JPH022336A - 細胞分散、培養及び物質回収の連続式設備 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の技術的背景 技術分野： 本発明は一般的には細胞培養設備に関し、且つ詳細には
細胞に重大な損傷を与えることなく、連続法を基盤とし
て、連続的に分散した細胞から生物学的物質を生産し、
抽出するのに適当した設備に関する。

既往技術・ 有用な物質を生産するために選択された細胞を培養する
ことは数世紀にわたって実施されてきた。

多年にわたり改良法が開発されてきており、これらの改
良法の多くは、細胞培養液から所与の生物学的物質を連
続的に製造するのに適した設備又は装置に集中している
。こうした連続方式の例は、例えはトルバート（Ｔｏｌ
ｂｅｒｔ）等の米国特許第４゜１６６．７６８号（反応
器と物質濾過装置の複合装置）、及びトルバート等の米
国特許第４．１７８゜２０９号（同じく反応器と物質濾
過装置の複合装置を示している）に記載されている。又
最近のゲーマー（Ｇｅｉｍｅｒ）等の米国特許第４．６
３９，４２２号（連続培養及び哺乳類の細胞分散物から
生物学的物質の採集用の細胞培養濾過装置）、Ｗ、Ｒ。

アラスーン（Ａ　ｒａｔｈｏｏｎ）及びＪ、Ｒ，バーチ
（Ｂｉｒｃｈ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３
２巻、１３９［１１３９５頁（１９８６年）の“バイオ
テクノロジーにおける大規模細胞培養″（哺乳類細胞生
産のスケールアンプに関連する問題の論説）及びＪ。

Ｐ、サラケン（Ｔ　ｈａｒａｋｅｎ）及びＰ、Ｃ，チャ
ウ（Ｃｈａｕ）、Ｂ　１ｏｔｅｃｈ、　＆　　Ｂ　ｉｏ
ｅｎｇｌ、Ｘ■巻、３２９−３４２頁（１９８６年）の
“哺乳類細胞の大規模培養のための半径流中空繊維バイ
オレアフタ−（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）”をも参照され
たい。

組換え型ＤＮＡ及びモノクローン性抗体技術を基礎とし
た比較的最近の発見に伴って、連続法に基づいて有用な
生物学的物質を生産することができる細胞培養設備の提
供に対し次第に注意が向けられてきた。理想的な設備に
おいては、細胞の大部分が損傷されず、生物学的物質の
圧出（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に最適な環境が保持され
、物質の収量が許容できる程度で、設備が適度に長く且
つ経済的に有用な寿命を有している。現在まで開示され
た細胞培養設備の多くは上記の目標を一つ又はそれ以上
達成してはいるが、単一な設備で上記の目標の総てを達
成するのは困難である。これは哺乳類の環境の変化に対
する敏感性が知られているために、哺乳類の細胞培養設
備に対しては特に真実である。

モノクローン性抗体及び組換えＤＮＡ技術を基礎とした
生物学的物質の両者の生産のための哺乳類の細胞系に今
や大きな注意が向けられているとすれば、単一な哺乳類
細胞培養設備で上記の目標の総てが達成されることは極
めて望ましいことである。

哺乳類細胞の大Ｕ模化はまだ困難と考えられているが、
幾つかの付加的細胞培養設備が提案されている。高い細
胞密度及び、細胞培地中に開放された生成物の採集を同
時に達成するためには、どちらにしても培養すべき細胞
を懸濁するか又は固定化する設備が利用される。懸濁細
胞のための中空繊維カートリッジ（バイオレスポンス［
ＢｉｏＲｅｓｐｏｎｃｅＪ社に譲渡されｌニョーロッパ
特許出願第０゜１１２．１５５号参照）、並びに固定化
細胞のためのセラミック　カートリッジ（Ｂ、Ｇ、Ｄ、
ポーデカ−［Ｂｏｄｅｋｅｒ］等、Ｄ　ｅｖｅｌｏｐ、
　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｓ　ｔａｎｄａｒｄ。

６６巻、４７３−４７９頁［Ｓ　、　Ｋ　ａｒｇｅｒ、
　Ｂ　ａｓｅｌ。

１９８７年１）は懸濁細胞のために、又は引き続いて訓
胞培地と共に潅流（ｐｅｒｆｕｓｅ）される細胞を固定
化するために使用されている。これらの設備の利点はほ
んの僅かな数の細胞しか含まないか、又は全く細胞を含
まない媒地から生成物を採集することができることであ
る。

微生物の発酵に使用される深槽タンク発酵器技術を哺乳
類細胞の培養に適用するために多くの試みが為された。

固着依存（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
）細胞及び独立細胞の両者共深槽タンク発酵器中で成長
した。しかしとりわけ、一つの重要な問題は連続培養を
確立することである。培地を含む生成物を細胞から分離
し、長期間の培養工程を可能とするために、トラップ及
び回転濾過器が使用された。しかし不都合なことに、両
方法は予期したよりも有効ではないことが示された。回
転濾過器は目詰まりする傾向があり、後になって培地が
浸透できなくなる。従ってこうした高密度反応器は現在
の技術を用いる限り、不可能ではないにしても困難であ
る。

本明細書に記載する解決策は上記の問題の多くを回避す
る。一つの具体化においては、本発明の設備は反応器の
外側の細胞が分散した培養液の量及び滞留時間を制限す
る。好適な設備は又細胞の凝集物を連続的に破壊するこ
とによって、細胞の連続的な分散を容易にし、循環する
細胞から媒体と共に採集すべき物質を分離するように調
整された平均孔径（例えば孔径０．６μｍ）を有する、
中空繊維膜のような外部的−過装置を使用する。−過器
又は多孔性の中空繊維装置を反応器の外側に付設するこ
とにより、任意の時点における反応器の外側の培養液の
容積、及び任意の分散した細胞が反応器の外側にある長
さを調節することが可能となる。装置は発酵器の外側に
位置しており、膜が目詰まりし、物質及び媒地の透過が
得られなくなった時には、容易に交換することができる
。本発明の設備の詳細は下記に記載されている。

本発明の総括 本発明の細胞培養設備は、細胞からモノクローン性抗体
又は他の蛋白質のような有用な生物学的物質が連続的に
圧出されることか充分に保証される条件下で、培養液中
に細胞分散物を優待するのに適した反応器から成る。反
応器と連続的に連結しているか、しかし反応器からは分
離して、通過する培養液から圧出される物質（例えは抗
体）を抽出することができが、分散した、細胞は取り出
さずに元の反応器に還送する物質分離装置がある。特定
の時点において反応器の調節された環境の外側にある培
養液（及び分散した細胞）の量は比較的少量である。特
定の分散した細胞が反応器の外側にある時間は２分間よ
りも短い間である。

更に好適な具体化においては、培養液に栄養物か補充さ
れ、廃棄生成物は反応器に戻る以前にインライン（ｉｎ
　−１ｉｎｅ）透析装置によって除去される。

更に該設備は最少量の培養液を反応器から分離及び透析
装置を通して移動させ、そして反応器に還送するので、
細胞に損傷を与えることなく、必要な時に、細胞の凝集
物を分散させるのに適している。

一般に任意の時点における反応器の外側の培養液の容積
は、設備全体の培養液の約５％以下（−般に２−５％の
範囲）である。反応器の外側の液体の実際の容積は、勿
論発酵器全体の容積に依存する。本発明で例示した設備
では、この容積（反応器の外側の）は約２００　３００
ｍ（２の範囲である。これは任意の時点において、所与
の懸濁細胞が反応器の外側にある時間は約２分間より短
い（外側培養液容量　（Ｖ　Ｏ）を２００−３００ｍ１
２とするためには、約１０１００−ｌ５０／分のポンプ
輸送速度を用いる）ことを意味する。この重要な関係は として表現することができる。上記のように反応器の外
側の容積を少なくし、時間を短くすることにより、本発
明の設備は０２、ｐ）（、栄養分の損失、廃棄物の増加
等のような重要な変動値に対する制御の減損を最少にす
ることが可能である。本発明の設備において、栄養分の
補給源は栄養分の損耗の場所（物質収集装置）からでき
るだけ離れている。

これにより物質収集装置を通じての栄養分の損耗が最少
となる。

好適な分離又は−過装置は多孔性の中空繊維から成り、
その平均孔径は圧出された物質及び培養液の通過及び方
向変更（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）を可能とするが、圧
出する細胞は通過せず、設備中に還送され再循環される
大きさのものである。多孔性繊維は哺乳類の細胞を連続
採集工程から排除するから、中空繊維の平均孔径は０．
２ないし０．６μｍの範囲になければならない。好適な
具体化においては、該−過器を通過する物質の少なくと
も４０％、好適には約１００％が中空繊維装置に入る分
散細胞培養液から除去される。

特定な具体化例 本発明の重要な態様は、それが哺乳類細胞の培養に適す
る発酵反応器及び圧出された生物学的生産物（又は生物
学的物質）の分離及び採集のための発酵器外部設備に関
することである。本発明の他の重要な態様は、発酵反応
器の外部培養液の量が少なく（全培養液容積の約５％以
下）保たれることである。更に、上記のポンプ輸送速度
と培養液の外側容積（Ｖｏ）の関係式により決定される
ように、分散した細胞か約２分間以内に反応器環境に還
送されることである。成極の哺乳類細胞が本設備で使用
されると、細胞は損傷されず、且つ或場合には、細胞の
凝集物が設備を貫流する際に制御された破壊を受けるこ
とにより、それらの機能が増強されたように見える。

本発明の設備は下記に示すように、異なった反応器中の
各種の哺乳類細胞系に対し有用であるが、我々は潅流形
式（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　　ｍｏｄｅ）の撹拌式深槽反
応器を使用した。一連の実例中では、ＥＢＶ転換ヒト・
リンパ球分泌１ｇＭモノクローン性抗体を血清を含まな
い条件下で撹拌式深槽反応器中で培養した。

全反応器内容物を螺動式（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ）ポ
ンプを用いて外部ループを通してポンプ輸送し、発酵器
中に還送する。このループ中に、市販の多孔性中空繊維
カートリンジを設置した。中空繊維膜は平均０．６　μ
ｍの孔径を有し、従って媒地と集積した物質（例えばＩ
ｇＭ抗体）のみを透過し、引き続き系から除去すること
ができた。細胞は常時ループ中に、従って全体的に発酵
器中に保持された。

何時の場合も細胞は反応器から２分間以上離れることは
なかった。ポンプ輸送は細胞に有害ではないことが見出
され、発酵器は外部膜を経て潅流されながら、３０日以
上連続的に稼動した。

物質及び方法（モノクローン性抗体） 細胞及び培地 ＩｇＭモノクローン性抗体（シュードモナス・アエルギ
ノーザ［Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏ
ｚａ］、フインンヤー型５と反応性）を生産するヒトＥ
ＢＶ転換細胞系１３ＣＩ（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、ＣＲ
Ｌ８７９６）を順応し、ＤＭＥ及びＨａｍのＦ１２（シ
グマ［Ｓ　ｉｇｍａ］）のｌ：１混合物を基剤とし、２
ｇ／（１のヒト血清アルブミン（マイルズ［Ｍｉｌｅｓ
１社）及び１０ｍｇ／Ｑのヒト・トランスフェリン（マ
イルズ社）及び２００単位／Ｑの牛インシュリン（エラ
ンコ・プロダクツ［Ｅ　１ａｎｃｏ　　Ｐ　ｒｏｄｕｃ
ｔｓ１社、エリ・リリ［Ｅ　ｌｉ　Ｌ　１ｌｌｙ］社部
門）を添加した血清を含まない媒地中で培養した。全発
酵工程を通じて同じ媒地を使用した。

発酵器内容物についての細胞の計数は、血球計を用いて
一日に二度測定され、細胞の生存性（ｖｉａｂｉｌｉｔ
ｙ）はトリパン・ブルー排除（ｅｘｃ　ｌｕｓ　１ｏｎ
）試験を用いて評価された。グルコース及びラクテート
の濃度は細胞計数のためＩこ採取した試料と同一の試料
について市販の分析計を用いて分析した。

１ｇＭ試験 カーニー（Ｋ　ｅａｒｎｅｙ）等によりＪ　、　　ｒ　
ｍｍｕｎｏｌ、　　１２３．１５４８（１９７９年）に
記載された方法による競合的Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ（ｅｎ
ｚｙｍｅ　−１ｉｎｋｅｄ　　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅ
ｎｃ　　ａｓｓａｙ）が試料中のＩｇＭの定量に使用さ
れ　ｔこ　。

反応器（発酵器） 反応器全体の構成は５Ｑの発酵器を含み、第１図に示す
通りである。第１図は代表的な実例で使用された発酵器
の典型的なｌｉｌ！成を示している。容器及びそのヘッ
ド・プレート（ｈｅａｄ　ｐｌａｔｅ）は市販品（ヴア
ーチス［Ｖ１ｒｔｉｓ］）を使用した。発酵器内容物の
分離は発酵器の内側に位置する３０フイートのシリコン
・ゴムの配管を経て０□／　ｃ　Ｏ２／空気の混合物を
用いて行なわれた。設備の一体性（１ｎｔｅｇｒｉｔｙ
）はヘッド・スペースの２ｐｓｉの空気圧によって保た
れている。すべての外部の配管はシラスチック（ｓｉｌ
ａｓｔｉｃ−シリコンゴム）配管から成る。

細胞分離 発酵器は実験の始動期に潅流を可能とするために、ｌ　
５０　ｒｐｍで運転されているステンレス鋼製の回転−
過器（ｓｐｉｎ　ｆｉｌｔｅｒ）を装備していた。

２８４時間後、回転−過器の目詰まりのために、細胞の
分離はプラスマバ−（Ｐ　ｌａｓｍａｐｕｒ）■中空繊
維カートリッジ（オレゴン・テクニカ［Ｏｒｅｇｏｎ　
Ｔｅｋｎｉｋａ］、ＢＶから購入）を用いて外部的に行
なわれｔこ。

次いで発酵器の内容物はマスターフレックス（ｍａｓｔ
ｅｒｆ　Ｉｅｘ）ｎ動式ポンプを用い、シラスチ／り配
管を通じてポンプ輸送された。グラスマパー■中空繊維
カートリッジはこのループ中に入れられ、細胞分散物は
繊維の内腔（ｌｕｍｅｎ）を通して１５０ｍＱ１分の速
度でポンプ輸送される。繊維の膜は孔Ｈ０，６５μｍ及
び有効表面積０．０７＋ｏ２を有するプラスマフアン（
Ｐ　ｌａｓｍａｐｈａｎ）Ｐ　Ｉ　Ｈから成っている。

プラスマパー・カートリノジの前面の圧力計器は、カー
トリッジ中の圧力の増力目を測定するために使用され、
何時膜の目詰まりが始まったかを示す。

採集される培地は、７０１５．２０のポンプ揚程を有す
る第二のマスターフレックス・ポンプ（Ｐ２）を用いて
、プラスマパー・カートリノジの余分な毛管空隙から連
続的に抜き取られた。プラスマパーを通して採集された
媒体の最大容積は、−日当たり発酵型容積の１０６％に
相当する４゜５ａであった。

採集速度と同じ配送速度に設定された第三のマスターフ
レックス・ポンプ（Ｐ３）が発酵器中に新鮮な無血清培
地を送るために使用された。

本発明の全体の設備が第１図に例示されている。

該図において、分散した細胞培養液１０はシャフト９を
経てモーターＭにより駆動される撹拌機８により連続的
に撹拌しながら、撹拌式タンク反応益６中に入れられて
いる。初期の研究においては、溶解した物質を含有する
細胞を含まない培養液が、更に精製するためにポンプＰ
２により配管２２を経て直接ポンプ輸送できるように、
回転濾過器７が細胞分離器として使用された。都合の悪
いことに、回転−過器７は２００−３００時間後には目
詰まりする傾向があるので、結局それを取り除き、そし
て細胞含有培養液及び物質ｌＯが直接反応器からから配
管２４を経てポンプ輸送され、ポンプＰ、によって外部
の中空繊維装置２６を通り、及び配管２８を経て反応器
６に還送される本発明に到達した。ｐＨ，０２を監視す
る装置、及び培地を補充する装置（ポンプＰ、を経て供
給）が第１図に示すように取り付けられている。培養液
試料は配管１６を経て周期的に採取することができる。

結果　（モノクローン性抗体の連続生産）細胞の成長及
び生存性に及ぼすポンプ輸送の効果。発酵器（＃８６０
４１）は４６％の生存性を持つた細胞数１０　Ｘ　１０
’／ｍＱで、３＋２の培養液を用いて接種された。発酵
器は、最初細胞を含まない発酵器内古物を９０ｍＱ／時
間の速度、即ち、−日当たり２．２Ｑ又は７３％の培地
の交換の速度で除去するステンレス鋼回転−過器を備え
ていた。この潅流速度を一定に保つと、生存率の増加（
第３図）及び約２　Ｘ　１０６／ｍ（ｌの細胞密度（第
２図）が得られる。接種後１２０時間に、マスターフレ
ックス・ポンプを用いる培養液のポンプ輸送が、１００
１５０ｍＩ２／分の速度で、外部ブラスマパ−■を通し
て開始された。潅流速度はこの時期の間、回転濾過器を
通じて一日当たり７３％の培地交換速度に保持された。

第２及び３図は生存率及び細胞密度の両者ともポンプ輸
送の開始の殆んど直後に増加することを示す。両者は増
加し、従前よりは一段と高い平坦域に到達し、平均生存
率７５％、及び細胞密度５　Ｘ　Ｉ　Ｏ６／ｍＩ２に達
する。第２図は８００時間の実験時間の間、発酵器＃９
６０４１における１３Ｃ１細胞の全体的な及び生存細胞
密度を示す。

試料は指示された時間に発酵器から採取され、細胞密度
は血球計を用いて測定された。生存率はトリパン・ブル
ー除外試験を用いて測定された。

１＝−日当たり７３％の培地交換率における回転濾過器
を経由する潅流 ２−１００　ｍ０１分の流速でマスターフレックス・ポ
ンプを用いる培養液全体の連続的ポンプ輸送の開始 ３＝回転−過器の目詰まり ４＝プラスマパー■中空繊維カートリツジを経由する潅
流 ５＝ＩＳＡを用いず血清を含まない培地へ潅流培地の変
更 上記の五つの変化が第３−５図に適合している。

ポンプ輸送開始前に発酵器中に存在した細胞の凝集物は
、後では存在しなかった。細胞密度及び生存性は実験中
２８４時間後に回転濾過器が目詰まりするまで一定であ
って、細胞は得られる化学的安定化（ｃｈｅｍｏｓｔａ
ｔ）により失われた。第３図は全体で８００時間の実験
の間、＃８６０４１発酵型中の１３ｃｌ細胞の生存率を
示す。

試料は発酵器から第３図に指示された時間に採取され、
細胞密度は血球計を用いて測定された。

生存率はトリパン・ブルー除外試験を用いて測定された
。

プラスツバ−０分離器を経由する潅流 回転−過器の目詰まりの最初の兆候の７０時間後に、プ
ラスマバー分離器を経由する潅流が再出発した。回転濾
過器の目詰まりによって、発酵器の容積は４．５０に増
加しており、細胞密度は６８％の生存率で２　Ｘ　１０
　’／ｍ（ｌに減少した。潅流速度は２００　ｍＱ／時
間、即ち一日当たり４．８１２又は１０６％の培養液交
換速度に設定した。細胞密度は新しい潅流条件に直接感
応した。第２図に示すように、ブラスマパーでの潅流の
開始後１００時間で、１ｍＱ当たりの生存細胞数が１Ｏ
−１３Ｘ１０６の新しい平坦域に到達した。プラスマパ
ー分離器は３００時間以上にわたってカートリッジの前
面に４Ｏ−７０ｎ＋ｍＨｇの一定圧力で示される目詰ま
りの兆候を示さなかった。接種後７００時間で、プラス
マバー分離器は目詰まりし、それ以上潅流することはで
きなかった。細胞密度が高いために、培養液は直ちに感
応して生存率が減少しく第３図）、４日後に中止した。

生成物の放出 使用された細胞系は培養培地中にＩｇＭモノクローン性
抗体を分泌する。採集された培地中の１ｇＭ４度は第４
図に示されている。生存細胞数のように、ＩｇＭ濃度は
潅流がプラスマパー分離器を用いて開始した後に増加し
、従ってＩｇＭの培地中への放出は細胞数に依存するこ
とを示している。好適な細胞数は潅流条件下で５−１０
Ｘ１０”／ｒｎｌである。ＩｇＭの放出に及ぼす培地成
分の影響を評価するために、接種後５００時間で供給培
地中のＨ５ＡｉＪ度を２９／ＱからＯｇ／Ｑに減少させ
た。細胞濃度が高いために、細胞の生存率には何の影響
もなかったが、ＩｇＭ濃度は培地の蛋白質濃度を変える
前に到達した濃度の５０％に減少した。第４図は８００
時間の実験の間に＃８６０４１発酵器中の’１３Ｃ１細
胞により培地中に分泌されたＩＢＭの量を示す。上記の
ように、試料は指示された時間に採取され、１ｇＭ４度
は競合的ＥＬＩＳＡ法を用いて測定された。

細胞の代謝活性 各種の培養条件下の細胞の代謝活性を測定するために、
グルコースの消費とラクテートの生産を測定した。第５
図は回転−過器を用いる潅流下においては、細胞濃度が
比較的低いために、発酵器中におけるグルコースとラク
テートの濃度は両者共約１１ｍモルであることを示す。

プラスマバー■での潅流が開始した後、細胞密度は増加
し、グルコースの消費及びラクテートの生産の両者が増
強される。１Ｏ−１３Ｘｌｏ’生存細胞／ｒｎＱにおけ
る細胞密度の平坦域の間、平均グルコース濃度は２５ｍ
モル及びラクテートの平均濃度は３ｍモルに達した。第
５図は８００時間の実験の間における＃８６０４１発酵
器中のラク３Ｃトとグルコースの濃度を示す。

考察 上記の実例に示された研究は、ヒトＥＢＶ転換リンパ細
胞の培養のための深槽発酵器の変形を示している。他の
発酵反応器も使用できる（例えばエアリフト［ａｉｒ　
１ｉｆｔ］発酵器、中空′ｍ維バイオリアクター等）。

潅流装置の構成は高細胞密度（１０１３ＸｌＯ’生存細
胞／ｍＱ程度まで）の潅流反応器の維持を可能とする外
部に位置する多孔性中空繊維方式を包含する。この構成
に好適であるマスターフレックス嬬動式ポンプを用いて
細胞をポンプ輸送することは、細胞に障害を与えないだ
けでなく、少なくともこの例においては、生存率を増大
させていることが示された。培養液のポンプ輸送の前に
発酵器中に見られた細胞の凝集物は、ポンプ輸送後は存
在しなかった。これは恐らくポンプ輸送中の細胞の集塊
に加えられた物理的応力によるものである。

上記の方式における凝集物の破壊は、単独細胞の方が媒
体により良く接触でき、その結果良好な成長と代謝活性
を招くことを可能とするように思われる。実験の始動段
階で使用されたステンレス鋼回転濾過器は、細胞密度を
２　Ｘ　Ｉ　Ｏ’／ｍＱの低い段階に到達させただけで
僅か２８４時間後に目詰まりを起こした。回転−過器の
目詰まりは細孔内に沈着する細胞及び細胞の残骸のため
に起こる。

濾過器が発酵器の内部に位置するために、目詰まりは普
通には培養の終結を意味することとなる。

プラスマパー■カートリッジの使用によって、回転濾過
器よりも驚く程高い潅流速度が１０日以上にわたって可
能となり、その結果１３ＸｌＯ’／ｍＱの極めて高い細
胞密度が得られる。しかしブラスモパー膜も回転濾過器
が目詰まりするのと同じ理由で無限には使用できないが
、目詰まりは繊維中の細胞懸濁液の流速を増加させるこ
とによって、最少限度にすることができる。

カートリッジを発酵器の外側に位置させることにより追
加される利点は、実験（又は生産）を中断することなく
新しいカートリッジに交換できることである。数個のプ
ラスモパー・カートリ７ジを並列に構成することが可能
であり、こうすれば最初のカートリッジの目詰まりが起
こった後に、新しいカートリッジに切り替えることが可
能となり、中断を避けることができる。

更に行った実験によれば、本文に記載された構成はｔｏ
−２０Ｑの培養にも適しており、小規模の発酵器に限定
されるものではないことが示されＩこ。

上記の開示が与えられれば、当業者には変形法が想起で
きるものと思われる。従って上記の実例は例証と解釈す
べきであり、本文に開示された発明は特許請求の範囲に
よってのみ限定されるべきことを意図するものである。

本発明の主なる特徴及び態様は以下の通りである。

１、物質を圧出している懸濁細胞の集団から物質を連続
的に生産し且つ分離するための設備であって、 （ａ）細胞による物質の圧出を促進するのに充分な条件
下に保持された培養液中に少なくとも細胞の一部を含む
反応器： （ｂ）反応器と液体的に連絡しており、且つその外側に
ある分離用装置を通して、比較的少容量の培養液、圧出
された物質及び分散した細胞を連続的に及び比較的迅速
に移動させる外部的手段であって、該装置は貫流する培
養液の少なくとも一部と共に事実上線ての細胞が通過す
ることを可能としながら、少なくとも物質の一部を培養
液から連続的に分離するのに適した装置：及び （Ｃ）反応器から出た細胞及び培養液を最初の反応器に
還送する手段 から成る設備。

２、任意の時間において反応器の外側の比較的少容量の
液体が全体の培養液の約５％以下である上記ｌに記載の
設備。

３、段階（ｂ）の分散した細胞が約２分間よりも短い間
、反応器の外側にある上記ｌに記載の設備。

４、反応器が撹拌式タンク発酵器であり、分離装置が該
装置を貫流する物質の少なくとも約４０％を連続的に分
離するのに適した多孔性中空繊維から成る上記１に記載
の設備。

５、中空繊維が約０．２ないし０．６μｍの範囲の平均
孔径を何する上記４に記載の設備。

６、分離装置の出口と反応器の間に透析手段が含まれて
おり、該透析手段は培養培地に栄養分を提供し、且つ廃
棄物を除去するのに適当している上記ｌに記載の設備。

７、物質が蛋白質であり、及び細胞が蛋白質を圧出する
に適した哺乳類細胞である上記ｌに記載の設備。

８、物質が抗体であり、及び細胞がモノクローン性抗体
を圧出することができる上記ｌに記載の設備。

９、段階（ｂ）が凝集した細胞を分散させるのに適した
手段を含む上記１に記載の設備。

１０　、　（ａ）物質を圧出することができる細胞の集
団を含む細胞の分散した培養液及び培地用液を反応器中
に導入し、且つ物質の圧出を確保する条件下に反応器を
維持すること；（ｂ）移動する培養液の大部分及び事実
上線ての分散した細胞が分離装置を通過することが一丁
′能であると共に、少なくとも物質の一部を培養液から
連続的に分離するのに適した分離１４．物質が蛋白性で
ある上記１０に記載の刃装置を通して、分散した細胞及
び物質を含む培養液の一部を連続的に移動させること；
（ｃ）培養液の大部分及び分散した細胞を反応器に連続
的に還送すること、 の工程から成る生物学的物質を連続的に生産し及び分離
する方法。

１１、下記の関係式 により決定されるように、反応器の外側の培養液の容積
が全体の培養液の容積の約５％以下であり、且つ所与の
分散した細胞が約２分間よりも短い間反応器の外側にあ
る上記ＩＯに記載の方法。

１２、反応器が撹拌式タンク反応器であり、分離装置が
該装置を通過する物質の少なくとも約４０％を連続的に
分離するのに適した多孔性中空繊維から成る上記ｌＯに
記載の方法。

１３、中空繊維が約０．２ないし０．６μｍの範囲の平
均孔径を有する上記ＩＯに記載の方法。

法。

＋５．物質が抗体である上記１３に記載の方法。

１６、細胞凝集物を分散するための手段が反応器と分離
装置の間に配置されている上記１０に記載の方法。

１７、分散手段がポンプである上記１６に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の好適な設備の略図である。 第２図は本発明の方式の反応器における細胞密度の変化
と時間との関係を示すグラフである。 第３図は本発明の反応器における細胞の生存率と時間と
の関係を示すグラフである。 第４図は本発明の反応器における抗体の生産と時間との
関係を示すグラフである。 第５図は本発明の反応器におけるグルコースとラクテー
トの生産と時間との関係を示すグラフである。 第２図 第３図 時 間 （時間）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）物質を圧出している懸濁細胞の集団から物質を連続
   的に生産し且つ分離するための設備であって、 （ａ）細胞による物質の圧出を促進するに充分な条件下
   に保持された培養液中に細胞の少なくとも一部を含む反
   応器； （ｂ）反応器と液体的に連絡しており且つその外側にあ
   る分離用装置を通して、比較的少容量の培養液、圧出さ
   れた物質及び分散した細胞を連続的に且つ比較的迅速に
   移動させる外部手段、ここで該分離用装置は貫流する培
   養液の少なくとも一部と共に事実上総ての細胞が通過す
   ることを可能としつつ、少なくとも物質の一部を培養液
   から連続的に分離するのに適している；及び （ｃ）反応器から出た細胞及び培養液を最初の反応器に
   還送する手段 を有することを特徴とする設備。 ２）（ａ）物質を圧出することができる細胞の集団を含
   む分散した細胞培養物及び培地用液を反応器中に導入し
   そして物質の圧出を確保する条件下に反応器を維持し； （ｂ）移動する培養液の大部分及び事実上総ての分散し
   た細胞を分離装置を通過することを可能としつつ、少な
   くとも物質の一部を培養液から連続的に分離するのに適
   した分離装置を通して、分散した細胞及び物質を含む培
   養液の一部を連続的に移動させ； （ｃ）培養液の大部分及び分散した細胞を反応器に連続
   的に還送する、 工程を有することを特徴とする生物学的物質を連続的に
   生産し及び分離する方法。