JPH03266979A - 細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）産業上の利用分野 本発明は動植物細胞の培養方法に関するものである。更
に詳しくは、細胞をサスペンション状態で培養する方法
において、培養液中に該培養液と実質的に混和しない溶
媒を共存させた場合に培養液中の細胞のロスを低減させ
る方法に関するものである。

（ｂ）従来技術 細胞の培養技術は、例えばウィルス、ワクチン。

モノクローナル抗体、インターフェロンなどの抗ウィル
ス削成いはホルモンなどの生理活性物質の製造にとって
重要である。

従来、細胞培養は一般にシャーレ、試験管、培養びんな
どを用いて実験室的規模で行なわれている。

一方、近年、細胞の大量培養法及びそのための装置とし
て、いくつかの提案がなされている。これらの提案は、
大きく分けて付着培養と浮遊培養との２つの方式に分類
されるが、これらの方式は培養される細胞の特性によっ
ていずれかに決められる。

本発明はサスペンション状態で付着培養又は浮遊培養を
行う方式における改良方法に関する。

一方、細胞の培養においては、通常酸素（０２）の供給
を必要とし、そのためサスペンション液の液面の気相部
から酸素含有ガスを溶解されて供給する方法、又はサス
ペンション液中へ酸素含有カスを吹込んで供給する方法
などがとられている。

しかし、細胞培養を工業的規模、就中の酸素供給方法は
、いずれも不適当である。すなわちサスペンション液面
の自由表面から酸素を供給する場合は、ザスペンション
液量か増大するとそれと共に液表面の面積を増加させる
ことが出来ず、工業的規模では、酸素の供給不足を避け
ることは不可能に近い。

まなサスペンション液中へ酸素含有ガスを吹込んで供給
する場合には、発泡によって液面が上昇し、時には操作
を継続することさえ困難となる。

さらにこの方式は、気泡と接触することによって死滅乃
至増殖活性が弱まる細胞には採用し離いし、また気泡に
よって分離現象が起きる細胞（例えば成る種の植物細胞
）にも同様に用いることは出来ない。

これらの前記方法の欠点を克服する方法として、酸素を
溶解さぜな過フッ素化合物（ＰＥＲＦＬＵＯＲＯＣＨＥ
旧ＣＡＬＳ　）を培養液中に供給することにより酸素の
供給を行なうという方法が提案されている（ＢＩＯ／Ｔ
ＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　Ｖｏｌ、２　　Ｎｏ、１０　　ｐ
７１３−ｐ７２４　１９８９）。

また、過フッ素化合物に限らず、他の非親水性有機溶媒
も水系溶媒系に酸素を供給する方法として有用であるこ
とが知られている（　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢ＋ｏｅｎ
ａ、Ｖｏｌ、１７　ｐ８１５−８２６１９７５）　、し
がし、水と実質的に混和しないこれらの溶媒を水系培養
系に共存させて撹拌培養を行なった場合、水系培養液と
非親水性溶媒とのある程度のエマルジョン化は避けられ
ず、このエマルジョン中に細胞がとり込まれ、水系培養
液中の細胞密度か減少するという欠点かある。この欠点
は水系培養液が無血清培地である場合に特に顕著である
。また、この欠点は非親水性溶媒を酸素供給以外の目的
で水系培養液中に存在させた場合にも同様である。

（Ｃ）発明の目的 本発明の目的は、非親水性溶媒を水系培養液と共存させ
た場合について前記した問題点を解消することにある。

本発明者は培養系中にある種のポリマーを存在せしめる
ことによって細胞のエマルジョンへの取込みが抑制され
ることを発見し本発明に到った。

（ｄ）発明の構成 すなわち、本発明は細胞を培養液及び該培養液と実質的
に混和しない溶媒とからなる培養系中で撹拌培養する際
に、該培養系中にポリビニル系化金物、ポリグリコール
系化合物及びセルロース誘導体から成る群より選ばれた
少なくとも一種の化金物を存在させることを特徴とする
細胞の培養方法である。

かかる本発明によれば、非親水性溶媒を水系培養系に共
存させて撹拌培養を行なった場合にも水系培養液と非親
水性溶媒とのエマルジョンへの細胞の取込みによる細胞
のロスは最少限に抑えられ、動植物細胞を効果的に高密
度で生育させることが可能となる。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の細胞培養方法はサスペンション状態で細胞を培
養する方法に適用されるが、サスペンション状態とは、
水性培養液中で細胞それ自体が浮遊しながら、或いは細
胞か微小担体（マイクロキャリアー）に担持されて浮遊
しながら、またマイクロカプセル中で細胞が生育される
ような種々の浮遊培養をいう。特に本発明は、細胞自体
を浮遊させながら培養する方式に有利に用いられる。ま
た、培養方式はバッチ（回分）、フェトバッチ（半回分
）、パーフュージョン（潅流）方式のいずれにも適用さ
れるが殊にパーフュージョン方式に有利に用いられるに
こで、パーフュージョン方式とは、一般に新しい培養液
を培養槽中へ供給しつつ、生育阻害物質を含んだ古い培
養液を培養槽外へ排出しながら培養する方式である。こ
の方式を用いて培養するに当って重要なことの１つは、
サスペンション液中の生細胞と前記古い培養液とを効率
よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培養槽
内の細胞の生育環境を最適条件下に維′持することであ
る。また、ここでサスペンション液中から分離され、培
養槽外へ取り出された古い培養液は、膜による分離法、
或いは吸着による分離法などにより、その中に含まれる
生育阻害物質を除去し、更に必要により産生された有用
物質を分画された後、培養に必要な添加成分を新たに加
えることにより、新しい培養液としてて再使用すること
かできる。

本発明の培養方法において、培養する細胞は動物細胞、
植物細胞いずれであっても良く天然のものであってもま
た人為的或いは遺伝子操作によって変成された細胞であ
っても良い。本発明は特に動物細胞に有利に適用され、
浮遊性細胞であっても接着性細胞であっても良い。

例えは、細胞としてＩＬ−２−の如きリンホカインを産
生ずるリンパ球由来の細胞であってもよく、インターフ
ェロン（ＩＦＮ）の如き有用な生理活性物質を産生ずる
２倍体細胞であってもよい。

さらに種々のモノクローナル抗体を産生ずる細胞であっ
てもよく、遺伝子導入により生理活性物質を産生ずるよ
うになった細胞でも良い。

サスペンション培養に用いられる培養液は実質的に水よ
りなる水性培養液である。該水性培養液は、動Ｔｈ細胞
の培養に通常使用される各種添加物例えば種々の無機塩
、ビタミン類、補酵素、ブドウ等、アミノ酸、抗生物質
、成長促進因子などを含有している。

また培養液には血清を加えることもできるか、血清を用
いない所謂無血清培地を培養液として使用することもで
きる。本発明は無血清培地に好適に適用される。

本発明の培養方法において使用される非親水性溶媒とし
ては培養液と実質的に混和せず、細胞の生育を実質的に
阻害しないものなら何でも良い。

かかる溶媒としてはフルオロカーボン、あるいはイソオ
クタン、ヘキサン、ヘプタンなどのパラフィン類などが
挙げられる。これらは単独でも二種以上の混合物でも使
用され得る。本発明においては殊にフルオロカーボンが
好適に使用される。

かかるフルオロカーボンとしては、常温で液体であるも
のか有利であり、市販されているものか広く利用できる
。例えば各種熱媒体、電気絶縁材料として使用されてい
るフルオロカーボン、人工血液として使用されている種
々のフルオロカーボンが使用できる。その具体例として
は、例えば炭素数８以上のパーフルオロアルカン類、パ
ーフルオロシクロアルカン類（例えは、パーフルオロデ
カリン、パーフルオロメチルデカリン、炭素数３〜５の
アルキル置換基を有するパーフルオロアルキルシクロヘ
キサン）、炭素数５〜７のアルキル置換基を有するパー
フルオロアルキルテトラヒドロフラン類、炭素数４〜６
のアルキル置換基を有するパーフルオロアルキルテトラ
ヒドロピラン類パーフルオロアダマンタン類（例えばパ
ーフルオロアダマンタン、パーフルオロメチルアダマン
タン、パーフルオロジメチルアダマンタン、パーフルオ
ロジメチルエチルアダマンタン、パーフルオロジメチル
アダマンタンなど）が挙げられる。前記フルオロカーボ
ンは、種々の基、例えば第３級アミノ基を含有したもの
であってもよい。

これらは一種でも二種以上の混合物でも使用される。さ
らに住友スリーエム■より発売されている種々のフロリ
ナート■（Ｎｕｏｒｉｎｅｒｔ）であってもよい。

前記したフルオロカーボンは単に例示のために挙げたの
であって本発明方法の実施を防げない限り他のフルオロ
カーボンであっても同等差支えない。

本発明において使用される培養系に添加するポリマーと
してはポリビニル系化合物、ポリグリコール系化合物及
びセルロース誘導体から選ばれる化合物が挙げられる。

ポリビニル−系化合物として下記式［Ｉ］で表わされる
化合物が挙げられる。

１ ０ 上記の化合物の具体例として、ポリビニルピロリドン、
ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル（ポリメチ
ルビニルエーテル）等がある。

ポリグリコール系化合物として下記式［Ｉ［］又は［Ｉ
［］で表わされる化合物が挙げられる。またこれらの混
合物、共重合体も使用することができる。

４ 上記化合物の具体例として、ポリエチレングリコール、
ポリプロピレングリコール又はこれらのエーテル、エス
テルが挙げられる。すなわち、ボ１ リエチレングリコールセチルエーテル、ポリエチレング
リコールドデシルエーテル、ポリエチレングリコールノ
ニルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールオレイ
ルエーテル、ポリエチレングリコールステアレート ［ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２０）ｍＯｃｃ、□Ｈ３５］　、ポ
リプロピレングリコールセチルエーテル、ポリプロピレ
ングリコールドデシルエーテル、ポリプロピレングリコ
ールノニルフェニルエーテル等がある。

セルロース誘導体は、セルロース中の水酸基の少なくと
も一部に−ＯＲ，で表わされる置換基が結合したもので
Ｒ５として炭素数１〜３のアルキル基、しドロキシエチ
ル基［ＣＨ２ＣＨ２０Ｈ］などが挙げられる。尚−０Ｒ
５はセルロース中のすべての水酸基に結合している必要
はなく一部でもよい。

上記に記載の培養系添加用ポリマーの分子量の範囲は特
に制限はないが、一般に１００〜ｓ、ｏｏｏ、ｏｏｏの
ものが用いられる。

２ 培養液中への添加濃度は０．００１　ｇ　／　１〜１０
０ｇ／！　好ましくは０．１ｗ／ｌ〜１０ｙ／１加える
の有利である。

（ｅ）発明の効果 かくして、本発明方法によれは動植物細胞を培養する系
において、水性培養液と実質的に混和しない溶媒を培養
系中に共存させて撹拌培養を行ない際に水と溶媒とのエ
マルジョンへの細胞の巻込みが最小限に抑制され、細胞
を高密度に増殖維持することが可能となる。

（１）実施例 以下、実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例１ 培養系のモデル実験として以下のような実験を行なった
。

（１）実験方法 プラスチック製遠心管（Ｃ０ＲＮＩＮＧ　　２５３１９
．１５ｍ１　）にポリビニルピロリドンに３０（和光純
薬、ＭＷ４０．０００）　　０．１％（Ｗ／Ｗ）及びマ
ウス・ヒトハイブリドーマＸ８７株Ｉ　Ｘ　１０６ｃｅ
ｌｌｓ／　ｍｌを含む培養液４３ ｍｌを入れ、これにフルオロカーボン（３Ｍ社製フロリ
ナートＦＣ−１０）１ｍｌを加え、天地を逆にし、元に
戻すことを繰り返し撹拌した。撹拌後培養液層中の生細
胞密度を計数し、以下の式により細胞保存率を算出した
。

撹拌後生細胞密度（Ｃｅｌ　Ｉｓ／ｍｌ　）細胞保存率
（％）　−ｘＩＱＯ 撹拌後生細胞密度（Ｃｅｌ　Ｉｓ／ｍｌ）比較としてポ
リビニルピロリドンを含まない培養液を用いて同様に実
験を行なった。培養液は以下に示すもの（ＩＲＥＳ　−
ｅＲＤＦ）を用いた。

（培養ｉ） 基礎培地として、ＲＰＭ１１６４０培地、ハムーＦ１２
培地及びダルベツコ変報イーグル培地を２：１：１で混
合したものにアミノ酸、グリコース等をさらに増強した
もの（以下、ｅ−ＲＤＦと称する）を用い、増殖因子と
してインスリン、トランスフェリン、エタノールアミン
、亜セレン酸（ＩＴＥＳ）を加えた。インスリンの添加
量は９μｇ／ｍｌ。

トランスフェリンは１０．ｕ　ｇ　／　ｍｌ　、エタノ
ールアミ４ ンは１０μｍ、亜セレン酸は２０ｎＨであった。

（２）実験結果 撹拌回数と細胞保存率の関係を第１表に示す。

第１表 撹拌回数と細胞保存率 細胞：マウス−ヒトハイブリドーマＸ８７株培地：　Ｉ
ＴＥＳ−ｅＲＤＦ　＋０．１％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピ
ロリドンに３０及びＩＴＥＳ−ｅＲＤＦ拌回数全回数０
回とした以外は実施例１と同様に実験を行なった。実験
結果を第２表に示す。

第２表　ポリビニルピロリドンの濃度の影響細胞：マウ
ス−ヒトハイブリドーマＸ８７株培地：　ＩＴＥＳ−ｅ
ＲＤＦ　十〇　〜０．５％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリ
ドンに３０ 実施例２ ポリビニルピロリドンの濃度を種々に変えて撹　５ 実施例３ 疎水性溶媒の種類を種々に変えて撹拌回数を１００回と
した以外は実施例１と同様に実験を行なった。実験結果
を第３表に示す。

６ 第３表 溶媒種類の影響 細胞：マウス−ヒトハイブリドーマＸ８７株培地：　Ｉ
ＴＥＳ−ｅＲＤＦ　＋０．１％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピ
ロリドンＫ　３０　１ＴＥＳ−ｅＲＤＦ第４表　添加ポ
リマーの影響 細胞：マウス−ヒトパイプリドーマＸ８７株培地：　Ｉ
ＴＥＳ−ｅＲＤＦ　＋０．１Ｘ（ｗ／ｖ）添加物実施例
４ 添加ポリマーを種々に変えて撹拌回数を１００回とした
以外は実施例１と同様に実験を行なった。

実験結果を第４表に示す。

７ 実施例５ 細胞にＢ　ＨＫ株を用い、撹拌回数を１００回とした以
外は実施例１と同様に実験を行なった。実験結果を第５
表に示す。

　８ 第５表　ＢＨＫ株の保存率 細胞：　ＢＨＫ株 培地：　ＩＴＥＳ−ｅＲＤＦ　＋０．１％（ｗ／ｖ）ポ
リビニルピロリドンに３０及びＩＴＥＳ−ｅＲＤＦ実施
例６ （実験装置） 本実験用いた装置のフローチャートを第１図に示す。培
養装置としては内筒外径９０胴φ、外筒内径１３０１Ｉ
ＩＩＩＩφのガラス製重力沈降型潅流培養槽を用いた。

正味の培養容積（細胞が存在する部分の容積）は約１．
６１であった。培養槽にはテフロン製のパドル型撹拌翼
が設けられている。酸素を含有したフルオロカーボンは
培養槽上部より液適状で供給した。フルオロカーボンは
培養液と分離して培養槽槽底に溜る。このフルオロカー
ボンをポン１つ プにより酸素吸収塔へ送入した。酸素を吸収したフルオ
ロカーボンは吸収塔の内筒から溢流して倍層槽に流入し
循環使用された。

（細　胞） マウス・ヒト・ハイブリドーマＸ８７株を用いた。

（培　地） Ｉ　ＴＥ　Ｓ　−ｅ　ＲＤ　Ｆ　＋０．１％（Ｖ＋／Ｖ
）ポリビニルピロリドンに３０を用いた。

（培養方法） ３７℃の恒温水槽中に設置された培養槽に濾過滅菌した
フルオロカーホン（３Ｍ社製、フロリナートＥＣ−４０
）を仕込み、槽底に溜ったフルオロカーボンをポンプで
酸素吸収塔へ送液した。酸素吸収塔からフルオロカーボ
ンか溢流して培養槽に還留している状態になった時点で
、培養槽底部のフルオロカーボンの自由表面か培養槽内
筒の下端から約１■下の位置になるようにフルオロカー
ボンの仕込み量を調整した。フルオロカーボン送液ポン
プを停止し、濾過滅菌した培地を培養槽に仕込んだ。次
いでＣＯ２インキュベーターで静置培養０ してられた細胞を播種し、撹拌速度３０ｒｐｍで撹拌を
行った。溶存酸素コントローラーとフルオロカーボン送
液ポンプを連動し、コントロール点を３ｐｐｎ＋に設定
した。培養初期には酸素吸収塔に５％ＣＯ２含有空気を
通気したが、酸素消費か激しくなった時点で純酸素に切
り換えた。実験データに記載した条件で、細胞と分離さ
れた培養液を沈降ゾーン（培養槽の外筒と内筒で囲まれ
た部分）から培養系外に取り出した。同時に培養槽の液
位が一定になるように新培地を送入することによって潅
流培養を行った。

培地潅流速度は１．６１／ｄａｙで開始し、細胞密度の
増加に従って３．２ｆ　／ｄａｙまで増加さぜな。

（実験結果） 培養結果を第６表に示す。

第６表　実施例６培養経過 （比較例） 培地にポリビニルピロリドンを含まないＩＴＥＳ−ｅＲ
ＤＦを用いた以外は実施例６と同様に行なった。

１ ２ （培養結果） 培養結果を第７表に示す。

第７表 比較例培養経過

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例で使用した培養装置の概略図を示す。 ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）細胞を培養液及び該培養液と実質的に混和しない溶
   媒とからなる培養系中で撹拌培養する際に、該培養系中
   にポリビニル系化合物、ポリグリコール系化合物及び、
   セルロース誘導体から成る群より選ばれた少なくとも一
   種の化合物を存在させることを特徴とする細胞の培養方
   法。 ２）培養液が実質的に血清を含まない無血清培地である
   請求項１記載の培養方法。