JPS62289170A - 細胞の培養装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （ａ）　　産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるだめの装置および方法に
関するものである。更に詳しくは細胞をサスベンンヨン
状態で培養するための装置および方法に関するものであ
る。

細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン、インター
７エｐノの如き抗ウィルス削成いはホルモンの如き生物
薬品の製造にとって重要である。更に近年特定タンパク
質などを標的とするモノクローナル抗体の生産は抗体産
細泡とエミｑ−マによるノ１イプリドーマの培養による
ものであり、その技術の解決は工業的に重要なテーマで
ある。

（′ｂ）　　従来技術 従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管。

培養びんなどを用いて実験室的規模で行なわれている。

一方近年細肥の培養法及びそのための装置として、いく
つかの提案がなされている。これらの提案は、大きく分
けて付着培養（ａｎｃｈ−ｏｒａｇａ　ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ）　　と浮遊培養、つまりサスペ
ンジョン培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕ−ｒ
ｅ）との２つの方式に分類されるが、これらの方式は培
養される細胞の特性によっていずれかに決められる。

このうちサスペンジョン培養に関して下記の提案がなさ
れている。例えばマグネティックスクーラーもしくは機
械的に駆動されるシャフト上の羽根車によって、スピナ
ーフラスコの中に調整された攪拌機能を設けた培養方法
が提案されている（米国特許第２，９５８，５１７号お
よび同第３，６４９，４６５号明細書参照）。

特開昭５７−６５１８０号公報には、回転可能なシャフ
ト上に支持される少くとも１枚の比較的大表面積の屈撓
性シートを攪拌機とし、該攪拌機を回転させて該シート
を波立たせ、それによってヒトの２倍体細胞のような成
る種の虚弱細胞だ対し所望の隠かな攪拌を作り出すサス
ペンジョン培養装置が提案されている。

しかし、上記装置による培養方法においては、細胞が一
定量の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比
較的低い密度で停止する。

細胞のサスペンジョン培養において、細胞の生長増殖が
比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細胞を天竜に且つ
高密度で培養するために、一般に新しい培養液を培養槽
中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い培養液を培Ｉ
Ｎ？ａ外へ排出しながら培養する方式すなわち通称バー
ヒユージョン方式と言われる方式が提案されている（Ａ
ｎｎｕａｌ　Ｒｓｐｏｒｔｓ　ｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎ　−
ｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、ｖｏｌ、　６参照
）。この方式を用いて培養するに当って重要なことの１
つは、サスペンジョン液中の生細胞と前記古（・培養液
とを効率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出し
、培養槽内の細胞の成育環境Ｉｋ：最適条件下に維持す
ることである。サスペンジョン液から生細胞と古い培養
液とを分離するために種々のフィルターやまた種々の形
式が提案されているが、フィルターの口塞つや、装置の
構造の煩雑性などの点で工業的培養装置としてはいずれ
も滴定すべきものとは言い棒い。

特開昭５９−８２０８３号公報および特開昭６０−９４
８２号公報には、培養装置内に細胞沈澱管を兼ねた培養
上清排出管と新鮮培地添加用の導管を設け、該導管から
培地を添加し同時に上記排出管から培養上清を排出しつ
つ培養を行うようにした浮遊細胞の高濃度培養装置が提
案されている。

一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし数１０ｊ
りｐンと小さくしかもその比重は培地の比重と大きな差
がないため、浮遊細胞と培地とを重力によって分離する
上記の如き装置では、細胞沈降を有利に達成するために
沈降面積を大きくする必要があるが上記２件の特開昭に
開示された装置では沈降面積をあまり大きくとることは
できない。

（ｅ）　　発明の目的 そこで本発明の目的は、簡単な構造でサスペンジョン培
養液から生細胞と培養液とを分離することが可能な装置
および方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、フィルターなどを使用しなくとも
生細胞と古い培養液とを分離することが可能な装置ｔオ
Ｊよび方法、従ってフィルターの目罵りなどＫよる問題
の発生を解消した製置および方法を提供することにある
。

本発明のさらに他の目的は、細胞沈降を有利に達成する
ための沈降面積を非常は大きくとることのできる工業的
に有利なサスペンジョン培養のための装置および方法を
提供することにある。

本発明の更に他の目的は、サスペンジョン培養において
しばしば問題となる死細胞およびその破壊片を培養槽外
へ容易に除去可能な装置および方法を提供することにあ
る。

本発明の更に他の目的は、細胞の大量且つ高密度の培ｑ
＃に適したパーヒユージョン方式による工業的装置およ
び方法を提供することにある。

更に他の目的および利点は、以下の説明から明らかとな
るであろう。

（ｄｌ　　発明の構成および効果 すなわち、本発明者の研究によれば、前記した本発明の
目的および利点は、第１に（＆）培養槽中の任意の位置
から、培養液よりも比重が大きく且つ酸素が溶解した液
状の酸素キャリアーを供給するだめの供給口。

（ｉ））該培安槽の底部から該酸素キャリアーな取り出
すための取り出し口、 （ｃｌ　　前記培養槽における液状の酸素キャリアーの
供給位置よりも上部に設置された細胞の沈降を許容する
に充分なセトリングゾーン、 （ｄ）　　該セトリングゾーンよりも下部に設けられた
サスペンジョン培養ゾーン ｔｅ）　　該培養槽罠おける液状の酸素キャリアーの供
給位置より下部に設けられた新しい培養液の供給口、 （ｆ）　　該セトリングゾーンの上部に設けられた細胞
を含まない培養液な培養槽外へ排出するための排出口、 を有する細胞のサスペン′）ヨン培養のため培養装置に
よって達成される。

かかる本発明によれば、培１１！槽中の上部に設置され
たセ）　ｌ）ングゾーンにおいて、生細胞は重力方向の
下部へ沈降し、古い培養液や細胞破壊片などはセトリン
グシー／の上部へ分離されることになるので、セトリン
グゾーンの上部に設けられた培養液の排出口から生細胞
を実質的に含まない培養液を排出することができる。従
って本発明は、口塞りの原因となるフィルターを使用す
ることなく、簡単な方式によって生細胞と培養液な効率
よく分離することを可能とするので、細胞の大量且つ高
密度培養に適用することができる。

さらに本発明によれば、培養のための酸素の供給な培養
液よりも比重が大きく且つ酸素を溶解した酸素キャリア
ーを介して行うので、培養のための酸素の供給が全体だ
スムースに行なうことが簡単であるばかりでなく、酸素
キャリアー自体の攪拌効果により、機械的攪拌が全（不
要であるか或いは催かでよいという効果がある。

本発明の培養装置は、細胞？サスペンドこせて実質的な
細胞培養を実施する区域と規定できる細胞のサスペンジ
ョン培養ゾーンおよびそのゾーンの上部に設けられた細
胞を重力によって培養液から分離する区域と規定できる
細胞のセトリングゾーンを有して（・る。細胞のサスペ
ンジョン培養ゾーンと細胞のセトリングゾーンとは、細
庇培譬槽内において該セトリングゾーンの下方に培養ゾ
ーンが位置するよう罠なっている。このような構造に有
するため、細胞のセトリングゾーンにおいて、沈降しそ
して培養液から分離された細胞はセトリングゾーンの下
方からそのま工細胞のサスペンジョン培養ゾーンに再び
導入され、その区域で再び培養される。

本発明の装置において、培養槽内の該セトリングゾーン
は、該培養槽の上方に形成されている。このような構造
によって、培養槽内でセトリングゾーンの有効なセトリ
ング面積を非常に大きくとることのできる利点がある。

本発明の装置は、セトリングゾーンにおいて細胞と分離
された古い培養液を排出するための培養液排出口および
培養ゾーンへ新しい培養液を供給するだめの培養液の供
給口を上記培養［１ζ有している。

本発明の装置における培養槽は、大略円筒状の形状であ
ることが好ましく、その上部にセトリングゾーン、セト
リングゾーンの下部に培養ゾーンが形成され、セトリン
グゾーンと培養ゾーンとはその円筒状において実質的に
同心に位置することが望ましく、またセトリングゾーン
と培養ゾーンとは円心軸に対し同じ面積の円形状の断面
積を有していてもよ（、異なっていても差支えない。

また、本発明の装置は、セトリングゾーンにおける細胞
のセトリングな助長するため。

セトリングゾーン内に細胞のセトリングを助長する手段
を有することができる。その様な手段は、細胞が沈降す
る重力方向の距離を短くするような手段でちり、例えば
重力方向を遮ぎる方向にセトリングゾーン内に設けられ
た沈降板であることができる。

さらに、セトリングゾーン中には、細胞のサスペンジョ
ン培養ゾーン中に形成される培養液の流動の影響を可及
的に小さくする目的で、重力方向に伸びてセトリングゾ
ーンを仕切るじゃま板を設けることもできる。重力方向
に角度を有してセトリングゾーン内に設けられたじゃま
板は沈降板としての機能を発揮することは容易に理解さ
れよう。

本発明の細胞培養装置はサスペンジョン型の細胞培養に
適用されるが、サスペンジョン型とは、水性Ｕ体中で細
胞それ自体が浮遊しながら、或いは細胞を微小担体（マ
イクロキヤ！＋７−）Ｋ担持して浮遊しながら、またマ
イクロカプセル中で細胞が生育されるような種々の浮遊
培養をいう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊させながら
培養する方式に有利に用いられる。

本発明の細胞培養装置において培養される細胞は、植物
λ′３胞、動物細胞、微生物細胞などであってもよく、
また人為的或いは遺伝子操作により変性された細胞例え
ばハイブリドーマであってもよい。殊に本発明の培養装
置は、動物細胞の培養に適している。

本発明におけるサスペンジョン型の細胞培養槽中におい
ては、培会しようとする細胞が培養液中に浮遊した状態
で培養される。培養液は実質的に水よりなる水性媒体に
、種々の無機塩、ビタミン顛、捕酵素、ブドウ糖、アミ
ノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される添加成
分が加えられている。また培養液には血清を加えること
もできるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液と
して使用することも出来る。

本発明の培養装置を用いて細胞を潅流培養する本発明方
法は、セトリングゾーンの上部から細胞を実質的に含ま
ない培養液を排出しそしてサスペンジョン培養ゾーンへ
新しい培養液を導入することによって有利に実施される
。

以下本発明の装置および方法について更に詳細に説明す
る。

添付した図面は、本発明の装置およびそれに付随した酸
素キャリアーの供給装置の概略図の一例を示したもので
ある。

図面において培養槽本体Ａは大略円筒状の形状をしてお
り、新しい培養液の供給導管を通じて培養液の供給口１
が備えられ、酸素を溶解した酸素キャリアーを供給する
ための供給口４が設けまた培養槽内の圧力を一定圧力に
維持するための均圧管３が設けられている。

培養槽Ａにおいて、酸素キャリアーの供給口より上部に
セトリングゾーンが位置しＣは細胞の重力沈降を容易な
らしめるための整流装置であり、その整流装置は図面の
如く、縦形の仕切板であることができる。

さらにセトリングゾーンの上部には古い培養液の排出口
２が設けられ、ポンプＰ−２を通じて培養槽外へ培養液
を排出するようになっている。

図は培養槽Ａの底部に攪拌翼Ｂが設置され、それを回転
させることによって、細胞をサスペンジョン状態に維持
することもできる。しかし前述したように、酸素キャリ
アーをその供給口から供給することによって、それが培
養ゾーン中を落下し、かくして攪拌効果が生じるので、
攪拌翼Ｂによる攪拌は行なわなくてよい場合もある。

図において、セトリングゾーンの内部では、細胞が重力
方向へ沈降し、細胞を実質的に含む古い培養液が上部に
存在するように設計されている。

セトリングゾーンは、その中における培養液の線速度が
、細胞の沈降速度よりも遅く且つ培養槽内のサスペンジ
ョン液の攪拌が及ばない領域が確保されていればよく、
その形状および構造に限定を受けない。

さら罠培養装置には、酸素、二酸化炭素や栄養素の濃度
、ｐＨの値を測定し、それらを成る範囲に維持する装置
が一般に設置されているが、本発明の細胞培養槽にもこ
れらの装置が備えられてもよいことは言うまでもない。

しかし添付図面にはこれらの付属装置は省略されている
。

本発明の方法を実施するに当って、新しい培養液は、こ
の中とブドウ糖、蛋白質の如き栄養源９種々のアミノ酸
、無機塩、抗生物實なとの細胞培養に必要な成分を水溶
液とし℃含むものが使用されるが、さらに血清を含んで
いてもよく、また含んでいなくてもよい。

かかる新しい培養液は、サスペンジョン培養ゾーンへの
培養液供給口から、例えば図２に示すように培養槽中の
培養ゾーンに設けられた培養液供給口から供給される。

またサスペンジョン液中へ直接導管を通じて供給しても
よい。

かく（−て本発明においては、細胞を培養槽中でサスペ
ンジョン状態で培養する方法であって、 （ｉ）　　該培養槽中の任意の位置から、培養液よりも
比重が大きく且つ酸素を溶解した液状の酸素キャリアー
を供給し、 印　核培養槽の底部から該酸素キャリアを培養槽外へ泡
り出し、 ｔｌｎ＋　　前記培養槽における液状の酸素キャリアー
の供給位置よりも上部に、細胞の沈降を許容するに充分
なセトリングゾーンを設け、ｌｖ）　　ＦＪセトリング
ゾーンよりも下部にサスペンジョン培養ノーンを設け、 （Ｖ）　　該培養＜ｄにおける液状の酸素そヤリ７−の
供給位置よりも下部の任意の位置より新しい培養液を供
給し、 ＶＤ　　該セトリングゾーンの上部より細胞を含まない
培養液を培養槽外へ排出する、 ことを特徴とする細胞の培養方法が提供される。

本発明の方法を実施するに当って、新しい培養液の供給
と、古い培養液の排出とは、培養槽中の液面の水準がほ
ぼ一定となるように維持することが望ましいが、必ずし
もその必要はない。新しい培養液の供給と古い培養液の
排出とは、それぞれ独立して、連続的に行なうこともで
きまた間歇的に行なうこともできる。

本発明の培養方法において、サスペンジョン液中の酸素
を供給しその濃度を一定に維持するために、酸素を供給
する方法としては、酸素を溶解した酸素キャリアーを用
いることによって行なわれる。酸素キャリアーとしては
、培養液よりも比重が大きく、酸素を溶解し得る液状の
化合物であって、殊に水と笑質的に混合しないものが使
用されろ。その例としては人工血液の素材物が使用され
、その例としては、人工血液の素材として使用されるよ
うな種々のフルオロカーボンが帛げられる。

かようなフルオロカーボンな酸素供給手段として使用す
る場合には、酸ｆ：ｆｔ溶博させたフルオロカーボンを
培養ゾーン中の上部から液滴状または薄膜状で添加すれ
ばよい。

本発明の培養方法を実施するに当っては。

培養槽の有効培養容積間に対して新しい培参夜？供給す
る割合（新しい培養液の供給量／Ｖ）は１日当り０．２
〜１０．好ましくは０．５〜５の範囲とするのが適当で
ある。

か（して本発明によれば、細胞のサスペンジョン培Ｉに
おいて、生細胞を含まない古い培養液ｋｌ＋２！単と分
離することができ、また細胞破壊片も古い培養液と共に
サスペンジョン液から除去できる。また本発明の装置は
構造が簡単であり、その操作が煩雑でなく工業的装置と
して適している。殊に細胞の大豆培養、高密度培養に有
利である。

以下実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例 実験装置 実験装置の概略図を添付図面て示す。培養ｍＡの内径は
５０．ダ高さは２６０輔のガラス製であり底部に電磁回
転攪拌翼、頂部に）・二カム状のステンレス製整流銭傭
が装着されている。

培養槽Ａには培養液供給口１．培養液取出口２．均圧管
３．酸素キャリヤー供給口４゜酸素キャリヤー取り出し
口５が取付けである。

均圧管３は滅菌フィルターＦ経由大気と通じている。

また槽内には図に示すように底部に電Ｉａ攪拌によるテ
フａ７！ｌ！攪拌翼Ｂ、上部にハニカム状のステンレス
類の整流装置ｃが取付けである。

つ素吸収塔りは第１図に示すような構造のガラス製の塔
であ）。吸収塔りの内項底部には酸素キャリヤー供給口
６および酸濃含をガス供給ロアが、吸収塔の外項上部に
はガス排出口８が、また外項底部には酸素キャリヤー取
り出し口９が増付けである。ガス排出口８は滅菌フィル
タＥ経由大気に開放され１いる。

実験装置は３７℃の恒温室にさらに培養槽および吸収塔
は３７℃の恒温槽中に設置した。

培養条件 細胞；マウス　ヒト／・イブリドーマＨ−２株マウスミ
エローマＰ３Ｕ１ｍとヒトＢセル三融合して得られたハ
イブリ（−マであり、下記培地による静置培養の最高到
達細胞密度は０．８〜１．Ｉ　Ｘ　１０’ｃｃｌｌｓ　
／　ｗｓｌである。

培地； 基礎培地として、ＲＰＭ１１６４０培地とハム−１２培
地とダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１で混合し
たものを用い、増殖因子として次のものを加えた。

あらかじめオートクレーブ滅菌しである培養に０．４５
μフイルター２濾過滅菌済の酸素キャリヤーとして米国
３Ｍ社製のフルオロカーボン、フロリナー）ＦＣ−７７
１００１ｊおよび培地３７０ｄを吸収塔ＤＫＦＣ−７７
を２００ｊｌｊ仕込んだ。

ポンプＰ−３を駆動し、ＦＣ−７７を培養槽は供給した
。培養槽底部のＦＣ−７７のレベルが槽底から約５０．
の位置で一定になるように、ＦＣ−７７のオーバーフレ
ー位置Ｇ点を固定した。

ポンプＰ−２を駆動し、培地を連続的に一定流量で取出
した。培養槽内の培養液の液面が整流装置Ｃの上部２０
．で一定になるようにポンプＰ−１経由新培地を供給す
べく液面調節計をセットした。

以上の操作が可能であることを確認したのちポンプＰ−
１、Ｐ−２、Ｐ−３を停止した。

Ｈ２株を細胞密度が０．７　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ　
／　ｄになるよ５に無菌的に培養槽Ａに播種し、攪拌な
開始し回転速度を４　Ｏｒ−ｐ−ｍに設定した。

培養槽中の溶存！！２索ｄ度が３　ｐｐｍになるように
溶存酸素一度調節計ＤＯＣを設定し、ノズル７経由空気
を吸収塔に吹込みを開始して。

溶存酸素は自動フン）ａ−ルを開始した。

培養開始２日経過後、ポンプＰ−２を駆動し５００　＊
／　ｄａｙで培養液の取出しを開始した。培養槽の液位
が一定になるように新境地がポンプＰ−１経由送入され
ることを確認した。

以上の定常操作に入ったのち細胞の堆層の状況から判断
してポンプＰ−２０流景を変更した。また培養開始後、
６日目からポンプＰ−３の駆動時間が長くなったので酸
素含有ガスを空気から酸素に切り換えた。

培養開始後、１０日間培養を行った。その結果を第１表
に示した。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、本発明の培養装置およびそれに付随してい
る酸素キャリヤー供給装置の概略図の一例を示すもので
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）培養槽中の任意の位置から、培養液よりも比
   重が大きく且つ酸素が溶解した液状の 酸素キャリアーを供給するための供給口、 （ｂ）該培養槽の底部から該酸素キャリアーを取り出す
   ための取り出し口、 （ｃ）前記培養槽における液状の酸素キャリアーの供給
   位置よりも上部に設置された細胞 の沈降を許容するに充分なセトリングゾー ン、 （ｄ）該セトリングゾーンよりも下部に設けられたサス
   ペンジョン培養ゾーン、 （ｅ）該培養槽における液状の酸素キャリアーの供給位
   置より下部に設けられた新しい培 養液の供給口、 （ｆ）該セトリングゾーンの上部に設けられた細胞を含
   まない培養液を培養槽外へ排出す るための排出口 を有することを特徴とする細胞のサスペンジョン培養の
   ための培養装置。 ２、細胞を培養槽中でサスペンジョン状態で培養する方
   法であつて、 （ｉ）該培養槽中の任意の位置から、培養液よりも比重
   が大きく且つ酸素を溶解した液状 の酸素キャリアーを供給し、 （ｉｉ）該培養槽の底部から該酸素キャリアを培養槽外
   へ取り出し、 （ｉｉｉ）前記培養槽における液状の酸素キャリアーの
   供給位置よりも上部に、細胞の沈降を 許容するに充分なセトリングゾーンを設け、（ｉｖ）該
   セトリングゾーンよりも下部にサスペンジョン培養ゾー
   ンを設け、 （ｖ）該培養槽における液状の酸素キャリアーの供給位
   置よりも下部の任意の位置より新 しい培養液を供給し、 （ｖｉ）該セトリングゾーンの上部より細胞を含まない
   培養液を培養槽外へ排出する、 ことを特徴とする細胞の培養方法。