CN111201434A - 用于控制细胞培养物中的过程变量的原位拉曼光谱系统和方法 - Google Patents

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CN111201434A CN201880058522.3A CN201880058522A CN111201434A CN 111201434 A CN111201434 A CN 111201434A CN 201880058522 A CN201880058522 A CN 201880058522A CN 111201434 A CN111201434 A CN 111201434A
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Abstract

本发明提供了用于监测和控制生物反应器细胞培养物中的一个或多个过程变量以便提高产品质量和一致性的原位拉曼光谱方法和系统。所述方法和系统将用于细胞培养物的实时评定的原位拉曼光谱和化学计量建模技术与信号处理技术联合使用来实现对细胞培养过程变量的精确的连续反馈和模型预测控制。通过使用来自拉曼光谱的实时数据，可以连续或间歇地监测所述细胞培养物内的所述过程变量，并且自动反馈控制器将所述过程变量维持在预先确定的设定点或者维持特定的补料方案，所述特定的补料方案将变化量的剂递送至生物反应器以最大化生物产品质量。

Description

用于控制细胞培养物中的过程变量的原位拉曼光谱系统和 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月16日提交的美国临时专利申请62/572,828以及2018年4月25日提交的申请62/662,322的权益和优先权，所有所述申请在准许的情况下以引用的方式整体并入。
发明领域
本发明总体涉及生物反应器系统和方法，所述生物反应器系统和方法包括用于监测和控制生物反应器细胞培养物中的一个或多个过程变量的原位拉曼光谱方法和系统。
发明背景
美国食品和药物管理局(FDA)的过程分析技术(PAT)框架鼓励主动开发和实施用于过程开发、过程分析和过程控制的创新型解决方案，以更好地理解过程并且控制产品的质量。在制造过程期间会监测和控制过程参数。例如，在制造生物产品期间，生物反应器中的细胞培养物中的营养物的补料是重要的过程参数。当前的生物产品制造涉及每日大剂量补料的补料策略。在当前方法下，每日大剂量补料每天会将细胞培养物中的营养物浓度增大至少五倍。为了确保在补料中间，培养物中的营养物不会耗尽，每日大剂量补料将营养物维持在高浓度水平。事实上，每次补料都被设计成在下一次补料之前都能维持培养物需要的所有营养物。然而，每次每日大剂量补料中的大量营养物都可能会引起生物反应器中的营养物水平的大幅波动，从而导致生产培养物的产品质量输出的不一致性。
此外，每次每日大剂量补料中的高浓度的营养物会促成所得的生物产品中的翻译后修饰的增加。例如，细胞培养物中的高浓度的葡萄糖可能会导致最终的生物产品中的糖化的增加。糖化是还原糖以非酶促的方式添加到蛋白质的氨基酸残基，这通常发生于蛋白质的N-端胺基和带正电的胺基。所得的糖化产物可能会具有黄色或褐色的光学性质，这可能会导致有色的药物产品(Hodge JE(1953)J Agric Food Chem.1:928-943)。糖化还可能会在治疗性单克隆抗体(mAb)的单一生产批次内产生电荷变体并且会导致结合抑制(Haberger M等人(2014)MAbs.6:327-339)。
因此，为了推进PAT倡议，需要一种能够优化细胞培养物内的营养物浓度，从而带来较高质量产品的方法或系统。
发明内容
本文公开了用于监测和控制生物反应器细胞培养物中的一个或多个过程变量的原位拉曼光谱方法和系统。
本发明的一个实施方案包括一种用于控制细胞培养基条件的方法，所述方法包括使用原位拉曼光谱对所述细胞培养基中的一种或多种分析物进行定量；以及调整细胞培养基中的一个或多个分析物浓度以匹配预先确定的分析物浓度，所述预先确定的分析物浓度将细胞培养基中的蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至30％。在一些实施方案中，翻译后修饰包括糖化。在其他实施方案中，细胞培养物中的蛋白质包括抗体、其抗原结合片段或融合蛋白。在另一些其他实施方案中，细胞培养基包括哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞。
在一些实施方案中，分析物是葡萄糖。在此方面，预先确定的葡萄糖浓度是0.5至8.0g/L。在另一个实施方案中，预先确定的葡萄糖浓度是1.0g/L至3.0g/L。在又一个实施方案中，葡萄糖浓度是2.0g/L或1.0g/L。在其他实施方案中，预先确定的分析物浓度将细胞培养基中的蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至20％或5.0％至10％。在另一些其他实施方案中，连续地、间歇地或间隔地执行对分析物进行的定量。例如，以5分钟间隔、10分钟间隔或15分钟间隔执行对分析物进行的定量。在又一些其他实施方案中，每小时或至少每天执行对分析物进行的定量。在一些实施方案中，自动地执行对分析物浓度进行的调整。在另一些其他实施方案中，对至少两种或至少三种或至少四种不同的分析物进行定量。
本发明的另一个实施方案包括一种用于减少分泌性蛋白质的翻译后修饰的方法，所述方法包括：在包括0.5至8.0g/L葡萄糖的细胞培养基中培养分泌所述蛋白质的细胞；使用原位拉曼光谱增量式地确定在培养所述细胞期间细胞培养基中的葡萄糖浓度；以及通过每小时自动地递送多个剂量的葡萄糖来调整所述葡萄糖浓度以将葡萄糖浓度维持为0.5至8.0g/L，以便将分泌性蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至30.0％。在一个实施方案中，葡萄糖浓度是1.0至3.0g/L。
本发明的又一个实施方案包括一种用于控制细胞培养基条件的系统，所述系统包括一个或多个处理器，所述一个或多个处理器与计算机可读介质通信，所述计算机可读介质存储软件代码以由一个或多个处理器执行以便使所述系统：从原位拉曼光谱仪接收包括细胞培养基中的一种或多种分析物的浓度的数据；以及调整细胞培养基中的一个或多个分析物浓度以匹配预先确定的分析物浓度，所述预先确定的分析物浓度将细胞培养基中的蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至30％。在一个实施方案中，软件代码被进一步配置成使所述系统对所述数据执行化学计量分析，例如偏最小二乘回归建模。在其他实施方案中，软件代码被进一步配置成使所述系统对所述数据执行一种或多种信号处理技术，例如降噪技术。
本发明的另一个实施方案包括一种用于减少分泌性蛋白质的翻译后修饰的系统，所述系统包括：一个或多个处理器，所述一个或多个处理器与计算节可读介质通信，所述计算机可读介质存储软件代码以由一个或多个处理器执行以便使所述系统：从原位拉曼分析仪增量式地接收包含在培养分泌所述蛋白质的细胞期间细胞培养基中的葡萄糖浓度的光谱数据；以及通过每小时自动地递送多个剂量的葡萄糖来调整所述葡萄糖浓度以将葡萄糖浓度维持为0.5至8.0g/L，例如1.0至3.0g/L，以便将分泌性蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至30.0％。在一个实施方案中，软件代码被进一步配置成使所述系统将所述光谱数据内的峰值与葡萄糖浓度相关联。在另一个实施方案中，软件代码被进一步配置成对光谱数据执行偏最小二乘回归建模。在又一个实施方案中，软件代码被进一步配置成对光谱数据执行降噪技术。在又一些其他实施方案中，对葡萄糖浓度进行的调整是由自动反馈控制软件执行。
附图说明
可以从以下结合下文描述的附图提供的具体实施方式确定本发明的其他特征和优点：
图1是根据本发明的一个实施方案的用于控制细胞培养物中的过程变量的方法的流程图。
图2是根据本发明的用于控制与图1相关联的细胞培养物中的过程变量的系统的示意图。
图3是示出通过离线营养物样品确认的预测营养物过程值的图。
图4是示出根据本发明的在信号处理技术之后的已滤波的最终营养物过程值的图。
图5是示出营养物浓度的预定设定点偏移之后的预测营养物过程值和已滤波的最终营养物过程值的图。
图6是示出根据本发明的反馈控制的连续营养物补料中和大剂量营养物补料中葡萄糖浓度对翻译后修饰的影响的线图。
图7是示出根据本发明的反馈控制的连续营养物补料和大剂量营养物补料的原位拉曼预测的葡萄糖浓度值的图。
图8是示出根据本发明的反馈控制的连续营养物补料和大剂量营养物补料的抗体滴度的线图。
图9是示出因葡萄糖浓度所致的归一化的翻译后修饰的百分比的柱形图。
图10是示出根据本发明的反馈控制的连续营养物补料和大剂量营养物补料的葡萄糖浓度的图。
图11是示出与大剂量补料策略细胞培养相比较，反馈控制细胞培养可以将PTM减少多达50％的图。
具体实施方式
Ⅰ.定义
如本文所使用，除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个提及物。
除非本文另有指明，否则本文对值范围的叙述仅仅意图用作单独地提及落在所述范围内的每个单独的值的速记方法，并且每个单独的值被并入到本说明书中，就像本文单独地引用每个单独的值一样。
术语“约”的使用意图描述在陈述值以上或以下的在近似+/-10％范围内的值；在其他实施方案中，值可以具有在陈述值以上或以下的在近似+/-5％范围内的值范围；在其他实施方案中，值可以具有在陈述值以上或以下的在近似+/-2％范围内的值范围；在其他实施方案中，值可以具有在陈述值以上或以下的在近似+/-1％范围内的值范围。前述范围意图根据上下文来理清，并且不暗示进一步的限制。除非本文另外指明或另外与上下文明显矛盾，否则可以按任何合适的次序来执行本文描述的所有方法。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅意图更好地阐明本发明，并且除非另有要求，否则不限制本发明的范围。说明书中的语言都不应被解释为指出任何未要求保护的元素对本发明的实践是必不可少的。
术语“生物产品”指代任何抗体、抗体片段、经修饰的抗体、蛋白质、糖蛋白、或融合蛋白以及在生物反应器过程中制造的最终药物物质。
术语“控制(control)”和“控制(controling)”指代将细胞培养物中的过程变量的量或浓度水平调整到预定设定点。
术语“监测(monitor)”和“监测(monitoring)”指代定期地检查细胞培养物中的过程变量或细胞培养物中的过程条件的量或浓度水平。
术语“稳态”指代将细胞培养物中的营养物的浓度、过程参数或质量属性维持在不变的、恒定的或稳定的水平。应理解，不变的、恒定的或稳定的水平指代预先确定的设定点内的水平。操作者在细胞培养物产生时间段内可以改变设定点，从而改变稳态水平。
Ⅱ.生产生物产品的方法
一个实施方案提供了用于监测和控制生物反应器细胞培养物中的一个或多个过程变量以便提高产品质量和一致性的方法。过程变量包括但不限于以下项的浓度：葡萄糖、氨基酸、维生素、生长因子、蛋白质、活细胞计数、氧气、氮气、pH、死细胞计数、细胞因子、乳酸盐、谷氨酰胺、诸如果糖和半乳糖之类的其他糖、铵、渗透压度以及它们的组合。所公开的方法和系统将用于细胞培养物的实时评定的原位拉曼光谱和化学计量建模技术与信号处理技术联合使用来实现对细胞培养过程变量的精确的连续反馈和模型预测控制。生物反应器内容物的原位拉曼光谱允许分析生物反应器中的一个或多个过程变量，而无需物理地移除生物反应器内容物的样品来进行测试。通过使用来自拉曼光谱的实时数据，可以连续或间歇地监测细胞培养物内的过程变量，并且自动反馈控制器将过程变量维持在预先确定的设定点或者维持特定的补料方案，所述特定的补料方案将变化量的剂递送至生物反应器以最大化生物产品质量。
所公开的方法和系统控制细胞培养过程中的一个或多个过程变量。术语“细胞培养物”和“细胞培养基”可以互换地使用并且包括被设计成支持微生物、细胞或细胞系的生长和维护的任何固体、液体或半固体。细胞培养基内可能存在诸如以下的组分：多肽、糖、盐、核酸、细胞碎片、酸、碱、pH缓冲剂、氧气、氮气、用于调节粘度的剂、氨基酸、生长因子、细胞因子、维生素、辅因子和营养物。一个实施方案提供了一种哺乳动物细胞培养过程并且包括哺乳动物细胞或细胞系。例如，哺乳动物细胞培养过程可以利用在化学成分确知的基础培养基中生长的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
可以在生物反应器中执行细胞培养过程。生物反应器包括种子罐(seed train)、分批补料装置和连续的生物反应器。生物反应器的容积的范围可以为约2L至约10,000L。在一个实施方案中，生物反应器可以是60L不锈钢生物反应器。在另一个实施方案中，生物反应器可以是250L生物反应器。每个生物反应器还应当维持在约5x 106个细胞/mL至约100x106个细胞/mL的范围内的细胞计数。例如，生物反应器应当维持约20x 106个细胞/mL至约80个细胞/mL的细胞计数。
所公开的方法和系统可以监测和控制存在于细胞培养物中并具有可检测的拉曼光谱的任何分析物。例如，本发明的方法可以用于监测和控制包括添加到细胞培养物中的组分在内的细胞培养基的任何组分、从细胞分泌的物质以及在细胞死亡后存在的细胞组分。可以通过所公开的系统和方法监测和/或控制的细胞培养基的组分包括但不限于：诸如氨基酸和维生素之类的营养物、乳酸盐、辅因子、生长因子、细胞生长率、pH、氧气、氮气、活细胞计数、酸、碱、细胞因子、抗体和代谢物。
一个实施方案提供了用于监测和控制细胞培养物中的营养物浓度的方法。如本文所使用，术语“营养物”可以指代提供生长和存活所必需的营养的任何化合物或物质。营养物的实例包括但不限于：简单的糖，诸如葡萄糖、半乳糖、乳糖、果糖或麦芽糖；氨基酸；以及维生素，诸如维生素A、维生素B和维生素E。在另一个实施方案中，本发明的方法可以包括监测和控制细胞培养物中的葡萄糖浓度。通过控制细胞培养物中的营养物浓度，例如葡萄糖浓度，已发现，可以在比先前使用每日大剂量营养物补料策略可能达到的浓度范围低的浓度范围下生产诸如蛋白质的生物产品。
此外，通过控制细胞培养物中的营养物浓度和其他过程变量，本发明的方法进一步提供对蛋白质的一种或多种翻译后修饰的调节。不受任何特定理论的束缚，据信，通过在细胞培养物内提供较低的营养物浓度，可以减少蛋白质和抗体中的翻译后修饰。可以通过本发明调节的翻译后修饰的实例包括但不限于：糖化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团实现的衍生、溶蛋白性裂解和通过非天然存在的氨基酸实现的修饰。另一个实施方案提供了用于调节蛋白质的糖化的方法和系统。例如，通过在细胞培养基中提供较低浓度范围的葡萄糖，可以降低最终生物产品中分泌性蛋白质或抗体的糖化水平。
图1是控制生物反应器细胞培养物中的一个或多个过程变量，例如营养物浓度的示例性方法的流程图。待监测和控制的每个过程变量的预先确定的设定点可以被编程到所述系统中。预定设定点表示细胞培养物中的在整个过程中要维持或调整的过程变量的量。葡萄糖浓度是可以监测和调节的营养物的一个实例。如上文简要地论述的，已发现，与使用每日大剂量营养物补料策略的培养基中的葡萄糖浓度相比较，可以在包含低水平的葡萄糖的培养基中由细胞产生生物产品(例如，蛋白质、抗体、融合蛋白和药物物质)。在一个实施方案中，营养物浓度的预定设定点是使细胞系生长和繁殖所需的营养物的最低浓度。所公开的方法和系统可以在一段时间内将多个小剂量的营养物递送到培养基，或者可以向培养基提供稳定的营养物流。在一些实施方案中，可以在所述过程期间根据细胞培养基内的条件来增大或减小预定设定点。例如，如果预定大小的营养物浓度会导致细胞培养基内的细胞死亡或次优的生长条件，则可以增大预定设定点。然而，营养物浓度应当维持在约0.5g/L至约10g/L的预定设定点。在另一个实施方案中，营养物浓度应当维持在约0.5g/L至约8g/L的预定设定点。在又一个实施方案中，营养物浓度应当维持在约1g/L至约3g/L的预定设定点。在另一个实施方案中，营养物浓度应当维持在约2g/L的预定设定点。这些预定设定点实质上提供了在整个过程中营养物浓度应当维持的基线水平。
在一个实施方案中，通过拉曼光谱执行对细胞培养物中的一个或多个过程变量，例如营养物浓度的监测(步骤101)。拉曼光谱是振动光谱的一种形式，它提供可以用于样品鉴别和定量的与分子振动有关的信息。在一些实施方案中，使用原位拉曼光谱来执行对过程变量的监测。原位拉曼分析是在其原始位置处分析样品，而无需提取样品的一部分以在拉曼光谱仪中进行分析的方法。原位拉曼分析的有利之处在于：拉曼光谱分析仪是非侵入性的，这降低了污染的风险，并且是非破坏性的，因为不会对细胞培养物活力或蛋白质质量产生影响。
原位拉曼分析可以提供对细胞培养物中的一个或多个过程变量的实时评定。例如，由原位拉曼光谱提供的原始光谱数据可以用于获得并监测细胞培养物中的营养物浓度的当前大小。在此方面，为了确保原始光谱数据是不断更新的，应当大约每10分钟至2小时获取来自拉曼光谱的光谱数据。在另一个实施方案中，应当大约每15分钟至1小时获取光谱数据。在又一个实施方案中，应当大约每20分钟至30分钟获取光谱数据。
在此方面，可以由任何可商购的允许原位拉曼分析的拉曼光谱分析仪分析对细胞培养物中的一个或多个过程变量的监测。原位拉曼分析仪应当能够获得细胞培养物内的原始光谱数据(例如，拉满分析仪应当配备有可以插入到生物反应器中的探针)。合适的拉曼分析仪包括但不限于：RamanRXN2和RamanRXN4分析仪(Kaiser Optical Systems,Inc.AnnArbor,MI)。
在步骤102中，可以将通过原位拉曼光谱获得的原始光谱数据与待监测或控制的特定过程变量的离线测量结果(例如，离线营养物浓度测量结果)进行比较，以便将光谱数据内的峰值与过程变量相关联。例如，如果待监测或控制的过程变量是葡萄糖浓度，则可以使用离线葡萄糖浓度测量结果来确定哪个光谱区展现出葡萄糖信号。可以通过任何适当的分析方法来收集离线测量数据。另外，可以使用任何类型的多元软件包，例如SIMCA 13(MKSData Analytic Solutions,Umea,Sweden)来将原始光谱数据内的峰值与待监测或控制的特定过程变量的离线测量结果相关联。然而，在一些实施方案中，可能需要用光谱滤波器对原始光谱数据进行预处理以去除任何变化的基线。例如，可以用任何类型的点平滑技术或归一化技术来对原始光谱数据进行预处理。可能需要归一化来对拉曼分析仪的任何激光功率变化和暴露时间进行校正。在一个实施方案中，可以用点平滑，诸如以21cm-1进行的1阶导数点平滑以及归一化，诸如标准正态变量(SNV)归一化来处理原始光谱数据。
还可以对所获得的光谱数据执行化学计量建模。在此方面，可以对光谱数据使用包括但不限于以下项的一种或多种多元方法：偏最小二乘法(PLS)、主成分分析法(PCA)、正交偏最小二乘法(OPLS)、多元回归法、典型相关法、因子分析法、聚类分析法、图示法等等。在一个实施方案中，使用所获得的光谱数据来创建PLS回归模型。可以通过将预测变量和观测变量投影到新的空间来创建PLS回归模型。在此方面，可以使用获自拉曼分析的测量值和离线测量值来创建PLS回归模型。PLS回归模型提供预测过程值，例如预测营养物浓度值。
在化学计量建模之后，可以对预测过程值(例如，预测营养物浓度值)应用信号处理技术(步骤103)。在一个实施方案中，信号处理技术包括降噪技术。在此方面，可以对预测过程值应用一种或多种降噪技术。可以利用本领域技术人员已知的任何降噪技术。例如，降噪技术可以包括数据平滑和/或信号抑制。平滑通过一系列平滑算法和滤波器来实现，而信号抑制使用信号特性来识别所分析的光谱数据中不应当包括的数据。在一个实施方案中，预测过程值是由降噪滤波器减弱的噪声。降噪滤波器提供最终的已滤波的过程值(例如，最终的已滤波的营养物浓度值)。在此方面，降噪技术将原始测量结果与基于模型的估计进行组合以实现测量结果根据模型应当产生的结果。在一个实施方案中，降噪技术将当前的预测过程值与其不确定性进行组合。不确定性可以通过预测过程值的可重复性和当前过程条件来确定。一旦观测到下一个预测过程值，就使用加权平均来更新对预测过程值(例如，预测营养物浓度值)的估计，其中将更大权重给予具有更高确定性的估计。使用迭代方法，可以基于先前的测量结果和当前过程条件而更新最终过程值。在此方面，算法应当是递归的并且能够实时地运行以便利用当前的预测过程值、先前的值以及根据经验确定的常数。降噪技术通过降低自动反馈控制器将对其有所行动的噪声来提高从拉曼分析和PLS预测接收的测量结果的稳健性。
在获得最终的已滤波的过程值(例如，最终的已滤波的营养物浓度值)时，可以向自动反馈控制器发送最终的值(步骤104)。可以使用自动反馈控制器来控制过程变量(例如，营养物浓度)并且将所述过程变量维持在预定设定点。自动反馈控制器可以包括能够将误差值计算为所需的设定点(例如，预定设定点)与测量的过程变量之间的差值并自动地应用准确的且易响应的校正的任何类型的控制器。自动反馈控制器还应当具有能够实时地从平台接口改变的控制件。例如，自动反馈控制器应当具有允许调整预定设定点的用户界面。自动反馈控制器应当能够对预定设定点的变化进行响应。
在一个实施方案中，自动反馈控制器可以是比例积分微分(PID)控制器。在此方面，PID控制器可操作来计算预定设定点与测量的过程变量(例如，测量的营养物浓度)之间的差值并且自动地应用准确的校正。例如，当要控制细胞培养物的营养物浓度时，PID控制器可以操作来计算已滤波的营养物值与预定设定点之间的差值并且提供对营养物量的校正。在此方面，PID控制器可以可操作地连接到生物反应器上的营养物泵，使得可以将校正量的营养物泵送到生物反应器中(步骤105)。
通过使用拉曼实时分析和反馈控制，本发明的方法能够向细胞培养物中提供连续的降低的浓度的营养物。也就是说，本发明的方法能够向细胞培养物提供稳态营养物添加。在一个实施方案中，为了维持预定营养物浓度，可以在一段时间内经由营养物泵连续地向细胞培养物中泵送营养物。在另一个实施方案中，可以在工作周期内经由营养物泵向细胞培养物中添加营养物。例如，在此方面，营养物的添加可以是交替的或者在一段时间内间歇地进行。
所公开的方法和系统还允许在包含比使用每日大剂量营养物补料策略的培养基中的营养物浓度低的营养物浓度范围，例如葡萄糖浓度范围的培养基中生产生物产品。在一个实施方案中，营养物浓度，例如葡萄糖浓度比大剂量营养物补料低至少3g/L。在另一个实施方案中，营养物浓度，例如葡萄糖浓度比使用大剂量营养物补料获得的培养基中的营养物浓度低至少5g/L。在又一个实施方案中，营养物浓度，例如葡萄糖浓度比使用大剂量营养物补料获得的营养物浓度低至少6g/L。
此外，通过所公开的系统和方法实现的培养基中的较低的营养物浓度和稳态添加允许减少蛋白质和单克隆抗体中的翻译后修饰。在一个实施方案中，所公开的方法和系统以接近或以培养物中的细胞吸收或消耗营养物的速率递送营养物。随时间推移进行的小剂量营养物的稳态添加允许产生与标准大剂量补料添加相比较具有更低的翻译后修饰水平，例如更低的糖化水平的生物产品。重要的是，降低浓度的营养物的稳态添加不会影响抗体产生。在一个实施方案中，当与在标准大剂量补料添加情况下观测到的翻译后修饰相比较时，降低的营养物浓度使翻译后修饰减少多达30％。在另一个实施方案中，当与在标准大剂量补料添加情况下观测到的翻译后修饰相比较时，降低的营养物浓度使翻译后修饰减少多达40％。在又一个实施方案中，当与在标准大剂量补料添加情况下观测到的翻译后修饰相比较时，降低的营养物浓度使翻译后修饰减少多达50％。
Ⅲ.生物反应器系统
另一个实施方案提供了用于监测和控制生物反应器细胞培养物中的一个或多个过程变量的系统。多个部件被整合到具有单个用户界面的单个系统中。参考图2，拉曼分析仪200可以可操作地连接到生物反应器300。在此方面，拉曼探针可以插入到生物反应器300中以获得细胞培养物内的一个或多个过程变量，例如营养物浓度的原始光谱数据。拉曼分析仪200还可以可操作地连接到计算机系统500，使得可以接收并处理所获得的原始光谱数据。
计算机系统500通常可以使用一个或多个编程的通用计算机系统，诸如嵌入式处理器、片上系统、个人计算机、工作站、服务器系统和小型计算机或大型计算机，或者在分布式联网计算环境中实施。计算机系统500可以包括一个或多个处理器(CPU)502A-502N、输入/输出电路504、网络适配器506和存储器508。CPU 502A-502N执行程序指令以便执行本发明系统和方法的功能。通常，CPU 502A-502N是一个或多个微处理器，诸如INTEL
Figure BDA0002405141100000131
处理器。
输入/输出电路504提供向计算机系统500输入数据或从所述计算机系统输出数据的能力。例如，输入/输出电路可以包括：输入装置，诸如键盘、鼠标、触控板、轨迹球、扫描仪、模数转换器等；输出装置，诸如视频适配器、显示器、打印机等；以及输入/输出装置，诸如调制解调器等。网络适配器506使装置500与网络510对接。网络510可以是包括但不限于互联网的任何公共或专有LAN或WAN。
存储器508存储由CPU 502执行来执行计算机系统500的功能的程序指令以及由所述CPU 502使用和处理来执行所述功能的数据。存储器508可以包括例如电子存储器装置，诸如随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可编程只读存储器(PROM)、电可擦可编程只读存储器(EEPROM)、快闪存储器等；以及机电式存储器，诸如磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器等，所述机电式存储器可以使用电子集成驱动器(IDE)接口或者其变化或增强型式，诸如增强型IDE(EIDE)或超直接存储器存取(UDMA)；或基于小型计算机系统接口(SCSI)的接口或者其变化或增强型式，诸如快-SCSI、宽-SCSI、快且宽的-SCSI等；或串行高级技术附件(SATA)或者其变化或增强型式；或光纤通道仲裁环路(FC-AL)接口。
存储器508可以包括控制器例程512、控制器数据514和操作系统520。控制器例程512可以包括用于执行处理来实施一个或多个控制器的软件例程。控制器数据514可以包括由控制器例程512执行处理所需的数据。在一个实施方案中，控制器例程512可以包括用于执行多元分析，诸如PLS回归建模的多元软件。在此方面，控制器例程512可以包括用于执行化学计量PLS建模的SIMCA-QPp(MKS Data Analytic Solutions,Umea,Sweden)。在另一个实施方案中，控制器例程512还可以包括用于对数据集执行降噪的软件。在此方面，控制器例程512可以包括用于执行降噪滤波器模型的MATLAB Runtime(The Mathworks Inc.,Natick,MA)。此外，控制器例程512可以包括用于操作自动反馈控制器，例如PID控制器的软件，诸如MATLAB Runtime。用于操作自动反馈控制器的软件应当能够计算预定设定点与测量的过程变量(例如，测量的营养物浓度)之间的差值并且自动地应用准确的校正。因此，计算机系统500还可以可操作地连接到营养物泵400，使得可以将校正量的营养物泵送到生物反应器300中。
所公开的系统可以控制和监测单个生物反应器或多个生物反应器中的过程变量。在一个实施方案中，所述系统可以控制和监测至少两个生物反应器中的过程变量。在另一个实施方案中，所述系统可以控制和监测至少三个生物反应器或至少四个生物反应器中的过程变量。例如，所述系统可以在一个小时内监测多达四个生物反应器。
实施例
以下非限制性实施例演示了根据本发明的用于控制生物反应器细胞培养物中的一个或多个过程变量的方法。所述实施例仅仅说明本发明的优选实施方案，并且不应被解释为限制本发明，本发明的范围由所附权利要求限定。
实施例1
材料和方法
哺乳动物细胞培养过程利用在化学成分确知的基础培养基中生长的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。在由RSLogix 5000软件(Rockwell Automation,Inc.Milwaukee,WI)控制的60L中试规模的不锈钢生物反应器中执行生产。
用于模型的数据收集包括利用BIO-PRO光学器件(Kaiser Optical Systems,Inc.Ann Arbor,MI)的来自Kaiser RamanRXN2和RamanRXN4分析仪(Kaiser OpticalSystems,Inc.Ann Arbor,MI)两者的光谱数据。将RamanRXN2和RamanRXN4分析仪操作参数设定为10秒扫描时间，进行75次累积。将接至RSLinx OPC服务器的OPC读取器/写入器用于数据流转。
使用SIMCA 13(MKS Data Analytic Solutions,Umea,Sweden)来将光谱数据内的峰值与离线葡萄糖测量结果相关联。对原始光谱数据执行以下光谱滤波：以21cm-1进行的1阶导数点平滑，所述点平滑用于去除变化的基线；以及标准正态变量(SNV)归一化，所述SNV归一化用于对激光功率变化和暴露时间进行校正。
用在Nova Bioprofile Flex(Nova Biomedical,Waltham,MA)上取得的对应的离线测量结果创建偏最小二乘回归模型。下表1A示出了营养物化学计量型偏最小二乘回归模型的细节。
表1A：营养物化学计量型偏最小二乘回归模型细节
营养物PLS模型变量 值
观测结果 223
波长范围(cm<sup>-1</sup>) 350-3100
营养物浓度范围(g/L) 0.65-8.63
RMSEE 0.430
RSMECV 0.662
R<sup>2</sup>X 0.982
Q<sup>2</sup> 0.869
还将执行信号处理技术，确切地说是降噪滤波。降噪技术将原始测量结果与基于模型的估计进行组合以实现测量结果根据模型应当产生的结果。使用迭代方法，所述降噪技术允许基于先前的测量结果和当前过程条件而更新已滤波的测量结果。
利用有算法单独地编程在MATLAB Runtime(The Mathworks Inc.,Natick,MA)中的反作用的比例积分微分(PID)控制装置。PID控制器的诸如调谐常数的所有变量都能够实时地从平台接口改变。
结果
图3示出了通过离线营养物样品确认的预测营养物过程值。如从图3可以看到，拉曼分析仪和化学计量模型在离线分析方法变化的情况下预测营养物浓度值。这证明了根据本发明的方法的原位拉曼光谱和化学计量建模提供对营养物浓度值的准确测量。
图4示出了在信号处理技术之后的已滤波的最终营养物过程值。如从图4可以看到，信号处理技术降低了原始的预测营养物过程值的噪声。对预测营养物值的降噪滤波提高了整个反馈控制系统的稳健性。
图5示出了在反馈控制的连续营养物分批补料中营养物浓度的预定设定点偏移之后的预测营养物过程值和已滤波的最终营养物过程值。如通过已滤波的营养物过程值的调整可以看到，当出现营养物浓度设定点的偏移时观测到了来自反馈控制器的成功响应。事实上，PID控制器能够快速地对设定点变化进行响应，从而在没有经过噪声滤波的营养物过程值的情况下操作。
基于图3至图5所示的结果，本发明的方法提供了使得能够在连续且稳定的营养物添加下进行自动反馈控制的实时数据。
实施例2
材料和方法
在250L一次性生物反应器中执行生产。创建偏最小二乘回归模型。下表1B示出了营养物化学计量型偏最小二乘回归模型的细节。
表1B：营养物化学计量型偏最小二乘回归模型细节
营养物PLS模型变量 值
观测结果 147
波长范围(cm<sup>-1</sup>) 350-3100
营养物浓度范围(g/L) 0.6-3.61
RMSEE 0.352
RSMECV 0.520
R<sup>2</sup>X 0.769
Q<sup>2</sup> 0.617
在这个实施例中没有使用噪声滤波技术。
结果
图6示出了葡萄糖浓度对翻译后修饰的影响。如从图6可以看到，葡萄糖浓度越大，PTM的百分比越高。下表2中示出了图6中％归一化的翻译后修饰(PTM)和葡萄糖浓度随分批日而变化的数据点。
表2：图6的％归一化的PTM和葡萄糖浓度数据点
Figure BDA0002405141100000181
图7示出了根据本发明的反馈控制的连续营养物补料和大剂量营养物补料的原位拉曼预测的葡萄糖浓度值。图7中的加粗黑线表示预定设定点。预定设定点(SP1)最初设定在3g/L(SP1)并且增加到5g/L(SP2)。如从图7可以看到，在预定设定点偏移期间准确地调整了拉曼预测的葡萄糖浓度。下表3中示出了图7中拉曼预测的葡萄糖浓度值随分批日而变化的数据点。
表3：图7的拉曼预测的葡萄糖浓度数据点
Figure BDA0002405141100000191
Figure BDA0002405141100000201
Figure BDA0002405141100000211
Figure BDA0002405141100000221
Figure BDA0002405141100000231
Figure BDA0002405141100000241
Figure BDA0002405141100000251
Figure BDA0002405141100000261
图8示出了反馈控制的连续营养物补料和大剂量营养物补料的抗体滴度。如在图8中可以看到，抗体产生不受任一种方法的影响。以下的表4和表5分别示出了图8的大剂量补料抗体滴度和反馈控制抗体滴度数据点。
表4：图8的大剂量补料抗体滴度数据点
Figure BDA0002405141100000271
表5：图8的反馈控制抗体滴度数据点
Figure BDA0002405141100000272
Figure BDA0002405141100000281
图9示出了因葡萄糖浓度所致的归一化的PTM的百分比。如从图9可以看到，随着葡萄糖浓度从约6g/L-8g/L(大剂量补料收获的设定点)下降到5g/L(设定点2)，再下降到3g/L(设定点1)，PTM也出现下降。换言之，较少地暴露于营养物会带来PTM的减少。下表6中示出了图9中的归一化的PTM的百分比的数据点。
表6：图9的％归一化的PTM数据点
条件 ％的翻译后修饰 ％的归一化的翻译后修饰
SP增加的第1天 12.03 0.401
SP增加的第0天 11.79 0.393
SP增加的第1天 14.88 0.496
SP增加的第2天 16.48 0.549333333
SP增加的第3天 17.58 0.586
SP增加的第4天 20.63 0.687666667
大剂量补料收获 27.2 0.906666667
图10示出了根据本发明的反馈控制的连续营养物补料和大剂量营养物补料的葡萄糖浓度。如通过图10可以看到，本发明的方法能够提供降低的稳定浓度的葡萄糖。下表7中示出了图10中的葡萄糖浓度的数据点。
表7：图10的葡萄糖浓度数据点
Figure BDA0002405141100000282
Figure BDA0002405141100000291
Figure BDA0002405141100000301
Figure BDA0002405141100000311
Figure BDA0002405141100000321
Figure BDA0002405141100000331
Figure BDA0002405141100000341
Figure BDA0002405141100000351
Figure BDA0002405141100000361
Figure BDA0002405141100000371
Figure BDA0002405141100000381
Figure BDA0002405141100000391
Figure BDA0002405141100000401
Figure BDA0002405141100000411
Figure BDA0002405141100000421
Figure BDA0002405141100000431
Figure BDA0002405141100000441

Claims (38)

1.一种用于控制细胞培养基条件的方法，所述方法包括：
使用原位拉曼光谱对所述细胞培养基中的一种或多种分析物进行定量；以及
调整所述细胞培养基中的一个或多个分析物浓度以匹配预先确定的分析物浓度，所述预先确定的分析物浓度将所述细胞培养基中的蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至30％。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述翻译后修饰包括糖化。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物中的蛋白质包括抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物中的蛋白质包括融合蛋白。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养基包含哺乳动物细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物是葡萄糖。
8.如权利要求7所述的方法，其中预先确定的葡萄糖浓度是0.5至8.0g/L。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述葡萄糖浓度是1.0g/L至3.0g/L。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述葡萄糖浓度是2.0g/L。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述葡萄糖浓度是1.0g/L。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述预先确定的分析物浓度将所述细胞培养基中的蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至20％。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述预先确定的分析物浓度将所述细胞培养基中的蛋白质的翻译后修饰维持为5.0％至10％。
14.如权利要求1所述的方法，其中连续地执行所述对分析物进行的定量。
15.如权利要求1所述的方法，其中间歇地执行所述对分析物进行的定量。
16.如权利要求1所述的方法，其中间隔地执行所述对分析物进行的定量。
17.如权利要求1所述的方法，其中以5分钟间隔执行所述对分析物进行的定量。
18.如权利要求1所述的方法，其中以10分钟间隔执行所述对分析物进行的定量。
19.如权利要求1所述的方法，其中以15分钟间隔执行所述对分析物进行的定量。
20.如权利要求1所述的方法，其中每小时地执行所述对分析物进行的定量。
21.如权利要求1所述的方法，其中至少每天执行所述对分析物进行的定量。
22.如权利要求1所述的方法，其中自动地执行所述对分析物浓度进行的调整。
23.如权利要求1所述的方法，其中对至少两种不同的分析物进行定量。
24.如权利要求1所述的方法，其中对至少三种不同的分析物进行定量。
25.如权利要求1所述的方法，其中对至少四种不同的分析物进行定量。
26.一种减少分泌性蛋白质的翻译后修饰的方法，所述方法包括：
在包含0.5至8.0g/L葡萄糖的细胞培养基中培养分泌所述蛋白质的细胞；
使用原位拉曼光谱增量式地确定在培养所述细胞期间所述细胞培养基中的葡萄糖浓度；
通过每小时自动地递送多个剂量的葡萄糖来调整所述葡萄糖浓度以将所述葡萄糖浓度维持为0.5至8.0g/L，以便将所述分泌性蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至30.0％。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述葡萄糖浓度为1.0至3.0g/L。
28.一种用于控制细胞培养基条件的系统，所述系统包括：
一个或多个处理器，所述一个或多个处理器与计算机可读介质通信，所述计算机可读介质存储软件代码以由所述一个或多个处理器执行以便使所述系统：
从原位拉曼光谱仪接收包括细胞培养基中的一种或多种分析物的浓度的数据；以及
调整所述细胞培养基中的一个或多个分析物浓度以匹配预先确定的分析物浓度，所述预先确定的分析物浓度将所述细胞培养基中的蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至30％。
29.如权利要求28所述的系统，其中所述软件代码被进一步配置成使所述系统对所述数据执行化学计量分析。
30.如权利要求29所述的系统，其中所述化学计量分析包括偏最小二乘回归建模。
31.如权利要求28所述的系统，其中所述软件代码被进一步配置成使所述系统对所述数据执行一种或多种信号处理技术。
32.如权利要求31所述的系统，其中所述信号处理技术包括降噪技术。
33.一种用于减少分泌性蛋白质的翻译后修饰的系统，所述系统包括：
一个或多个处理器，所述一个或多个处理器与计算机可读介质通信，所述计算机可读介质存储软件代码以由所述一个或多个处理器执行以便使所述系统：
从原位拉曼分析仪增量式地接收包含在培养分泌所述蛋白质的细胞期间细胞培养基中的葡萄糖浓度的光谱数据；以及
通过每小时自动地递送多个剂量的葡萄糖来调整所述葡萄糖浓度以将所述葡萄糖浓度维持为0.5至8.0g/L，以便将所述分泌性蛋白质的翻译后修饰维持为1.0％至30.0％。
34.如权利要求33所述的系统，其中所述软件代码被进一步配置成使所述系统将所述光谱数据内的峰值与葡萄糖浓度相关联。
35.如权利要求33所述的系统，其中所述软件代码被进一步配置成对所述光谱数据执行偏最小二乘回归建模。
36.如权利要求33所述的系统，其中所述软件代码被进一步配置成对所述光谱数据执行降噪技术。
37.如权利要求33所述的系统，其中对所述葡萄糖浓度进行的所述调整是由自动反馈控制软件执行。
38.如权利要求33所述的系统，其中所述葡萄糖浓度为1.0至3.0g/L。
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