlfasermembran wies eine mittlere Porengröße von 0,6 µm auf und ließ daher nur Medium und gesammelte Substanz (d.h. IgM- Antikörper) zur anschließenden Entfernung aus dem System durchtreten. Die Zellen wurden zu allen Zeiten in der Schlaufe und damit im Gesamtfermenter gehalten. Zu keiner Zeit waren die Zellen länger als 2 Minuten aus dem Reaktor entfernt. Es wurde festgestellt, daß das Pumpen für die Zellen nicht schädlich war, und Fermenter wurden kontinuierlich für mehr als 30 Tage betrieben, während sie über die externe Membran versorgt wurden.

Materialien und Methoden (Monoclonale Antikörper)

Zellen und Züchtungsmedium

Die menschliche, mit EBV transformierte Zellinie 13C1 (ATCC Nr. CRL 8796), die monoclonale IgM-Antikörper bildet (reaktiv gegenüber Pseudomonas aeruginosa, Fisher-Typ 5) wurde angepaßt und in einem serumfreien Medium gezüchtet, das auf einem 1:1-Gemisch von DME und Ham- F12 (Sigma) bei Zugabe von 2 g/l menschliches Serumalbumin (Miles Inc.) und 10 mg/l menschliches Transferrin (Miles Inc.) sowie 200 U/l Rinderinsulin (Elanco Products, Co., Division of Eli Lilly Co.) basierte, gezüchtet. Das gleiche Medium wurde während des gesamten Fermentationsverfahrens verwendet.
Die Zellzahlen des Fermenterinhalts wurden zweimal täglich unter Verwendung eines Hemacytometers bestimmt, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Anwendung des Trypanblau-Farbstoffausschlußtests bewertet. Die Konzentrationen von Glucose und Lactat wurden in den gleichen Proben, die für die Zählung der Zellen entnommen wurden unter Verwendung von im Handel erhältlichen Analysatoren bestimmt.

IgM-Bestimmung

Ein kompetitiver ELISA-Test gemäß der von Kearny et al., J. Immunol., Bd. 123 (1979), S. 1548 beschriebenen Methode wurde verwendet, um die Menge an IgM in den Proben zu bestimmen.

Der Reaktor (Fermenter)

Der gesamte Fermenter-Aufbau umfaßte einen 5 l fassenden Fermenter und ist in Fig. 1 gezeigt. Fig. 1 zeigt den typischen Aufbau des Fermenters, der in einem repräsentativen Beispiel verwendet wurde. Das Gefäß und seine Kopfplatte wurden im Handel erhalten (Virtis). Eine Belüftung des Reaktorinhalts wurde mit einem O&sub2;/CO&sub2;/Luft-Gemisch über eine 30 Fuß lange Silikonkautschuk-Rohrleitung, die innerhalb des Reaktors angeordnet war, durchgeführt. Die Integrität des Systems wurde durch einen Luftdruck von 2 psi im oberen Bereich des Gefäßes sichergestellt. Alle äußeren Rohrleitungen bestanden aus Silikonkautschuk.

Zelltrennung

Der Fermenter war mit einem rotierenden Filter aus rostfreiem Stahl ausgestattet, der bei 150 U/min betrieben wurde, um eine Perfusion in der Anfangsphase des Versuchs zu ermöglichen.
Nach 284 Stunden wurde die Zelltrennung aufgrund eines verstopften rotierenden Filters außerhalb mit einer Plasmapur -Hohlfaserpatrone (erhalten von Organon Teknika, BV) durchgeführt.
Der Fermenterinhalt wurde anschließend durch eine Silikonkautschuk- Rohrleitung mit Hilfe einer peristaltischen "Masterflex"-Pumpe gepumpt. Eine Plasmapur -Hohlfaserpatrone wurde in dieser Schlaufe angeordnet, und die Zellsuspension wurde durch das innere Lumen der Fasern mit 150 ml/min gepumpt. Die Membran der Filter bestand aus Plasmaphan PIH mit einer Porengröße von 0,65 µm und einer effektiven Oberfläche von 0,07 m². Ein Druckanzeigegerät vor der Plasmapur-Patrone wurde verwendet, um einen ansteigenden Druck in der Patrone zu bestimmen, was anzeigt, wann eine Verstopfung der Membran beginne,
Das zu gewinnende Züchtungsmedium wurde kontinuierlich aus dem Extrakapillarraum der Plasmapur-Patrone unter Verwendung einer zweiten "Masterflex"-Pumpe (P&sub2;) mit einer Förderhöhe von 7015,20 entnommen. Das maximale Volumen an Medium, das über die Plasmapur Patrone gewonnen wurde, betrug 4,3 l pro Tag, entsprechend 106 % des Fermentervolumens.
Eine auf die gleiche Fördergeschwindigkeit wie die zur Gewinnung verwendete Pumpe eingestellte dritte "Masterflex"-Pumpe (P&sub3;) wurde verwendet, um dem Fermenter frisches, serumfreies Medium zuzuführen.
Unser Gesamtsystem ist in Fig. 1 gezeigt. Eine dispergierte Zellkultur 10 wird in einem gerührten Tankreaktor 6 bei kontinuierlichem Rühren, das mit einem Rührer 8, der durch einen Motor M über einen Schaft 9 angetrieben wird, durchgeführt wird, gehalten. Zunächst wurde ein rotierender Filter 7 als Zelltrennvorrichtung verwendet, so daß zellfreies Züchtungsmedium, das die gelöste Substanz enthielt, direkt über die Rohrleitung 22 durch die Pumpe P&sub2; zur weiteren Reinigung gepumpt werden konnte. Allerdings neigte der rotierende Filter 7 nach 200 - 300 Stunden zur Verstopfung, was zu seiner Entfernung und zur vorliegenden Erfindung führte, bei der Zellen enthaltendes Züchtungsfluid und die Substanz 10 direkt aus dem Reaktor 6 über eine Rohrleitung 24 mittels einer Pumpe P&sub1; durch eine externe Hohlfaservorrichtung 26 und zurück in den Reaktor 6 über eine Rohrleitung 28 gepumpt werden. Vorrichtungen zur Aufzeichnung von pH-Wert und O&sub2; sowie Vorrichtungen zum Ersatz von Kulturmedium (Zufuhr über Pumpe P&sub3;) werden bereitgestellt, wie es in Fig. 1 gezeigt ist. Proben des Züchtungsmediums können periodisch über ein Rohr 16 entnommen werden.

Ergebnisse (Kontinuierliche Herstellung von monoclonalen Antikörpern)

Einfluß des Pumpens auf Zellwachstum und Lebensfähigkeit. Der Fermenter (Nr. 86041) wurde mit 3 l Kultur bei 10 x 10&sup5; Zellen/ml mit 46 %-iger Lebensfähigkeit angeimpft. Der Fermenter war zunächst mit einem rotierenden Filter aus rostfreiem Stahl ausgestattet, durch den ellfreier Fermenterinhalt mit einer Geschwindigkeit von 90 ml/h d.h. 2,2 l oder 73 % Mediumaustausch pro Tag, entnommen wurde. Diese Perfusionsgeschwindigkeit wurde konstant gehalten und führte zu einer erhöhten Lebensfähigkeit (Fig. 3) und einer Zelldichte von etwa 2 x 10&sup6;/ml (Fig. 2). 120 Stunden nach der Animpfung wurde das Pumpen der Kultur mit der "Masterflex"-Pumpe durch die äußere Plasmapur-Patrone mit einer Geschwindigkeit von 100 - 150 ml/min begonnen. Die Perfusionsgeschwindigkeit wurde bei 73 % Mediumaustausch pro Tag durch den rotierenden Filter während dieser Zeit gehalten. Die Figuren 2 und 3 zeigen, daß sowohl die Lebensfähigkeit als auch die Zelldichte fast unmittelbar nach dem Beginn des Pumpens anstiegen Beide stiegen und erreichten ein höheres Plateau als vorher, was zu einem Mittelwert von 75 % für die Lebensfähigkeit und etwa 5 x 10&sup6;/ml für die Zelldichte führte. Fig. 3 zeigt die Dichte der gesamten und der lebensfähigen 13C1-Zellen im Fermenter Nr. 86041 während der 800 Stunden des Versuchs.
Proben wurden dem Fermenter zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen, und die Zelldichte wurde unter Verwendung eines Hemacytometers bestimmt. Die Lebensfähigkeit wurde unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlußtests bestimmt.
1 = Perfusion über den rotierenden Filter bei 73 %-igem Mediumaustausch pro Tag
2 = Beginn des kontinuierlichen Pumpens der gesamten Kultur mit einer "Masterflex"-Pumpe bei 100 ml/min
3 = rotierender Filter verstopft
4 = Perfusion über Plasmapur -Hohlfaserpatrone
5 = Umstellung des Perfusionsmedium auf serumfreies Medium ohne HSA
Die fünf vorstehend angegebenen Änderungen betreffen die Figuren 3 bis 5.
Zellaggregate, die im Fermenter vorhanden waren, bevor mit dem Pumpen begonnen wurde, waren nachher nicht mehr vorhanden Die Zelldichte und die Lebensfähigkeit waren konstant, bis der rotierende Filter nach 284 Stunden in dem Ansatz verstopfte und Zellen aufgrnd der resultierenden Chemostase verlorengingen. Fig 3 zeigt die Lebensfähigkeit von 13C1- Zellen im Fermenter Nr. 86041 während der gesamten 800 Stunden des Versuchs.
Proben wurden dem Fermenter zu den in Fig. 3 angegebenen Zeiten entnommen und die Lebensfähigkeit wurde unter Anwendung des Trypanblau- Ausschlußtests bestimmt

Perfusion über eine Plasmapur -Trennvorrichtung

70 Stunden nach den ersten Zeichen einer Verstopfung des rotierenden Filters wurde die Perfusion über eine Plasmapur-Trennvorrichtung wieder aufgenommen. Aufgrund des verstopften rotierenden ilters hatte das Fermentervolumen auf 4,5 l zugenommen und die Zelldichte hatte auf 2 x 10&sup6;/ml bei 68 %-iger Lebensfähigkeit abgenommen. Die Perfusionsgeschwindigkeit wurde auf 200 ml/h, d.h. 4,8 l oder 106 % Mediumaustausch pro Tag, eingestellt. Die Zelldichte sprach unmittelbar auf die neuen Perfusionsbedingungen an. Wie in Fig. 2 gezeigt ist, erreichte die Zelldichte ein neues Plateau von 10 - 13 x 10&sup6; lebensfähige Zellen/ml zu einem Zeitpunkt 100 Stunden nach dem Beginn der Perfusion mit der Plasmapur-Trennvorrichtung. Die Plasmapur-Trennvorrichtung zeigte keine Anzeichen einer Verstopfung für über 300 Stunden, was sich aus einem konstanten Druck von 50 bis 70 mm Hg vor der Patrone ergibt. 700 Stunden nach der Animpfung verstopfte die Plasmapur-Trennvorrichtung und erlaubte keine weitere Perfusion. Aufgrund der hohen Zelldichte sprach die Kultur unmittelbar darauf an, wobei die Lebensfähigkeit abnahm (Fig. 3), und sie wurde 4 Tage später beendet

Produktfreisetzung

Die verwendete Zellinie sonderte monoclonale IgM-Antikörper in das Züchtungsmedium ab. Die IgM-Konzentration im gewonnenen Medium ist in Fig. 4 gezeigt. Wie die Anzahl der lebensfähigen Zellen, so stieg die IgM-Konzentration an, nachdem die Perfusion mit der Plasmapur- Trennvorrichtung begonnen wurde, was anzeigt, daß die Freisetzung von IgM in das Medium von der Zelldichte abhängt. Eine bevorzugte Zelldichte beträgt 5 - 10 x 10&sup6;/ml unter Perfusionsbedingungen. Um den Einfluß von Mediumkomponenten auf die IgM-Freisetzung zu bewerten, wurde 500 Stunden nach der Animpfung die HSA-Konzentration im zugeführten Medium von 2 g/l auf 0 g/l verringert. Aufgrund der hohen Zelldichte hatte dies keinerlei Einfluß auf die Lebensfähigkeit der Zellen, die IgM-Konzentration wurde jedoch auf 50 % der Konzentration verringert die erreicht wurde, bevor der Proteingehalt des Mediums verändert wurde. Fig 4 zeigt die Menge an IgM, die von 13C1-Zellen im Fermenter Nr. 86041 während der 800 Stunden des Versuchs ins Medium abgesondert wurde. Wie vorstehend angegeben, wurden Proben dem Fermenter zu den angegebenen Zeiten entnommen, und die IgM-Konzentration wurde mit einem kompetitiven ELISA-Test bestimmt.

Stoffwechselaktivität der Zellen

Um die Stoffwechselaktivität der Zellen unter verschiedenen Züchtungsbedingungen zu messen, wurden der Glucoseverbrauch und die Lactatbildung gemessen. Fig. 5 zeigt, daß bei Perfusion mit dem rotierenden Filter die Glucosekonzentration und die Lactatkonzentration im Fermenter beide etwa 11 Millimol betragen, und zwar aufgrund der vergleichsweise niedrigen Zelldichte. Nachdem die Perfusion mit der Plasmapur-Trennvorrichtung begonnen wurde, stieg die Zelldichte, und sowohl der Glucoseverbrauch als auch die Lactatbildung waren verstärkt. Während des Plateaus der Zelldichte bei 10 - 13 x 10&sup6; lebensfähige Zellen/ml wurden eine mittlere Glucosekonzentration von 25 Millimol und eine mittlere Lactatkonzentration von 3 Millimol erreicht. Fig. 5 zeigt die Konzentration an Lactat und Glucose im Fermenter Nr. 86041 während der 800 Stunden des Versuchs.
Die in den vorstehenden Beispielen beschriebene Arbeit zeigt die Modifizierung eines Tieftankfermenters für die Züchtung von menschlichen, mit EBV transformierten Lymphozyten. Es können andere Fermentationsreaktoren verwendet werden (z.B. Air lift-Fermenter, Hohlfaser-Bioreaktoren und dergl.). Der Versuchsaufbau für die Perfusion umfaßt ein außerhalb angeordnetes poröses Hohlfasersystem, das die Aufrechterhaltung einer hohen Zelldichte (bis zu 10 - 13 x 10&sup6; lebensfähige Zellen/ml) im Perfusionsreaktor ermöglicht. Es wurde gezeigt, daß das Pumpen der Zellen mit einer peristaltischen "Masterflex"-Pumpe, die bei diesem Versuchsaufbau bevorzugt ist, den Zellen nicht schadet, sondern zumindest in diesem Beispiel, sogar ihre Lebensfähigkeit erhöht. Aggregate von Zellen, die im Fermenter vor dem Pumpen der Kultur sichtbar waren, waren nach dem Pumpen nicht mehr vorhanden. Dies hat wahrscheinlich seine Ursache in der physikalischen Beanspruchung der Zellklumpen während des Pumpens.
Das Aufbrechen der Aggregate im vorstehenden System scheint einzelnen Zellen einen besseren Zugang zum Medium zu ermöglichen, was zu einem besseren Wachstum und einer besseren Stoffwechselaktivität führt. Der rotierende Filter aus rostfreiem Stahl, der in der Anfangsphase des Ansatzes verwendet wurde, zeigte eine Verstopfung nach nur 284 Stunden, was das Erreichen nur einer geringen Zelldichte von 2 x 10&sup6;/ml erlaubte. Die Verstopfung des rotierenden Filters tritt auf, da Zellen und Zellbruchstücke sich in den Poren ablagern. Da der Filter sich innerhalb des Fermenters befindet, bedeutet dies normalerweise eine Beendigung der Züchtung. Die Verwendung der Plasmapur-Patrone zeigte eine überraschend höhere Perfusionsgeschwindigkeit als der rotierende Filter für mehr als 10 Tage, was zu einer wesentlich höheren Zelldichte von 13 x 10&sup6;/ml führte. Aus den gleichen Gründen, aus denen die rotierenden Filter verstopfen, können jedoch auch Plasmapur-Membranen nicht unbegrenzt verwendet werden, eine Verstopfung kann jedoch durch Erhöhung der Durchflußgeschwindigkeit der Zellsuspension durch die Fasern minimiert werden.
Ein weiterer Vorteil der Anordnung der Patrone außerhalb des Fermenters besteht darin, daß sie durch eine frische Patrone ersetzt werden kann, ohne den Versuch (oder die Produktion) zu unterbrechen. Versuchsaufbauten mit mehreren Plasmapur-Patronen in einer parallelen Anordnung sind möglich, und dies würde es erlauben, auf eine neue Patrone umzuschalten, nachdem eine Verstopfung der ersten Patrone aufgetreten ist, wobei eine Unterbrechung vermieden wird.
Weitere Versuche haben gezeigt, daß der vorstehend beschriebene Versuchsaufbau auch für Kulturen mit 10 bis 20 l geeignet ist, daß er also nicht auf kleine Fermenter beschränkt ist.
Ausgehend von der vorstehenden Offenbarung ist anzunehmen, daß ein Fachmann Variationen erkennt. Dementsprechend ist es beabsichtigt, daß die vorstehenden Beispiele der Erläuterung dienen und daß die hier offenbarte Erfindung nur durch die nachstehenden Ansprüche beschränkt wird.

Claims

1. System für die kontinuierliche Herstellung und Abtrennung einer gewünschten Substanz aus einer Population von suspendierten Zellen, die die Substanz exprimieren, wobei das System folgende Komponenten umfaßt:

A. einen Reaktor und ein Züchtungsfluid mit suspendierten Zellen und exprimierter Substanz in dem Züchtungsfluid wobei mindestens ein Teil der Zellen in dem Züchtungsfluid unter Bedingungen gehalten wird, die geeignet sind, die Expression der gewünschten Substanz durch die Zellen zu fördern;

B. externe Einrichtungen unter Einschluß einer Pumpe, einer externen Schlaufe mit einer Rohrleitung und einer Trennvorrichtung in Verbindung mit dem Reaktor und außerhalb des Reaktors zur kontinuierlichen Bewegung des Fluids, der exprimierten Substanz und der suspendierten Zellen durch die Trennvorrichtung, wobei die externen Einrichtungen ein Gesamtvolumen von weniger als etwa 5 % des Gesamtvolumens des Fluids, der exprimierten Substanz und der suspendierten Zellen enthalten, wobei das Gesamtvolumen durch die Trennvorrichtung gemäß der folgenden Beziehung bewegt wird:

Volumen in der Trennvorrichtung (ml)/Durchflußgeschwindigkeit des Züchtungsfluids (ml/min) ≤ 2 min

wobei die Trennvorrichtung eine Einrichtung zur kontinuierlichen Abtrennung mindestens eines Teils der gewunschten Substanz aus dem Fluid umfaßt, während sie es ini wesentlichen allen Zellen erlaubt, mit mindestens einem Anteil des Fluids durch die Vorrichtung zu treten: und

C. Einrichtungen zur Zuruckführung der Zellen und des Fluids aus der Vorrichtung in den Reaktor.

2. System nach Anspruch 1 wobei es sich bei dem Reaktor um einen gerührten Tankfermenter handelt und die Trennvorrichtung poröse Hohlfasern umfaßt, die so angepaßt sind, daß sie kontinuierlich mindestens etwa 40 % der durch die Vorrichtung tretenden Substanz abtrennen.

3. System nach Anspruch 2, wobei die Hohlfasern einen mittleren Porendurchmesser im Bereich von etwa 0,2 µm bis etwa 0,6 µm aufweisen.

4. System nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Substanz um ein Protein und bei den Zellen um Säugerzellen handelt, die das Protein exprimieren.

5. System nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Substanz um einen Antikörper handelt und die Zellen fähig sind, monoclonale Antikörper zu exprimieren.

6. System nach Anspruch 1, wobei Stufe (b) Einrichtungen umfaßt, die zum Dispergieren aggregierter Zellen angepaßt sind.

7. Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung und Abtrennung einer gewünschten biologischen Substanz aus einem Zellzüchtungsfluid, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:

(a) kontinuierliche Einführung in einen Reaktor mit einem Kreislaufsystem einer dispergierten Zellkultur und eines Inkubationsfluids, das eine Zellpopulation umfaßt, die zur Expression der gewünschten Substanz fähig ist, und Aufrechterhaltung des Reaktors unter Bedingungen, um die Expression der gewünschten Substanz sicherzustellen:

(b) kontinuierliche Bewegung eines Anteils des Züchtungsfluids unter Einschluß dispergierter Zellen und der exprimierten Substanz durch eine Trennvorrichtung, die außerhalb des Reaktors angeordnet ist, und die angepaßt ist, um kontinuierlich darin mindestens einen Teil der exprimierten Substanz von dem Fluid abzutrennen, während sie es dem größten Teil des sich bewegenden Eluids und im wesentlichen allen dispergierten Zellen erlaubt, durch die Trennvorrichtung zu treten;

(c) kontinuierliches Zurückführen des größten Teils des Fluids und der dispergierten Zellen in den Reaktor über eine Zurückführungsschlaufe, die die Trennvorrichtung umfaßt, wobei das Gesamtvolumen des Züchtungsfluids außerhalb des Reaktors in der Zurückführungsschlaufe weniger als etwa 5 % des Gesamtvolumens des Züchtungsfluids beträgt und eine gegebene dispergierte Zelle in dem Volumen sich in der Zurückführungsschlaufe für weniger als etwa 2 Minuten befindet, was durch die nachstehende Beziehung bestimmt wird:

Volumen in der Zurückführungsschlaufe (ml)/Durchflußgeschwindigkeit des Züchtungsfluids (ml/min) ≤ 2 min.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Reaktor um einen gerührten Tankreaktor handelt und die Trennvorrichtung poröse Hohlfasern umfaßt, die angepaßt sind, um kontinuierlich mindestens etwa 40 % der durch die Trennvorrichtung tretenden Substanz abzutrennen.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Hohlfasern einen mittleren Porendurchmesser im Bereich von etwa 0,2 µm bis etwa 0,5 µm aufweisen.

10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Substanz proteinartig ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei der Substanz um einen Antikörper handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 7, wobei eine Einrichtung zum Dispergieren von Zellaggregaten innerhalb der Zurückführungsschlaufe und zwischen dem Reaktor und der Trennvorrichtung angeordnet ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei der Dispergiereinrichtung um eine Pumpe handelt.