EA016451B1 - Способ суспензионного культивирования клеток - Google Patents

Способ суспензионного культивирования клеток Download PDF

Info

Publication number
EA016451B1
EA016451B1 EA200900188A EA200900188A EA016451B1 EA 016451 B1 EA016451 B1 EA 016451B1 EA 200900188 A EA200900188 A EA 200900188A EA 200900188 A EA200900188 A EA 200900188A EA 016451 B1 EA016451 B1 EA 016451B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
cell culture
biological substance
reactor
cell
Prior art date
Application number
EA200900188A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200900188A1 (ru
Inventor
Гербен Мейле Зейлстра
Роберт Патрик Хоф
Якоб Схилдер
Original Assignee
ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38441437&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA016451(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. filed Critical ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Publication of EA200900188A1 publication Critical patent/EA200900188A1/ru
Publication of EA016451B1 publication Critical patent/EA016451B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/08—Hollow fibre membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/28—Constructional details, e.g. recesses, hinges disposable or single use
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение касается способа культивирования клеток, предпочтительно Е1-иммортализованных HER клеток, более предпочтительно клеток PER.C6, в реакторе в виде суспензии в культуральной среде, где клетки продуцируют биологическое вещество, предпочтительно антитело, где по меньшей мере один компонент культуральной среды добавляется в культуру клеток, где культура клеток, включающая клетки, биологическое вещество и культуральную среду, циркулирует над системой сепарации, где система сепарации отделяет биологическое вещество от веществ, имеющих более низкий молекулярный вес, чем биологическое вещество, и где биологическое вещество остается в реакторе или возвращается в реактор. Предпочтительно часть веществ с более низким молекулярным весом постоянно удаляется из культуры клеток.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается способа культивирования клеток в реакторе в виде суспензии в культуральной среде.
Сведения о предшествующем уровне техники
Такой способ, например, известен из ЭДО 04/099396. В нем описывается, как можно повысить плотность клеток в культуре клеток и выход желаемого биологического материала путем оптимизирования условий роста в способе культивирования с подпиткой.
Более того, ЭДО 05/095578 раскрывает способ культивирования клеток с помощью непрерывной перфузии культуры клеток, включающей культуральную среду и клетки, где культуральная среда добавляется в культуру клеток и где культура клеток циркулирует над фильтрующим модулем, включающим полые волокна, что приводит к оттоку жидкости, имеющей более низкую плотность клеток, чем культура клеток, и где поток через фильтрующий модуль представляет собой переменный тангенциальный поток, где клетки продуцируют биологическое вещество. В примерах ЭДО 05/095578 показано, что производится 0,9 г/л/день продукта, что соответствует концентрации продукта в оттекающей жидкости примерно 0,3 г/л.
Чем больше объем жидкости, содержащей биологическое вещество, тем более трудоемкой становится очистка этого биологического вещества. В способах, которые раскрыты в ЭДО 04/099396 и ЭДО 05/095578, концентрация получаемого биологического вещества является не слишком высокой. Таким образом, последующая переработка такого полученного биологического вещества является обременительной, так как биологическое вещество нуждается в концентрировании перед применением последующих стадий очистки или появляется необходимость очистки биологического вещества из больших объемов менее концентрированного раствора. Кроме того, культивирование клеток при низких плотностях клеток приводит к более низкой объемной продуктивности и, следовательно, требует большего объема и/или большего количества реакторов для культивирования и, таким образом, больших вложений в оборудование для получения заданного уровня продукции.
Сущность изобретения
Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление способа, в котором продукт получают из культуры клеток в более высоких концентрациях.
Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение возможности культивирования клеток и получения биологического материала в течение длительного периода времени.
Эти цели достигаются с помощью способа культивирования клеток в реакторе в виде суспензии в культуральной среде, где клетки продуцируют биологическое вещество, где по меньшей мере один компонент культуральной среды добавляют в культуру клеток и где культура клеток, включающая биологическое вещество и культуру клеток, циркулирует над системой сепарации, и где система сепарации отделяет биологическое вещество от веществ, имеющих более низкий молекулярный вес, чем биологическое вещество, и где биологическое вещество остается в реакторе или возвращается в реактор.
Например, настоящее изобретение касается способа культивирования клеток в реакторе в культуральной среде, где клетки продуцируют биологическое вещество, где питательные вещества и/или культуральная среда добавляется/добавляются в реактор, и где культура клеток, включающая клетки и культуральную среду, циркулирует над фильтром, имеющим размер пор или способным пропускать соединения с молекулярным весом от 5 до 500 кДа.
Было установлено, что при применении системы сепарации, которая отделяет биологическое вещество от веществ, имеющих более низкий молекулярный вес, чем биологическое вещество, биологическое вещество может накапливаться в культуре клеток в более высоких концентрациях.
Таким образом, настоящее изобретение отличается от способов культивирования клеток, описанных в имеющемся уровне техники, тем, что оно обеспечивает накопление желаемого биологического вещества вместе с клеточной массой.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения часть веществ с более низким молекулярным весом постоянно удаляется из культуры клеток.
Дополнительное преимущество способа настоящего изобретения заключается в том, что может быть достигнута более высокая концентрация жизнеспособных клеток по сравнению, например, со способами периодического культивирования или с подпиткой. Более того, время продукции - период времени, за который клетки продуцируют биологическое вещество, - может быть увеличено по сравнению, например, со способами периодического культивирования или с подпиткой. По сравнению со способами периодического культивирования или с подпиткой можно также применять реактор меньшего размера. Применение реактора меньшего размера является преимуществом, поскольку это снижает затраты, связанные с оборудованием и обслуживанием.
Кроме того, более высокие концентрации биологического вещества могут быть получены за более короткое время.
Было установлено, что можно получать высокие концентрации биологического вещества в реакторе без резкого снижения жизнеспособности клеток и, следовательно, без ограничения времени продукции. Квалифицированный специалист в данной области техники должен ожидать, что будет иметь место ин
- 1 016451 гибирование продуктом, т.е. ингибирование продукции биологического вещества самим биологическим веществом или ингибирование другими макромолекулами, продуцируемыми клеткой (такими, например, как белки клетки-хозяина, ферменты или обломки клеток). Более того, было установлено, что накопление желаемого биологического вещества не нарушает работы системы сепарации.
Способ настоящего изобретения предоставляет значительное преимущество в плане плотности клеток, концентрации продукта в культуре клеток и более длительного периода культивирования по сравнению со способами, описанными в \УО 05/095578 и \УО 04/099396. В результате этого способ настоящего изобретения обеспечивает повышенную продукцию желаемого биологического материала.
Клетки, которые могут применяться для продукции биологического вещества, в принципе представляют собой все клетки, известные специалисту в данной области техники, которые обладают способностью продуцировать биологический продукт. Клетки могут быть эукариотическими клетками, например клетками плесневых грибов, например АкрегдШик шдег, АкрегдШик огухас. Тпсйойегта гееке1, РешсШшт сйгукодепит; клетками дрожжей, например 8аесйаготуеек сегеу1К1ае, К1иууеготусек 1асйк, РйаГПа гйойохута; клетками дрожжей из рода Рюй1а, например РюЫа ракЮпк; или прокариотическими клетками, например ЕксйепсЫа сой, ВасШик кр., например В.1юйсшГогш1к, В.киЫШк, В.ату1о11диеГас1епк, В.а1ка1орййик, 81гер1отусек кр., СогупеЬаЫегшт д1и1ат1сит, Ркеийотопак кр. Примеры эукариотических клеток также описаны, например, в Сйи, Ь., КоЬшкоп, Ό.Κ. (2001), Сшт. Оршюп Вю1есйп., уо1. 12, р. 180187. Предпочтительно, чтобы клетки, которые применяются в способе настоящего изобретения, представляли собой клетки животных, в частности клетки млекопитающих. Примеры клеток млекопитающих включают клетки яичников китайского хомячка СНО (СЫпеке Натк1ег Оуагу), гибридомы, клетки почек новорожденных хомячков ВНК (ВаЬу Натк1ег К1йпеу), клетки миеломы, клетки человека, например клетки НЕК-293, клетки лимфобластомы человека, клетки Е1-иммортализованной линии НЕК, клетки мыши, V например клетки N80. Более предпочтительно, применяются клетки Е1-иммортализованной линии клеток НЕК, наиболее предпочтительно клетки РЕК.С6.
Первичные клетки сетчатки эмбрионов человека (НЕК) могут быть выделены из эмбрионов (Вугй Р., Вго\гп К.^., ОаШтоге Р.Н. 1982. Майдпап! (гапкГогтаЕоп оГ йитап етЬгуо ге1шоЬ1ак1к Ьу с1опей айепоуйик 12 ΌΝΑ. №Шге. 298: 69-71, Вугй Р.1., Огапй К.1.А., ОаШтоге Р.Н. 1988. 01ГГегеп(1а1 1гапкГогтаЕоп оГ рптагу йитап етЬгуо ге1та1 се11к Ьу айепоу1гик Е1 гедюпк апй сотЫпайопк оГ Е1А + гак. Опсодепе. 2: 477-484). Первичные клетки погибают при культивировании через несколько пассажей. Е1иммортализованные клетки НЕК для целей настоящего изобретения получают из первичных клеток НЕК с помощью экспрессии в них ДНК, кодирующей аденовирусные белки Е1А и Е1В, для получения иммортализованных клеток. Такие иммортализованные клетки могут культивироваться в течение более чем 100 пассажей. Способы получения Е1-иммортализованных клеток НЕК были описаны, например, в патенте США 5994128 и в работах Вугй Р., Вго\гп К.^., ОаШтоге Р.Н. 1982. Майдпап! йапкГогтайоп оГ йитап етЬгуо гейпоЬ1ак!к Ьу с1опей айепоуйик 12 ^NΑ. №1иге. 298: 69-71, Вугй Р.1., Огапй К.1.А., ОаШтоге Р.Н. 1988. П1ГГегепйа1 1гапкГогтайоп оГ рптагу йитап етЬгуо ге1ша1 се11к Ьу айепоу1гик Е1 гедюпк апй сотЫпайопк оГ Е1А + гак. Опсодепе. 2: 477-484 и ОаШтоге, Р.Н., Огапй, К.1.А. апй Вугй, Р.Т (1986). ТгапкГогтайоп оГ йитап етЬгуо гейпоЬ1ак!к тейй ктиап У1гик 40, айепоу1гик апй гак опсодепек. АпйСапсег Кек. 6, р. 499-508. Например, иммортализованные клетки НЕК, включая клетки РЕК.С1, РЕК.С3, РЕК.С4, РЕК.С5, РЕК.С6, РЕК.С8 и РЕК.С9, были получены путем трансфекции первичных клеток НЕК с прменением плазмиды, которая содержала Е1А- и Е1В-кодирующие последовательности аденовируса серотипа 5 (Ай5) (нуклеотиды 459-3510 Ай5) под контролем промотора фосфоглицераткиназы человека (РОК) (см. патент США 5994128).
В предпочтительном воплощении клетки в способе настоящего изобретения представляют собой Е1-иммортализованные клетки НЕК, более предпочтительно клетки РЕК.С6 (см. патент США 5994128). Клетки РЕК.С6 являются примером клеток, депонированных под номером ЕСАСС №. 96022940 (см., например, патент США 5994128, ЕР 0833934 В1).
В способе настоящего изобретения клетки могут культивироваться в суспензии в любом виде, например как иммобилизованные клетки, одиночные клетки или кластеры клеток или в виде комбинации всех этих вариантов. Предпочтительно клетки культивируются как одиночные клетки и/или как маленькие кластеры клеток, состоящие не более чем из 100 клеток, более предпочтительно не более чем из 20 клеток. Клетки, например, могут быть иммобилизованы на микроносителях, таких как коммерчески доступные носители, например, от ОЕ Неаййсаге (Су1ойех).
Реактор, как здесь определено, представляет собой систему, которая включает культуру клеток, где культура клеток, в свою очередь, включает клетки и культуральную среду. Реактор предпочтительно имеет стерильный барьер, такой как воздушный фильтр, для предотвращения контаминации желательных клеток другими клетками и предпочтительно поддерживает желаемое окружение для клеток путем предоставления правильных условий культивирования, таких как перемешивание, температура, рН, концентрация кислорода и т.д.
- 2 016451
Реактор, например, может иметь постоянную природу, например реактор может быть изготовлен из нержавеющей стали или из стекла, или, например, может иметь одноразовую природу, например реактор может представлять собой пластиковую бутыль или мешок. Примеры реакторов, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают, но ими не ограничиваются, сосуды с перемешиванием, сифоны и одноразовые мешки, содержимое которых может перемешиваться с помощью раскачивания, встряхивания или перемешивания с помощью мешалки. Предпочтительно применяются одноразовые (био)реакторы, поскольку они требуют относительно низких капительных вложений, обладают большой оперативной гибкостью, малым временем окупаемости и легко могут быть приспособлены к способу настоящего изобретения. Одноразовые (био)реакторы коммерчески доступны, например, от Нус1опе, 8атЮтш5, Аррйкоп или \Уауе.
Термин система сепарации в используемом в рамках настоящего изобретения значении определяется как система, способная производить разделение на основе молекулярного веса. Система сепарации, применяемая в способе настоящего изобретения, способна отделять биологическое вещество от веществ, имеющих более низкий молекулярный вес, чем биологическое вещество. Иначе говоря, предел пропускания по молекулярному весу подбирается таким образом, чтобы предел пропускания по молекулярному весу (то1еси1аг \\'еф111 сШ-оГР М\УСО) был меньше, более предпочтительно в 2 раза меньше, наиболее предпочтительно в 3 раза меньше, чем молекулярный вес биологического вещества. Как правило, но конечно в зависимости от молекулярного веса биологического вещества, продуцируемого в способе настоящего изобретения, значение М\УСО системы сепарации составляет предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10, наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 кДа и предпочтительно не более 500 кДа, более предпочтительно не более 300 кДа и наиболее предпочтительно не более 100 кДа. Например, для 1дС с молекулярным весом 150 кДа наиболее предпочтительной является система сепарации со значением М\УСО не более 50 кДа.
Примеры систем сепарации включают, но ими не ограничиваются, фильтры, центрифуги и водные двухфазные системы для экстракции.
Термин фильтр в используемом здесь значении означает все приспособления, способные разделять частицы на основе их размера или молекулярного веса. В принципе, в способе настоящего изобретения может применяться любой фильтр, если размер его пор или значение М\УСО выбрано таким образом, что биологическое вещество отделяется от веществ, имеющих более низкий молекулярный вес, чем биологическое вещество, обычно такой размер пор или значение М\УСО находится в диапазоне от 5 до 500 кДа. Примеры фильтров, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают мембранные фильтры, керамические фильтры и металлические фильтры. Фильтр может применяться в любой форме, например фильтр может иметь спиральную форму (навивку) или трубчатое строение или может применяться в виде плоского листа. Предпочтительно в способе настоящего изобретения применяемый фильтр представляет собой мембранный фильтр, предпочтительно фильтр из полого волокна. Термин полое волокно означает трубчатую мембрану. Внутренний диаметр трубочки составляет по меньшей мере 0,1 мм, более предпочтительно по меньшей мере 0,5 мм, наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,75 мм, и предпочтительно внутренний диаметр трубочки составляет не более 10 мм, предпочтительно не более 6 мм, наиболее предпочтительно не более 1 мм. Фильтрующие модули, включающие полое волокно, коммерчески доступны, например, от Оепета1 Е1ес1т1с (ОЕ, бывший Атешйат).
При циркуляции культуры клеток, включающей биологическое вещество, клетки и культуральную среду, над системой сепарации биологическое вещество и клетки остаются в реакторе, и, следовательно, оттекающая жидкость имеет более низкую концентрацию биологического вещества и более низкую плотность клеток, чем культура клеток. Обычно в способе настоящего изобретения оттекающая жидкость не содержит или почти не содержит биологическое вещество и клетки. Обычно оттекающая жидкость будет в основном содержать только компоненты с молекулярным весом, который меньше, чем молекулярный вес биологического вещества. Таким образом, практически все клетки и практически все биологическое вещество обычно остаются в реакторе.
Предпочтительно размер пор или значение М\УСО выбираются таким образом, чтобы размер пор или значение М\УСО фильтра были меньше, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза меньше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 3 раза меньше, чем диаметр или молекулярный вес продукта, что обеспечивает высокую степень удержания продукта. Как правило, но конечно в зависимости от размера или молекулярного веса продукта, т.е. биологического вещества, продуцируемого в способе настоящего изобретения, размер пор или значение М\УСО фильтра составляют предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10, наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 кДа и/или размер пор или значение М\УСО фильтра/мембраны составляют предпочтительно не более 500 кДа, более предпочтительно не более 300 кДа, наиболее предпочтительно не более 100 кДа.
Предел пропускания по молекулярному весу означает, что системой сепарации задерживается по меньшей мере 90% частиц, молекулярный вес которых выше этого значения.
- 3 016451
Циркуляция культуры клеток над системой сепарации, например над фильтром означает, что культура клеток проходит через систему сепарации, например через фильтр, в результате чего обеспечивается как отток жидкости, так и другой поток, содержимое которого остается в реакторе или возвращается в реактор. Поток, содержимое которого остается в реакторе или возвращается в реактор, будет, главным образом, содержать компоненты, молекулярный вес которых, по меньшей мере, равен молекулярному весу биологического вещества или выше него, и, следовательно, указанный поток будет включать больше биологического вещества, чем оттекающая жидкость.
В принципе, это не является критическим, когда в способе настоящего изобретения начинается циркуляция культуры клеток над системой сепарации. Циркуляция культуры клеток может начинаться, например, сразу с начала культивирования или когда плотность жизнеспособных клеток достигнет определенного уровня.
Циркуляция культуры клеток над фильтром может происходить в направлении, практически перпендикулярном по отношению к поверхности фильтра, что также известно под названием тупиковой фильтрации, или поток может быть практически параллельным поверхности фильтра, что также известно как тангенциальный поток, например однонаправленный тангенциальный поток (ТЕЕ) или перекрестный поток. Предпочтительным примером перекрестного потока является переменный тангенциальный поток (АТЕ), так как было показано, что при АТЕ не происходит (быстрого) засорения фильтра даже при очень высоких плотностях клеток. Хорошо известно, что при глубокой фильтрации необходимо, чтобы последний фильтр с малым размером пор был защищен от засорения с помощью предварительных грубых фильтров. Это мнение основывается на распространенном представлении о том, что фильтры с более мелкими порами или с более низкими значениями МАСО легче засоряются, ограничивая, таким образом, время производства. Если исподбзуется АТЕ, то применение предварительных фильтров становится ненужным.
Поток может создаваться движением культуры клеток, движением фильтра или и тем и другим. Фильтр, например, может вращаться (вращающийся фильтр) или вибрировать (вибрирующий фильтр). Альтернативно этому, если поток создается только движением культуры клеток, то фильтр остается неподвижным, а культура клеток может, например, приводиться в движение с помощью насосов или давления.
Термин переменный тангенциальный поток означает, что имеет место один поток в том же направлении (т. е. тангенциально к), что и поверхность фильтра (фильтров), и этот поток движется вперед и назад, и имеет место другой поток в направлении, по существу перпендикулярном к указанной поверхности фильтра. Переменный тангенциальный поток может быть получен с помощью способов, известных специалистам в данной области техники (например, как описано в патенте США 6544424).
При культивировании клеток по меньшей мере один компонент культуральной среды, например одно или более питательное вещество и/или культуральная среда, может добавляться к клеткам. В способе согласно настоящему изобретению преимуществом является частичное восполнение или предпочтительно полное восполнение по меньшей мере одного из истощаемых питательных веществ путем добавления этого питательного вещества или этих питательных веществ в реактор. Например, в реактор может добавляться полная культуральная среда, что является дополнительным преимуществом, поскольку нет необходимости готовить отдельную подпитку для среды. Культуральная среда, например, может добавляться к клеткам в более концентрированном виде, что является преимуществом, так как с небольшими объемами легче работать. Кроме того, в реактор также может добавляться одно или более питательное вещество. Например, в реактор могут добавляться углеводы, например глюкоза или фруктоза, аминокислоты, такие как глутамин, и/или пептиды.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения условия для культуры клеток выбираются таким образом, чтобы скорость роста клеток и/или удельная продуктивность клеток не лимитировались, и более предпочтительно таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного из компонентов культуральной среды оставалась практически постоянной. Примерами условий, лимитирующих культуру клеток, являются истощение питательных веществ и накопление ингибирующих метаболитов, таких как аммиак, углекислый газ и лактат. Например, условия культуры клеток, такие как подпитка, могут выбираться таким образом, чтобы скорость роста клеток не лимитировалась, например, с помощью поступления достаточного количества питательных веществ для того, чтобы скомпенсировать их истощение и/или чтобы избежать продукцию ингибирующих метаболитов, таких как лактат или аммиак. Например, условия аэрации могут выбираться таким образом, чтобы образование углекислого газа не лимитировало скорость роста клеток. Выращивание клеток в нелимитирующих условиях является крайне выгодным с точки зрения правил организации производства и контроля качества (Сооб МапиГасФгшд Ргаейсе, СМР), поскольку 1) это может обеспечивать постоянное окружение культуры клеток, что во многих случаях также обеспечивает постоянное и хорошее качество продукта; и 2) это может обеспечить высокую жизнеспособность клеток, в некоторых случаях обеспечить жизнеспособность клеток более чем 98%. Высокая жизнеспособность клеток снижает высвобождение связанных с клетками загрязняющих веществ, таких как клеточные белки, что облегчает очистку продукта. Более того, выращивание клеток в отсутствие лимитирования скорости роста клеток и/или лимитирования удельной продуктивности имеет
- 4 016451 коммерческое преимущество в том, что это позволяет продуцировать больше биологического вещества даже за более короткое время, поскольку в способе настоящего изобретения высокая плотность клеток будет достигаться быстрее.
Удельная продуктивность клеток представляет собой количество данного биологического вещества, продуцируемого на одну клетку в единицу времени, и обычно выражается в пгхклетка-1хдень-1.
Скорость добавления по меньшей мере одного компонента культуральной среды, например питательных веществ и/или культуральной среды к культуре клеток (скорость входящего потока или скорость перфузии) влияет на жизнеспособность и плотность клеток. В способе настоящего изобретения компонент(ы) культуральной среды, такие как питательные вещества и/или культуральная среда, могут добавляться, например путем постоянного вливания, полупостоянного вливания, пошагового вливания или периодического вливания. Предпочтительно, чтобы компонент(ы) среды для культуры клеток, например питательные вещества и/или культуральная среда, добавлялись путем постоянного вливания.
Компонент(ы) культуральной среды, такие как полная культуральная среда и/или питательные вещества, могут, в принципе, добавляться в реактор в любое время в процессе культивирования. Предпочтительно, чтобы подпитка начиналась до того, как субстраты, такие как глутамин и глюкоза, достигнут низких уровней, которые останавливают рост клеток, или до того, как ингибиторные метаболиты, например лактат или аммиак, достигнут таких высоких уровней, которые останавливают рост клеток. С этой точки зрения компонент(ы) культуральной среды, такие как питательные вещества и/или полная культуральная среда, предпочтительно добавляются в реактор с такой скоростью, которая обеспечивает потребность в субстрате.
В одном воплощении настоящего изобретения культуральная среда добавляется со скоростью подпитки согласно формуле (1)
Скорость подпитки=8РК.х (общий объем культуры клеток)х (плотность жизнеспособных клеток), (1) где скорость подпитки выражается в литрах в день;
8РК. представляет собой удельную скорость подпитки (8ресШс Реек Ра1с). т.е. скорость, с которой культуральная среда добавляется к культуре клеток, и выражается как объем среды, добавляемой на одну жизнеспособную клетку в единицу времени;
плотность жизнеспособных клеток представляет собой число жизнеспособных клеток на единицу объема.
Число жизнеспособных клеток может быть определено специалистом в данной области техники, например с помощью окрашивания трипановым синим. Удельная скорость подпитки предпочтительно выбирается между 0,01 и 0,3 нл/клетку/день, более предпочтительно между 0,01 и 0,2 нл/клетку/день.
При выборе скорости подпитки может быть выгодно принять во внимание дополнительные параметры, например, количество глюкозы, которое надо добавлять в культуру, и/или скорость подачи кислорода. Например, для клеток РЕК..С6 скорость подачи культуральной среды и/или питательных веществ предпочтительно выбирается таким образом, чтобы концентрация глюкозы поддерживалась между 3 и 20 ммоль/л, более предпочтительно между 5 и 15 ммоль/л. Предпочтительно, чтобы концентрация глюкозы составляла по меньшей мере 3 ммоль/л, более предпочтительно по меньшей мере 5 ммоль/л и предпочтительно была не более 20 ммоль/л, более предпочтительно не более 15 ммоль/л.
В специальном воплощении настоящего изобретения культура клеток (включающая клетки, биологическое вещество и культуральную среду) удаляется из реактора по меньшей мере один раз и жидкость, например, культуральная среда или питательное вещество, добавляется в реактор для того, чтобы скомпенсировать удаление культуры клеток. Удаление культуры клеток может привести к увеличению времени процесса при высоких плотностях клеток в комбинации с высокой жизнеспособностью клеток, что приводит к более высокой продуктивности. Культура клеток может удаляться постоянно или периодически.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения культура клеток (включающая клетки, культуральную среду и биологическое вещество) удаляется из реактора сразу, как только будет достигнута желаемая плотность клеток, например плотность клеток по меньшей мере 10х106 жизнеспособных клеток/мл, предпочтительно по меньшей мере 20х 106 жизнеспособных клеток/мл, более предпочтительно по меньшей мере 30х106 жизнеспособных клеток/мл, например плотность клеток не более чем 200х 106 жизнеспособных клеток/мл, и жидкость, например культуральная среда или питательное вещество, добавляется в реактор для того, чтобы скомпенсировать удаление культуры клеток. Предпочтительно культура клеток удаляется с такой скоростью, чтобы плотность клеток оставалась в пределах желательного диапазона плотности клеток. Это воплощение настоящего изобретения имеет значительно больше преимуществ по сравнению с обычным способом периодического культивирования или способа с подпиткой, поскольку оно объединяет преимущества способа настоящего изобретения с высокой жизнеспособностью клеток, которая может поддерживаться в течение более длительного времени, что делает возможным обеспечить даже более высокую общую объемную продуктивность. Термин объемная продуктивность означает количество биологического вещества, продуцируемого на единицу объема реактора в единицу времени, и обычно выражается в гхл-1хдень-1. По сравнению с обычным перфузион
- 5 016451 ным процессом это воплощение настоящего изобретения также имеет значительно больше преимуществ, поскольку оно объединяет преимущества способа настоящего изобретения с удалением части культуры клеток, содержащей высокую концентрацию биологического вещества. Высокая концентрация биологического вещества в удаляемой части культуры клеток делает коммерчески выгодным извлечение биологического вещества их этой удаляемой части. В обычном перфузионном процессе с удалением культуры клеток удаляемая культура клеток не содержит достаточного количества биологического вещества для того, чтобы было коммерчески выгодно извлекать это биологическое вещество, и удаляемая часть культуры клеток, таким образом, обычно рассматривается в качестве отходов производства. Следовательно, в этом воплощении настоящего изобретения все продуцируемое биологическое вещество теоретически может извлекаться экономически выгодным, прямым и простым способом.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения условия для культуры клеток подбираются таким образом, чтобы скорость роста клеток и/или удельная продуктивность клеток не лимитировались, более предпочтительно таким образом, чтобы также концентрация по меньшей мере одного из компонентов культуральной среды, такого как глюкоза или глутамин, оставалась постоянной, и культура клеток удаляется по меньшей мере один раз из реактора сразу же после того, как будет достигнута желаемая плотность клеток, и жидкость, например питательные вещества и/или культуральная среда, добавляется в реактор, чтобы скомпенсировать удаление культуры клеток.
Предпочтительно, чтобы скорость оттока жидкости была подобрана таким образом, чтобы она была практически равна скорости добавления по меньшей мере одного компонента культуральной среды, например питательных веществ и/или культуральной среды, минус скорость не обязательного удаления культуры клеток.
Клетки, которые продуцируют биологическое вещество, представляют собой, например, клетки, способные экспрессировать ген, кодирующий биологическое вещество. Клетки, способные экспрессировать ген, кодирующий биологическое вещество, могут, например, быть получены путем трансфекции клеток плазмидой, содержащей ген, кодирующий биологическое вещество, и ген, кодирующий подходящий селективный маркер, например ген, обеспечивающий устойчивость к неомицину (маркерный ген Ыео). Стабильно трансфицированные клетки затем могут отбираться с помощью селективного давления, например, в случае с маркерным геном №о, путем выращивания трансфицированных клеток в присутствии С418 (генерицина) и последующего скринига клеток для поиска клеток, демонстрирующих высокий уровень экспрессии биологического вещества. Способы для получения клонов Е1-иммортализованных клеток НЕЯ, экспрессирующих белок, и способы культивирования таких клеток для продуцирования нужного белка хорошо известны специалистам в данной области техники и могут быть найдены, например, в патенте США И8 6855544.
Биологические вещества, которые могут продуцироваться клетками, например путем экспрессии (рекомбинантного) гена, кодирующего эти вещества, представляют собой, например, (рекомбинантные) белки, в частности рецепторы, ферменты, слитые белки, белки крови, такие как белки каскада свертывания крови, многофункциональные белки, такие как, например, эритропоэтин, вирусные или бактериальные белки, например, для применения в вакцинах, иммуноглобулины, такие как антитела, например 1дС или 1дМ, и т.п.. Предпочтительно клеткой продуцируется белок, более предпочтительно антитело. Предпочтительно биологические вещества, такие как белки или вакцины, продуцируемые клетками, могут применяться как активные ингредиенты в фармацевтических препаратах. В контексте настоящего изобретения термины продукт и биологическое вещество являются взаимозаменяемыми.
В рамках настоящего изобретения фармацевтический препарат означает любой препарат, который может применяться в качестве лекарственного средства, в частности в качестве лекарственного средства для человека. Такое лекарственное средство может, например, применяться для диагностических или профилактических целей, например в качестве вакцины, и/или для терапевтических целей, таких как, например, восполнение уровня фермента или белка, дефицит которого наблюдается у пациента, или в качестве антитела для уничтожения нежелательных клеток. Фармацевтический препарат может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, примеры которых хорошо известны специалистам в данной области техники.
Линия клеток РЕЯ.С6 может применяться для продукции биологического вещества, такого как лишенный Е1 аденовирус (см., например, патент США 6994128; ΝίοΙιοΕ е1 а1., 2002, Ргорадайоп οί абепоу1га1 уесЮгк: ике оГ РЕЯ.С6 се11к. 1п: Сипе1 Ό., Поид1ак 1.Т., ебйогк. Абепоу1га1 уесЮгк Гог депе Гйегару. 8ап Э|едо: Е1кеу1ег. р. 129-167), других вирусов (см., например, \¥О 01/38362) или рекомбинантных белков (см., например, патент США 6855544; Уа11ор еГ а1., 2005, РЕЯ.С6 се11к Гог 111е шапиГасГиге оГ Ыорйагшасеийса1 ргоГешк, Мобет Вюрйагтасеийсак: Оещдп, Эеуе1ортеп1 апб Ор01ш/а0оп. 4 Уо1итек, 779-807, 1бгд КпаЫеш (Ебйог)).
- 6 016451
Примеры белков, которые могут применяться в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях (с коммерческим названием, приведенным в скобках) включают Тепес1ер1аке (ΤΝ Каке™), (рекомбинантный) антигемофилический фактор (КеРас1о™), лимфобластоидный интерферон α-ηΐ (\Уе11Гегоп™). (рекомбинантный) фактор коагуляции Щоуо8еуеп™), Е1апегсер1 (ЕпЬте1™), ТгакЮ/итаЬ (Нетсерйп™), 1пГ11х1таЬ (Кеткабе™), Ρ;·ι1ίνίζι.ιιη;ώ (8упад1к™), ВакШхтаЬ (81ти1ес1™), ОасИ/итаЬ (Ζеηараζ™), КйихЮаЬ (Кйихап™), (рекомбинантный) фактор коагуляции IX (ВепеДх™) и интерферон Ц-1а (Ауопех™).
Примеры вакцин, которые могут применяться в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях, включают изолированные белковые антигены, примеры таких вакцин включают, но ими не ограничиваются, живую пероральную тетравалентную вакцину против ротавируса (Ко1а8Ые1б™), вакцину против бешенства (КапАуей™), вакцину против гриппа и инактивированную вакцину против гепатита А (УАСТА™).
Значение рН, температура, концентрация растворенного кислорода и осмолярность культуральной среды в принципе не являются критическими и зависят от типа выбранных клеток. Предпочтительно значение рН, температура, концентрация растворенного кислорода и осмолярность культуральной среды выбираются таким образом, чтобы это было оптимально для роста и продуктивности клеток. Специалист в данной области техники знает, как подобрать оптимальные значения рН, температуры, концентрации растворенного кислорода и осмолярности для культуры клеток (см., например, XVО 2004/099396). Для способа настоящего изобретения, когда применяются Е1-иммортализованные клетки НЕК, предпочтительно, чтобы значение рН выбиралось между 6,6 и 7,6 и/или температура выбиралась между 30 и 39°С и осмолярность выбиралась между 260 и 400 мОсм/кг. Для поддержания оптимальных условий культивирования желателен автоматический контроль за условиями процесса. Для оптимизации условий процесса, например для обеспечения остановки роста с целью повысить продуктивность клеток, в процессе культивирования может быть применен сдвиг в условиях культивирования клеток. Это может быть сделано, например, с помощью изменения температуры (такого как с 37 до 32°С), сдвига рН или сдвига осмолярности.
Способ настоящего изобретения в принципе может быть осуществлен на любом типе культуральной среды, пригодной для культивирования клеток. Рекомендации для выбора культуральной среды и условий культивирования клеток хорошо известны и, например, предоставляются в главах 8 и 9 книги Ртекйпеу, К.1. СиЙите оГ ашта1 се11к (а тапиа1 оГ Ьакк 1есйшдие8), 441 ебйюп 2000, νίΕν-Είκκ и в книге Эоу1е, А., СпГГцНк, ЕВ., №\\'е11, Ό.Ο. Се11 &Т155ие сийите: ЕаЬота!оту Ртосебитек. 1993, 1оНп νίΚν & 8опк.
Культуральная среда может, например, включать в качестве компонента культуральной среды источник углеводов, соли, и/или аминокислоты, и/или витамины, и/или липиды, и/или детергенты, и/или буферы, и/или факторы роста, и/или гормоны, и/или цитокины, и/или микроэлементы. Примеры источников углеводов включают глюкозу, фруктозу, галактозу и пируват. Примеры солей включают соли магния, например МдС12-6Н2О, Мд8О4 и Мд8О4-7Н2О, соли железа, например Ре8О4-7Н2О, соли калия, например КН2РО4, КС1; соли натрия, например NаН2РО4, №2НРО4, и соли кальция, например СаС12-2Н2О. Прмеры аминокислот включают все известные протеиногенные аминокислоты, например гистидин, глутамин, треонин, серин, метионин. Примеры витаминов включают аскорбат, биотин, холинхлорид, миоинозитол, Ό-пантотенат, рибофлавин. Примеры липидов включают жирные кислоты, например линолевую кислоту и олеиновую кислоту. Примеры детергентов включают Тетееп® 80 и Р1итошс® Р68. Примеры буферов включают НЕРЕ8 и №-ьС’О3. Примеры факторов роста/гормонов/цитокинов включают ЮР (инсулинподобный фактор роста), гидрокортизон и (рекомбинантный) инсулин. Примеры микроэлементов известны специалисту в данной области техники и включают Ζη, Мд и 8е. Культуральная среда может, например, также включать другие компоненты культуральной среды, например соевый пептон или этаноламин.
Для продукции биологических веществ согласно настоящему изобретению, в частности если биологические вещества предназначены для применения в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях, бессывороточная среда является предпочтительной по сравнению со средой, содержащей источник сыворотки.
Причиной для этого является тот факт, что содержащая сыворотку среда может быть загрязнена вирусами, представлять риск прионовой инфекции и может создавать значительные затруднения в последующей переработке биофармацевтического продукта (т.е. в дальнейшей очистке биологического вещества из культуры клеток). Таким образом, способ настоящего изобретения предпочтительно осуществляется в культуральной среде, которая не включает сыворотку из животного источника, включая человека. Поскольку соединения из источника, являющегося млекопитающим, также представляют риск инфекции, предпочтительно культуральная среда для клеток является свободной от источника, являющегося млекопитающим (т.е. культуральная среда для клеток не включает сыворотку или другие компоненты из источника, являющегося млекопитающим). Более предпочтительно культуральная среда для клеток является свободной от животного источника (т.е. культуральная среда для клеток не включает сыворотки или компонентов из животного источника, включая человека). Примеры бессывороточных питательных
- 7 016451 сред, которые могут применяться для культивирования клеток РЕК.С6, включают коммерчески доступные среды, такие как, например, среды ЕХ Се11™ УРКО (8АЕС), НуО® СПМ4КеДпо™ (НуС1опе), 18 РгоУес СО (1ту1ие хаепЦПс). 293-8ЕМ II (1пуйтодеп).
В предпочтительных воплощениях биологическое вещество, продуцируемое в способе настоящего изобретения, извлекается из того потока, содержимое которого сохраняется или предпочтительно возвращается обратно в реактор, или из культуры клеток, которая удаляется из реактора, или из обоих этих источников. Биологическое вещество (вещества), продуцируемое в способе настоящего изобретения, может дополнительно извлекаться из культуры клеток в ходе так называемой последующей переработки (0о\\'П51геат ртосеззшд) с применением способов, зависящих от природы биологического вещества; такие способы хорошо известны специалисту в данной области техники. Последующая переработка обычно включает несколько стадий очистки в разной комбинации и в разном порядке. Примеры стадий очистки в ходе последующей переработки представляют собой стадии разделения (например, путем аффинной хроматографии, и/или ионообменной хроматографии, и/или экстракцией с водными двухфазными системами, и/или преципитацией, например, сульфатом аммония), стадии концентрирования биологического вещества (например, с помощью ультрафильтрации или диафильтрации), стадии смены буферов и/или стадии удаления неактивных вирусов (например, с помощью фильтрации вирусов, сдвига рН или обработки растворителем и детергентом).
В одном аспекте настоящее изобретение касается культуры клеток, включающей клетки млекопитающих, предпочтительно Е1-иммортализованные клетки НЕК, более предпочтительно клетки РЕК.С6, имеющей плотность жизнеспособных клеток по меньшей мере 50х106 клеток/мл, предпочтительно по меньшей мере 60х106 клеток/мл, в частности, по меньшей мере 90х106 клеток/мл и концентрацию биологического вещества по меньшей мере 5 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 10 г/л, в частности, по меньшей мере 11 г/л. В принципе концентрация биологического вещества может быть такой высокой, какую позволяет обеспечить растворимость биологического вещества. Концентрация жизнеспособных клеток составляет обычно не более 200х106 клеток/мл и предпочтительно находится в диапазоне 80150х 106 клеток/мл.
Плотность жизнеспособных клеток может определяться, например, с помощью окрашивания трипановым синим, например, с применением счетчика клеток, доступного, например, от компании Iииоνаΐ^8 (Себех се11 соиШет).
Клеточная культура означает жидкость, включающую культуральную среду для клеток, клетки и биологическое вещество, при этом жидкость представляет собой результат процесса культивирования клеток в реакторе в культуральной среде для клеток, где клетки продуцируют биологическое вещество.
Далее настоящее изобретение объясняется с помощью следующих примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает плотность жизнеспособных клеток Υ (106хмл-1), отложенную против времени процесса X (дни), для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С1 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 2 показывает концентрацию 1дС в реакторе Ζ (% по сравнению с концентрацией 1дС в способе А) против времени процесса X (дни) для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С1 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 3 показывает плотность жизнеспособных клеток Υ (106хмл-1), отложенную против времени процесса X (дни), для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С2 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 4 показывает концентрацию 1дС в реакторе Ζ (% по сравнению с концентрацией 1дС в способе А) против времени процесса X (дни) для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С2 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 5 показывает плотность жизнеспособных клеток Υ (106хмл-1), отложенную против времени процесса X (дни), для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С3 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 6 показывает концентрацию 1дС в реакторе Ζ (% по сравнению с концентрацией 1дС в способе А3) против времени процесса X (дни) для способов А и С3.
Фиг. 7 показывает общий выход β (% по сравнению с выходом в способе А, на 1 л объема реактора), отложенный против времени процесса X (дни), для способов А, В и С3.
Фиг. 8 показывает количество клеток Υ (106хмл-1), отложенное против времени процесса X (дни), для С4 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 9 показывает концентрацию 1дС в реакторе Ζ (% по сравнению с максимально достигаемой концентрацией 1дС), отложенную против времени процесса X (дни), для способа С4 (одно воплощение способа настоящего изобретения).
- 8 016451
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Примеры
Пример 1. Сравнение между способом периодического культивирования, способом с подпиткой и способом согласно настоящему изобретению.
В этом примере проведение процесса по способу настоящего изобретения сравнивается со способами периодического культивирования и с подпиткой.
Фиг. 1 показывает плотность жизнеспособных клеток Υ (106хмл-1), отложенную против времени процесса X (дни), для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С1 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 2 показывает концентрацию 1дС в реакторе Ζ (% по сравнению с концентрацией 1дС в способе А) против времени процесса X (дни) для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С1 (способ настоящего изобретения).
Все процессы ферментации были проведены с применением контроллера 8атЮтшк ΒίοκΙαΙ В для поддержания температуры 36,5°С, значения рН между 7,2 и 6,8, при ΌΘ 50% насыщения воздуха и при 200 об/мин. Во всех экспериментах применялась одна и та же линия клеток РЕК.С6 (см. \УО 2004/099396), продуцирующая 1дС.
Способ периодического культивирования А.
Способ периодического культивирования был выполнен в сосуде 8аг1опик В5 с рабочим объемом 4 л. Клетки инокулировали до 3х 105 клеток/мл в среду УРКО (8АЕС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина и затем культивировали в течение 17 дней.
Способ с подпиткой В.
Способ с подпиткой был выполнен в сосуде 8аг1опик В5 с рабочим объемом 4 л. Клетки инокулировали до 3х105 клеток/мл в среду УРКО (8АЕС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина. В процессе культивирования добавлялись глюкоза и глутамин, чтобы поддерживать их концентрацию выше 15 и 1 мМ соответственно. Аминокислоты и пептиды добавлялись начиная с 5-го дня для восполнения использованных клетками аминокислот.
Способ настоящего изобретения С1.
Способ настоящего изобретения был выполнен в сосуде Аррйкоп объемом 2 л. Для удержания клеток и продукта 1дС применялась мембрана из полого волокна с пределом пропускания по молекулярному весу (М^СО) 100 кДа, полученная от Сепега1 Е1сс1г1с (СЕ), включенная в модуль АТЕ системы АТЕ-2 (Кейпе Тес11по1оду). Культивирование начинали с 3х105 клеток/мл в среде УРРО (8АЕС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина. Культуральная среда УРКО (8АЕС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина прокачивалась через суспензию культуры клеток при удельной скорости подпитки (8рес1йс Еееб Ка!е, 8ЕК) между 0,05 и 0,2 нл/клетку/день. Самая высокая достигнутая концентрация продукта составила 1,4 г/л.
Способ настоящего изобретения обеспечил повышенные плотности жизнеспособных клеток и повышенные концентрации продукта по сравнению с упомянутыми выше способами культивирования за меньшее время, как можно видеть из фиг. 1 и 2.
Пример 2. Сравнение между способом периодического культивирования, способом с подпиткой и способом согласно настоящему изобретению.
В этом примере способ согласно настоящему изобретению снова сравнивается со способами периодического культивирования и с подпиткой; в способе С2 контролировалось давление СО2 и применялась система сепарации с отсечением 50 кДа.
Фиг. 3 показывает плотность жизнеспособных клеток Υ (106хмл-1), отложенную против времени процесса X (дни), для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С2 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 4 показывает концентрацию 1дС в реакторе Ζ (% по сравнению с концентрацией 1дС в способе А) против времени процесса X (дни) для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С2 (способ настоящего изобретения).
Все процессы ферментации были проведены с применением контроллера 8атЮтшк ΒίοκΙαΙ В для поддержания температуры 36,5°С, значения рН между 7,2 и 6,8, при ЬО 50% насыщения воздуха и при 200 об/мин. Во всех экспериментах применялась одна и та же линия клеток РЕК.С6 (см. \СО 2004/099396), продуцирующая 1дС.
Способ периодического культивирования А.
Способ периодического культивирования был выполнен в сосуде 8аг1опи5 В5 с рабочим объемом 4 л. Клетки инокулировали до 3х 105 клеток/мл в среду УРКО (8АЕС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина и затем культивировали в течение 17 дней.
- 9 016451
Способ с подпиткой В.
Способ с подпиткой был выполнен в сосуде 8аг1опи8 В5 с рабочим объемом 4 л. Клетки инокулировали до 3х105 клеток/мл в среду УРКО (8АРС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина. В процессе культивирования добавлялись глюкоза и глутамин, чтобы поддерживать их концентрацию выше 15 и 1 мМ соответственно. Аминокислоты и пептиды добавлялись начиная с 5-го дня для восполнения использованных клетками аминокислот.
Способ настоящего изобретения С2.
Способ настоящего изобретения был выполнен в сосуде АррРкоп объемом 2 л. Для удержания клеток и продукта 1дС применялась мембрана из полого волокна с пределом пропускания по молекулярному весу (М^СО) 50 кДа (СЕ), включенная в модуль АТР системы АТР-2 (Кейпе Тес11по1оду). Культивирование начинали с 3х105 клеток/мл в среде УРКО (8АРС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина. Культуральная среда УРКО (8АРС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина прокачивалась через суспензию культуры клеток при 8РК между 0,05 и 0,2 нл/клетку/день. Давление СО2 поддерживалось ниже 15%.
Результат.
Как можно видеть из фиг. 3 и 4, способ согласно настоящему изобретению обеспечивает значительно повышенные плотности жизнеспособных клеток и повышенные концентрации продукта (2415% х выход при периодическом культивировании; 690% х выход при способе с подпиткой) за то же самое или более короткое время (100% времени при периодическом культивировании, 81% времени при способе с подпиткой).
Общее увеличение продуктивности в гхл-1хдень-1 способа настоящего изобретения в 23,9 раза выше продуктивности способа периодического культивирования гхл-1 хдень-1 и в 8,5 раз выше продуктивности способа с подпиткой в гхл-1хдень-1. В способе настоящего изобретения С2 было произведено 11,1 г продукта/л. Несмотря на высокую плотность клеток, не наблюдалось засорения задерживающего устройства (фильтра) в течение 17 дней.
Пример 3. Сравнение между способом периодического культивирования, способом с подпиткой и способом согласно настоящему изобретению.
В этом примере осуществление способ настоящего изобретения с удалением культуры клеток снова сравнивается со способами периодического культивирования и с подпиткой: в способе С3 культура клеток удалялась из реактора.
Фиг. 5 показывает плотность жизнеспособных клеток Υ (106хмл-1), отложенную против времени процесса X (дни), для способа А (периодическое культивирование), В (с подпиткой) и С3 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 6 показывает концентрацию 1дС в реакторе Ζ (% по сравнению с концентрацией 1дС в способе А3) против времени процесса X (дни) для способов А и С3.
Фиг. 7 показывает общий выход О (% по сравнению с выходом в способе А, на 1 л объема реактора), отложенный против времени процесса X (дни), для способов А, В и С3.
Все процессы ферментации были проведены с применением контроллера 8аПогш8 Вю81а1 В для поддержания температуры 36,5°С, значения рН между 7,2 и 6,8, при ЬО 50% насыщения воздуха и при 200 об/мин. Во всех экспериментах применялась одна и та же линия клеток РЕК.С6 (см. \УО 2004/099396), продуцирующая 1дС (молекулярный вес примерно 150 кДа).
Способ периодического культивирования А.
Способ периодического культивирования был выполнен в сосуде 8аг1опи8 В5 с рабочим объемом 4 л. Клетки инокулировали до 3х 105 клеток/мл в среду УРКО (8АРС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина и затем культивировали в течение 17 дней.
Способ с подпиткой В.
Способ с подпиткой был выполнен в сосуде 8аг1опи8 В5 с рабочим объемом 4 л. Клетки инокулировали до 3х105 клеток/мл в среду УРКО (8АРС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина. В процессе культивирования добавлялись глюкоза и глутамин, чтобы поддерживать их концентрацию выше 15 и 1 мМ соответственно. Аминокислоты и пептиды добавлялись начиная с 5-го дня для восполнения использованных клетками аминокислот.
Способ настоящего изобретения С3.
Способ настоящего изобретения был выполнен в сосуде АррРкоп объемом 2 л. Для удержания клеток и продукта 1дС применялась мембрана из полого волокна с пределом пропускания по молекулярному весу (М^СО) 100 кДа (СЕ), включенная в модуль АТР системы АТР-2 (Кейпе Тес11по1оду). Культивирование начинали с 3х105 клеток/мл в среде УРКО (8АРС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина. Культуральная среда УРКО (8АРС) с добавлением 6 мМ Ь-глутамина прокачивалась через суспензию культуры клеток при 8РК между 0,05 и 0,2 нл/клетку/день. Культуру клеток удаляли в количестве 10% от рабочего объема в день, когда плотность жизнеспособных клеток была выше 10х106 клеток/мл, и в дальнейшем в количестве 30% от рабочего объема, когда плотность жизнеспособных клеток превышала 30х 106 клеток/мл.
- 10 016451
Результат.
Как можно видеть из фиг. 5, в способе настоящего изобретения быстро достигаются более высокие плотности жизнеспособных клеток. Кроме того, фиг. 5 также показывает, что жизнеспособность клеток может поддерживаться дольше в способе настоящего изобретения, так как процесс С3 поддерживался в рабочем состоянии в течение почти 40 дней, поскольку не наблюдалось засорения задерживающего устройства (фильтра) даже при высоких плотностях клеток.
Фиг. 6 показывает, что в способе настоящего изобретения достигаются гораздо более высокие концентрации продукта, чем концентрация продукта в способе периодического культивирования. Отбираемая из реактора культура клеток в ходе процесса С3 содержала продукт в концентрации, которая составила от 200 до 250% от конечной концентрации продукта в способе периодического культивирования А.
Фиг. 6 показывает, что больше всего продукта образуется в способе настоящего изобретения и что способ настоящего изобретения может поддерживаться в течение более длительного времени, чем способ периодического культивирования А или способ с подпиткой В. На 17-й день общий выход продукта в способе С3 был в 8,1 раза выше общего выхода в способе периодического культивирования (А3) и в 2,1 раза выше выхода в способе с подпиткой (В). Также на 17-й день способ периодического культивирования был завершен. На 21-й день общий выход продукта в способе С3 был в 3 раза выше общего выхода в способе с подпиткой В. На 21-й день способ с подпиткой был завершен. После 39 дней общий выход продукта в способе С3 был в 25 раз выше выхода в способе периодического культивирования А и в 6 раз выше выхода в способе с подпиткой В.
Из этого эксперимента можно заключить, что общий выход желаемого биологического материала в способе согласно настоящему изобретению может быть дополнительно улучшен путем удаления части культуры клеток, когда плотность клеток превышает определенный высокий уровень.
Пример 4. Культивирование и продукция с клетками СНО.
В этом примере способ согласно настоящему изобретению был выполнен с линией клеток СНО, продуцирующей 1дС, и включал снижение температуры для замедления роста клеток.
Фиг. 8 показывает количество клеток Υ (106хмл-1), отложенное против времени процесса X (дни), для С4 (способ настоящего изобретения).
Фиг. 9 показывает концентрацию 1дС в реакторе Ζ (% по сравнению с максимально достигаемой концентрацией 1дС), отложенную против времени процесса X (дни), для способа С4 (одно воплощение способа настоящего изобретения).
Ферментация проводилась с применением контроллера 8айогш5 ΒίοδΙαΙ В для поддержания температуры 36,5°С, значения рН между 7,1 и 6,9, при ИО 40% насыщения воздуха и при 100 об/мин. На 5-й день температура была снижена до 32°С.
Способ настоящего изобретения С4.
Способ настоящего изобретения был выполнен в сосуде Аррйкоп объемом 2 л. Для удержания клеток и продукта применялась мембрана из полого волокна с пределом пропускания по молекулярному весу (МЭДСО) 50 кДа (Сепега1 Е1сс1г1с). включенная в модуль АТР системы АТР-2 (Вейпе Тесйио1оду). Культивирование начинали с 5х106 клеток/мл в культуральной среде МТСМ-49 (Нус1опе). Культуральная среда прокачивалась через суспензию культуры клеток при 8ЕР между 0,1 и 0,4 нл/клетку/день. Давление СО2 поддерживалось ниже 15%.
Результат.
Результаты показывают, что способ настоящего изобретения также работает с применением линии клеток СНО, продуцирующей белок. Достигаемая плотность клеток и концентрации продукта увеличены по сравнению с периодическим культивированием. Результаты также показывают, что в способе настоящего изобретения рост клеток может быть остановлен (например, с помощью снижения температуры), тогда как накопление продукта в культуральной системе продолжается.
Пример 5. Способ настоящего изобретения, выполненный с линией клеток миеломы.
Способ согласно настоящему изобретению также может применяться с линиями клеток миеломы. С этой целью ферментация проводилась с применением контроллера 8айогш5 В1ок1а1 В для поддержания температуры 36,5°С, значения рН между 7,2 и 6,8, при ИО 40% насыщения воздуха и при 100 об/мин. Культивирование клеток начинали с инокуляции клеток миеломы до 3х105 клеток/мл в культуральной среде 8РМ4МаЬ (Нус1опе) в сосуде 8аг1опи5 объемом 5 л. Для удержания клеток и продукта применялась мембрана из полого волокна с пределом пропускания по молекулярному весу (МЭДСО) 30 кДа (Сепега1 Е1ес!пс), включенная в модуль АТР системы АТР-2 (ВеПпе ТесНпо1оду). Культуральная среда 8РМ4МаЬ (Нус1опе) прокачивалась через суспензию культуры клеток при 8ЕВ между 0,1 и 0,4 нл/клетку/день. Давление СО2 поддерживалось ниже 15%.
- 11 016451
Пример 6. Способ настоящего изобретения, выполненный с линией клеток МОСК.
Способ согласно настоящему изобретению также может применяться с линей клеток МОСК. С этой целью ферментация проводилась с применением контроллера ЗаЛопиз Вюз1а1 В для поддержания температуры 36,5°С, значения рН между 7,2 и 6,8, при ΏΘ 40% насыщения воздуха и при 100 об/мин. Культивирование клеток начинали с инокуляции трансформированных клеток МОСК до 3х105 клеток/мл в культуральной среде УР-8ЕМ (1пуйтодеи) в сосуде Зайогшз объемом 5 л. Для удержания клеток и продукта применялась мембрана из полого волокна с пределом пропускания по молекулярному весу (М^СО) 30 кДа (Сеиета1 Е1ес1пс), включенная в модуль ЛТР системы АТР-4 (Кейпе Тесйпо1оду). Культуральная среда УР-8ЕМ ОпуЦгодеп) прокачивалась через суспензию культуры клеток при ЗЕК между 0,1 и 0,4 нл/клетку/день. Давление СО2 поддерживалось ниже 15%.

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ суспензионного культивирования эукариотических клеток в реакторе в культуральной среде, где клетки способны продуцировать желаемое биологическое вещество, кодируемое по меньшей мере одним геном, трансфицированным в клетки, где по меньшей мере один компонент культуральной среды для клеток добавляют в культуру клеток с тем, чтобы восполнить один или более компонентов, истощаемых в процессе культивирования; и где культура клеток, включающая клетки, биологическое вещество и культуральную среду, циркулирует над системой фильтрации с использованием тангенциального потока; и где система фильтрации имеет размер пор, подходящий для отделения желаемого биологического вещества от веществ, имеющих более низкий молекулярный вес, чем желаемое биологическое вещество; причем вытекающий из фильтра поток жидкости, по существу, содержит только компоненты, имеющие более низкий молекулярный вес, чем молекулярный вес желаемого биологического вещества, а биологическое вещество остается в реакторе или возвращается в реактор.
  2. 2. Способ по п.1, где часть веществ с более низким молекулярным весом, чем желаемое биологическое вещество, постоянно удаляют из культуры клеток.
  3. 3. Способ по пп.1, 2, где клетки представляют собой клетки млекопитающих.
  4. 4. Способ по пп.1-3, где желаемое биологическое вещество представляет собой рекомбинантный белок.
  5. 5. Способ по пп.1-3, где желаемое биологическое вещество представляет собой антитело.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где система сепарации представляет собой фильтр.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-5, где система сепарации представляет собой мембранный фильтр.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-5, где система сепарации представляет собой фильтр из полого волокна.
  9. 9. Способ по любому из пп.6-8, где культура клеток циркулирует над фильтром в виде перекрестного потока.
  10. 10. Способ по любому из пп.6-8, где культура клеток циркулирует над фильтром в виде переменного тангенциального потока.
  11. 11. Способ по любому из пп.1-10, где культуру клеток удаляют из реактора по меньшей мере один раз.
  12. 12. Способ по любому из пп.1-10, где культуру клеток удаляют из реактора по меньшей мере один раз и где жидкость и культуральную среду для клеток добавляют в реактор, чтобы скомпенсировать удаление культуры клеток.
  13. 13. Способ по п.12, где условия для культуры клеток подбирают таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного компонента культуральной среды для клеток оставалась постоянной.
  14. 14. Способ по любому из пп.1-13, где истощаемые питательные вещества, по меньшей мере, частично восполняются путем добавления этих питательных веществ в реактор.
  15. 15. Способ по любому из пп.11, 12, где желаемое биологическое вещество извлекают из клеток и/или из культуры клеток.
EA200900188A 2006-07-14 2007-07-04 Способ суспензионного культивирования клеток EA016451B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06014671 2006-07-14
EP07002571 2007-02-06
PCT/EP2007/005915 WO2008006494A1 (en) 2006-07-14 2007-07-04 Improved process for the culturing of cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200900188A1 EA200900188A1 (ru) 2009-06-30
EA016451B1 true EA016451B1 (ru) 2012-05-30

Family

ID=38441437

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200900188A EA016451B1 (ru) 2006-07-14 2007-07-04 Способ суспензионного культивирования клеток
EA201101581A EA201101581A1 (ru) 2006-07-14 2007-07-04 Улучшенный способ культивирования клеток

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201101581A EA201101581A1 (ru) 2006-07-14 2007-07-04 Улучшенный способ культивирования клеток

Country Status (22)

Country Link
US (7) US8119368B2 (ru)
EP (5) EP2634243B2 (ru)
JP (4) JP5092129B2 (ru)
KR (3) KR20120009530A (ru)
CN (2) CN104263700A (ru)
AR (1) AR062072A1 (ru)
AU (1) AU2007272054C1 (ru)
BR (1) BRPI0714347A2 (ru)
CA (1) CA2657040C (ru)
CL (1) CL2007002060A1 (ru)
DK (4) DK2343362T4 (ru)
EA (2) EA016451B1 (ru)
ES (5) ES2625066T3 (ru)
FI (1) FI2343362T4 (ru)
HU (5) HUE034299T2 (ru)
IL (2) IL196322A0 (ru)
MX (2) MX340242B (ru)
PL (5) PL2634242T3 (ru)
PT (5) PT2634243T (ru)
SI (5) SI2634243T1 (ru)
TW (3) TWI413689B (ru)
WO (1) WO2008006494A1 (ru)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1930281A (zh) 2004-03-05 2007-03-14 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于通过连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法
US8585594B2 (en) * 2006-05-24 2013-11-19 Phoenix Biomedical, Inc. Methods of assessing inner surfaces of body lumens or organs
SI2634243T1 (en) 2006-07-14 2018-01-31 Patheon Holdings I B.V. Improved cell culture process
US9109193B2 (en) 2007-07-30 2015-08-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Continuous perfusion bioreactor system
US8623650B2 (en) 2007-10-19 2014-01-07 Viacyte, Inc. Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum
US9238792B2 (en) * 2009-09-15 2016-01-19 E I Du Pont De Nemours And Company Compartmentalized simultaneous saccharification and fermentation of biomass
CA2776461C (en) 2009-10-15 2020-08-25 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles.
BR112012008507B8 (pt) 2009-10-15 2021-05-25 Crucell Holland Bv método para purificar partículas de adenovírus a partir de uma suspensão de célula
WO2012030512A1 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Percivia Llc. Flow-through protein purification process
CN107190034A (zh) 2010-10-05 2017-09-22 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 生产蛋白质的方法
MX344465B (es) 2011-02-10 2016-12-14 Crucell Holland Bv Sistema de separacion de celulas a traves de membrana por presion alternamente neumatica.
ES2560470T3 (es) * 2011-04-29 2016-02-19 Biocon Research Limited Un método para reducir la heterogeneidad de anticuerpos y un proceso de producción de dichos anticuerpos
CN103517919B (zh) 2011-05-13 2016-11-16 欧克塔医药公司 在重组fviii的生产中提高真核细胞生产率的方法
KR101857380B1 (ko) 2011-07-01 2018-05-11 암젠 인크 포유동물 세포 배양
TWI637057B (zh) 2012-11-09 2018-10-01 拜爾沙納有限公司 具交替生物反應器用途之不連續進料批次製程
US9975095B2 (en) 2012-11-29 2018-05-22 Emd Millipore Corporation Container having magnetic impeller assembly with hood
DK2970843T3 (da) * 2013-03-15 2021-11-22 Genzyme Corp Fremgangsmåder til frembringelse af cellebank med høj densitet
DK2976418T3 (da) 2013-03-19 2021-01-11 Cmc Biologics As Fremgangsmåde til fremstilling af et produkt (f.eks. polypeptid) i en kontinuerlig cellekulturfermenteringsproces
SG11201601899TA (en) * 2013-09-16 2016-04-28 Genzyme Corp Methods and systems for processing a cell culture
US10421986B2 (en) 2013-09-30 2019-09-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method for the clarification of high-density crude cell culture harvest
WO2015188009A1 (en) 2014-06-04 2015-12-10 Amgen Inc. Methods for harvesting mammalian cell cultures
AU2015274238B2 (en) * 2014-06-13 2020-11-05 Csl Limited Improved production of recombinant von Willebrand factor in a bioreactor
DK3172317T3 (da) 2014-07-24 2019-07-22 Janssen Vaccines & Prevention Bv Fremgangsmåde til oprensning af poliovirus fra cellekulturer
JP6530171B2 (ja) * 2014-09-09 2019-06-12 旭化成メディカル株式会社 培養産生物の回収方法
EP3423158B1 (en) 2016-02-24 2023-11-15 The Rockefeller University Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for huntington's disease and uses thereof
AU2017249402A1 (en) * 2016-04-12 2018-10-04 Artemis Biosystems, Inc. Perfusion filtration systems
WO2018159847A1 (ja) 2017-03-03 2018-09-07 富士フイルム株式会社 細胞培養装置及び細胞培養方法
IL273549B2 (en) 2017-10-06 2023-10-01 Lonza Ag Automated control of cell culture using Raman spectroscopy
CN118580925A (zh) 2017-10-16 2024-09-03 里珍纳龙药品有限公司 灌注生物反应器及相关使用方法
WO2019084410A1 (en) * 2017-10-26 2019-05-02 Repligen Corporation MICRO-ALTERNATIVE TANGENTIALLY FLOWING INFUSION FILTER, TREATMENT CONTAINER, AND METHODS OF USING THE SAME
EP3724229A1 (en) * 2017-12-11 2020-10-21 Amgen Inc. Continuous manufacturing process for bispecific antibody products
SG11202005782UA (en) 2018-03-08 2020-09-29 Repligen Corp Tangential flow depth filtration systems and methods of filtration using same
CN111868249B (zh) * 2018-03-19 2024-06-18 富士胶片株式会社 生产物的制造方法
CN109157690A (zh) * 2018-06-15 2019-01-08 翁炳焕 猴-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
CN111406105B (zh) * 2018-11-02 2024-08-30 上海药明生物技术有限公司 具有连续收获而无细胞排出的强化灌流细胞培养方法
EP3647405A1 (en) * 2018-11-02 2020-05-06 Microfluidx Cell culture device and method of using the same
CN113924355B (zh) * 2019-05-28 2024-04-02 上海药明生物技术有限公司 用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统
CN114599775A (zh) * 2019-11-07 2022-06-07 默克专利股份公司 用于进行灌注细胞培养的方法和系统
US20210283565A1 (en) 2020-03-10 2021-09-16 Cellares Corporation Systems and methods for cell processing
WO2024072444A1 (en) * 2022-09-26 2024-04-04 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat
US11898127B1 (en) 2022-09-26 2024-02-13 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004099396A1 (en) * 2003-05-09 2004-11-18 Crucell Holland B.V. Cultures of e1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom
US6855544B1 (en) * 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
WO2005095578A1 (en) * 2004-03-05 2005-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4477342A (en) 1982-08-31 1984-10-16 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for controlling ultrafiltration during hemodialysis
US4885166A (en) * 1985-06-11 1989-12-05 Ciba-Geigy Corporation Hybrid interferons
US5286646A (en) * 1985-11-25 1994-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Method for mammalian cell culture
PT84991B (pt) * 1986-06-06 1990-03-08 Genentech Inc Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo
JPH0642905B2 (ja) 1986-06-13 1994-06-08 東レ株式会社 血液透析膜
GB8617646D0 (en) 1986-07-18 1986-08-28 Manchester Inst Science Tech Recovery of biological material
US6022742A (en) * 1986-11-26 2000-02-08 Kopf; Henry B. Culture device and method
US4806484A (en) * 1987-08-07 1989-02-21 Igb Products, Ltd. Perfusion airlift bioreactor
JPH0797982B2 (ja) 1987-09-24 1995-10-25 東洋紡績株式会社 細胞培養装置
US4921792A (en) 1987-11-27 1990-05-01 Miles Inc. Continuous cell dispersion, cultivation and substance recovery process
JPH01243985A (ja) 1988-03-25 1989-09-28 P C C Technol:Kk 植物器官の培養法及びその培養槽
US5595909A (en) 1988-05-23 1997-01-21 Regents Of The University Of Minnesota Filter device
JPH02119772A (ja) * 1988-10-29 1990-05-07 Shimadzu Corp 細胞培養装置
JP2625990B2 (ja) * 1988-11-19 1997-07-02 株式会社島津製作所 細胞培養装置
US5019512A (en) 1989-03-17 1991-05-28 Baxter International Inc. Spin filter for removing substantially cell-free culture medium from suspension cell culture system
JP2690144B2 (ja) * 1989-04-24 1997-12-10 哲哉 峠 膜型細胞培養装置
JPH0793874B2 (ja) * 1989-04-27 1995-10-11 日本碍子株式会社 バイオリアクタ
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
JP2948675B2 (ja) * 1991-03-20 1999-09-13 日本碍子株式会社 発酵液中の有価物を回収するクロスフロー濾過方法
JPH0531332A (ja) * 1991-07-30 1993-02-09 Toto Ltd 微生物の膜分離方法
GB9118664D0 (en) 1991-08-30 1991-10-16 Celltech Ltd Cell culture
JPH07123972A (ja) * 1993-11-01 1995-05-16 Fumio Yamauchi 膜型バイオリアクター
JPH07298871A (ja) * 1994-05-06 1995-11-14 Fumio Yamauchi 膜型バイオリアクター
US6204000B1 (en) 1995-04-28 2001-03-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic methods and gene therapy using reagents derived from the human metastasis suppressor gene KAI1
DK0833934T4 (da) 1995-06-15 2012-11-19 Crucell Holland Bv Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi
US5994728A (en) 1995-11-15 1999-11-30 Matsushita Electronics Corporation Field effect transistor and method for producing the same
JPH1015357A (ja) * 1996-07-01 1998-01-20 Nitto Denko Corp 排水の処理方法
JPH1033671A (ja) * 1996-07-24 1998-02-10 Jms Co Ltd 中空糸型人工肝臓とその灌流及び培養システム
JP3346996B2 (ja) 1996-09-18 2002-11-18 金剛株式会社 免震自立棚
JPH10108666A (ja) * 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器
JPH10108673A (ja) * 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器を用いた動物細胞の培養方法
US6001585A (en) 1997-11-14 1999-12-14 Cellex Biosciences, Inc. Micro hollow fiber bioreactor
US8026096B1 (en) 1998-10-08 2011-09-27 Protein Sciences Corporation In vivo active erythropoietin produced in insect cells
JP4475819B2 (ja) 1999-01-26 2010-06-09 シェーリング−プラウ・リミテッド チャイニーズハムスター卵巣細胞中でのウシコロナウイルスの増殖
ATE536417T1 (de) 1999-04-15 2011-12-15 Crucell Holland Bv Herstellung von rekombinanten proteinen in einer menschlichen zelle mit mindestens einem e1 adenovirus protein
JP2001149099A (ja) 1999-11-26 2001-06-05 Olympus Optical Co Ltd 染色体異常解析のための有核細胞の標本作製方法
EP1103610A1 (en) 1999-11-26 2001-05-30 Introgene B.V. Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
US6168941B1 (en) 2000-04-07 2001-01-02 Genvec, Inc. Method of producing adenoviral vector stocks
JP4138209B2 (ja) 2000-06-29 2008-08-27 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 プラバスタチン含有組成物
JP2002113896A (ja) 2000-10-05 2002-04-16 Seiko Epson Corp 画像形成装置
US6733662B2 (en) * 2001-02-23 2004-05-11 V.A.I. Ltd. Methods and apparatus for biological treatment of waste waters
JP3547715B2 (ja) * 2001-03-06 2004-07-28 榮 新垣 ベクター精製用装置及び方法
US6716354B2 (en) 2001-03-08 2004-04-06 Cdg Technology, Inc. Methods of treating water using combinations of chlorine dioxide, chlorine and ammonia
JP4047176B2 (ja) 2001-04-17 2008-02-13 セーレン株式会社 培地添加剤および動物細胞培養用培地
DE10120835C2 (de) 2001-04-27 2003-04-10 Sifin Inst Fuer Immunpraeparat Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern
DE10120838A1 (de) 2001-04-27 2002-10-31 Basf Ag Stoffmischung zur UV-Stabilisierung von Kunststoffen und Herstellung davon
AU2002333739B2 (en) 2001-08-31 2007-08-02 Bayer Intellectual Property Gmbh A unit and a process for carrying out high cell density fermentation
HU225988B1 (en) 2001-09-05 2008-02-28 Yamasa Corp Use of cytidine-phosphocholine for producing pharmaceutical compositions for diabetic neuropathy
WO2003025158A1 (en) 2001-09-14 2003-03-27 Medcell Biologics, Inc. Oxygen enriched bioreactor and method of culturing cells
GB0123098D0 (en) * 2001-09-26 2001-11-14 Lonza Biologics Plc Use of aminoglycoside resistance gene
WO2003041749A1 (de) 2001-11-15 2003-05-22 Aesculap Ag & Co. Kg Sterilbehälter
JP2003219873A (ja) 2002-01-24 2003-08-05 Japan Science & Technology Corp サケ科キングサーモン由来の不死化細胞
US20030186335A1 (en) 2002-03-28 2003-10-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Monoclonal antibodies, hybridomas, cell isolation method, isolated cells and immunological diagnostic method
US6902909B2 (en) 2002-07-09 2005-06-07 Synthecon, Inc. Methods for efficient production of mammalian recombinant proteins
DE10237082B4 (de) 2002-08-09 2014-12-31 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen
AU2004235017B2 (en) * 2003-05-01 2009-06-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of biological substances by perfusion culturing of suspended animal cells
CA2532754A1 (en) * 2003-07-17 2005-02-03 Global Cell Solutions, Llc Automated cell culture system and process
JP2005041984A (ja) 2003-07-22 2005-02-17 Shin Kobe Electric Mach Co Ltd 水架橋ポリオレフィン製シートの製造法
US20080230488A1 (en) * 2004-03-29 2008-09-25 Pall Corporation Pleated, Crossflow Fluid Treatment Elements, Methods for Making Them, and Methods for Treating Cellular Solutions
EP2843040A1 (en) * 2005-01-05 2015-03-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell culture method and utilization of the same
CN100354408C (zh) * 2005-10-09 2007-12-12 南京工业大学 一种高密度细胞培养方法及其生物反应装置
WO2007070704A2 (en) * 2005-12-17 2007-06-21 Airinspace B.V. Air purification devices
JP5031332B2 (ja) 2006-03-31 2012-09-19 旭化成ホームズ株式会社 線切断具
SI2634243T1 (en) 2006-07-14 2018-01-31 Patheon Holdings I B.V. Improved cell culture process
EP2014760A1 (en) 2007-06-13 2009-01-14 CMC Biopharmaceuticals A/S A method for producing a biopolymer (e.g. polypeptide) in a continuous fermentation process
JP2008308560A (ja) 2007-06-13 2008-12-25 Tohcello Co Ltd 表面防汚性複合フィルムの製造方法
JP5426937B2 (ja) * 2009-06-19 2014-02-26 興和株式会社 光学的反応測定装置および光学的反応測定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6855544B1 (en) * 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
WO2004099396A1 (en) * 2003-05-09 2004-11-18 Crucell Holland B.V. Cultures of e1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom
WO2005095578A1 (en) * 2004-03-05 2005-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JONES D. ET AL.: "High level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6". BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 19, 2003, pages 163-168, XP002256988, ISSN: 8756-7938, the whole document *
JONES D.H. ET AL.: "PER.C6 CELL LINE FOR HUMAN ANTIBODY PRODUCTION CRUCELL'S TECHNOLOGY MAINTAINS HUMAN GLYCOSYLATION PATTERNS". GENETIC ENGINEERING NEWS, MARY ANN LIEBERT, NEW YORK, US, vol. 22, no. 10, 15 May, 2002 (2002-05-15), page 50, 54, XP009018783, ISSN: 1270-6377, the whole document *
MARANGA L. ET AL.: "Metabolism of PER.C6 (TM) cells cultivated under fed-batch conditions at low glucose and glutamine levels". BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY & SONS, HOBOKEN, NJ, US, vol. 94, no. 1, 7 March, 2006 (2006-03-07), pages 139-150, XP002403089, ISSN: 0006-3592, the whole document *
XIE L. ET AL.: "SERUM-FREE SUSPENSION CULTIVATION OF PER.C6 CELLS AND RECOMBINANT ADENOVIRUS PRODUCTION UNDER DIFFERENT PH CONDITIONS". BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY & SONS, HOBOKEN, NJ, US, vol. 80, no. 5, 5 December, 2002 (2002-12-05), pages 569-579, KHR001155285, ISSN: 0006-3592, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
PT2634250T (pt) 2017-07-13
US8222001B2 (en) 2012-07-17
DK2634243T3 (en) 2017-12-11
PL2343362T3 (pl) 2016-11-30
DK2041259T3 (en) 2016-01-25
PT2343362T (pt) 2016-07-13
US20140154745A1 (en) 2014-06-05
EP2343362B2 (en) 2024-04-03
PL2041259T3 (pl) 2016-04-29
WO2008006494A1 (en) 2008-01-17
US9670520B2 (en) 2017-06-06
PL2634250T3 (pl) 2017-09-29
EP2634243A1 (en) 2013-09-04
US9469865B2 (en) 2016-10-18
AU2007272054A1 (en) 2008-01-17
PL2634242T3 (pl) 2017-09-29
HUE035109T2 (en) 2018-05-02
DK2343362T4 (da) 2024-07-08
EP2343362B8 (en) 2016-05-18
TW201341527A (zh) 2013-10-16
KR20090031899A (ko) 2009-03-30
SI2634243T1 (en) 2018-01-31
US20120149063A1 (en) 2012-06-14
CA2657040C (en) 2013-10-01
KR101143796B1 (ko) 2012-05-21
SI2634250T1 (sl) 2017-06-30
US20120064623A1 (en) 2012-03-15
DK2634242T3 (en) 2017-05-22
HUE028365T2 (en) 2016-12-28
JP5092129B2 (ja) 2012-12-05
ES2625062T3 (es) 2017-07-18
EP2634242A1 (en) 2013-09-04
US20160265017A1 (en) 2016-09-15
KR101685246B1 (ko) 2016-12-09
ES2559308T3 (es) 2016-02-11
CN102876628A (zh) 2013-01-16
US20130095527A1 (en) 2013-04-18
ES2579957T3 (es) 2016-08-17
ES2650042T3 (es) 2018-01-16
PT2634243T (pt) 2017-12-18
SI2634242T1 (sl) 2017-07-31
IL196322A0 (en) 2009-09-22
KR20120009530A (ko) 2012-01-31
MX340242B (es) 2016-07-01
US8119368B2 (en) 2012-02-21
ES2625066T3 (es) 2017-07-18
US8440458B2 (en) 2013-05-14
PT2634242T (pt) 2017-07-12
AR062072A1 (es) 2008-10-15
SI2041259T1 (sl) 2016-04-29
TWI512102B (zh) 2015-12-11
TWI627274B (zh) 2018-06-21
CN104263700A (zh) 2015-01-07
SI2343362T1 (sl) 2016-09-30
PT2041259E (pt) 2016-02-15
EP2634243B2 (en) 2024-07-24
HUE028593T2 (en) 2016-12-28
JP5448010B2 (ja) 2014-03-19
CL2007002060A1 (es) 2008-04-18
AU2007272054B2 (en) 2011-09-08
EA201101581A1 (ru) 2012-04-30
JP2012165764A (ja) 2012-09-06
US20120149107A1 (en) 2012-06-14
EP2041259A1 (en) 2009-04-01
BRPI0714347A2 (pt) 2013-05-07
EA200900188A1 (ru) 2009-06-30
TW201604277A (zh) 2016-02-01
AU2007272054C1 (en) 2014-08-28
CA2657040A1 (en) 2008-01-17
KR20130014640A (ko) 2013-02-07
HUE032608T2 (en) 2017-10-30
EP2634250B1 (en) 2017-04-05
HUE034299T2 (en) 2018-02-28
EP2343362A1 (en) 2011-07-13
IL234890A (en) 2016-05-31
EP2634242B1 (en) 2017-04-05
TW200813216A (en) 2008-03-16
EP2634250A1 (en) 2013-09-04
EP2041259B1 (en) 2015-10-14
TWI413689B (zh) 2013-11-01
JP2009543565A (ja) 2009-12-10
US8685731B2 (en) 2014-04-01
FI2343362T4 (fi) 2024-07-04
MX2009000522A (es) 2009-01-27
EP2343362B1 (en) 2016-03-30
US20100075413A1 (en) 2010-03-25
JP2014217395A (ja) 2014-11-20
JP2011067222A (ja) 2011-04-07
DK2343362T3 (en) 2016-07-18
PL2634243T3 (pl) 2018-02-28
EP2634243B1 (en) 2017-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016451B1 (ru) Способ суспензионного культивирования клеток
AU2013204016B2 (en) Improved process for the culturing of cells

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU