JPS62289169A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （ａ）産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための装置に関するもの
である。更に詳しくは細胞をサスペンジョン状態で培養
するための装置に関するものである。

細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン。

インターフェロンの如き抗ウィルス削成いはホルモンの
如き生物薬品の製造にとって重要で必る。

更に近年特定タンパク貿などを標的とするモノクローナ
ル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマによるハイブ
リトーマの培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。

（ｂ）従来技術 従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管、培養びんなど
を用いて実験至的規模で行なわれている。

一方近年細胞の培養法及びそのための装置として、いく
つかの提案がなされている。これらの提案は、大きく分
けて付着培養（ａｎｃｈｏｒａｑｅ　ｄｅｐｅｎ−ｄｅ
ｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ）と浮遊培養、つまりザスペンシ
ョン培ｉ　（ＳＩＪＳｐｅｎＳｉＯｎ　ＣＩＪｌｔｌＪ
ｒｅ）との２つの方式に分類されるか、これらの方式は
培養される細胞の特性によっていずれかに決められる。

このうちサスペンジョン培養に関して下記の提案がなさ
れている。例えばマグネテイツクスターラーもしくは機
械的に駆動されるシャフト上の羽根車によって、スピナ
ーフラスコの中に調整された攪拌機能を設けた培養方法
が提案されている（米国特許第２，９５８，５１７号お
よび同第３，６４９，４６５号明細書参照）。

特開昭５７−６５１８０＠公報には、回転可能なシャフ
ト上に支持される少なくとも１枚の比較的大表面積の屈
撓性シートを攪拌機とし、該攪拌機を回転させて該シー
トを波立たせ、それによってヒトの２倍体細胞のような
成る種の虚弱細胞に対し所望の穏やかな攪拌を作り出す
サスペンジョン培養装置が提案されている。

しかし、上記装置による培養方法においては、細胞が一
定量の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比
較的低い密度で停止する。

細胞のサスペンジョン培養において、細胞の生長増殖が
比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細胞を大量に且つ
高密度で培養するために、一般に新しい培養液を培養槽
中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古い培養液を培養
槽外へ排出しながら培養する方式すなわち通常パーヒユ
ージョン方式と言われる方式が提案されている（Ａｎｎ
ｕａｌ　Ｒｅｐｏｒ−ｔｓ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔ
ｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、　ｖｏｌ、６参照）。

この方式を用いて培養するに当って重要なことの１つは
、サスペンジョン液中の生細胞と前記古い培養液とを効
率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培養
槽内の細胞の生育環境を最適条件下に維持することであ
る。ザスペンジョン液から生細胞と古い培養液とを分離
するために種々のフィルターやまた種々の形式が提案さ
れているが、フィルターの口塞りや、装置の構造の煩雑
性などの点で工業的培養装置としてはいずれも満足すべ
きものとは言い離い。

特開昭５９−８２０８３号公報および特開昭６０−９４
８２号公報には、培養装置内に細胞沈澱管を兼ねた培養
上清排出管と新鮮培地添加用の導管を設け、該導管から
培地を添加し同時に上記排出管から培口上清を排出しつ
つ培養を行うようにした浮遊細胞の高濃度培養装置が提
案されている。

一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし数１０ミ
クロンと小さくしかもその比重は培地の比重と大きな差
がないため、浮遊細胞と培地とを重力によって分離する
上記の如き装置では、細胞沈降を有利に達成するために
沈降面積を大きくする必要があるが上記２件の特開昭に
開示された装置では沈降面積を必まり大きくとることは
できない。

（Ｃ）発明の目的 そこで本発明の目的は、簡単な構造でザスペンション培
養液から生細胞と培養液とを分離することが可能な装置
を提供することにおる。

本発明の仙の目的は、フィルターなどを使用しなくとも
生細胞と古い培養液とを分離することが可能な装置およ
び方法、従ってフィルターの口塞りなどによる問題の発
生を解消した装置を提供することにおる。

本発明のさらに他の目的は、細胞沈降を有利に達成する
ための沈降面積を非常に大きくとることのできる工業的
に有利なサスペンジョン培養のための装置を提供するこ
とにある。

本発明の更に他の目的は、サスペンジョン培養において
しばしば問題となる死細胞およびその破壊片を培養槽外
へ容易に除去可能な装置を提供することにおる。

本発明の更に他の目的は、細胞の大量且つ同密度の培養
に適したパーヒユージョン方式による工業的装置を提供
することにおる。

更に伯の目的および利点は、以下の説明から明らかとな
るであろう。

（ｄ）発明の構成および効果 すなわら、本発明者の研究によれば、前記した本発明の
目的および利点は、培養ユニットの少なくとも２個を含
み、培養液の供給口を有するサスペンジョン培養のため
の細胞培養装置でおって、該培養ユニットは細胞のザス
ペンション培養ゾーン、細胞のセトリングゾーンおよび
該セトリングゾーンの上部からの培養液の排出口よりな
り、該培養ユニットにおいて該サスペンジョン培養ゾ−
ンと該セトリングゾーンとは該セトリングゾーンの下方
部位を通じて連絡するように仕切りによって仕切られて
おり、該セトリングゾーンは該培養ユニットの外側壁と
該仕切りの間に形成されている構造を有し、各培養ユニ
ットは培養液の流通が許容しくｑるように縦方向に重ね
られていることを特徴とする細胞培養装置によって達成
される。

かかる本発明の細胞培養装置は、培養ユニットの２個以
上、好ましくは２〜１０、特に好ましくは２〜５個が縦
方向に培養液が流通し得るように重ねられた構造を有し
ている。そしてこの培養ユニットは細胞のサスペンジョ
ン培養ゾーン、細胞のセトリングゾーンおよび該セトリ
ングゾーンの上部からの培養液の排出口よりなり、該培
養ユニットにおいて該サスペンジョン培養ゾーンと該セ
トリングゾーンとは該セトリングゾーンの下方部位を通
じて連絡するように仕切りによって仕切られており、該
セトリングゾーンは該培養ユニットの外側壁と該仕切り
の間に形成されている構造を有している。

かかる本発明の培養装置では、培養ユニットに設置され
たセトリングゾーンにおいて、生細胞は重ノＪ方向の下
部へ沈降し、古い培養液や細胞破壊片などはセトリング
ゾーンの上部に分離されることになるのでセトリングゾ
ーンの上部に設けられた培養液の排出口から生細胞を実
質的に含まない培養液を排出することができる。また本
発明の装置は培養ユニットを２個以上任意に重ねて構成
されているので、培養の実質容積に対し、比較的大きい
セトリングゾーンの容積を設置することが容易であり、
また必要により培養ユニットを増減して培養規模を変化
させることができる。

さらに本発明は、口塞りの原因となるフィルターを使用
することなく、簡単な方式によって生細胞と培養液を効
率よく分離することを可能とするので、細胞の人聞且つ
同密度培養に有利に適用することができる。

本発明の培養装置における培養ユニットは、細胞をザス
ペンドさせて実質的な細胞培養を実施する区域と規定で
きる細胞のサスペンジョン培養ゾーンおよび細胞を重力
によって培養液から分離する区域と規定できる細胞のセ
トリングゾーンを有している。細胞のサスペンジョン培
養ゾーンと細胞のセトリングゾーンとは、細胞培養槽内
において該セトリングゾーンの下方部位を通じて連絡す
るように仕切りによって仕切られている。このような構
造を有するため、細胞のセトリングゾーンにおいて、沈
降しそして培養液から分離された細胞は該セトリングゾ
ーンの下方部位を通じて細胞のサスペンジョン培養ゾー
ンに再び導入され、その区域で再び培養される。

本発明の装置において、培養槽内の該セトリングゾーン
は、該培養装置の外側壁と上記仕切りの間に形成されて
いる。このような構造によって、培養装置内でセトリン
グゾーンの有効なセトリング容積を比較的大きくとるこ
とのできる利点かある。

本発明の装置は、各培養ユニットのセトリングゾーンに
おいて細胞と分離された古い培養液を排出するための培
ｆｓ液排出口および培養装置へ新しい培養液を供給する
ための培養液供給口を上記培養装置の任意の個所に１個
所以上有している。かかる供給口は装置内の上部に設け
ることが望ましい。

本発明の培養ユニットにおいて、該セトリングゾーンは
、好ましくは、該ナスペンション培養ゾーンの周囲に該
サスペンジョン培養ゾーンを取囲むように装置側壁と該
仕切りとの間に形成されている。この好ましい態様にお
いて、例えば該ナスペンション培養ゾーンと該セトリン
グゾーンは円筒状仕切りによって仕切られている。この
場合、ざらに好ましくは、該円筒状仕切りと対向する側
壁の実質的部分が円筒状であり、そして上記円筒状仕切
りと上記円筒状槽側壁とが実質的に同心に位置している
。

また、本発明の培養ユニットは、セトリングゾーンにお
ける細胞のセトリングを助長するため、セトリングゾー
ン内に細胞のセトリングを助長する手段を有することが
できる。その様な手段は、細胞が沈降する重力方向の距
離を短くするような手段であり、例えば重力方向を遮ぎ
る方向にセトリングゾーン内に設けられた沈降板である
ことができる。

ざらに、セトリングゾーン中には、細胞のサスペンジョ
ン培養ゾーン中に形成される培養液の流動の影響を可及
的に小さくする目的で、重力方向に伸びてセトリングゾ
ーンを仕切るじゃま板を設けることもできる。車力方向
に角度を有してセトリングゾーン内に設けられたじゃま
板は沈降板としての機能を発揮することは容易に理解さ
れよう。

本発明の培養装置は、細胞のサスペンジョン培養ゾーン
中の培養液を強制的に流動させるだめの手段を備えるこ
とができる。そのようは手段は、例えば培養液中に細胞
を強制的にリスペンドさけるための機械的攪拌手段であ
ることができる。また、培養装置に、酸素含有ガス導入
口、または酸素含有ガス導入口と酸素含有ガス案内筒を
設け、該導入口から導入された酸素含有ガスが上昇する
際の攪拌効果により培養ゾーン中に細胞を強制的にリス
ベンドさせることもできる。

本発明の細胞培養装置はサスペンジョン型の細胞培養に
適用されるが、サスペンジョン型とは、水性媒体中で細
胞それ自体が浮遊しなから、或いは細胞を微少担体（マ
イクロキャリアー）に担持して浮遊しながら、またマイ
クロカプセル中で細胞が生育されるような種々の浮遊培
養をいう。殊に本発明は、細胞自体を浮遊させながら培
養する方式に有利に用いられる。

本発明の細胞培養装置において培養される細胞は、植物
細胞、動物細胞、微生物細胞などでおってもよく、また
人為的或いは遺伝子操作により変性された細胞例えばバ
イプリドーマであってもよい。殊に本発明の培１５装置
は、動物細胞の培養に適している。

本発明におけるサスペンジョン型の細胞培養装置中にお
いては、培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状
態で培養される。培養液は実質的に水よりなる水性媒体
に、種々の無機塩、ビタミン類、補酵素、ブドウ糖、ア
ミノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される添加
成分が加えられている。また培養液には血清を加えるこ
ともできるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液
として使用することもできる。

本発明の培養装置を用いて細胞を）Ｗ流培養する場合に
は、セトリングゾーンから細胞を実質的に含まない培養
液を汲出しそして１外養装置へ新しい培養液を導入する
ことによって有利に実施される。

その際、各培養ユニットにおけるセトリングゾーンによ
って規定される細胞の有効セトリング面積［３（ｃｍ２
　）　］と、サスペンジョン培養ゾーン内の培養液の堆
積［Ｖ　（Ｃｍ３　）　１との比Ｖ　／　Ｓが好ましく
は０．１〜５００ｃｍ　、特に好ましくは１〜１００ｃ
ｍの範囲におる。

以下本発明の装置について図面により更に詳細に説明す
る。

先ず添付した図１〜図３により本発明を説明すると、図
１〜図３はいずれもそれぞれ本”ｆｌ明の装置の概略図
の一例を示したものでおる。

図１にｄ３いて培養装置本体５にはその内壁の内側に隔
壁６によって仕切られたセトリングゾーン７が設けられ
ている。培養装置５には新しい培養液の供給導管１を通
じて培養液の供給口が備えられ、導管３を通じて酸素ま
たは酸素含有ガスが供給されるようになっており、また
排ガスの排出導管４が設けられている。ざらにセトリン
グゾーン７の上部には古い培養液の排出口が設けられ、
導管２−１〜２−４を通じて培養装置外へ培養液を排出
するようになっている。

本発明の装置でいう培養ユニットとは次１においては、
培養装置の縦長方向に直角断面を切った時に、培養液の
排出口２−１から２−２までの占める区域を１つの培養
ユニットということができる。図１においては４つの培
養ユニットを包含している。

図１は培養装置５中に撹拌装置８か設置され、それを回
転させることによって、細胞かリスペンション状態に維
持されている。

一方図２において、１〜８は図１と同じ機能を持った手
段および装置を意味ｌる。図１と異なるのは、培養槽１
の中に案内筒９か説けられ、その案内筒９の下部に酸素
または酸素含有ガスを導管３を介して供給するようにな
っている点である。

粉の案内筒９の下部に酸素または酸素含有ガスを供給す
ることによってサスペンジョン液は案内筒９の内部を下
部から上部へ上昇し、案内筒９の外側では逆に上部から
下部へとサスペンジョン液の移動が起り、全体としてサ
スペンジョン液の攪拌が行なわれる。

図３には、培養槽にフルオロカーボンに溶解させて酸素
を導入する装置の縦断面の概略図が示されている。図３
の装置は、図１の装置等に較べるとフルオロカーボン導
入口３−１から酸素を溶解されたフルオロカーボンが導
入され、下方へ落下する間に培養液と接触して培養液に
酸素を供給し、その後培養槽の下方に貯まり、フルオロ
カーボン排出口４−１から排出される。なお図３におい
て、３−１および４−１を除いて１〜８は図１と同じ手
段および装置を意味している。

上記図１〜図３において、いずれも培養装置の内壁の内
側に隔壁６によって仕切られたセトリングゾーン７が設
けられていて、そのセトリングゾーンには″す゛スペン
ジョン液の攪拌効果は実質的に及ばないようになってい
る。セトリングゾーン７の内部では、細胞が重力方向へ
沈降し、細胞を実質的に含まない生育阻害物質を含む古
い培養液が上部に存在するように設計されている。

セトリングゾーンは、その中における培養液の線速度が
、細胞の沈降速度よりも遅く且つ培養槽内の１ナスペン
シヨン液の攪拌が及ばない領域が確保されていればよく
、その形状および構造に限定を受けない。

図１〜図３の装置は、セトリングゾーン７とサスペンジ
ョン培養ゾーンとが円筒状隔壁６によって仕切られてお
り、該円筒状隔壁６と対向する槽側壁の実施的部分が円
筒状であり、そして上記円筒状隔壁と上記円筒状槽側壁
とが実質的に同心に位置しているものである。

粉の装置における各培養ユニットにおいて、Ｖ／Ｓ　（
ここで、■はサスペンジョン培養ゾーン内の培養液の体
積であり、Ｓは細胞の有効なセトリング面積である）を
算出する基礎となるＳは下記式で表わされる。

π Ｓ＝　−（Ｄ２−ｄ２　＞ ここで、Ｄは円筒状槽側壁部の直径でおり、ｄは円筒状
隔壁６の直径である。また、■は培養槽の容積から、培
養液の存在しない空間部の体積とセトリングゾーンの容
積とを差し引いた体積と理解されるべきである。

さらに培養装置には、酸素、二酸化炭素や栄養素の濃度
、ｐＨの値を測定し、それらを成る範囲に維持する装置
が一般に設置されているが、本発明の細胞培養装置にも
これらの装置が備えられてもよいことは言うまでもない
。しかし添付図面にはこれらの付属装置は省略されてい
る。

本発明の装置を用いて培養を実施するに当って、新しい
培養液は、この中にブドウ糖、蛋白質の如き栄養源、種
々のアミノ酸、無機塩、抗生物質などの細胞培養に必要
な成分を水溶液として含むものが使用されるが、更に血
清を含んでいてもよく、また含んでいなくてもよい。

かかる新しい培養液は、サスペンジョン培養装置への培
養液供給口１から、例えば図１〜図３に示すように培養
装置の上部に設けられた培養液供給口１から供給される
。また（ナスペンション液中へ直接導管を通じて供給し
てもよい。

また本発明の装置を用いて培養を実施するに当って、新
しい培養液の供給と、古い培養液の排出とは、培養装置
中の液面の水準がほぼ一定となるように維持することが
望ましいが、必ずしもその必要はない。新しい培養液の
供給と古い培養液の排出とは、それぞれ独立して、連続
的に行うこともできまた間歇的に行うこともできる。

またサスペンジョン液中の酸素濃度をいっていに維持す
るために、酸素を供給する方法としては、図１および図
２の如く、サスペンジョン液中の酸素または酸素含有カ
スを直接供給してもよく、また他の供給手段によっても
よい。他の供給手段としては、図３の如く例えば酸素キ
ャリアーを用いる方法でおる。酸素キャリアーとしては
、水と実質的に混合しないで酸素を溶解し得る液状の化
合物が使用され、その例としては、人工血液の素材とし
て使用されるような種々のフルオロカーボンが挙げられ
る。かようなフルオロカーボンを酸素供給手段として使
用する場合には、酸素を溶解させたフルオロカーボンを
サスペンジョン液中の上部から液滴状または薄膜状で添
加すればよい。

攪拌方法としては、図１の示した攪拌翼の回転による如
き機械的攪拌方法、また図２に示した案内筒を用いたド
ラフト効果による方法、この他図３に示したお説き酸素
を溶解した酸素キャリアーを用いることにより酸素供給
と攪拌を同時に行なう方法などが挙げられる。もちろん
これら攪拌手段を２つ以上併用することもできる。

また培谷を実施するに当っては、培養槽の有効培養容積
（Ｖ）に対して新しい培養液を供給する割合（新しい培
養液の供給ｆｆｌ／Ｖ）は１日当り０．２〜１０．好ま
しくは０．５〜５の範囲とするのが適当でおる。

かくして本発明の装置は、細胞のリスペンジョン培養に
おいて、生細胞を含まない古い培養液を簡単に分離する
ことができ、また細胞破壊片も古い培養液と共にサスペ
ンジョン液から除去できる。

また本発明の装置は構造が簡単であり、その操作が煩雑
でなく工業的装置として適している。殊に細胞の大量培
養、高密度培養に有利である。

【図面の簡単な説明】

図１〜図３は、いずれも本発明の培養装置のｆ、を略図
の一例を示したものである。 （」２

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 培養ユニットの少なくとも２個を含み、培養液の供給口
   を有するサスペンジョン培養のための細胞培養装置であ
   って、該ユニットは細胞のサスペンジョン培養ゾーン、
   細胞のセトリングゾーンおよび該セトリングゾーンの上
   部からの培養液の排出口よりなり、該培養ユニットにお
   いて該サスペンジョン培養ゾーンと該セトリングゾーン
   とは該セトリングゾーンの下方部位を通じて連絡するよ
   うに仕切りによって仕切られており、該セトリングゾー
   ンは該培養ユニットの外側壁と該仕切りの間に形成され
   ている構造を有し、各培養ユニットは、培養液の流通が
   許容し得るように縦方向に重ねられていることを特徴と
   する細胞培養装置。