JPS61257181A - 動物細胞の培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ）産業上の利用分野 本発明は動物細胞の培養方法に関するものである。更に
詳しくは有用物質を産生ずる動物細胞を培養し、有用物
質を高められた濃度で培養するための方法に関するもの
である。

ｂ）従来技術 細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン、インター
フェロンの如キ抗つィルス剤或いはホルモンの如き生物
薬品の製造にとって重要である。更に近年特定タンパク
質などを標的とするモノクローナル抗体の生産は抗体産
生細胞とミエローマによるハイブリドーマの培養による
ものであり、その技術の解決は工業的に重畳なテーマで
ある。

従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管。

培養びんなどを用いて実験室的規模で行なわれている。

一方近年前記した如き有用物質の産生を、目的として工
業的な細胞の培養法及びそのための装置として、いくつ
かの提案がなされている。これらの提案は、大きく分け
て付着培養（ａｎｃｈｏｒａｇｐ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
　ｃｕｌｔｕｒｅ）と浮遊培養、つまシサスベンジョン
培養（５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ　）との２
つの方式に分類されるが、これらの方式は培９きれる細
胞の特性によっていずれかに決められる。

本発明はサスベンジョン型の細胞培養における装置およ
び方法例関する。そのサスベンジョン培養によって細胞
を培養する方法に関し、最近いくつかの提案があり、例
えばマグネティックスクーラーもしくは機械的に駆動さ
れるシャフト上の羽根車によって、スピナーフラスコの
中に調整された攪拌機能を設けた培養方法などが提案さ
れている（例えば特開昭５７−６５１８０号公報参照）
。

しかし上記の方法においては、一定量の栄養分の中で培
養されるため細胞の生長増殖は比較的低い密度で停止す
る。

このよう力細胞のサスペンション培養において、大量に
１つ高密度で培養するために、一般に新しい培養液を培
養槽中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い培養液を
培養槽外へ排出しながら培養する方式が提案され、こノ
方式は通称パーヒユージョン方式と言われている。この
方式を用いて培養するに当って重要なことの１つは、サ
スベンジョノ液中の生細胞と前記古い培養液とを効率よ
く分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培養槽内
の細胞の生育環境を最適条件下に維持することである。

さらに細胞培養により有用物質を得るために工業的にＭ
費なことは、目的とする有用物質を高い＃度で得ること
である。一般に細胞培養において培養液中の細胞が産生
ずる有用物質の濃度は標めて低く、培養液から有用物質
を分離、精製するために煩雑な手段を要し、それが回収
率の低下、フスト了ツブの原因の１つになっている。

一方培養’Ｉ−高い細胞密度で行なうととくよシ、成る
程度有用物質の濃度を高くすることは可能であるが、細
胞金高密度で培養するためには前述した如く新しい培養
液を供給しながら、古い培養液を培養系外へ排出しなけ
ればならず、高密度による細胞培養方法においては、有
用物質の濃度を高くするためには自ら限界があった。

Ｃ）発明の目的 そこで本発明の目的は、動物細胞の培養によってそれが
産生ずる有用物ｘ’ｔ−より高められた濃度で得ること
ができる方法を提供することである。

本発明の他の目的は、有用物質を高い濃度で含む培１１
液を得ると共にそれを実施するための工業的に有利な培
養システムを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、特に抗体を高濃度で得るた
めの簡単で工業的価値のある細胞培養方法を提供するこ
とＫある。

本発明のざらに他の目的は以下の説明から明らかとなる
であろう。

ｄ）発明の構成 本発明者の研究によれば、前記した如き本発明の目的は
有用物質を産生ずる動物細胞上サスペンション状態で培
養槽中にて培養する方法において、 （１）　　サスペンション培養液から動物細胞と培養液
とを分離し、分離された動物細胞を培養槽へもどす工８
囚 （２）　　前工場囚で分離された培養液全限外Ｆ遇によ
り産生された有用物質を含む高分子量成分とそれ以外の
低分子量成分とに分画する工程（Ｂ）および （３）　　前工程中）で分画された高分子量成分の少く
とも一部を培養槽へ循環する工程０ により該培養を行うことを特徴とする動物細胞の培養方
法により達成されることがわかった。

かかる本発明によれば、目的とする有用物質を高濃度で
得ることが可能となり、また培養方法も操作が簡単であ
るので工業的に有利である。

本発明の細胞培養方法はサスペンション状態で培養する
方法に適用されるが、サスペンション状態とは、水性媒
体中で細胞それ自体が浮遊しながら、或いは細胞を微小
担体（マイクロキャリアー）に担持して浮遊しながら、
またマイクロカプセル中で細胞が生育されるような穐々
の浮遊培ｑ＃をいう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊略
せながら培養する方式に有利に用いられる。

本発明の培養方法において、培養する動物細胞としては
、サスペンション状態にて増殖可能なものであればよく
、天然の動物細胞のみならす、人為的或いは遺伝子操作
により変性された細胞例えばハイブリド−マであっても
よい。

また細胞として、ＩＬ−２の如きリンホカインを産生ず
るリンパ球由来の細胞であってもよく、インターフェロ
ン（ＩＦＮ）の如き有用な生理活性吻質を産生ずる２倍
体細胞であってもよい。さらに種々のモノクローナル抗
体を産生ずる細胞であってもよく、本発明はかかるモノ
クローナル抗体ｔ−産生する細胞の培養に対してモノク
ローナル抗体を高い濃度で得る目的のために％に適し工
いる。

本発明におけるサスペンション状態の細胞培養において
培養槽中においては、培養しようとする細胞が培養液中
に浮遊した状態で培養される。培養液は実質的に水よ抄
なろ水性媒体に、種々の無機塩、ビタミン類、補酵素。

ブドウ糖、アミノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に使
用される添加成分が加えられている・また培養液には血
清管加えることもできるし、血清を用いない所謂無血清
培地を培養液として使用することも出来る。

本発明の培養方法においては先ずサスペンション培養液
から動物細胞と培養液とを分離し、動物ｍ施は培養槽へ
もどされる〔工程囚〕。

この動物細胞と培養液との分離は、後述する第１図、第
２図および第３図に示されたように培養槽内（例えばサ
スペンション培養液中）で行ってもよく、また培養槽か
らサスペンション培養液を一旦取υ出し培養槽外で動物
細胞と培養液と全労離し動物細胞は培養槽へもどす方式
であってもよい。これらいずれの場合であっても動物細
胞と培養液との分離は細胞が生育した状態で、分離され
た培養液中に細胞が実質的に混入しない方法で分離でき
ればよく、種々の分離手段が採用できる。その手段とし
ては例えば遠心分離９回転フィルタ＋、　固定フィルタ
ー、ホローファイバモジュールなどを用いることができ
る。さらに第１図および第３図に示すように培養槽内に
セトリングゾーンを設けそのゾーン内で動物細胞と培養
液とを分離し、その培養液を培養槽外へ取出すこともで
きる。上記の如き動物細胞と培養液との分離は無菌状態
で実施される。

例えば動物細胞が・・イブリドーマである場合一般にそ
の大きさは１０μ以上であるから、フィルターによって
分離するためにはフィルターの細孔径が５μ以下のもの
であればよい。

本発明方法において、前述の如く工程囚においてサスペ
ンション培養液から動物細胞とそれを含まない培養液と
全労離し、動物細胞は培養槽にもどされ、一方墳養液は
培養槽外へ取り出される。次にかくして分離された培養
液を限外−過によって、産生された有用物質を含む高分
子量成分とそれ以外の低分子量成分とに分画される〔工
程））〕。この工Ｓ　（Ｂ）における限外−過は通常限
外−過膜として使用されている分離手段が採用される。

この工程ＣＢ）の限外−過の分画能は、産生された有用
物質の分子量、所望する分画速度などにより左右される
が、有用物質を実質的に透過しない膜が好ましく、就中
分子量約１５万のものを実質的に透過しない膜、殊に分
子量約１０万のものを透過しないＨｔ−用いるのが望ま
しい。例えばモノクローナル抗体を産生させ、高濃度で
得るためＫは、分子量分画５０に以下の限外Ｆ過膜を用
いる場合モノクローナル抗体の洩れは実質的に無視でき
、また分子量分画１０に以上の限外−過膜を用いると環
流比も大きく取ることができ能率的にＦ遇することがで
きる。

一方、分子量分画１００におよびそれ以上の限外濾過膜
を用いると膜を透過するモノクローナル抗体の量が無視
できなくなる。

本発明においては特に有用物質がＩｇＧ抗体であって限
外テ過は分子量約１５万のものを実質的に透過しまい膜
を使用するのが有利である。さらに有用物質がＩｇＭで
あって限外−過は分子量約１００万のものを透過しない
膜を用いるのが有利である。

工程＠）における限外−過は、濾過面を容易に洗滌、再
生できる方式、つまりホールド・アップが少ない方式が
好ましく、その形式はホロー・ファイバー、スパイクル
、チュプ２−．プレートアンドフレームなどが挙げられ
るが就中ホロー１フアイバー、プレートアンドフレーム
の形式が望ましい。

かくして前記工程０３）で分画された有用物質を含む高
分子量成分の少くとも一部は培養槽へ循環される〔工程
Ω〕。モノクローナル抗体を産生させ、工１！　ＣＢ）
でこれを含む成分を分画し培養槽に循環させてサスペン
ション培養液中のモノクローナル抗体濃度が高くなって
も（例えば１１１１ｇ／ｍ以上）、そのこと自体細胞の
生育、増殖には特に悪い影響は与えない。

上記工程（Ｑにおいて、前工穆（Ｂ）から分画された有
用物質を含む高分子量成分は培養槽中のその濃度や細胞
の生育状態を監視しながら、培養槽中へ循環する割合を
決定すればよい。

すなわち一般にサスペンション培養液中の細胞密度が低
く且つ有用物質の濃度も低い場合には全量乃至はとんど
を培養槽中へ循環することが望ましく、一方サスベンジ
ョン培養液中の有用物質の濃度が比較的高くなるに従っ
て、その循環割合を少なくシ、他は系外へ取シ出すこと
が望ましい。

本発明者の研究によれば、工程（Ｂ）で分画されたもう
一方の低分子量成分は、これをそのまま系外へ取り出す
こともできるが、その中に含まれる生育阻害物質を除去
してその少くとも一部を培養槽へ循環すれば工業的に極
めて有利に本発明ｔ−実施できることがわかった。

すなわち、前記低分子量成分中には、アンモニアなどの
細胞が産生じた生育阻害物質の他に、生育に必要な栄養
成分、成長因子などの有効成分を多く含まれており、前
記低分子量成分中の生育阻害物質を主として除去し、残
余を培養液へ循環することによシ、新しい培養液の使用
を低減でき、また成長因子などの使用量を少くすること
ができる。殊に血清添加培地を用いる場合、血清の使用
割合を大巾に低下させることができる。

かくして本発明において、前記工程（Ｂ）で分画された
低分子量成分から生育阻害物質を除去して残余の成分の
少くとも一部を培養槽へ循環する〔工程（至）〕ことは
、工業的に一層有利である。この工ｓ０において、低分
子量成分から生育阻害物質を除去する方法としては、特
に制限を受けないが一般に生育阻害物質４了ンモニアの
如く前記低分子量成分中ではより低分子量のものが多く
一方成長因子などの高価なものは比較的分子量が大きい
のでそのことを利用して膜による分離法或いは吸着によ
る分離法を採用するのが好ましい。

例えば血清添加培地を用いて培養する場合、この工程０
において、ＩＯＫの分ｍＭｔ−用いて生育阻害物質含有
成分金除去し、他を培養槽へ循環すれば血清の使用割合
を大巾におさえることが可能となる。

一方無血清培地（例えばＩＴＥ８　）ｔ−用いて培養す
る場合、ＩＯＫの分離膜を用いると成長因子としてのト
ランスフェリンは高回収率で再使用可能であシ、インシ
ュリンは部分的に回収され、ＩＫの分ｌ１ｌＩＪｌ［ｔ
−用いるとトランスフェリン、インシュリンは一層高い
回収率で再使用できる。しかしエタノールアミン、セレ
ナイトなどの低分子量物はかかる分離膜では生育阻害物
質と共に素通シし回収は回置である。

また本発明の方法を実施するに当って、新しい培養液の
供給と、古い培養液の排出とは、培養槽中の液面の水準
がほぼ一定七なるように維持することが望ましいが、必
ずしもその必要はない。新しい培養液の供給と古い培養
液の排出とは、それぞれ諌立して、連続的に行なうこと
もできまた間歇的に行なうこともできる。

本発明の培養方法において、サスペンション液中の酸素
濃度を一定に維持するために、酸素を供給する方法とし
ては、前述の如く、サスペンション液中へ酸素または酸
素含有ガスを直接供給してもよく、また他の供給手段に
よってもよい。他の供給手段としては、例えば識素中ヤ
リア−を用いる方法である。酸素キャリアーとして杜、
水と実質的に混合しないで酸素を溶解し得る液状の化合
物が使用され、その例としては、人工血液の素材として
使用されるような種々のフルオロカーボンが挙げられる
。かようなフルオロカーボンを酸素供給手段として使用
する場合には、ＷＩ素を溶解させたフルオロカーボンを
サスペンション液中の上部から液滴状または薄膜状で添
加すればよい。

培養を効率的に行なうために、新しい培養液および酸素
などをサスペンション液中へ均一に供給し、一方古い培
養液を槽外へ排出する必要があり、そのためサスペンシ
ョン液は良く攪拌されていることが望ましい。攪拌方よ
る方法、この他前記した如き酸素を溶解した酸素キャリ
アーを用いることによる酸素供給と攪拌を同時に行なう
方法などが挙げられる・もちろんこれら攪拌手段を２つ
以上併用することもできる。

また培養は、培養槽の有効培養容積（Ｖ）Ｋ対して新し
い培養液全供給する割合（新しい培養液の供給ｔ／Ｖ　
）　バー８当り　０．２’〜１０、好ましくは０．５〜
５の範囲とするのが適当である。

かくして本発明によれば有用物質殊にモノクローナル抗
体を高い濃度で含有する培養液を比較的簡単な手段で得
ることができ、また成る場合には血清、成長因子などの
高価な物質を大巾に節約することが可能となる。

以下実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例１ （１）　　培養装置 添付第１図に示す培養システムを使用した。

培養槽（ＡＰ−１）は図のように外壁の内側に隔壁によ
って仕切られたセトリングシーツがもうけられ、その上
部には培養液の排出口を有しており、正味培養容積は約
２００−である。

図のＡＰ−２Ｔｒ！プレートアンドフレーム型限外−過
装置である。限外ｐ過膜はミ１７ボア社製ペリマンラボ
カセット用限外濾過膜使用した。

使用した膜の公称分画分子量は実験データの項に記する
。

（２）　培養液 基礎培地として、ＲＰＭＩ　１６４０培地、ハム−１２
培地及びダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１で混
合したもの（以下ＲＤＦと称する）を用い増殖因子とし
てインスリン、トランスフェリン、エタ／−ルアミン、
亜セレン酸を加えた。エタノールアミンの添加−ＪｔＦ
ｉ、１０　Ｍ　ｇ／ｄ　、亜セレン酸は２Ｘ１０−＠ｍ
ｏｌｅ／ｊ！であシ、インスリン及びトランスフェリン
については培地αにおいてはインスリン２　Ｂ　ｇ／ｍ
。

トランスフェリン１０μｇ／ｍｌであり培地βにおいて
はインスリン０．２日ｇ／ｍ１．）ランスフェリ７１〃
ｇ／−である〇 （３）　　培養方法及び結果 あらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養槽に正味培
養容積が約２００−になるように培養液αを送入し、こ
れ全マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１株を親株とするマウ
ス×マウスハイ７リドーｆｆ　４Ｃ１０Ｂ６株全４Ｘ１
０”個／ｍ／となるように播種した。この細胞はＩｇＧ
産性株である。培養槽では炭瞳儂ガス５％を含む酸素ガ
スが（溶存ｒＩｉ素が３解となるように）吹込み７ズル
■全通して自動的にコントロールされて送入されている
。培養槽中の培養液は３７℃に保持されている。培養槽
中にはマリン型攪拌翼が取付けられており攪拌速度は６
０ｒｐ■であった。

播種後４日間は回分培養全行った。第１表に示すように
培養開始後４８目に細胞密度は！、Ｉ　Ｘ　１０・個／
−に達し、回分培養では最高密度に到達したと判断しバ
ーヒユーショアｆ：開始した。バーヒユージョンの尺度
として正味培養容積の１日当りの置換率として表わし実
験結果を併記する。すなわちポンプｐ−ｉ、ｐ−ｎ。

Ｐ−■を駆動しバルブＸｔ−開、バルブＹを閉として、
培養槽内で細胞と分離された培養液をライン０から抜き
と９．その量と同じ量の新培地αをライン■から連続的
に送入した。限外濾過装置ＡＰ−２には分子量分画１０
００の限外濾過膜がセットされており、ライン［Ｆ］か
らは膜を通過した液を、またライン■からは膜を通過し
なかった液を系外に取出した。時間の経過とともに細胞
密度が上昇し、１０日には１２Ｘ１０８個／−に達した
。この時点で図においてパルプＸを閉じパルプＹを開き
限外濾過膜を通過しなかった液は培養槽に循環した。

同時にライン■から送入する培地をαからβに変更した
。１０日０から培養槽から細胞を含む培養混合物を正味
培養容積の約１０％に当る２０−１毎日系外に抜取った
。

以上の培養操作ｔ−２６日間継続した。その結果全館１
表に示す。

第１表　実施例１実験結果 細胞　マウス拳マウスハイブリドーマ　４Ｃ１ＯＢ６株
培地　α：ＩＴＥＳ＋ＲＤＦ　　Ｉ：２ａｇ〆一　　Ｔ
　：　１０ａｇ／ｍｇβ：　ＩＴＥＳ＋ＲＤＦ　　Ｉ　
：　０．２１１ｇ／ＲｔＴ　：　ｌａｇ／ｍ使用限外濾
過膜：ミリポア社製　ＰＳＡＣＯＬＣ０５（分子量分画
ｉ、ｏｏｏ　＞比較例１ 培養装置及び培養液は実施例１と同じものを用いた＠冥
験方法は、第１図において常にパル７’Ｙを閉としパル
プＸを開にし、かつラインのより送入する培地種類を常
にαとした以外は全て実施例１と同じにした。実験結果
を第２表に示す。

比較例２ 培養装置及び培養液は実施例１と同じものを用いた。実
験方法は第１図において、常にパルプＹを閉としパルプ
Ｘを開とした以外は全て実施例１と同じにした。実験結
果を第３表に示す。

第２表　比較例１実験結果 細胞：マウス・マウスハイブリドーマ　４０１０Ｂ６株
培地：　ａ　：　ＩＴＥＳ＋ＲＤＦ　Ｉ　：　２ｎｇ／
ｄ　Ｔ：　１０ａｇ／ｄ使用限外−過膜二ミリポア社製
　ＰＳＡＣＯＬＣ０５（分子量分画１．０００）Ｍ３表
　比較例２実験結果 細胞：マウス・マウスハイプリドーマ　４０１０Ｂ６株
培地　α：ＩＴＥＳ＋ＲＤＦ　　Ｉ：２μｇ／ｒｄ　　
　’ｒ：ＩＱμｇ／ｄβ：ＩＴＥＳ＋ＲＤＦ　　Ｉ：０
．２ｉｔＫ／ｍｌ　　Ｔ：１ａｇΔｄ使用限外濾過膜二
ミリボ了社製　ＰＳＬＣＯＬ　０５（分子量分画１．０
００）実施例２ 次に記する事項以外は実施例１と１司様にして培養実験
を行った。

細胞：マウスミエローマ　Ｐ３Ｕ１とヒトＢセルを融合
して得られたヒ）ＩｇＡｉｌ生マウス・ヒトハイプリド
ーマ４Ｈ１１株 培地：牛胎児血清（Ｆｅ２）添加培地 限外濾過膜分画分子量：１０，０００ 実験結果を第４表に示す。

実施例３ 次に記す事項以外は実施例１と同様にして培養実験を行
った。

細胞：マウスミエローマＰ３Ｕ１とヒトＢセルを融合し
て得られたヒトＩｇＧ産生マウス・ヒトハイプリドーマ
Ｄ３４・３・１株 培地：基本培地ＲＤＦにインスリン、トランスフェリン
、エタノールアミン、亜セレン酸及びＢＳＡ　（牛血清
アルブミン）を添加した無血清培地。

限外濾過膜分画公刊β：１０．０００ 実験結果を第５表に示す。

第４表　実施例２実験結果 細胞；マウス・ヒトハイノリドーマ　４Ｈ１１株（ヒト
ＩｇＡ産生株）培地　α：１０％ＦＣ８十ＲＤＦ β：　１％ＦＣ８＋ＲＤＦ 使用限外濾過膜：Ｚリボ１社製　ＰＴＧＣＯＬＣ０５（
分子量分画１０．０００　）第５表　実施例３実験結果 細胞：マウス・ヒトハイノリドーマ　Ｄ３４・３＠１株
培地：　Ａ　ＩＴＥＳ＋ＢＳＡ＋ＲＤＦ　Ｉ：１０ａｇ
／ｍ　Ｔ：２０ａシーＢＳＡ：５１１１ｇ／ｍＢ　ＩＴ
酩＋Ｂ８Ａ＋ＲＤＦ　Ｉ：　２μｇ鷹Ｔ：　２ｇｇ鷹Ｂ
８Ａ：０．５■／−使用限外濾過膜：ミリホア社製　Ｆ
ｒＧＣＯＬＣｏ５（分子量分画１０．０００）実施例４ （１）培養装置 実施例を同じ （２）培養液 牛胎児血清＋ＲＤＦｔ−使用した〇 （３）　　実験方法及び結果 細胞はＩｇＭ産生マウスヒトハイ７リドーマｐＢＤＨ株
を用い限外濾過膜は分子量分画ｉ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ
のものを用いた以外は実施例と同じ要領で実、唖を行っ
た。実験結果を第６表に示す。

実施例５ （１）　　培養装置 第２図に示したような培養システ７−ヲ使用した。培養
槽ＡＰ−１の中には所定の分子量分画を有する限外−過
膜でできた中空糸の多数からなるホローファイバーモジ
ュールＡＰ−２が内装されておシ一方のモジューの−ｍ
ＫＲ新培地の流入口が他のモジュールの−ｍＫＲ第６表
　実施例４実験結果 細胞　マウス・ヒトハイブリドーマ　ｐＢＤＨ株培地　
α：ｌＯ％ＦＣ８＋　ＲＤＦ β：　１％ＦＣ８＋　ＲＤＦ 使用限外テ過膜：ミｌＪホ了社製ＰＴＨＫ　ＯＬＣ０５
（分子量分画１００，０００　）培養液の流出口が設け
られている。

（２）　　培養液 ＩＴＥＳ　＋　ＢＳＡ　＋　ＲＤＦ （３）　　培養方法及び結果 あらかじめ培養槽をエチレンオキサイドガス滅菌し、十
分水洗した前記培養槽に約３００−の培養液σを送入し
、これにマウス°ヒトハイプリドーマＤ３４・３・１株
ｔ−４Ｘ１０’個／−となるよ′うに播種した。培養槽
では炭酸ガス５％を含む酸素ガスが（溶存酸素が３解に
なるように）吹込ノズル■を通して自動的にコントロー
ルされて吹込まれるよう罠なっている。培養槽中の培養
液は恒温室中で３７℃保持されている。培養槽中にはマ
リン型攪拌翼が取付けられており攪拌速度は６０　ｒｐ
ｍであった。播種後４日間は回分培養を行った。第７表
に示すように培養開始後、４日目に細胞密度は１．Ｑ　
Ｘ　１０・個／　ｔｎｌに達したのでバーヒニージョン
を開始した。すなわちポツプｐ−ｔを駆動してホローフ
ァイバーモジュールＡＰ−２を介して限外Ｐ過膜で濾過
された培養液をライン０ｔ−通して系外へ取出した。一
方ラインのからは新培地をラインＤからの取出しに見合
う速度で培養槽に供給した。培養槽中のホローファイバ
ーモジュールは自動切替えパルプにより８日目までは８
時間に１回、それ以降１８８日目では１時間に１回、そ
れ以降は１５分に１回切替えを行って１間欠点く新培地
により逆洗条を行った。実験結果を第７表に示す。

第７表　実施例４実験結果 細胞：マウス・ヒトハイブリドーマ　Ｄ３４・３１株培
地：σ：１１鐸＋ＢＳＡ＋即Ｆ　Ｉ：１０μｇ澹Ｔ：２
０μシーＢＳＡ：５■／−β：■田＋ＢＳＡ＋ＲＤＦ　
Ｉ：　２ａｇ／ｒｔ　Ｔ：　２ｕｆＺ／ｄ　ＢＳＡ：０
．５■／ｍｅ使用限外濾過膜：ホローファイバーモジュ
ール（分子量分画１００００）実施例６ （１）　　培養装置 添付第３図に示しまたような培養システムを使用した。

培養槽ＡＰ−１及び限外濾過装置ＡＰ−２は実施例１と
同じものを用いた。洲。

除去装置ＡＰ−３はガラス製の円筒状密閉容具であり、
内部に触媒化成社製ゼオライトｚＣＰ−５０５０ｇを充
填した。

（２）培養液 実施例を同じ。

（３）　　実験方法及び結果 あらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養槽に正味培
養容積が約２００−になるように培養液αを送入り、こ
れにマウス・マウスバイア’　ＩＪ　トーマ４Ｃ１０Ｂ
６　＆ｔ−４Ｘ１０’個／ｍトするように播種した。培
養槽では溶存酸素が３解となるように炭酸ガス５％金含
む酸素ガスが吹込みノズル■全通して自動的にフントロ
ールされて送入されている。培養槽中の培養液は３７℃
に保持されている。培養槽中にはマリン型攪拌翼が取付
けられており、攪拌速度は６０ｒｐｍであった。

播種後４日目後では回分培養を行った。４日目以降実施
例１と同じ要領でバーヒユージョンｔ−開始した０１０
日目以降はライン［Ｆ］より取υ出したＰ液の一部をラ
イン■を通してＮＨ，除去装置に送入し、ＮＨ，を吸着
除去［７たのち培養槽へ送入した。ライン［Ｆ］から取
出したＦ液のうち洲、除去装置に送入しなかったものは
ライン■全通して系外に取出した。ラインのを通して系
内循環を行った量は、第８表の［培地循環−１の項に示
している。尚本実験において第８表の「置換率」は「培
地循環」による置換をも含めている。以上の培養操作ｔ
−２６日間継続した。その結果を第８表に示す。

第８表　実施例６実験結果 細胞　マウス・マウスバイア゛リドーマ　４０１０Ｂ６
株培地　Ａ：ＩＴＥＳ＋ｅ）のＦ　Ｉ：２μｇ／ｄ　　
Ｔ：１０ａｇ／ｄＢ：ＩＴＥＳ＋ｅ）のＦ　Ｉ：０．４
μｇ／ｄ　Ｔ：　１ｍｇ／ｄ使用限外濾過：ミリボア社
製ＰＴＧＣＯＬＣｏｓ（分子量分画１０ρ００）

【図面の簡単な説明】

添付第１図、第２図および第３図はそれぞれ本発明の培
養方法を実施する工程の概略図を示したものである。 特杵出願人　帝人株式会社　。 代理人　弁理士　前　　１）　純　　博・　・１１１図 手続補正書 昭和０年９月７２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有用物質を産生する動物細胞をサスペンション状態
   で培養槽中にて培養する方法において、 （１）サスペンション培養液から動物細胞と培養液とを
   分離し、分離された動物細胞を培 養槽へもどす工程（Ａ） （２）前工程（Ａ）で分離された培養液を限外ろ過によ
   り産生された有用物質を含む高分子量 成分とそれ以外の低分子量成分とに分画す る工程（Ｂ）および （３）前工程（Ｂ）で分画された高分子量成分の少くと
   も一部を培養槽へ循環する工程（Ｃ） により該培養を行うことを特徴とする動物細胞の培養方
   法。 ２、有用物質を産生する動物細胞をサスペンジョン状態
   で培養槽中にて培養する方法において （１）サスペンジョン培養液から動物細胞と培養液とを
   分離し、分離された動物細胞を培 養槽へもどす工程（Ａ） （２）前工程（Ａ）で分離された培養液を限外ろ過によ
   り産生された有用物質を含む高分子量 成分とそれ以外の低分子量成分とに分画す る工程（Ｂ） （３）前工程（Ｂ）で分画された高分子量成分の少くと
   も一部を培養槽へ循環する工程（Ｃ）および （４）前工程（Ｂ）で分画された低分子量成分から生育
   阻害物質を除去し、残余の成分の少く とも一部を培養槽へ循環する工程（Ｄ） により該培養を行うことを特徴とする動物細胞の培養方
   法。 ３、該限外ろ過は、有用物質を実質的に透過させない濾
   過膜を用いる第１項または第２項記載の方法。 ４、該限外ろ過は分子量約１５万のものを実質的に透過
   させないろ過膜を用いる第１項または第２項記載の方法
   。 ５、該限外ろ過は分子量約１０万のものを実質的に透過
   させないろ過膜を用いる第１項または第２項記載の方法
   。 ６、該有用物質が抗体である第１項または第２項記載の
   方法。 ７、該有用物質がＩｇＧであつて且つ該限外ろ過は分子
   量約１５万のものを実質的に透過しないろ過膜を用いる
   第１項または第２項記載の方法。 ８、該有用物質がＩｇＭであつて且つ該限外ろ過は分子
   量約１００万のものを実質的に透過しないろ過膜を用い
   る第１項または第２項記載の方法。 ９、サスペンション培養液からの動物細胞と培養液との
   分離を培養槽中で行う第１項または第２項記載の方法。 １０、該生育阻害物質がアンモニアである第２項記載の
   方法。