CN113924355B - 用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统 - Google Patents

用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，包括：生物反应器，包括：(1)用于接收细胞培养物的罐体，(2)用于将营养物质从进料储器供给所述罐体的端口，(3)用于从所述罐体自动出料的端口，和(4)借助细胞滞留系统从罐体连续收集物料的端口；拉曼光谱分析仪，包括：(i)一个或多个拉曼探头，所述探头被浸入生物反应器中并被配置为在生物反应器中收集拉曼光谱，以及(ii)主机，所述主机被配置为接收由拉曼探头采集和传输的拉曼光谱并将其转换为数值；和与所述拉曼光谱分析仪、进料储器和自动出料装置通信的控制器，该控制器接收来自拉曼光谱分析仪的值并将这些值与预设参数进行比较，基于该比较的结果，该控制器进一步被配置为控制进料储器以对营养物质进入生物反应器的进料速率进行调节，并被配置为控制自动出料装置从生物反应器中自动排放物料。本发明还涉及使用该系统监测和自动控制灌流细胞培养的方法。

Description

用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞 培养系统
优先权信息
本申请要求于2019年5月28日提交的PCT/CN2019/088722的优先权，其全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统。本发明还涉及使用该系统监测和自动控制灌流细胞培养的方法。
背景技术
目前，质量源于设计(QBD)和过程分析技术(PAT)[1][2]的概念已被广泛接受并应用于协助评估过程稳健性、监控和改进过程开发以及药物制造。PAT，尤其是原位和实时监测技术，在开发用于生产具有所需质量属性的产品的稳健而新颖的工艺方面显示出巨大的潜力。其还可以通过方便、大量和连续的测量来帮助进一步了解所述工艺，从而增强传统的离线分析。
诸如近红外(NIR)、中红外(MIR)、拉曼和荧光光谱等光谱方法在生物过程监测和控制方面的进展已有报道[6][7]。在过去几十年中，拉曼光谱技术由于化学特异性高且来自水和样品制备的干扰低，在生物药物的研究和制造中受到了越来越多的关注。作为一种很有前途的PAT工具[8]，浸入式拉曼探头的使用能够有助于实现原位测量并且能够进行实时过程控制。然而，由于灌流装置的复杂性以及无菌性的挑战，原位和实时监测PAT工具很难在灌流细胞培养期间使用。
灌流细胞培养[5]作为一种连续过程的策略，近来得到了很好的确立，并因其更高的产物产量和稳定的PQA(产品质量属性)而受到广泛关注。使用ATF(交替切向流)装置，在不断添加新鲜的营养物质的同时，可以去除诸如乳酸盐、铵离子、溶解的二氧化碳等不期望的副产物和一些其他副产物。通过灌流策略，更高的活细胞密度(VCD)和更高的产率均可在小型生物反应器中就能够实现[6][3]。通常，通过引入细胞出料系统以维持相对稳定状态，灌流过程可在一定的目标细胞密度下进行，同时由于较短的产物停留时间，重组蛋白的稳定性和质量得到了保留。
在最近的FDA关于连续制造的指南中[4]，产品质量问题得到了解决和强调，因此该指南建议使用过程监控和PAT工具以帮助在生产持续过程中生成有关输入物料、过程中物料和最终产物的过程参数和属性的实时信息，这可以为瞬态干扰、过程偏差、主动过程控制、更准确的物料转移和实时释放测试(RTRT)的高可检测性开辟道路。因此，FDA希望在具有改进的开发方法(如QbD和PAT)的药品生产中采用连续制造，以减少药品质量问题，降低生产成本，并改善患者获得高质量药品的机会。然而，如上文所讨论的，由于灌流装置的复杂性和无菌性的挑战，在灌流细胞培养过程中几乎没有使用原位和实时监测PAT工具。迄今为止，灌流细胞培养的过程监测仍主要依靠传统的人工取样和离线/在线检测，这可能导致离线取样后出现长时间的延迟，难以进行必要的纠正措施，增加了批次损失的风险。此外，人工操作会带来更多可能导致污染的人为错误风险。因此，迫切需要用于灌流细胞培养的自动化PAT工具，其能够对灌流细胞培养进行监测和自动控制，从而减少人工操作，为实验室规模和工业规模的自动控制提供原位和实时监测结果。
发明内容
本发明一般涉及用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统。本发明还涉及使用该系统监测和自动控制灌流细胞培养的方法。
在一些方面，本发明涉及用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，包括：
生物反应器，包括：
(1)用于接收细胞培养物的罐体，
(2)用于将营养物质从进料储器供给所述罐体的端口，
(3)用于从所述罐体自动出料的端口，和
(4)借助细胞滞留系统从罐体连续收集物料的端口；
拉曼光谱分析仪，包括：(i)一个或多个拉曼探头，所述探头被浸入生物反应器中并被配置为在生物反应器中收集拉曼光谱，以及(ii)主机，所述主机被配置为接收由一个或多个拉曼探头采集和传输的拉曼光谱并将其转换为生化参数值；和
与所述拉曼光谱分析仪、进料储器和自动出料装置通信的控制器，该控制器被配置为接收来自拉曼光谱分析仪的值并将这些值与预设参数进行比较，并且该控制器进一步被配置为根据比较动作的结果控制进料储器以用于调节营养物质进入生物反应器的进料速率，并被配置为根据比较动作的结果控制自动出料装置从生物反应器中自动排放物料。
在一个实施方案中，所述生物反应器还包括连接到搅拌器的可旋转轴。
在一个实施方案中，在所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统中，所述细胞滞留系统通过用于从罐体连续收集物料的端口连接到生物反应器。所述细胞滞留系统包括但不限于交替切向过滤(ATF)系统、切向流过滤(TFF)系统、内部微滤系统、介电泳系统、声共振系统和重力沉降系统。一种优选的细胞滞留系统是ATF系统。通常，所述ATF系统包括C24控制器、带有聚醚砜(PES)膜的中空纤维柱、真空泵和定制管。在使用中，所述待收获的物料周期性地泵入和泵出所述中空纤维柱，从所述中空纤维的孔隙连续获取所述物料中所含的液体，而物料中所含的细胞则被截留并通过返流再次泵回所述生物反应器。
在一个实施方案中，所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统还包括产物收获储器。在一个优选的实施方案中，所述产物收获储器与细胞滞留系统偶联，并且细胞滞留系统与生物反应器偶联。
在一个实施方案中，所述拉曼光谱分析仪包括多于一个拉曼探头，例如2、3或4个拉曼探头，尤其是浸入式拉曼探头。所述拉曼探头可以相对于彼此测量不同的信号。
在一个实施方案中，所述拉曼探头被配置为在细胞培养物周期性地暴露于光束之后，通过检测生物反应器中散射光的强度来收集生物反应器中的拉曼光谱。
在一个实施方案中，所述拉曼光谱分析仪还包括激光发射模块，其周期性地(例如，15分钟～1小时)向生物反应器中发射激发波长为785nm的激光。同时，为了避免生物反应器外部光线的影响，通常在拉曼光谱检测过程中保护所述生物反应器避开外界光线。例如，所述生物反应器可以用不透光材料制成的遮盖罩遮盖。因此，在一个实施方案中，所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统还可以包括由不透光材料制成的遮盖罩，其中所述遮盖罩被配置为当所述拉曼光谱分析仪的激光发射模块向所述生物反应器定期发射激光以及所述拉曼探头通过检测所述生物反应器中散射光的强度来收集拉曼光谱时遮盖所述生物反应器。在一个实施方案中，所述生物反应器本身是不透光的，例如由不透光材料制成，在这种情况下，在检测拉曼光谱时不需要保护所述生物反应器避开外界光线。
在一个实施方案中，所述收集的拉曼光谱与已经离线检测的各种标准对照测量值进行关联。例如，校准光谱首先由光谱滤波器模块进行预处理，然后通过偏最小二乘(PLS)回归与所述标准对照测量值进行关联。
在一个实施方案中，将所述收集的拉曼光谱与生化指标进行关联，所述生化指标包括但不限于活细胞密度(VCD)、细胞直径、pH、pCO2、pO2、Na+离子和K+离子、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸盐、乳酸盐、铵离子和滴度、渗透压等。
在一个实施方案中，将所述预设参数值预先输入控制器。所述控制器被配置为接收来自拉曼光谱分析仪的生化指标值并将其与预设参数值进行比较。换言之，将从拉曼光谱分析仪输入的生化指标与所述控制器中的预设参数值进行比较。根据比较的结果，所述控制器控制进料储器以调节营养物料进入所述生物反应器的进料速度，并控制自动出料装置从生物反应器中自动出料，以将细胞培养保持在稳定状态。
在一个实施方案中，从所述生物反应器自动排出的物料与当时生物反应器中的物料相同，并且通常包括细胞、产物、代谢物、营养物和一些盐。
在一个实施方案中，所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统用于连续培养动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞，优选动物细胞，例如哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO K1细胞)、杂交瘤、BHK(幼仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞、人细胞(例如HEK-293细胞)、人类淋巴母细胞、E1永生化HER细胞、小鼠细胞(例如NSO细胞和SP/20细胞)。
在一个实施方案中，培养所述细胞以产生目的产物，例如单克隆抗体或重组蛋白等。
在一些方面，本发明涉及通过使用所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统监测和自动控制灌流细胞培养的方法，包括：
(a)在生物反应器中，在起始体积的基础培养基中培养起始量的细胞；
(b)将细胞培养物周期性暴露于光束后，通过一个或多个拉曼探头采集拉曼光谱，并通过主机将采集到的拉曼光谱转化为生化指标；和
(c)基于将生化指标与输入到控制器的相应预设参数值进行比较的结果，通过控制器调节营养物质从进料储器进入生物反应器的进料速率和物料从生物反应器自动出料的速率。
在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括在细胞滞留系统的帮助下从生物反应器连续收获目的细胞产物。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括通过细胞滞留系统基于细胞尺寸将细胞维持在生物反应器中。所述细胞滞留系统包括但不限于交替切向过滤(ATF)系统、切向流过滤(TFF)系统、内部微滤系统、介电泳系统、声共振系统和重力沉降系统。一种优选的细胞滞留系统是ATF系统。通常，所述ATF系统包括C24控制器、带有聚醚砜(PES)膜的中空纤维柱、真空泵和定制管。在使用中，所述待收获的物料周期性地泵入和泵出所述中空纤维柱，从所述中空纤维的孔隙连续获取所述物料中所含的液体，而所述物料中所含的细胞则被截留并通过返流再次泵回所述生物反应器。
在一个实施方案中，当激光发射模块周期性地(例如，15分钟～1小时)向生物反应器发射激发波长为785nm的激光时，拉曼探头通过检测生物反应器中散射光的强度而收集拉曼光谱。在一个实施方案中，所述生物反应器通常在拉曼光谱检测期间避开外界光线，以避免来自生物反应器外部的光的影响。例如，所述生物反应器可以用不透光材料制成的遮盖罩遮盖。在一个实施方案中，生物反应器本身是不透光的，例如由不透光材料制成，在这种情况下，在检测拉曼光谱时不需要保护生物反应器避开外界光线。
在一个实施方案中，所述收集的拉曼光谱与已经离线检测的各种标准对照测量值进行关联。例如，校准光谱首先由光谱滤波器模块进行预处理，然后通过偏最小二乘(PLS)回归与所述标准对照测量值进行关联。
在一个实施方案中，所述收集的拉曼光谱与生化指标相关联，所述生化指标包括但不限于活细胞密度(VCD)、细胞直径、pH、pCO2、pO2、Na+离子和K+离子、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸盐、乳酸盐、铵离子和滴度、渗透压等。
在一个实施方案中，将所述预设参数值预先输入控制器。将从所述拉曼光谱分析仪传输的生化指标与控制器中的预设参数值进行比较。根据比较动作的结果，所述控制器控制进料储器以调节生物反应器中营养物质的进料速度，并且控制自动出料装置从生物反应器中自动出料，以将细胞培养保持在稳定状态。
在一个实施方案中，该方法用于连续培养动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞，优选动物细胞，例如哺乳动物细胞。所述合适的哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO K1细胞)、杂交瘤、BHK(幼仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞、人细胞(例如HEK-293细胞)、人类淋巴母细胞、E1永生化HER细胞、小鼠细胞(例如NSO细胞和SP/20细胞)。
在一个实施方案中，培养所述细胞以产生目的产物，例如单克隆抗体或重组蛋白等。
前述内容为概要，因此必然包含简化、概括和细节的遗漏；因此，本领域的技术人员将理解，所述概要仅是说明性的，并不意欲以任何方式进行限制。本文描述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其他方面、特征和优点将在本文阐述的教导中变得明显。提供所述概要是为了以简化的形式介绍概念的选择，下面的详细描述将进一步介绍这些概念。本概述无意确定要求保护的主题的关键特征或基本特征，也无意用于协助确定要求保护的主题的范围。此外，本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容都将通过引用而整体并入本文。
附图说明
图1是用于VCD反馈控制功能的硬件、软件、网络和通信设施的示意图。
图2是根据本发明的一个实施方案的用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统的示意图。
图3示出了一项灌流实验(FC0B)的拉曼光谱原始数据。
图4(a)-(k)示出了对用于测试集(在FC0A数据上训练、在FC0B数据上测试的模型)的目标离线生化指标的预测。通常，SNV-1D和SNV-2D都是拉曼信号预处理方法，其中任何一种都包括标准正态变换(SNV)和随后的一阶导数或二阶导数。数值范围(即800-1800)代表用于建模而选择的拉曼位移范围，VIP>0.5表示选择拉曼位移范围时变量投影重要性指标(VIP)大于0.5。(a)IgG SNV-1D 800-1800；(b)活力SNV-1D VIP>0.5；(c)谷氨酰胺SNV-1DVIP>0.5；(d)活力SNV-1D VIP>0.5；(e)葡萄糖SNV-2D 800-1800；(f)乳酸盐SNV-1D 600-1700VIP>0.5；(g)NH4 +SNV-1D 800-1600；(h)渗透压SNV-1D 800-1800；(i)Na+SNV-1D 800-3400；(j)K+SNV-2D所有波长；和(k)pCO2SNV-1D VIP>0.5。
图5(a)-(f)示出了基于不同模型的训练集的VCD预测。(a)预处理方法为SNV和一阶导数，数据来源：生物反应器FC0A，从第1天到第50天；(b)预处理方法为SNV和二阶导数，数据来源：生物反应器FC0A，从第1天到第50天；(c)预处理方法为SNV和一阶导数，数据来源：生物反应器FC0B；(d)预处理方法为SNV和二阶导数，数据来源：生物反应器FC0B；(e)预处理方法为SNV和一阶导数，数据来源：生物反应器FC0A(从第1天到第50天)和FC0B；以及(f)预处理方法为SNV和二阶导数，数据来源：生物反应器FC0A(从第1天到第50天)和FC0B。
图6示出了训练集VCD的不同PLS模型的均方根误差。
图7(A)-(B)示出了两种不同拉曼数据预处理方法的霍特林T2范围(Hotelling’sT2-range)：(A)一阶导数，(B)二阶导数(数据来源：FC0A，1-50天)。
图8(a)-(f)示出了对测试集(FC0A，第51-62天)的VCD的预测，每个子图的副标题表示建模方法和校准数据集。(a)SNV-1D FC0A 1-50天；(b)SNV-2D FC0A 1-50天；(c)SNV-1D FC0B；(d)SNV-2D FC0B；(e)SNV-1D FC0A 1-50天和FC0B；(f)SNV-2D FC0A 1-50天和FC0B。
图9示出了不同VCD模型的预测均方根误差(RMSEP)。
图10示出了FC0A中自动控制的VCD和相应的泵送速率，其为培养天数的函数。
图11示出了在大规模培养(60L)中自动控制的VCD和相应的泵送速率，其为培养天数的函数。
具体实施方式
虽然本发明可以以许多不同的形式体现，但这里公开的是其具体说明性实施方案，其举例说明了本发明的原理。需要强调的是，本发明不限于所示的特定实施方案。此外，此处使用的任何章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。
除非本文另有定义，与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。更具体地，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指对象，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及的“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及的“细胞”包括多个细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”表示“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式的使用，例如“包括”和“含有”的使用不是限制性的。此外，在说明书和所附权利要求书中提供的范围包括两个端点以及两个端点之间的所有点。
一般来说，本文所描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交有关的命名法和技术都是该领域中众所周知和常用的。除非另有说明，本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法，以及如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所描述的那样进行。本文所描述的与分析化学、合成有机化学和药物化学的实验室程序和技术有关的命名法是该领域中众所周知和常用的那些。此外，本文中使用的任何章节标题仅用于组织目的，不能被解释为限制所描述的主题。
定义
为了更好地理解本发明，现对相关术语进行定义和解释如下。
术语“灌流细胞培养”是指培养细胞的连续过程。灌流是上游处理，其将细胞保留在生物反应器内，同时不断去除细胞、细胞废物和因细胞代谢而耗尽营养的培养基。向细胞提供新鲜培养基的速率与去除用过的培养基的速率相同。实现灌流最常用的手段是在ATF模式下使用中空纤维过滤。在ATF装置的帮助下，除去不期望的副产物如乳酸盐、铵、溶解的二氧化碳和其他一些副产物，同时不断添加新鲜的营养物质。
如本文所定义的“生物反应器”是包含细胞培养物(即，细胞和用于培养的培养基)的装置。其优选通过提供合适的条件，例如温度、pH、溶解氧浓度、离子浓度、连续搅拌等，为细胞维持有利的环境。其优选提供无菌环境。
通常，所述生物反应器例如可包括发酵罐、搅拌釜反应器、粘附式生物反应器、波型生物反应器、一次性生物反应器等。
拉曼光谱测量组分特有分子键的振动频率的变化。拉曼光谱为更传统的中1R光谱提供了补充信息，同时由于其抗水干扰而在水溶液中具有更多实用性，使其适合于生物反应器的应用。
从联机拉曼探头(拉曼探头偶联能够进行多变量分析(MVA)的主机)收集的拉曼光谱可用于监测生物反应器内的代谢物和细胞浓度。拉曼光谱提供了实时监测生物过程的能力，允许对营养进料实施反馈控制，从而提高产品质量和细胞生产率。
如本文所用的“拉曼光谱分析仪”是指一种装置，其能够通过一个或多个拉曼探头采集生物反应器中的拉曼光谱并将采集的拉曼光谱转化为生化参数值，例如活细胞密度(VCD)、细胞直径、pH、pCO2、pO2、Na+离子和K+离子、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸盐、乳酸盐、铵离子和滴度、渗透压等。
拉曼光谱分析仪通常包括：(i)一个或多个拉曼探头，其浸入生物反应器中并被配置为在生物反应器中收集拉曼光谱，以及(ii)主机，其被配置为接收由拉曼探头收集和传输的拉曼光谱并将其转化为生化参数值。所述拉曼光谱分析仪还包括(iii)激光发射模块，其周期性地(例如15分钟～1小时)向生物反应器发射激发波长为785nm的激光。
如本文所用的“控制器”是指与拉曼光谱分析仪偶联并与进料储器和自动出料装置通信的控制装置。所述控制器接收从拉曼光谱分析仪传输过来的转换后的生化参数值，并将其与预先输入控制器的相应预设参数值进行比较。根据比较动作的结果，控制器自动调节营养物质从进料储器进入生物反应器的进料速率和生物反应器中物料的自动出料速率。
如本文所用的“自动出料”是指与拉曼-灌流细胞培养集成的自动过程控制回路，其能够通过图2所示的出料系统将生物反应器中的活细胞密度控制在目标死区内。
如本文所用的“细胞滞留系统”是指细胞滞留装置，即错流膜过滤器，如ATF系统，通过该装置得到产物收获，同时将细胞根据其大小保持在生物反应器中。
用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统
所述用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统包括：
生物反应器，包括：
(1)用于接收细胞培养物的罐体，
(2)用于将营养物质从进料储器供给罐体的端口，
(3)用于从罐体自动出料的端口，和
(4)借助细胞滞留系统从罐体连续收集物料的端口；
拉曼光谱分析仪，包括：(i)一个或多个拉曼探头，这些探头浸入生物反应器中并被配置为在生物反应器中收集拉曼光谱，以及(ii)主机，其被配置为接收由一个或多个拉曼探头收集和传输的拉曼光谱并将其转化为生化参数值；和
与拉曼光谱分析仪、进料储器和自动出料装置通信的控制器，所述控制器被配置为接收来自拉曼光谱分析仪的值并将它们与预设参数进行比较，以及该控制器进一步被配置为根据比较动作的结果控制进料储器以调节进入生物反应器的营养物质的进料速率，并被配置为根据比较动作的结果控制自动出料装置从生物反应器中自动排出物料。
在一个实施方案中，所述生物反应器还包括连接到搅拌器的可旋转轴。
对生物反应器没有具体限制。本领域技术人员可根据实际需要选择合适的生物反应器。例如，所述生物反应器可包括发酵罐、搅拌釜反应器、粘附式生物反应器、波型生物反应器、一次性生物反应器等。
所述生物反应器可以具有任何合适的体积。例如，所述生物反应器的体积可为0.1mL至约25,000L或更大。例如，所述生物反应器的体积可以大于约0.5L，例如大于约1L，例如大于约2L，例如大于约3L，例如大于约4L，例如大于约5L，例如大于约6L，例如大于约7L，例如大于约8L，例如大于约10L，例如大于约12L，例如大于约15L，例如大于约20L，例如大于约25L，例如大于约30L，例如大于约35L，例如大于约40L，例如大于约45L。所述生物反应器的体积通常小于约25,000L，例如小于约15,000L，例如小于约10,000L，例如小于约5,000L，例如小于约1,000L，例如小于约800L，例如小于约600L，例如小于约400L，例如小于约200L，例如小于约100L，例如小于约50L，例如小于约40L，例如小于约30L，例如小于约20L，例如小于约10L。在一个实施方案中，例如，所述生物反应器的体积可以为约1L至约5L。在一个替代实施方案中，所述生物反应器的体积可为约25L至约75L。在又一个实施方案中，所述生物反应器的体积可为约1,000L至约5,000L。
在一个实施方案中，在所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统中，所述细胞滞留系统通过用于从罐体连续收集物料的端口连接到所述生物反应器。
在一个实施方案中，所述细胞滞留系统由错流膜过滤器，例如ATF系统构成。可供本领域技术人员选择的细胞滞留系统有很多，只要在得到产物收获的同时，可将细胞基于其大小通过细胞滞留系统保留在生物反应器中即可。例如，所述细胞滞留系统包括但不限于ATF(交替切向过滤)系统、切向流过滤(TFF)系统、内部微滤系统、介电泳系统、声共振系统和重力沉降系统。一种优选的细胞滞留系统是ATF系统。通常，所述ATF系统包括C24控制器、带有聚醚砜(PES)膜的中空纤维柱、真空泵和定制管。在使用中，所述待收获的物料周期性地泵入和泵出所述中空纤维柱，从所述中空纤维的孔隙连续获取所述物料中所含的液体，而所述物料中所含的细胞则被截留并通过返流再次泵回所述生物反应器。
在一个实施方案中，所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统还包括产物收获储器。在一个优选的实施方案中，所述产物收获储器与所述细胞滞留系统偶联，并且所述细胞滞留系统与所述生物反应器偶联。
在一个实施方案中，所述拉曼光谱分析仪包括多于一个拉曼探头，例如2、3或4个拉曼探头，尤其是浸入式拉曼探头。所述拉曼探头可以相对于彼此测量不同的信号。
在一个实施方案中，所述拉曼探头被配置为在细胞培养物周期性地暴露于光束之后，通过检测生物反应器中散射光的强度来收集生物反应器中的拉曼光谱。
在一个实施方案中，所述拉曼光谱分析仪还包括激光发射模块，其周期性地(例如，15分钟～1小时)向生物反应器发射激发波长为785nm的激光。同时，为了避免生物反应器外部光线的影响，通常在拉曼光谱检测过程中保护生物反应器避开外界光线。例如，所述生物反应器可以用不透光材料制成的遮盖罩遮盖。因此，在一个实施方案中，所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统还可以包括由不透光材料制成的遮盖罩，其中所述遮盖罩被配置为当所述拉曼光谱分析仪的激光发射模块向生物反应器发射激光并且所述拉曼探头通过检测生物反应器中散射光的强度来收集拉曼光谱时遮盖所述生物反应器。在一个实施方案中，所述生物反应器本身是不透光的，例如由不透光材料制成，在这种情况下，在检测拉曼光谱时不需要保护生物反应器避开外界光线。
在一个实施方案中，所述收集的拉曼光谱与已经离线检测的各种标准对照测量值相关联。例如，校准光谱首先由光谱滤波器模块进行预处理，然后通过偏最小二乘(PLS)回归与所述标准对照测量值相关联。
在一个实施方案中，所述收集的拉曼光谱与生化指标相关，所述生化指标包括但不限于活细胞密度(VCD)、细胞直径、pH、pCO2、pO2、Na+离子和K+离子、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸盐、乳酸盐、铵离子和滴度、渗透压等。
所述细胞培养基的pH值、溶解氧浓度和渗透压的选择原则上并非关键，并且取决于所选细胞的类型。优选地，选择pH、溶解氧浓度和渗透压以使其对于细胞的生长和产率为最佳。本领域技术人员知道如何确定培养物的最佳pH、溶解氧浓度和渗透压(参见例如WO2004/099396)。优选地，对于本发明的系统，所述pH选择在6.6-7.6，和/或所述渗透压选择在260-400mOsm/kg。所述生物反应器内的温度为20℃-40℃，优选30℃-40℃，更优选31.0-37.0℃。为了保持最佳工艺条件，通过使用所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统来实现工艺条件控制的自动化。
在一个实施方案中，所述预设参数值预先输入所述控制器。所述控制器被配置为接收来自所述拉曼光谱分析仪的生化指标值并将其与所述预设参数值进行比较。换言之，将从所述拉曼光谱分析仪传输的生化指标与控制器中的预设参数值进行比较。根据比较动作的结果，所述控制器控制进料储器以调节营养物质进入生物反应器的进料速率，并且控制自动出料装置从生物反应器中自动排放物料，以将细胞培养保持在稳定状态。
在一个实施方案中，从生物反应器自动排出的物料与当时生物反应器中的物料相同，并且通常包括细胞、产物、代谢物、营养物和一些盐。
在一个实施方案中，所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统用于连续培养动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞，优选动物细胞，例如哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO K1细胞)、杂交瘤、BHK(幼仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞、人细胞(例如HEK-293细胞)、人类淋巴母细胞、E1永生化HER细胞、小鼠细胞(例如NSO细胞和SP/20细胞)。
在一个实施方案中，培养所述细胞以产生目的产物，例如单克隆抗体或重组蛋白等。
例如，产生目的产物的细胞是能够表达编码细胞产物的基因的细胞。能够表达编码细胞产物的基因的细胞可以通过例如使用含有编码细胞产物的基因和编码合适的选择标记的基因的质粒转染细胞来制备。
所述目的产物可由所述细胞通过例如表达编码其的(重组)基因产生，所述目的产物例如是(重组)蛋白质，特别是受体、酶、融合蛋白、血蛋白例如来自凝血级联的蛋白、多功能蛋白例如促红细胞生成素、病毒或细菌蛋白质例如用于疫苗的那些；免疫球蛋白例如抗体，例如IgG或IgM等。所述细胞优选产生蛋白质，更优选抗体。优选地，由所述细胞产生的细胞产物例如蛋白质或疫苗可用作药物制剂中的活性成分。细胞产物可由所述细胞通过例如表达编码其的(重组)基因产生，所述细胞产物例如是(重组)蛋白质，特别是受体、酶、融合蛋白、血蛋白例如来自凝血级联的蛋白、多功能蛋白例如促红细胞生成素、病毒或细菌蛋白质例如用于疫苗的那些；免疫球蛋白例如抗体，例如IgG或IgM等。所述细胞优选产生蛋白质，更优选抗体。优选地，由所述细胞产生的细胞产物例如蛋白质或疫苗可用作药物制剂中的活性成分。细胞产物可由所述细胞通过例如表达编码其的(重组)基因产生，所述细胞产物例如是(重组)蛋白质，特别是受体、酶、融合蛋白、血蛋白例如来自凝血级联的蛋白、多功能蛋白例如促红细胞生成素、病毒或细菌蛋白质例如用于疫苗的那些；免疫球蛋白例如抗体，例如IgG或IgM等。所述细胞优选产生蛋白质，更优选抗体。优选地，由所述细胞产生的细胞产物例如蛋白质或疫苗可用作药物组合物中的活性成分。
在一个具体实施方案中，所述目的产物是可用于药物组合物的产物，其可以用作药物，特别是用于人类的药物。这种药物可以例如用于诊断，或用于预防目的，例如疫苗，和/或用于治疗目的，例如用作患者缺乏的酶或蛋白质，或杀死不需要细胞的抗体。除了通过本申请的灌流细胞培养物产生的目的产物之外，所述药物组合物还可包含药学上可接受的承载体或赋形剂，其实例是本领域技术人员众所周知的。
可用作药物制剂中活性成分的蛋白质的例子(括号内为品牌名称)包括但不限于替奈普酶(TN KaseTM)、(重组)抗血友病因子(ReFactoTM)、类淋巴母细胞干扰素α-n1(WellferonTM)、(重组)凝血因子(NovoSevenTM)、依那西普(EnbrelTM)、曲妥珠单抗(HerceptinTM)、英夫利昔单抗(RemicadeTM)、帕利珠单抗(SynagisTM)、巴利昔单抗(SimulectTM)、达克珠单抗(ZenapazTM)、利妥昔单抗(RituxanTM)、(重组)凝血因子IX(BenefixTM)和干扰素β-1a(AvonexTM)。
可用作药物制剂活性成分的疫苗的例子包括分离的蛋白质抗原，其实例包括但不限于活的口服四价轮状病毒疫苗(RotaShieldTM)、狂犬病疫苗(RanAvertTM)、流感疫苗和灭活甲型肝炎疫苗(VAQTATM)。
利用拉曼光谱集成灌流细胞培养系统监测和自动控制灌流细胞培养的方法
使用所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统监测和自动控制灌流细胞培养的方法包括：
(a)在生物反应器中，在起始体积的基础培养基中培养起始量的细胞；
(b)将细胞培养物周期性地暴露于光束后，通过一个或多个拉曼探头采集拉曼光谱，并通过主机将采集到的拉曼光谱转化为生化指标；和
(c)基于将所述生化指标与输入到控制器的相应预设参数值进行比较的结果，通过控制器调节营养物质从进料储器进入生物反应器的进料速率和物料从生物反应器自动出料的速率。
在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括在细胞滞留系统的帮助下从生物反应器连续收获目的细胞产物。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括通过细胞滞留系统将细胞基于其大小维持在生物反应器中。所述细胞滞留系统包括但不限于交替切向过滤(ATF)系统、切向流过滤(TFF)系统、内部微滤系统、介电泳系统、声共振系统和重力沉降系统。一种优选的细胞滞留系统是ATF系统。通常，所述ATF系统包括C24控制器、带有聚醚砜(PES)膜的中空纤维柱、真空泵和定制管。在使用中，所述待收获的物料周期性地泵入和泵出所述中空纤维柱，从所述中空纤维的孔隙连续获得所述物料中所含的液体，而所述物料中所含的细胞则被截留并通过返流再次泵回所述生物反应器。
在一个实施方案中，当激光发射模块周期性地(例如，15分钟～1小时)向生物反应器发射激发波长为785nm的激光时，拉曼探头通过检测生物反应器中散射光的强度来收集拉曼光谱。在一个实施方案中，所述生物反应器通常在拉曼光谱检测期间避开外界光线，以避免来自生物反应器外部的光的影响。例如，所述生物反应器可以用不透光材料制成的遮盖罩遮盖。在一个实施方案中，所述生物反应器本身是不透光的，例如由不透光材料制成，在这种情况下，在检测拉曼光谱时不需要保护所述生物反应器避开外界光线。
在一个实施方案中，所述收集的拉曼光谱与已经离线检测的各种标准对照测量值相关联。例如，校准光谱首先由光谱滤波器模块进行预处理，然后通过偏最小二乘(PLS)回归与所述标准对照测量值相关联。
在一个实施方案中，所述收集的拉曼光谱与生化指标相关联，所述生化指标包括但不限于活细胞密度(VCD)、细胞直径、pH、pCO2、pO2、Na+离子和K+离子、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸盐、乳酸盐、铵离子和滴度、渗透压等。
所述细胞培养基的pH值、溶解氧浓度和渗透压的选择原则上并非关键，并且取决于所选细胞的类型。优选地，选择pH、溶解氧浓度和渗透压以使其对于细胞的生长和产率为最佳。本领域技术人员知道如何找到培养物的最佳pH、溶解氧浓度和渗透压(参见例如WO2004/099396)。优选地，对于本发明的方法，所述pH选择在6.6-7.6，和/或所述渗透压选择在260-400mOsm/kg。所述生物反应器内的温度为20℃-40℃，优选为30℃-40℃，更优选为31.0-37.0℃。为了保持最佳工艺条件，使用所述拉曼光谱集成灌流细胞培养系统实现工艺条件的自动化控制。
在一个实施方案中，所述预设参数值预先输入控制器。所述从拉曼光谱分析仪传输的生化指标与所述控制器中的预设参数值进行比较。所述控制器根据比较动作的结果，控制进料储器以调节营养物料进入生物反应器的进料速度，并控制自动出料装置从生物反应器中自动出料，以将细胞培养保持在稳定状态。
所述预设的参数值没有限制，其取决于细胞类型和细胞产生的产物。本领域技术人员可以根据实际需要确定合适的预设参数值。
在一个实施方案中，所述方法用于连续培养动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞，优选动物细胞，例如哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO K1细胞)、杂交瘤、BHK(幼仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞、人细胞(例如HEK-293细胞)、人类淋巴母细胞、E1永生化HER细胞、小鼠细胞(例如NSO细胞和SP/20细胞)。
在一个实施方案中，培养所述细胞以产生目的产物，例如单克隆抗体或重组蛋白等。
例如，产生目的产物的细胞是能够表达编码细胞产物的基因的细胞。能够表达编码细胞产物的基因的细胞可以通过例如用含有编码细胞产物的基因和编码合适的选择标记的基因的质粒转染细胞来制备。
所述目的产物可由所述细胞通过例如表达编码其的(重组)基因产生，所述目的产物例如是(重组)蛋白质，特别是受体、酶、融合蛋白、血蛋白例如来自凝血级联的蛋白、多功能蛋白例如促红细胞生成素、病毒或细菌蛋白质例如用于疫苗的那些；免疫球蛋白例如抗体，例如IgG或IgM等。所述细胞优选产生蛋白质，更优选抗体。优选地，由所述细胞产生的细胞产物例如蛋白质或疫苗可用作药物制剂中的活性成分。细胞产物可由所述细胞通过例如表达编码其的(重组)基因产生，所述细胞产物例如是(重组)蛋白质，特别是受体、酶、融合蛋白、血蛋白例如来自凝血级联的蛋白、多功能蛋白例如促红细胞生成素、病毒或细菌蛋白质例如用于疫苗的那些；免疫球蛋白例如抗体，例如IgG或IgM等。所述细胞优选产生蛋白质，更优选抗体。优选地，由所述细胞产生的细胞产物例如蛋白质或疫苗可用作药物制剂中的活性成分。细胞产物可由所述细胞通过例如表达编码其的(重组)基因产生，所述细胞产物例如是(重组)蛋白质，特别是受体、酶、融合蛋白、血蛋白例如来自凝血级联的蛋白、多功能蛋白例如促红细胞生成素、病毒或细菌蛋白质例如用于疫苗的那些；免疫球蛋白例如抗体，例如IgG或IgM等。所述细胞优选产生蛋白质，更优选抗体。优选地，由所述细胞产生的细胞产物例如蛋白质或疫苗可用作药物组合物中的活性成分。
在一个具体实施方案中，所述目的产物是可用于药物组合物的产物，其可用作药物，特别是用作人类的药物。这种药物可以例如用于诊断，或用于预防目的，例如疫苗，和/或用于治疗目的，例如用作患者缺乏的酶或蛋白质，或杀死不需要细胞的抗体。除了通过本申请的灌流细胞培养物产生的目的产物之外，所述药物组合物还可包含药学上可接受的承载体或赋形剂，其实例是本领域技术人员众所周知的。
可用作药物制剂中活性成分的蛋白质的例子(括号内为品牌名称)包括但不限于替奈普酶(TN KaseTM)、(重组)抗血友病因子(ReFactoTM)、类淋巴母细胞干扰素α-n1(WellferonTM)、(重组)凝血因子(NovoSevenTM)、依那西普(EnbrelTM)、曲妥珠单抗(HerceptinTM)、英夫利昔单抗(RemicadeTM)、帕利珠单抗(SynagisTM)、巴利昔单抗(SimulectTM)、达克珠单抗(ZenapazTM)、利妥昔单抗(RituxanTM)、(重组)凝血因子IX(BenefixTM)和干扰素β-1a(AvonexTM)。
可用作药物制剂中活性成分的疫苗的例子包括分离的蛋白质抗原，其例子包括但不限于活的口服四价轮状病毒疫苗(RotaShieldTM)、狂犬病疫苗(RanAvertTM)、流感疫苗和灭活甲型肝炎疫苗(VAQTAww)。
本发明的方法原则上可以在任何类型的适合细胞培养的细胞培养基中进行。选择细胞培养基和细胞培养条件的指南是众所周知的，例如Freshney，R.I.Culture of animalcells(a manual of basic techniques),第四版，2000,Wiley-Liss的第8章和第9章，以及Doyle,A.,Griffiths,J.B.,Newell,D.G.Cell&Tissue culture:Laboratory Procedures1993,John Wiley&Sons中提供的那些。
在优选的实施方案中，由本发明的方法产生的细胞产物可以从所述生物反应器中取出的细胞培养物中获取。在本发明的方法中产生的细胞产物可以进一步在所谓的下游处理中从所述细胞培养物中获取，其中采用的方法依赖于细胞产物并且这些方法是本领域技术人员众所周知的。下游处理通常包括以各种方式组合和排序的几个纯化步骤。下游处理中的纯化步骤的例子包括分离步骤(例如，通过亲和色谱和/或离子交换色谱和/或水性两相系统提取和/或例如硫酸铵沉淀)、细胞产物浓缩步骤(例如，通过超滤或渗滤)、缓冲液交换步骤和/或病毒去除或灭活步骤(例如，通过病毒过滤、pH改变或溶剂去污剂处理)。
向细胞培养物中加入至少一种细胞培养基组分，例如营养物和/或细胞培养基的速率(即灌流速率)会影响细胞的活力和密度。在本发明的方法中，所述细胞培养基组分，例如营养物和/或细胞培养基可以以例如连续流、半连续流，例如逐步流或交错流的方式进料。优选地，以连续流方式加入细胞培养基组分，例如营养物和/或细胞培养基。
本发明的技术效果
本发明专注于拉曼光谱与灌流细胞培养的整合。如图2所示，该图显示了如何在拉曼光谱集成灌流细胞培养系统中实现自动出料。
灌流通过补料培养基不断加入生物反应器而实现，并且在细胞滞留系统的帮助下连续获取细胞产物。在VCD自动控制之前，细胞以需要定期修定的恒定泵出速率从生物反应器中排出。拉曼光谱可以检测生物反应器中的散射激光强度并将信号转换为多个变量值，这些预测的生化指标然后通过OPC连接传递到deltaV控制器。在deltaV控制器中，实时VCD与VCD设定值之间的差异被放入P.I.D(比例-积分-导数)算法中，然后该输出(即控制器输出)经过配置设置，比例到合适的执行器输出，最终将执行器输出级联到泵。即，将泵的功率设置为与预测VCD和目标VCD之间的差异成比例。此外，还设置了泵功率上限以确保系统安全。P.I.D.策略也被用来使VCD的在线控制顺利和稳定。
实施例
通过参考以下实施例将更容易理解如此概括描述的本发明，这些实施例以说明的方式提供并且不意欲限制本发明。所述实施例并不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。
材料
生物过程控制器系统：Finesse G3Lab通用控制器、TruBio Delta V 5.0控制软件、3L Applikon玻璃生物反应器；200L XDR生物反应器(Xcellerex XDR-200)。
ATF系统：Repligen交替切向流(ATF2)系统，用于3L台式生物反应器，其中的中空纤维模块由孔径为0.22μm、内径(ID)为1mm和过滤器尺寸为0.047m2的聚醚砜(PES)组成，对于用于200L XDR生物反应器的ATF6，过滤器尺寸为2.5m2。
拉曼系统：Kaiser RAMANRXN2多通道拉曼光谱分析仪(Kaiser Optical Systems,Inc.,安娜堡，密歇根)，激光的激发波长为785nm，最多四个bIO-LAB-220探头；Umetrics的SIMCA软件(版本14.1.2，Umetrics Inc.,圣荷西，加利福尼亚)。
OPC连接系统：Raman RunTime中的嵌入式OPC服务器，MatrikonOPC数据管理软件(MatrikonOPC，埃德蒙顿，阿尔伯塔，加拿大)。
细胞系和培养基：表达人IgG1单克隆抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、特定化学成分明确的基础培养基和补料培养基均为可商购的。
实施例1
1.细胞培养
将产生IgG1单克隆抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在3L台式生物反应器中以灌流模式培养，恒定工作体积为1500mL。使用商购的特定化学成分明确的基础培养基和补料培养基。在34.5℃下运行生物反应器(3-L Applikon玻璃生物反应器，ApplikonBiotechnology，荷兰)。如果需要，通过添加CO2气体以降低pH值，以及通过添加1M Na2CO3溶液以提高pH值，将pH值控制在6.9±0.2。通过L-sparger和Microsparger(孔径分别为1mm和100μm)将DO(溶解氧)保持在空气饱和度的40％。搅拌的设定值是250RPM。
生物反应器以大约0.5×106个细胞/毫升接种。当VCD达到约2.0×106个细胞/毫升时，在第2天开始基础培养基灌流。当VCD达到大于50×106个细胞/毫升时开始细胞出料。使用相同的灌流培养模式和相同的培养技术在两个3LApplikon玻璃生物反应器(ApplikonBiotechnology，荷兰)中培养细胞。为清楚起见，生物反应器的控制器被标记为FC0A和FC0B。所用的生物过程控制器系统是Finesse G3Lab通用型(Finesse Solutions,Inc.,加利福尼亚，美国)。
所述灌流培养使用具有0.22μm孔径、1mm内径(ID)和0.047m2的聚醚砜过滤器的ATF2(Repligen,派恩布鲁克,新泽西)细胞滞留系统进行操作。对于基础培养基进料，其灌流速率在0.6和1.5体积/体积/天(VVD)之间变化。对于补料培养基，通过以14.4分钟的间隔半连续地给料，其灌流速率在0.2和0.4VVD之间变化。细胞出料是通过由Finesse控制器操纵的蠕动泵进行的。灌流过程的持续时间为38天。
这两个生物反应器每天采样两次用于离线分析，其用作建模的标准对照测量值。使用Vi-CELL(Vi-CELL XR,Beckman Coulter)测量细胞密度、活力和细胞直径。使用血气分析仪(Rapidlab BGA348EX，西门子)分析pH、pCO2、pO2、Na+离子和K+离子。使用Cedex(CedexBio HT,Roche)测定葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸盐、乳酸盐、铵离子和滴度。使用渗透压计(Osmo PRO，Advanced Instruments，马塞诸塞州，美国)测量渗透压。
2.拉曼光谱采集
在线拉曼测量由Kaiser RAMANRXN2多通道拉曼光谱分析仪(Kaiser OpticalSystems,Inc.，安娜堡，密歇根)进行，激光的激发波长为785nm。基本单元允许使用单个分析仪支持多达4个bIO-LAB-220探头，并可用于监测多达四个生物反应器。同时，将bIO-LAB-220探头浸入我们的3L台式生物反应器中。还使用了典型的200mW激光功率。每个拉曼光谱都是使用10秒的曝光时间收集的，累积次数为75。收集模式是连续的。获取每个光谱总共需要大约13分钟。使用前按照说明书校准分析仪，每天自动校准一次，以保证细胞培养过程中波长的准确性。
3.化学计量建模
收集到的拉曼光谱与使用软件离线检测的各种标准对照测量值相关联。所述光谱和参考对以csv文件格式导出，然后使用Umetrics的SIMCA软件(版本14.1.2，UmetricsInc.,圣何塞，加利福尼亚)进行分析和处理。光谱首先由光谱滤波器模块进行预处理，然后通过偏最小二乘(PLS)回归与所述标准对照测量值相关联。
过程光谱数据的适当预处理对于创建性能良好的多变量模型是不可或缺的。在我们的研究中，通常使用的预处理是标准正态变换(SNV)后求导数。选择SNV处理是为了减少由细胞散射引起的信号倍增变化的影响。导数处理在去除变化的基线时很有用。根据预处理性能，对不同的目的参数可选择一阶或二阶导数滤波器进行建模。对于本实施例，这种顺序的预处理过滤在测试集中获得了最好的性能。对于光谱区域选择，重要的是去除光谱中主要由噪声、伪影、瑞利散射或其他非拉曼特征组成的区域。一般建模限于拉曼光谱的指纹区域，或根据VIP指数进行选择。经过预处理和光谱区域选择后，建立了葡萄糖、乳酸盐、铵离子和活细胞密度(VCD)等独立的PLS模型。通过观察与预测图评价了模型结果，该图显示了计算出的R2、交叉验证均方根误差(RMSECV)和预测均方根(RMSEP)。另一个重要的诊断工具是霍特林T2(Hotelling's T2)，可以用来理解模型的超结构和检测异常值。
4.集成拉曼到生物过程控制器
Raman RunTime系统提供了嵌入式OPC UA服务器。Finesse Trubio Delta V 5.0配备了OPC功能，因此可以通过MatrikonOPC数据管理器(MatrikonOPC,埃德蒙顿，阿尔伯塔，加拿大)获得预测值。集成和反馈控制回路如图1所示。
如图1所示，我们的控制策略存在两个逻辑回路。第一个称为过程控制回路，其中在3L生物反应器中以恒定频率获得拉曼信号，然后将信号传输到主机，即Runtime系统，主机中的SimcaKaiser模块可以读取频谱文件并将其转换为预测值，然后这些预测值通过局域网传递给MatrikonOPC数据管理器，最终Finesse TruBio DeltaV系统读取这些值并启动预定义的VCD自动输出逻辑，该逻辑回路实现了VCD的联机自动控制。第二个是建模循环，一旦需要建立一个新的模型，就必须启动这个循环。
5.灌流细胞培养关键生化值的预测
为了检测利用拉曼光谱法监测灌流细胞培养的关键生化值(即，IgG浓度、细胞活力、谷氨酰胺浓度、谷氨酸盐浓度、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、NH4 +浓度、渗透压、Na+离子浓度、K+离子浓度、CO2分压(pCO2))的可行性，基于来自FC0A的数据建立了多个PLS模型。它们在测试集(FC0B)上的表现如图4所示。
表1：测试集的预测均方根误差(RMSEP)
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如图4和表1所示，IgG的PLS模型的预测是可以接受的，RMSEP为147.48mg/L，误差可能主要归因于预测的IgG浓度的波动。对细胞活力的预测不令人满意，RMSEP为39％，这表明未来需要更多的工作来优化模型，因为灌流中细胞活力不仅受细胞密度、细胞代谢条件或外部环境(如培养基)的调节，而且还与基础进料速率和出料速率密切相关。考虑到这些PLS模型仅在一个批次中校准，并且在灌流技术中预测更具挑战性，对于谷氨酰胺、谷氨酸盐、葡萄糖和乳酸等溶质，在测试集上的预测表现是可以接受和合理的。从第26天到第45天，对谷氨酸盐的预测出现偏差而失去价值，这可能是由于模型的拟合不足以及批次之间的技术差异造成的。模型对第1天到第19天的葡萄糖浓度进行了精确预测，但在第19天之后，随着生物反应器中的葡萄糖逐渐降至零，其表现较差，这表明葡萄糖的进料、排出和消耗处于一种动态平衡。探头在生物反应器中的固定位置和培养基的异质性可能会导致葡萄糖浓度预测误差的增加。拉曼光谱也提供了对NH4 +、Na+、K+等离子的良好结果。预测的K+离子浓度在培养后期略有漂移，这是由细胞培养后期FC0A(训练集)和FC0B(测试集)之间的累积差异造成的。对渗透压的表现非常好，RMSEP为4.73mOsmo/kg，这意味着如果选择相同的基础培养基和补料培养基作为灌流细胞培养中的校准批次，则可以准确预测渗透压。此外，拉曼光谱还显示出预测用于灌流的生物反应器中二氧化碳分压的潜力。
6.结论
本发明建立了最先进的灌流细胞培养-拉曼集成系统，其中实现了关键参数的在线监测和活细胞密度的联机自动控制。结果表明，仅用一个批次的校准数据，该模型即可用于精确预测大多数关键参数，即，葡萄糖、乳酸盐、渗透压和IgG浓度，RMSEP分别为0.71g/L、0.24g/L、4.73mOsmo/kg和147.48mg/L，并且还可以以可接受的准确度预测一些参数，即，谷氨酸盐、谷氨酰胺、CO2分压、Na+离子浓度和K+离子浓度。此工作为生物制品连续制造中的PAT实施奠定了坚实的基础，显示出联机调节产品质量的巨大潜力，为解决生物制品连续制造的质量问题提供了强有力的工具。
实施例2
1.灌流VCD出料的自动反馈控制
通过±2死区控制将生物反应器VCD维持在50×106个细胞/毫升的设定值。当在线VCD增加到高于死区上限时，控制器蠕动泵启动以排出细胞。泵速由PID(比例-积分-导数)控制和输出比例确定。所述泵以恒定速度运行，直到测量下一次的在线VCD。如果新生成的VCD仍高于死区上限，所述泵会在新计算的泵速下继续运行。否则，泵将停止。
2.灌流细胞培养的拉曼光谱
图3示出了一项灌流实验的拉曼光谱原始数据，其中y轴表示拉曼强度，x轴表示从100cm-1到3400cm-1的拉曼位移。该图中的每条线代表该时刻的一条拉曼曲线，其中颜色表示测得的IgG浓度。
3.活细胞密度建模
为了实现VCD的自动控制，建立一个稳健且准确的PLS模型对VCD预测至关重要。实时准确地预测VCD值有助于控制器在过程联机控制回路中做出快速、正确的响应。因此，比较了具有不同拉曼信号预处理方法和数据源的6个不同模型，即两种导数和3个数据源。
数据源的变化会对模型校准空间产生相当大的影响，导致VCD预测模型的不同表现。考虑到生物反应器FC0A中设计的是自动控制，因此我们考虑用于VCD建模的第一个数据源是来自FC0A历史数据的拉曼数据，这意味着根据第1天到第50天的历史数据预测第51天FC0A的VCD。第二个数据源来自平行生物反应器FC0B。用于训练模型的第三个数据源是来自FC0B和FC0A(第1-50天)的培养数据。
如图5所示，所有6个PLS模型在训练集上的预测性能都是可接受的，尤其是基于拉曼光谱一阶导数的模型(左侧)。而且，对于具有不同数据源的模型，数据点位于不同的范围内。更详细地，来自FC0A的第1-50天的训练数据具有更均匀的VCD数据分布，但是来自FC0B的训练数据更有可能位于45至60×106个细胞/毫升的VCD范围内。
如图6所示，一般情况下，一阶导数训练集的RMSECV(交叉验证均方根误差)低于二阶导数的RMSE，但根据我们的经验，较低的训练RMSE可能会带来更大的过拟合风险。
此外，从霍特林T2(Hotelling’s T2)范围值方面对两种导数方法进行了比较。如图6(a)所示，对于一阶导数建立的模型，有些点在95％置信限之外，说明模型质量会受到一阶导数预处理的影响。因此，从霍特林T2范围图表的角度来看，二阶导数预处理优于一阶导数预处理。
基于不同模型的VCD测试性能结果如图8和图9所示。由于数据预处理方法和数据源不同，这些用于VCD预测的PLS模型具有不同的测试性能。值得一提的是，对拉曼光谱进行二阶导数预处理的PLS模型都具有比一阶导数模型更低的RMS预测误差。一致地，使用一阶导数预测的VCD都被高估了，这说明在我们的情况下，拉曼光谱的一阶导数会引入建模偏差。此外，二阶导数消除了这种偏差，但如预测VCD的波动所示，方差有所增加。
此外，数据源对VCD预测性能也有一定的影响。详细地说，历史数据比另一批次(FC0B)的数据要好得多，考虑到灌流中批次之间的差异，这是合理的。此外，图9的结果还表明，将FC0B的数据放入FC0A生成的训练数据集中并没有改善性能。
4.结论
结果还表明，拉曼光谱的二阶导数预处理在VCD预测中的性能优于一阶导数，并且批次本身的历史数据比并行批次的数据对VCD建模和校准的效果更好。
实施例3
1.小规模(3L生物反应器，培养体积1500mL)中的VCD自动控制
如前所述，使用来自FC0A的数据的二阶导数模型或使用来自FC0A和F07的数据训练的数据的二阶导数模型具有匹配的预测能力。因此选择了来自FC0A的数据的二阶导数模型，其中我们假设来自其本身的历史数据不会为VCD模型引入额外的偏差。
在这里，如图2所示，该图显示了我们如何在我们的灌流系统中实现自动出料。首先，随着补料培养基不断加入生物反应器而实现灌流，在细胞滞留系统的帮助下连续收获了产物。在自动控制VCD之前，细胞以需要定期修定的恒定泵送速率从生物反应器中排出。拉曼光谱可以检测反应器中的散射激光强度并将信号转换为多变量值，然后那些预测的生化指标通过OPC连接传递到deltaV控制器。在deltaV控制器中，实时VCD和VCD设定值之间的差异被放入P.I.D(比例-积分-导数)算法中，然后该输出(即控制器输出)经过配置设置，被比例到合适的执行器输出，最终所述执行器输出级联到泵。即，该泵的功率设置为与预测VCD和目标VCD之间的差异成比例。此外，为了确保系统安全，还设置了泵功率上限。P.I.D策略也被用来使VCD的在线控制顺利和稳定。
表2：3L台式生物反应器中VCD自动控制的总结
VCD自动控制的结果如图10所示。图10显示目标VCD设置为50×106个细胞/毫升，这是灌流细胞培养的推荐设置。与红色实心圆相比，青色线表示的预测的VCD值是可以接受的。而且，预测值在目标VCD(即50×106个细胞/毫升)附近波动。一旦在线预测的VCD高于50×106个细胞/毫升，泵将开始以如上所述的方式工作。一旦更新的VCD可能降低到目标VCD，泵速将在P.I.D控制策略的帮助下逐渐降低到0。如图10所示，很明显，离线VCD在目标VCD附近具有更大的振幅，这表明未来的运行需要更多的优化。
表2中的结果还表明，从第51天到第62天，受控的VCD的在线值和离线值的标准偏差分别为1.76和2.67，这与图10中的趋势一致。预测的在线VCD和离线VCD都基本维持在目标VCD，即分别为50.98和50.67。因此，这些结果表明，已经成功开发了一种可行的用于哺乳动物细胞培养灌流的VCD自动控制策略。
2.结论
建立了一种可行的用于哺乳动物细胞灌流培养的VCD自动控制策略，其中在线和离线VCD保持在50×106个细胞/毫升的目标VCD附近，即分别为50.98±1.76和50.67±2.67，长达11天。
实施例4
1.大规模(200升生物反应器中60升)中VCD的自动控制
受益于拉曼光谱的可扩展性和特异性，小规模(即3L)中构建的模型可以直接用于大规模(例如60L，例如在200L XDR生物反应器中)中VCD的在线监测和反馈控制。使用200LXDR生物反应器在灌流模式下进行培养，用于放大验证的恒定工作体积为约60.0L。并且为了保证放大过程中自动控制过程的稳健性，一旦在线和离线测得的VCD差异大于5×106个细胞/毫升，则将较大规模的最新数据加入到VCD的PLS模型的数据集中，以提高缩放模型间的准确性(cross-scale model accuracy)。
200L XDR生物反应器中VCD自动控制的结果如图11所示。图11显示目标VCD设置为40×106个细胞/毫升，这是灌流细胞培养的推荐设置。与实心圆相比，所示的预测VCD值是可以接受的。此外，预测值在目标VCD(即40×106个细胞/毫升)附近波动。一旦在线预测的VCD高于40×106个细胞/毫升，泵将逐渐开始以上述方式运行。一旦更新的VCD可能降低到目标VCD，泵速将在P.I.D控制策略的帮助下逐渐降低到0。如图11所示，很明显，在线VCD相对准确，并且在目标VCD附近得到了很好的控制。借助拉曼光谱分析仪和小规模中构建的模型以及P.I.D控制策略，具有目标VCD为40×106个细胞/毫升的稳定灌流状态维持了超过28天(自第7天之后)。
表3：60L灌流运行中VCD自动控制的总结
如表3所示，对于60L中的放大，从第6天至第35天(从自动控制启动时计算)受控的VCD的在线值和离线值的标准偏差分别为1.33和1.96。预测的在线VCD和离线VCD的平均值都基本保持在目标VCD，即分别为40.69和40.30，表明在大规模中实现了更稳定和准确的VCD控制。
2.结论
60L中的成功放大表明了拉曼光谱分析仪的可行性和可扩展性。此外，由于数据积累以及相应改善的模型稳健性和准确性，在大规模中获得了更准确和稳定的VCD曲线，显示了拉曼光谱在哺乳动物细胞灌流培养过程中控制VCD的强大潜力。
本领域技术人员将进一步理解，在不脱离本发明的精神或中心属性的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，因此应当理解，其他变化被预期为在本发明的范围内。因此，本发明不限于这里已经详细描述的特定实施方案。相反，应参考所附权利要求书来表明本发明的范围和内容。
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Claims (30)

1.一种用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，包括：
生物反应器，包括：
(1)用于接收细胞培养物的罐体，
(2)用于将营养物质从进料储器供给所述罐体的端口，
(3)用于从所述罐体自动出料的端口，
(4)借助细胞滞留系统从罐体连续收获物料的端口；
拉曼光谱分析仪，包括：(i)一个或多个拉曼探头，所述探头被浸入所述生物反应器中并被配置为在所述生物反应器中收集拉曼光谱，以及(ii)主机，所述主机被配置为接收由所述拉曼探头采集和传输的拉曼光谱并将其转换为生化参数值；和
与所述拉曼光谱分析仪、进料储器和自动出料装置通信的控制器，所述控制器被配置为接收来自拉曼光谱分析仪的值并将这些值与预设参数进行比较，并且所述控制器进一步被配置为根据比较操作的结果控制所述进料储器以调节营养物质进入所述生物反应器的进料速率，并被配置为根据比较操作的结果控制所述自动出料装置从所述生物反应器中自动排放物料。
2.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述细胞滞留系统通过用于从所述罐体连续收获物料的端口连接到所述生物反应器。
3.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述细胞滞留系统选自交替切向流过滤系统、切向流过滤系统、内部微滤系统、介电泳系统、声共振系统或重力沉降系统。
4.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述细胞滞留系统是交替切向流过滤系统。
5.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述系统还包括产物收获储器。
6.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述生物反应器还包括连接至搅拌器的可旋转轴。
7.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述拉曼光谱分析仪包括两个或更多个拉曼探头，其相对彼此测量不同的信号。
8.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述拉曼探头被配置为在所述细胞培养物周期性暴露于光束后，通过检测所述生物反应器中的散射光强度来收集所述生物反应器中的拉曼光谱。
9.根据权利要求8所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述拉曼光谱分析仪还包括激光发射模块，其周期性地向所述生物反应器发射激发波长为785nm的激光。
10.根据权利要求9所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述激光发射模块以15分钟至1小时的间隔周期性地向所述生物反应器发射激发波长为785nm的激光。
11.根据前述权利要求中任一项所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述系统还包括由不透光材料制成的遮盖罩，所述遮盖罩被配置为当所述拉曼光谱分析仪的激光发射模块向所述生物反应器周期性地发射激光并且所述拉曼探头通过检测所述生物反应器中散射光的强度来收集拉曼光谱时遮盖所述生物反应器。
12.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述收集的拉曼光谱与选自活细胞密度、细胞直径、pH、pCO2、pO2、Na+离子和K+离子、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸盐、乳酸盐、铵离子和滴度、或渗透压的生化指标相关联。
13.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述系统被配置为培养动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞。
14.根据权利要求1所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述系统被配置为培养动物细胞。
15.根据权利要求14所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述系统被配置为培养哺乳动物细胞。
16.根据权利要求15所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述哺乳动物细胞选自：中国仓鼠卵巢细胞，杂交瘤细胞，幼仓鼠肾细胞，骨髓瘤细胞，人类细胞，或小鼠细胞。
17.根据权利要求15所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统，其中所述哺乳动物细胞选自：CHO K1细胞，HEK-293细胞，人类淋巴母细胞，E1永生化HER细胞，NSO细胞或SP/20细胞。
18.一种通过使用根据权利要求1至17中任一项所述的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统来监测和自动控制灌流细胞培养的方法，包括：
(a)在生物反应器中，在起始体积的基础培养基中培养起始量的细胞；
(b)将细胞培养物周期性地暴露于光束后，通过一个或多个拉曼探头采集拉曼光谱，并通过主机将采集到的拉曼光谱转化为生化指标；和
(c)基于将所述生化指标与输入控制器的相应预设参数值进行比较的结果，通过控制器调节营养物质从进料储器进入所述生物反应器的进料速率和物料从所述生物反应器自动排放的速率。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括在细胞滞留系统的帮助下从所述生物反应器连续收获目的细胞产物。
20.根据权利要求18所述的方法，还包括通过细胞滞留系统将细胞基于其大小保持在所述生物反应器中。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述细胞滞留系统选自交替切向流过滤系统、切向流过滤系统、内部微滤系统、介电泳系统、声共振系统或重力沉降系统。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞滞留系统是交替切向流过滤系统。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述收集的拉曼光谱与选自活细胞密度、细胞直径、pH、pCO2、pO2、Na+离子和K+离子、葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸盐、乳酸盐、铵离子和滴度、以及渗透压的生化指标相关联。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法用于连续培养动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法用于连续培养动物细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自：中国仓鼠卵巢细胞，杂交瘤细胞，幼仓鼠肾细胞，骨髓瘤细胞，人类细胞，或小鼠细胞。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自：CHO K1细胞，HEK-293细胞，人类淋巴母细胞，E1永生化HER细胞，NSO细胞或SP/20细胞。
29.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞产生目的产物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述目的产物为单克隆抗体或重组蛋白。
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