JPS62181780A - 動物細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （お　産業上の利用分野 本発明は動物細胞の培養方法に圓するものである。更に
詳しくは、有用物質を産生ずる動物細胞を、高密度で培
養する方法に関するものである。

市）　従来技術 大規模による細胞天吊培養は、例えばウィルス。

ワクチン、インターフェロンなどの抗ウィルス剤、ある
いはホルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に
近年特定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗
体の生産は、抗体産生細胞とミニローマによるハイブリ
ドーマ天吊培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。

従来、細胞の大量培養法及びそのための装置としていく
つかの提案がなされている。しかし、これらの方法では
、特に無血清培地での培養において工業的に十分なほど
高密度には増殖していない。

（０１発明の目的 そこで、本発明者らは従来、サスペンジョン培養におい
て１０Ｇ〜５　ｘ　１０Ｇｃｅｌｌｓ　／ａｄ！程度に
しか増殖できなかった方法を、更に大ω且つ高密度で増
殖させることを目的として研究を進めた結果、本発明に
到達した。

（市　発明の構成及び効果 すなわち、本発明は、動物細胞を培養槽中にて、サスペ
ンジョン状態で且つ、新しい培養液を該培１！Ｉｆｆ中
へ供給すると共に、古い培養液を該培養槽外へ排出して
、高密度で培７５する方法において、該培養を無血清培
地を用い、且つサスペンジョン培養液中にポリビニルピ
ロリドンを存在せしめて行うことを特徴とする動物細胞
の培養方法である。

かかる本発明により、動物細胞を効果的に増殖させるこ
とができ、また高密度で生育することが可能となる。

以下、本発明について更に詳細に説明する。

本発明の細胞培養方法は無血清培地を用い、且つｌ）ス
ペンジョン状態で培養する方法に適用されるが、サスペ
ンジョン状態とは、水性媒体中で細胞それ自他が浮遊し
ながら、或いは細胞を微小担体くマイクロキャリアー）
に担持して浮遊しながらまたマイクロカプセル中で細胞
が生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊に本発明
は、１ａＩＩｌｌ自体を浮遊させながら培養する方式に
有利に用いられる。

本発明の培養方法において、培養する動物細胞としては
、サスペンジョン状態にて増殖可能なものであればよく
、天然の動物細胞のみならず、人為的或いは遺伝子操作
により変性された細胞例えばハイブリドーマであっても
よい。

また細胞としてＩＬ−２−の如きリンホカインを産生ず
るリンパ球由来の細胞であってもよく、インターフェロ
ン（ＩＦＮ）の如き有用な生理活性物質を産生ずる２倍
体ｌ１ｌＩ１１であってもよい。さらに種々のモノクロ
ーナル抗体を産生ずる細胞であってもよく、本発明はか
かるモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドーマの培
養に対してモノクローナル抗体を高い濃度で得る目的の
ために特に適している。

本発明における細胞培養は、パーヒユージョン方式で行
われる。ここで、バーヒユージョン方式とは、一般に新
しい培養液を培養槽中へ供給しつつ、生育阻害物質を含
んだ古い培養液を培養槽外へ排出しながら培養する方式
である。この方式を用いて培養するに当って＠要なこと
の１つは、サスペンジョン液中の生細胞と前記古い培養
液とを効率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出
し、培養槽内の１１Ｗ１の生育環境を最適条件下に維持
することである。また、ここでサスペンジョン液中から
分離され、培養槽外へ取り出された古い培養液は、隙に
よる分離法、或いは吸着による分離法などにより、その
中に含まれる生育阻害物質を除去し、更に必要により産
生された有用物質を分画された後、培養に必要な添加成
分を新たに加えることにより、新しい培養液として再使
用することができる。

本発明におけるサスペンジョン状態の細胞培養において
培養槽中においては、培養しようとする細胞が培養液中
に浮遊した状態で培養される。培養液は所謂無血清培地
であり、実質的に水よりなる水性媒体に、種々の無ｉ塩
、ビタミン類、捕酵素、ブドウ等、アミノ酸、抗生物質
などの通常細胞培養に使用される添加成分、無血清培地
に一般に用いられる増殖因子、及びポリビニルピロリド
ンが加えられている。また、培′Ｗｉ液には血清アルプ
モンやポリグリコールなどの添加物もポリビニルピロリ
ドンと共に加えることができる。

ここで、ポリビニルピロリドンとは、下記式の繰り返し
単位より成る化合物であり、ポリビニルピロリドンは、
これらの単位が１００〜６，０００個繰返されたものが
使用される。本発明で用いられるポリビニルピロリドン
は水に可溶であり、その分子ｍ　ハ、１０，０００〜７
００，０００、好マＬ　＜　ハ４Ｇ、０００〜４００，
０００である。サスペンジョン液中への添加伝は、０．
１〜１０ｇ／皇、好ましくは０．５〜５９７磨加えるの
が有利である。

本発明の培養方法において、サスペンジョン液中の酸素
１１１ｍを一定に維持するために、酸素を供給する方法
としては、サスペンジョン液中へ酸素または酸素含有ガ
スを直接供給してもよい。また他の供給手段によっても
よいが、本発明においては特に、サスペンジョン液中へ
の酸素または酸素含有ガスの直接供給に有効である。他
の供給手段としては、例えば酸素キャリアーを用いる方
法がある。

酸素キャリアーとしては、水と実質的に混合しないで酸
素を溶解し得る液状の化合物が使用され、その例として
は、人工血液の素材として使用されるような種々のフル
オロカーボンが挙げられる。

かようなフルオロカーボンを酸素供給手段として使用す
る場合には、酸素を溶解させたフルオロカーボンをサス
ペンジョン液中の上部から液滴状または薄膜状で添加す
ればよい。

かくして、本発明方法によれば、バーヒユージョン方式
におけるサスペンジョン培養において、生細胞率が上が
り、１０’　ｃｅｌｌｓ　／ｄ以上、好適条件下では５
　ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ　／ｄ以上の高密度で培養す
ることが可能となる。

以下、実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例 （１）培養装置 添付第１図に示す培養システムを使用した。培養槽は図
のように外壁の内側に隔壁によって仕切られたセトリン
グゾーンがもうけられ、その上部には培養液の排出口を
有しており、正味培養容積は約１２０ｄである。

（２）培養液 基礎培地として、ＲＰＭ　１１６４０培地、ハムーＦ１
２培地及びダルベツコ変報イーグル培地を２：１：１で
混合したものにアミノ酸、グルコース等をさらに増強し
たもの（以下、ｅ　−ＲＤＦと称する）を用い、増殖因
子としてインスリン、トランスフェリン、エタノールア
ミン、亜セレンＭ（ＩＴＥＳ）を加えた。インスリンの
添加母は９μ９／ｄ。

トランスフェリンは１０μ９７ｔｄ、エタノールアミン
は１０ｎＭ、亜セレン酸は２０ｎ　Ｍであった。

（３）培養方法及び結果 あらかじめオートクレーブ減菌した前記１８！槽に正味
培養容積が約１２０ｄになるように培養液ａを送入し、
これにマウスミニローマ細＋ａｐａｕｉ株を親株とする
マウスＸヒトハイブリドーマ４１−２−１株を４．８Ｘ
　１０５個／ｄとなるように播種した。この細胞はＩ（
ＪＧ産生株である。培養槽には酸素ガスが（溶存酸素が
３ｐｐ−となるように）吹込みノズルＢを通して自動的
にコントロールされて送入された。培養槽中の培養液は
３７℃に保持された。培養槽中にはマリン型撹拌四が取
付けられており、撹拌速度は６０ｒｐ−であった。

播種後１日問は回分培養を行ない、この後バーヒユージ
ョンを開始した。バーヒユージョンの尺度は正味培養容
積の１日当りの置換率として表わし、実験結果に併記す
る。

以上の培養操作を１３日Ｆｉｌｌ続した。その結果を第
１表に示す。

比較例 培養装置は実施例と同じものを用いた。培養液はポリビ
ニルピロリドンを含まなかった以外は実施例と同様に行
った。培養は１７日間継続した。その結果を第２表に示
す。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、本発明の培養方法を実施する工程の概略図
の１例を示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 動物細胞を培養槽中にて、サスペンジョン状態で、且つ
   新しい培養液を該培養槽中へ供給すると共に、古い培養
   液を該培養槽外へ排出して高密度で培養する方法におい
   て、該培養を無血清培地を用い、且つサンペンジョン培
   養液中にポリビニルピロリドンを存在せしめて行うこと
   を特徴とする動物細胞の培養方法。