TW201928042A - 用於控制細胞培養物中之製程變數的原位拉曼光譜系統及方法 - Google Patents

用於控制細胞培養物中之製程變數的原位拉曼光譜系統及方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供用於監測及控制生物反應器細胞培養物中之一或多個製程變數以便改良產物品質及一致性的原位拉曼光譜方法及系統。該等方法及系統利用原位拉曼光譜及化學計量模型化技術以便對細胞培養物進行即時評定，組合利用訊號處理技術以便對細胞培養物製程變數進行精確連續反饋及模型預測控制。藉由使用來自拉曼光譜之即時資料，可連續地或間歇性地監測細胞培養物內之製程變數，且自動化反饋控制器使該等製程變數維持在預定設定點，或維持遞送可變量之試劑至該生物反應器之特定饋料方案以使生物產物之品質最佳化。

Description

用於控制細胞培養物中之製程變數的原位拉曼光譜系統及方法
本發明大體上係關於生物反應器系統及方法，包括用於監測及控制生物反應器細胞培養物中之一或多個製程變數的原位拉曼光譜方法及系統。
美國食品藥物管理局(FDA)之製程分析技術(PAT)框架激勵自願開發及實施製程開發、製程分析及製程控制之創新性解決方案，以便更好地理解製程及控制產物品質。在製造過程中監測並控制製程參數。舉例而言，在製造生物產物期間向生物反應器中之細胞培養物中饋送營養物為一重要製程參數。當前生物產物製造包括每日團狀饋料之饋料策略。在當前之方法下，每日團狀饋料使細胞培養物中之營養物濃度每天增加至少五倍。為了確保培養物不會在饋料之間便耗竭營養物，每日團狀饋料維持營養物處於高濃度水準。實際上，各饋料設計為具有維持培養物直至下一次饋料所需之所有營養物。然而，各每日團狀饋料中之大量營養物可導致生物反應器中之營養物水準大幅擺動，從而導致生產培養物之產物品質輸出的不一致性。
另外，各每日團狀饋料中之營養物之高濃度有助於增加所得生物產物中之轉譯後修飾。舉例而言，細胞培養物中之高葡萄糖濃度可能導致最終生物產物中之糖化增加。糖化為非酶促添加還原糖至蛋白質之胺基酸殘基，典型地發生在蛋白質之N末端胺及帶正電胺基處。所得糖化產物可具有黃色或棕色光學性質，從而可獲得有色藥物產品(Hodge JE(1953)J Agric Food Chem.1：928-943)。糖化亦可能導 致單一生產批次之治療單株抗體(mAb)內存在電荷變異體，並且造成結合抑制(Haberger M等人，(2014)MAbs.6：327-339)。
因此，在企圖使PAT創製更進一步時，仍需要能夠最佳化細胞培養物內之營養物濃度從而獲得更高品質產物的方法或系統。
本文中揭示用於監測並控制生物反應器細胞培養物中之一或多個製程變數的原位拉曼光譜方法及系統。
本發明之一個實施例包括一種用於控制細胞培養基條件之方法，該方法包括使用原位拉曼光譜對細胞培養基中之一或多種分析物進行定量；及調節該細胞培養基中之該一或多種分析物的濃度以匹配預定分析物濃度，該等預定分析物濃度使該細胞培養基中之蛋白質之轉譯後修飾維持在1.0%至30%。在一些實施例中，該轉譯後修飾包括糖化。在其他實施例中，該細胞培養物中之蛋白質包括抗體、其抗原結合片段或融合蛋白質。在其他實施例中，該細胞培養基包括哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞。
在一些實施例中，該分析物為葡萄糖。在此態樣中，該預定葡萄糖濃度為0.5至8.0g/L。在另一實施例中，該預定葡萄糖濃度為1.0g/L至3.0g/L。在另一實施例中，該葡萄糖濃度為2.0g/L或1.0g/L。在其他實施例中，該預定分析物濃度使該細胞培養基中之蛋白質之轉譯後修飾維持在1.0%至20%或5.0%至10%。在其他實施例中，連續地或間歇性地對分析物進行該定量。舉例而言，以5分鐘間隔、10分鐘間隔或15分鐘間隔對分析物進行該定量。在其他實施例中，每小時或至少每日對分析物進行該定量。在一些實施例中，自動對分析物濃度進行該調節。在其他實施例中，對至少兩種或至少三種或至少四種不同的分析物進行定量。
本發明之另一實施例包括一種用於減少分泌蛋白質之轉譯後修飾的方法，其包括在包括0.5至8.0g/L葡萄糖之細胞培養基中培養分泌該蛋白質之細胞；在培養該等細胞期間使用原位拉曼光譜法漸增式測定該細胞培養基中之葡萄糖濃度；及藉由每小時自動遞送 多劑量之葡萄糖來調節該葡萄糖濃度以便使該葡萄糖濃度維持在0.5至8.0g/L，從而使該分泌蛋白質之轉譯後修飾維持在1.0%至30.0%。在一個實施例中，該葡萄糖濃度為1.0至3.0g/L。
儲存由該一或多個處理器執行之軟體代碼的電腦可讀媒體通訊，以促使該系統接收來自原位拉曼光譜儀之包含該細胞培養基中之一或多種分析物之濃度的資料，並且調節該細胞培養基中之該一或多種分析物的濃度以匹配預定分析物濃度，該等預定分析物濃度使該細胞培養基中之蛋白質之轉譯後修飾維持在1.0%至30%。在一個實施例中，該軟體代碼經進一步配置以促使該系統對該資料執行化學計算分析，例如偏最小平方回歸模型化。在其他實施例中，該軟體代碼經進一步配置以促使該系統對該資料執行一或多種訊號處理技術，例如雜訊減除技術。
本發明之另一實施例包括一種用於減少分泌蛋白質之轉譯後修飾的系統，其包括一或多個處理器，該一或多個處理器與儲存由該一或多個處理器執行之軟體代碼的電腦可讀媒體通訊，以促使該系統漸增式接收來自原位拉曼分析儀之包含在對分泌該蛋白質之細胞進行培養期間該細胞培養基中之葡萄糖濃度的光譜資料，並且藉由每小時自動遞送多劑量之葡萄糖來調節該葡萄糖濃度以便使該葡萄糖濃度維持在0.5至8.0g/L，例如1.0至3.0g/L，從而使該分泌蛋白質之轉譯後修飾維持在1.0%至30.0%。在一個實施例中，該軟體代碼經進一步配置以促使該系統將該光譜資料內之諸峰與葡萄糖濃度相關聯。在另一實施例中，該軟體代碼經進一步配置以便對該光譜資料執行偏最小平方回歸模型化。在另一實施例中，該軟體代碼經進一步配置以便對該光譜資料執行雜訊減除技術。在其他實施例中，該葡萄糖濃度之該調節係由自動化反饋控制軟體來執行。
可根據結合下文所描述之附圖而提供的以下實施方式來確定本發明之其他特徵及優勢：圖1為根據本發明之一個實施例之用於控制細胞培養物中之製程變數之方法的流程圖。
圖2為與圖1相關之根據本發明之用於控制細胞培養物中之製程參數之系統的示意圖。
圖3為顯示由離線營養物樣品證實之預計營養物製程值之圖。
圖4為顯示根據本發明之訊號處理技術之後的經過濾之最終營養物製程值的圖。
圖5為顯示營養物濃度之預定義設定點變化之後的預計營養物製程值及經過濾之最終營養物製程值的圖。
圖6為顯示根據本發明之反饋控制連續營養物饋料及團式營養物饋料之葡萄糖濃度對轉譯後修飾之影響的線圖。
圖7為顯示根據本發明之反饋控制連續營養物饋料及團式營養物饋料之原位拉曼預計葡萄糖濃度值的圖。
圖8為顯示根據本發明之反饋控制連續營養物饋料及團式營養物饋料之抗體效價的線圖。
圖9為顯示由葡萄糖濃度引起之轉譯後修飾之標準化百分比的條形圖。
圖10為顯示根據本發明之反饋控制連續營養物饋料及團式營養物饋料之葡萄糖濃度的圖。
圖11為顯示反饋控制細胞培養與團式饋料策略細胞培養相比可使PTM減少高達50%的圖。
I.定義
除非上下文另外清楚地指出，否則如本文所使用，單數形式「一」及「該」包括複數參照物。
除非本文中另外指示，否則本文中對值範圍之敍述僅意欲充當個別地提及屬於該範圍內之各獨立值的簡寫方法，且各獨立值併入本說明書中，就如同在本文中個別地對其進行敍述。
使用術語「約」意欲描述在所陳述之值以上或以下大約+/-10%範圍內之值；在其他實施例中，該等值可處於在所陳述之值以上或以下大約+/-5%範圍內之值的範圍內；在其他實施例中，該等值可 處於在所陳述之值以上或以下大約+/-2%範圍內之值的範圍內；在其他實施例中，該等值可處於在所陳述之值以上或以下大約+/-1%範圍內之值的範圍內。前述範圍意欲由上下文闡明，且並未隱含進一步限制。除非本文中另外指示或明顯與上下文相矛盾，否則本文中所描述之所有方法均可按任何適合之順序進行。除非另有主張，否則本文中所提供之任何及所有實例或例示性措辭(例如，"諸如")的使用均僅意欲更好地說明本發明，而非對本發明之範疇施加限制。本說明書中之措辭不應被視為指示任何未主張之要素對於實踐本發明為必需的。
術語「生物產物」係指生物反應器製程中所製造之任何抗體、抗體片段、經修飾抗體、蛋白質、糖蛋白或融合蛋白質以及最終原料藥。
術語「控制」係指將細胞培養物中之製程變數之量或濃度水準調節至預定義設定點。
術語「監測」係指對細胞培養物中之製程變數之量或濃度水準或者細胞培養物中之製程條件進行定期檢查。
術語「穩態」係指維持細胞培養物中之營養物濃度、製程參數或品質屬性處於不變、恆定或穩定水準。應理解，不變、恆定或穩定水準係指預定設定點內之水準。操作者可在產生細胞培養物之時段期間改變設定點且因此改變穩態水準。
II.用於產生生物產物之方法
一個實施例提供用於監測及控制生物反應器細胞培養物中之一或多個製程變數以便改良產物品質及一致性的方法。製程參數包括但不限於葡萄糖、胺基酸、維生素、生長因子、蛋白質、活細胞計數、氧、氮、pH值、死細胞計數、細胞因子、乳酸、麩醯胺酸、其他糖(諸如果糖及半乳糖)、銨之濃度、滲透壓度及其組合。所揭示之方法及系統利用原位拉曼光譜及化學計量模型化技術以便對細胞培養物進行即時評定，組合利用訊號處理技術以便對細胞培養物製程變數進行精確連續反饋及模型預計控制。生物反應器內含物之原位拉曼光譜允許在不必物理移出生物反應器內含物樣品進行測試之情況下分析生物反應器中之一或多個製程變數。藉由使用來自拉曼光譜之即時資 料，可連續地或間歇性地監測細胞培養物內之製程變數，且自動化反饋控制器維持該等製程變數處於預定設定點，或維持遞送可變量之試劑至該生物反應器之特定饋料方案以使生物產物品質最佳化。
所揭示之方法及系統控制細胞培養製程中之一或多個製程參數。術語「細胞培養物」與「細胞培養基」可互換使用，且包括設計用於支持微生物、細胞或細胞株之生長與維持的任何固體、液體或半固體。細胞培養基內可存在諸多組分，諸如多肽、糖、鹽、核酸、細胞碎屑、酸、鹼、pH值緩衝劑、氧、氮、黏度調節劑、胺基酸、生長因子、細胞因子、維生素、輔因子及營養物。一個實施例提供哺乳動物細胞培養製程且包括哺乳動物細胞或細胞株。舉例而言，哺乳動物細胞培養製程可利用化學成分確定之基礎培養基中生長的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。
可在生物反應器中進行細胞培養製程。生物反應器包括種子馴化生物反應器、分批饋料生物反應器及連續生物反應器。生物反應器可處於約2L至約10,000L之體積範圍內。在一個實施例中，生物反應器可為60L不鏽鋼生物反應器。在另一實施例中，生物反應器可為250L生物反應器。各生物反應器亦將維持處於約5×106個細胞/mL至約100×106個細胞/mL之範圍內的細胞計數。舉例而言，生物反應器將維持約20×106個細胞/mL至約80個細胞/mL之細胞計數。
所揭示之方法及系統可監測並控制存在於細胞培養物中且具有可偵測之拉曼光譜的任何分析物。舉例而言，本發明之方法可用於監測並控制細胞培養基之任何組分，包括添加至細胞培養物中之組分、由細胞分泌之物質及細胞死亡後存在之細胞組分。可藉由所揭示之系統及方法加以監測及/或控制之細胞培養基組分包括但不限於營養物(諸如胺基酸及維生素)、乳酸、輔因子、生長因子、細胞生長速率、pH值、氧、氮、活細胞計數、酸、鹼、細胞因子、抗體及代謝物。
一個實施例提供用於監測並控制細胞培養物中之營養物濃度的方法。如本文中所使用，術語「營養物」可能係指可提供生長及存活所必需之營養的任何化合物或物質。營養物之實例包括但不限於單糖(諸如葡萄糖)、半乳糖、乳糖、果糖或麥芽糖；胺基酸；及維 生素，諸如維生素A、維生素B及維生素E。在另一實施例中，本發明之方法可包括監測並控制細胞培養物中之葡萄糖濃度。已發現可藉由控制細胞培養物中之營養物濃度，例如葡萄糖濃度來產生處於比先前使用每日團式營養物饋料策略時可能產生之濃度範圍更低的濃度範圍內的諸如蛋白質之生物產物。
此外，藉由控制細胞培養物中之營養物濃度及其他製程變數，本發明之方法進一步提供調節蛋白質之一或多個轉譯後修飾。不受任何特定理論束縛，咸信藉由在細胞培養物內提供較低營養物濃度，可減少蛋白質及抗體中之轉譯後修飾。可藉由本發明加以調節之轉譯後修飾的實例包括但不限於糖化、糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/封端基團進行衍生化、蛋白水解裂解及藉由非天然存在胺基酸進行修飾。另一實施例提供用於調節蛋白質之糖化的方法及系統。舉例而言，藉由在細胞培養基中提供較低濃度範圍之葡萄糖，可降低最終生物產物中之分泌蛋白質或抗體中之糖化水準。
圖1為用於控制生物反應器細胞培養物中之一或多個製程變數(例如營養物濃度)之例示性方法的流程圖。可將欲監測及控制之各製程變數之預定設定點程式化至該系統中。預定義設定點表示整個製程中欲維持或調節之細胞培養物中之製程變數的量。葡萄糖濃度為可監測並調節之營養物的一個實例。如以上簡要論述，已發現可在與使用每日團式營養物饋料策略時培養基中之葡萄糖濃度相比含有低水準葡萄糖之培養基中由細胞產生諸多生物產物(例如蛋白質、抗體、融合蛋白質及原料藥)。在一個實施例中，營養物濃度之預定義設定點為細胞株生長及增殖所必需之營養物之最低濃度。所揭示之方法及系統可在一段時間內向培養基遞送多個小劑量營養物或可向培養基提供穩定營養物流。在一些實施例中，可視細胞培養基內之條件而增加或減少製程期間之預定義設定點。舉例而言，若營養物濃度之預定義量在細胞培養基內引起細胞死亡或次最佳生長條件，則可增加預定設定點。然而，營養物濃度應維持在約0.5g/L至約10g/L之預定義設定點。在另一實施例中，營養物濃度應維持在約0.5g/L至約8g/L之預定義設定點。在另一實施例中，營養物濃度應維持在約1g/L至約3g/L之 預定設定點。在另一實施例中，營養物濃度應維持在約2g/L之預定義設定點。此等預定義設定點基本上提供將在整個製程中維持營養物濃度之基線水準。
在一個實施例中，藉由拉曼光譜來監測細胞培養物中之一或多個製程變數，例如營養物濃度(步驟101)。拉曼光譜為振動光譜之一種形式，其提供可用於樣品鑑定及定量之關於分子振動之資訊。在一些實施例中，使用原位拉曼光譜來監測製程變數。原位拉曼分析為一種在樣品之原始位置對其進行分析而不必提取樣品之一部分以供在拉曼光譜儀中進行分析的方法。原位拉曼分析之有利之處在於拉曼光譜分析儀為非侵入性的，從而降低污染風險，並且為非破壞性的，從而不影響細胞培養物活力或蛋白質品質。
原位拉曼分析可提供對細胞培養物中之一或多個製程變數之即時評定。舉例而言，由原位拉曼光譜提供之原始光譜資料可用於獲得並監測細胞培養物中之營養物濃度之當前量。在此態樣中，為了確保連續更新原始光譜資料，應約每10分鐘至2小時獲取來自拉曼光譜之光譜資料。在另一實施例中，應約每15分鐘至1小時獲取光譜資料。在另一實施例中，應約每20分鐘至30分鐘獲取光譜資料。
在此態樣中，可藉由允許原位拉曼分析之任何市售拉曼光譜分析儀來分析對細胞培養物中之一或多個製程變數的監測。原位拉曼分析儀應能夠獲得細胞培養物內之原始光譜資料(例如，拉曼分析儀應配備有可插入生物反應器中之探針)。適合之拉曼分析儀包括但不限於RamanRXN2及RamanRXN4分析儀(Kaiser Optical Systems,Inc，Ann Arbor，MI)。
在步驟102中，可將藉由原位拉曼光譜獲得之原始光譜資料與欲監測或控制之特定製程變數的離線量測值(例如，離線營養物濃度量測值)相比較，以便將光譜資料內之諸峰與製程變數相關聯。舉例而言，若欲監測或控制之製程變數為葡萄糖濃度，則離線葡萄糖濃度量測值可用於確定哪個光譜區展現葡萄糖信號。可藉由任何適當之分析方法來收集離線量測資料。另外，可使用任何類型之多變量套裝軟體，例如SIMCA 13(MKS Data Analytic Solutions，Umea，Sweden) 將原始光譜資料內之諸峰與欲監測或控制之特定製程變數之離線量測值相關聯。然而，在一些實施例中，可能必需利用光譜過濾器對原始光譜資料進行預處理以移除任何變化之基線。舉例而言，可利用任何類型之點平滑化技術或標準化技術對原始光譜資料進行預處理。可能需要進行標準化以修正拉曼分析儀之任何雷射功率偏差及曝光時間。在一個實施例中，可利用點平滑化(諸如一階微分與21cm-1點平滑化)及標準化(諸如標準常態變量(SNV)標準化)對原始光譜資料進行處理。
亦可對所獲得之光譜資料進行化學計算模型化。在此態樣中，可對光譜資料使用一或多種多變量方法，包括但不限於偏最小平方(PLS)、主成分分析(PCA)、正交偏最小平方(OPLS)、多變量回歸、典型相關、因子分析、叢聚分析、圖解程序及其類似方法。在一個實施例中，使用所獲得之光譜資料來建立PLS回歸模型。可藉由將預計變數及觀測變數投射至新空間來建立PLS回歸模型。在此態樣中，可使用獲自拉曼分析之量測值及離線量測值來建立PLS回歸模型。PLS回歸模型提供預計製程值，例如預計營養物濃度值。
在化學計量模型化之後，可對預計製程值(例如，預計營養物濃度值)應用訊號處理技術(步驟103)。在一個實施例中，訊號處理技術包括雜訊減除技術。在此態樣中，可對預計製程值應用一或多種雜訊減除技術。可利用熟習此項技術者已知的任何雜訊減除技術。舉例而言，雜訊減除技術可包括資料平滑化及/或訊號抑制。平滑化係藉由一系列平滑化算法及過濾器來達成，而訊號抑制使用訊號特徵來鑑別出不應包括在所分析之光譜資料中的資料。在一個實施例中，預計製程值為藉由雜訊減除過濾器加以減輕之雜訊。雜訊減除過濾器提供最終經過濾之製程值(例如，最終經過濾之營養物濃度值)。在此態樣中，雜訊減除技術將原始量測值與基於模型之估計值組合，該基於模型之估計值為將根據該模型產生之量測值。在一個實施例中，雜訊減除技術組合當前預計製程值與其不確定性。可藉由預計製程值及當前製程條件之可重複性來確定不確定性。一旦觀測到下一預計製程值後，便使用加權平均值來更新預計製程值(例如，預計營養物濃度值)之估計值，其中以更高確定性給與該估計值更大權重。使用迭代方法，可基 於先前量測值及當前製程條件來更新最終製程值。在此態樣中，該算法應為遞迴性的並且能夠即時運作以便利用當前預計製程值、先前值及實驗測定之常數。雜訊減除技術藉由減除雜訊而改良自拉曼分析接收之量測值及PLS預測的穩定性，此後自動化反饋控制器將起作用。
在獲得最終經過濾之製程值(例如，最終經過濾之營養物濃度值)後，可將最終值發送至自動化反饋控制器(步驟104)。可使用自動化反饋控制器來控制並維持製程變數(例如，營養物濃度)處於預定義設定點。自動化反饋控制器可包括能夠將誤差值計算為所要設定點(例如，預定義設定點)與量測製程變數之間的差異並且自動應用精確反應性修正的任何類型之控制器。自動化反饋控制器亦應具有能夠即時自平台介面改變之控制。舉例而言，自動化反饋控制器將具有允許調節預定義設定點之使用者介面。自動化反饋控制器應能夠響應於預定義設定點之變化。
在一個實施例中，自動化反饋控制器可為比例積分微分(PID)控制器。在此態樣中，PID控制器可操作以計算預定義設定點與量測製程變數(例如，量測營養物濃度)之間的差異並且自動應用精確修正。舉例而言，當欲控制細胞培養物之營養物濃度時，PID控制器可操作以計算經過濾之營養物值與預定義設定點之間的差異並且修正營養物量。在此態樣中，可將PID控制器可操作地連接至生物反應器上之營養物泵，以便可將修正之營養物量泵送至生物反應器中(步驟105)。
藉由使用拉曼即時分析及反饋控制，本發明之方法能夠向細胞培養物提供連續降低濃度之營養物。亦即，本發明之方法能夠向細胞培養物提供穩態營養物添加。在一個實施例中，為了維持預定義營養物濃度，可經由營養物泵在一段時間內將營養物連續泵送至細胞培養物。在另一實施例中，可經由營養物泵在工作循環中將營養物添加至細胞培養物。舉例而言，在此態樣中，營養物之添加可在一段時間內交錯或間歇性地發生。
所揭示之方法及系統亦允許在含有比使用每日團式營養物饋料策略時培養基中之營養物濃度更低的營養物濃度範圍，例如葡萄糖濃度範圍的培養基中產生生物產物。在一個實施例中，營養物 濃度，例如葡萄糖濃度比團式營養物饋料低至少3g/L。在另一實施例中，營養物濃度，例如葡萄糖濃度比使用團式營養物饋料獲得的培養基中營養物濃度低至少5g/L。在另一實施例中，營養物濃度，例如葡萄糖濃度比使用團式營養物饋料獲得的營養物濃度低至少6g/L。
此外，培養基中之較低營養物濃度及藉由所揭示之系統及方法達成之穩態添加允許減少蛋白質及單株抗體中之轉譯後修飾。在一個實施例中，所揭示之方法及系統以接近或等於培養物中之細胞吸收或消耗營養物的速率遞送營養物。在一定時間內穩態添加小劑量營養物允許產生與標準團狀饋料添加相比具有較低水準之轉譯後修飾，例如較低水準之糖化的生物產物。重要的是，穩態添加降低濃度之營養物不影響抗體產生。在一個實施例中，當與標準團狀饋料添加中所觀測之轉譯後修飾相比時，降低營養物濃度使轉譯後修飾減少多達30%。在另一實施例中，當與標準團狀饋料添加中所觀測之轉譯後修飾相比時，降低營養物濃度使轉譯後修飾減少多達40%。在另一實施例中，當與標準團狀饋料添加中所觀測之轉譯後修飾相比時，降低營養物濃度使轉譯後修飾減少多達50%。
III.生物反應器系統
另一實施例提供用於監測並控制生物反應器細胞培養物中之一或多個製程變數的系統。將多個組件整合至具有單一使用者介面之單一系統中。參考圖2，可將拉曼分析儀200可操作地連接至生物反應器300。在此態樣中，可將拉曼探針插入生物反應器300中以獲得細胞培養物內之一或多個製程變數，例如營養物濃度之原始光譜資料。亦可將拉曼分析儀200可操作地連接至電腦系統500，以便可接收並處理所獲得之原始光譜資料。
電腦系統500典型地可使用一或多個程式化通用型電腦系統，諸如嵌式處理器、晶片上之系統、個人電腦、工作站、伺服器系統及迷你電腦或大型電腦，或者在分散式網路電腦環境中實現。電腦系統500可包括一或多個處理器(CPU)502A-502N、輸入/輸出電路504、網路配接器506及記憶體508。CPU 502A-502N執行程式指令以 便進行本發明系統及方法之功能。典型地，CPU 502A-502N為一或多個微處理器，諸如INTEL CORE®處理器。
輸入/輸出電路504提供向或自電腦系統500輸入資料或輸出資料之能力。舉例而言，輸入/輸出電路可包括輸入裝置，諸如鍵盤、滑鼠、觸控墊、軌跡球、掃瞄器、類比-數位轉換器等；輸出裝置，諸如視訊配接器、監視器、印表機等；及輸入/輸出裝置，諸如數據機等。網路配接器506為裝置500與網路510之介面。網路510可為任何公用或專屬LAN或WAN，包括但不限於因特網。
記憶體508儲存CPU 502為了執行電腦系統500之功能而執行之程式指令以及使用及處理之資料。記憶體508可包括例如電子記憶體裝置，諸如隨機存取記憶體(RAM)、唯讀記憶體(ROM)、可程式化唯讀記憶體(PROM)、電可抹除可程式化唯讀記憶體(EEPROM)、快閃記憶體等；及電子機械記憶體，諸如磁碟驅動器、磁帶驅動器、光碟驅動器等，其可使用積體式驅動電子(IDE)介面或者其變化或增強形式，諸如增強型IDE(EIDE)或超直接記憶體存取(UDMA)，或基於小型電腦系統介面(SCSI)之介面或者其變化或增強形式，諸如快SCSI、寬SCSI、快-寬SCSI等，或序列先進技術附件(SATA)或者其變化或增強形式，或光纖通道仲裁迴路(FC-AL)介面。
記憶體508可包括控制器常式512、控制器資料514及操作系統520。控制器常式512可包括用於執行處理從而實施一或多個控制器的軟體常式。控制器資料514可包括控制器常式512執行處理所需之資料。在一個實施例中，控制器常式512可包括用於執行多變量分析，諸如PLS回歸模型化之多變量軟體。在此態樣中，控制器常式512可包括用於執行化學計量PLS模型化之SIMCA-QPp(MKS Data Analytic Solutions，Umea，Sweden)。在另一實施例中，控制器常式512亦可包括用於對資料集執行雜訊減除之軟體。在此態樣中，控制器常式512可包括用於執行雜訊減除過濾器模型之MATLAB Runtime(The Mathworks Inc.，Natick，MA)。此外，控制器常式512可包括用於操作自動化反饋控制器，例如PID控制器之軟體，諸如MATLAB Runtime。用於操作自動化反饋控制器之軟體應能夠計算預定義設定點與量測製 程變數(例如，量測營養物濃度)之間的差異並且自動應用精確修正。因此，亦可將電腦系統500可操作地連接至營養物泵400，以便可將修正之營養物量泵送至生物反應器300中。
所揭示之系統可控制並監測單個生物反應器或複數個生物反應器中之製程變數。在一個實施例中，該系統可控制並監測至少兩個生物反應器中之製程變數。在另一實施例中，該系統可控制並監測至少三個生物反應器或至少四個生物反應器中之製程變數。舉例而言，該系統在一小時內可監測多達四個生物反應器。
實例
以下非限制性實例說明根據本發明之用於控制生物反應器細胞培養物中之一或多個製程變數的方法。該等實例僅說明本發明之較佳實施例，而不應被視為限制本發明，本發明之範疇係由所附申請專利範圍來定義。
實例1 材料及方法
哺乳動物細胞培養製程利用化學成分確定之基礎培養基中所生長的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。在由RSLogix 5000軟體(Rockwell Automation,Inc.，Milwaukee，WI)控制之60L試驗規模不鏽鋼生物反應器中進行產生。
該模型之資料收集包括來自利用BIO-PRO光學器件(Kaiser Optical Systems,Inc.，Ann Arbor，MI)之Kaiser RamanRXN2與RamanRXN4分析儀(Kaiser Optical Systems,Inc.，Ann Arbor，MI)的光譜資料。將RamanRXN2及RamanRXN4分析儀操作參數設定至10秒掃描時間，歷經75次累加。將針對RSLinx OPC伺服器之OPC讀取器/寫入器用於資料流。
使用SIMCA 13(MKS Data Analytic Solutions，Umea，Sweden)將光譜資料內之諸峰與離線葡萄糖量測值相關聯。對原始光譜資料進行以下光譜過濾：旨在移除變化基線之一階微分與21cm-1點平滑化及旨在修正雷射功率偏差及曝光時間之標準常態變量(SNV)標準化。
利用Nova Bioprofile Flex(Nova Biomedical，Waltham，MA)上獲取之相應離線量測值來建立偏最小平方回歸模型。以下表1A顯示營養物化學計量偏最小平方回歸模型之詳情。
亦執行訊號處理技術，特定言之，雜訊減除過濾。雜訊減除技術將原始量測值與基於模型之估計值組合，該基於模型之估計值為將根據該模型產生之量測值。使用迭代方法，允許基於先前量測值及當前製程條件來更新經過濾之量測值。
利用具有MATLAB Runtime(The Mathworks Inc.，Natick，MA)中單獨程式化之算法的逆作用比例-積分-微分(PID)控制。PID控制器之所有變數，諸如調諧常數，能夠即時自平台介面改變。
結果
圖3顯示由離線營養物樣品證實之預計營養物製程值。如由圖3可見，拉曼分析儀及化學計量模型預測之營養物濃度值在離線分析方法之變異性內。此說明根據本發明方法之原位拉曼光譜及化學計量模型化提供營養物濃度值之精確量測值。
圖4顯示訊號處理技術之後的經過濾之最終營養物製程值。如由圖4可見，訊號處理技術使原始預計營養物製程值之雜訊減少。預計營養物值之雜訊減除過濾使總體反饋控制系統之穩定性增加。
圖5顯示反饋控制連續營養物饋料批次中之營養物濃度之預定義設定點變化之後的預計營養物製程值及經過濾之最終營養物製程值。如藉由對經過濾之營養物製程值進行的調節可見，當營養物濃度設定點發生改變時，觀測到來自反饋控制器之成功反應。實際上，PID控制器能夠快速響應於設定點變化而離線操作經雜訊過濾之營養物製程值。
基於圖3至圖5中所示之結果，本發明之方法提供即時資料，使得能夠進行自動化反饋控制，以便進行連續穩定營養物添加。
實例2 材料及方法
在250L單次使用生物反應器中進行產生。建立偏最小平方回歸模型。以下表1B顯示營養物化學計量偏最小平方回歸模型之詳情。
此實例中未使用雜訊過濾技術。
結果
圖6顯示葡萄糖濃度對轉譯後修飾之影響。如由圖6可見，葡萄糖濃度愈高，PTM百分比愈高。以下表2中顯示圖6中之批次日期內之標準化轉譯後修飾(PTM)%及葡萄糖濃度之資料點。
圖7顯示根據本發明之反饋控制連續營養物饋料及團狀營養物饋料的原位拉曼預計葡萄糖濃度值。圖7中之加粗黑線表示預定義設定點。起初將預定義設定點(SP1)設定在3g/L(SP1)，並且增至5g/L(SP2)。如由圖7可見，在改變預定義設定點期間精確地調節拉曼預計葡萄糖濃度。以下表3中顯示圖7中之批次日期內之拉曼預計葡萄糖濃度值之資料點。
圖8顯示反饋控制連續營養物饋料及團狀營養物饋料之抗體效價。如圖8中可見，抗體產生不受任一種方法影響。以下表4及表5分別顯示圖8之團狀饋料抗體效價及反饋控制抗體效價資料點。
圖9顯示由於葡萄糖濃度所致之標準化PTM%。如由圖9可見，隨著葡萄糖濃度自約6g/L-8g/L(團式饋料收集之設定點)降至5g/L(設定點2)至3g/L(設定點1)，PTM有所減少。換言之，較低營養物曝露引起PTM減少。圖9中之標準化PTM%資料點示於以下表6中。
圖10顯示根據本發明之反饋控制連續營養物饋料及團狀營養物饋料之葡萄糖濃度。如由圖10可見，本發明之方法能夠提供降低之穩定葡萄糖濃度。圖10中之葡萄糖濃度資料點示於以下表7中。
實例2：反饋控制與團式饋料策略之比較 材料及方法
在如以上所描述之反饋控制或團式饋料策略下對細胞進行培養。
結果
圖11顯示使用反饋控制或團式饋料策略加以培養之細胞中的PTM的差異。每一對縱柱表示批次日期。對於每一對縱柱，左側縱柱為反饋控制資料，且右側縱柱為團式饋料資料。已證實與團狀饋料策略(每一對縱柱之右側縱柱)相比，反饋控制策略(每一對縱柱之左側縱柱)使後續實驗中之PTM%水準降低。將營養物設定點控制在恆定水準可在生產過程中穩定地維持PTM%。PTM%相對於團狀饋料策略亦有所降低，因而說明能夠經由拉曼光譜反饋控制來控制抗體品質。
所揭示之反饋控制培養系統及方法無需移出樣品便可提供即時多組分分析。即時資料使得能夠針對連續營養物添加進行自動反饋控制。反應性營養物之較低穩定生物反應器濃度使得抗體PTM水準相對於標準團狀營養物饋料降低超過50%，因而改良產物品質及一致性。
儘管在上述說明書中，已關於本發明之某些實施例對本發明進行描述，且已出於說明目的而提出許多細節，但熟習此項技術 者將顯而易知，本發明易受其他實施例影響且本文中所描述之某些細節可在不背離本發明之基本原則的情況下進行相當大的改變。
本文中所引用之所有參考文獻均以引用之方式整體併入。可在不背離本發明之精神或基本屬性的情況下將本發明實施為其他特定形式，且因此，應參考指示本發明之範疇的所附申請專利範圍而非上述說明書。

Claims (38)

  1. 一種用於控制細胞培養基條件之方法，其包括：使用原位拉曼光譜法對該細胞培養基中之一或多種分析物進行定量；及調節該細胞培養基中之該一或多種分析物的濃度以匹配預定分析物濃度，該等預定分析物濃度使該細胞培養基中之蛋白質的轉譯後修飾維持在1.0%至30%。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該轉譯後修飾包含糖化。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項中任一項之方法，其中該細胞培養物中之蛋白質包含抗體或其抗原結合片段。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項中任一項之方法，其中該細胞培養物中之蛋白質包含融合蛋白質。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法，其中該細胞培養基包含哺乳動物細胞。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該等哺乳動物細胞包含中國倉鼠卵巢細胞。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該分析物為葡萄糖。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該預定葡萄糖濃度為0.5至8.0g/L。
  9. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該葡萄糖濃度為1.0g/L至3.0g/L。
  10. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該葡萄糖濃度為2.0g/L。
  11. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該葡萄糖濃度為1.0g/L。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等預定分析物濃度使該細胞培養基中之蛋白質的轉譯後修飾維持在1.0%至20%。
  13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等預定分析物濃度使該細胞培養基中之蛋白質的轉譯後修飾維持在5.0%至10%。
  14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中連續地對分析物進行該定量。
  15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中間歇性地對分析物進行該定量。
  16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中以多種間隔對分析物進行該定量。
  17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中以5分鐘間隔對分析物進行該定量。
  18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中以10分鐘間隔對分析物進行該定量。
  19. 如申請專利範圍第1項之方法，其中以15分鐘間隔對分析物進行該定量。
  20. 如申請專利範圍第1項之方法，其中每小時對分析物進行該定量。
  21. 如申請專利範圍第1項之方法，其中至少每日對分析物進行該定量。
  22. 如申請專利範圍第1項之方法，其中自動對分析物濃度進行該調節。
  23. 如申請專利範圍第1項之方法，其中對至少兩種不同的分析物進行定量。
  24. 如申請專利範圍第1項之方法，其中對至少三種不同的分析物進行定量。
  25. 如申請專利範圍第1項之方法，其中對至少四種不同的分析物進行定量。
  26. 一種用於減少分泌蛋白質之轉譯後修飾的方法，其包括：在包含0.5至8.0g/L葡萄糖之細胞培養基中培養分泌該蛋白質之細胞；在培養該等細胞期間使用原位拉曼光譜法漸增式地測定該細胞培養基中之葡萄糖濃度；藉由每小時自動遞送多劑量之葡萄糖來調節該葡萄糖濃度以使該葡萄糖濃度維持在0.5至8.0g/L，從而使該分泌蛋白質之轉譯後修飾維持在1.0%至30.0%。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該葡萄糖濃度為1.0至3.0g/L。
  28. 一種用於控制細胞培養基條件之系統，其包含：一或多個處理器，該一或多個處理器與儲存由該一或多個處理器執行之軟體代碼的電腦可讀媒體通訊，以促使該系統接收來自原位拉曼光譜儀之包含該細胞培養基中之一或多種分析物之濃度的資料；及 調節該細胞培養基中之該一或多種分析物的濃度以匹配預定分析物濃度，該等預定分析物濃度使該細胞培養基中之蛋白質之轉譯後修飾維持在1.0%至30%。
  29. 如申請專利範圍第28項之系統，其中該軟體代碼經進一步配置以促使該系統對該資料執行化學計量分析。
  30. 如申請專利範圍第29項之系統，其中該化學計量分析包含偏最小平方回歸模型化。
  31. 如申請專利範圍第28項至第30項中任一項之系統，其中該軟體代碼經進一步配置以促使該系統對該資料執行一或多種訊號處理技術。
  32. 如申請專利範圍第31項之系統，其中該訊號處理技術包含雜訊減除技術。
  33. 一種用於減少分泌蛋白質之轉譯後修飾的系統，其包含：一或多個處理器，該一或多個處理器與儲存由該一或多個處理器執行之軟體代碼的電腦可讀媒體通訊，以促使該系統漸增式地接收來自原位拉曼分析儀之包含在對分泌該蛋白質之細胞進行培養期間該細胞培養基中之葡萄糖濃度的光譜資料；及藉由每小時自動遞送多劑量之葡萄糖來調節該葡萄糖濃度以使該葡萄糖濃度維持在0.5至8.0g/L，從而使該分泌蛋白質之轉譯後修飾維持在1.0%至30.0%。
  34. 如申請專利範圍第33項之系統，其中該軟體代碼經進一步配置以促使該系統將該光譜資料中之峰值與葡萄糖濃度相關聯。
  35. 如申請專利範圍第33項至第34項中任一項之系統，其中該軟體代碼經進一步配置以便對該光譜資料執行偏最小平方回歸模型化。
  36. 如申請專利範圍第33項至第35項中任一項之系統，其中該軟體代碼經進一步配置以便對該光譜資料執行雜訊減除技術。
  37. 如申請專利範圍第33項至第36項中任一項之系統，其中該葡萄糖濃度之該調節係由自動化反饋控制軟體來執行。
  38. 如申請專利範圍第33項至第37項中任一項之系統，其中該葡萄糖濃度為1.0至3.0g/L。
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