CN114651218B - 基于拉曼光谱学预测生物过程中的参数的方法和装置组件以及控制生物过程的方法和装置组件 - Google Patents

Abstract

一种基于拉曼光谱学预测生物过程中待观察的介质的参数的方法包括以下步骤：使用第一测量组件获取水性介质的第一系列制备拉曼光谱；基于来自利用第一测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对第一系列制备拉曼光谱进行归一化；基于经归一化的制备拉曼光谱构建参数的多变量模型；利用另一测量组件获取生物过程期间待观察的介质的预测拉曼光谱；基于来自利用另一测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对预测拉曼光谱进行归一化；以及将所构建的模型应用于预测拉曼光谱以用于对所述参数进行预测。一种用于预测生物过程中待观察的介质的参数的装置组件适于执行该方法。

Description

基于拉曼光谱学预测生物过程中的参数的方法和装置组件以 及控制生物过程的方法和装置组件

本发明涉及基于拉曼光谱学预测生物过程中的参数的方法。本发明还涉及用于预测生物过程中待观察的介质的参数的装置组件。本发明还涉及控制生物过程的方法。本发明还涉及用于控制生物过程的装置组件。

拉曼光谱越来越多地用于控制生物过程。生物过程中使用的用于获取拉曼光谱的装置通常包括光谱仪和光学探针，特别是光纤探针。为了对拉曼光谱进行评估，必须构建考虑某些过程变化的模型。

环境光可能对拉曼光谱的质量产生负面影响。特别是荧光管或节能灯在拉曼光谱中展示出不期望的特征带。因此，拉曼光谱主要用于小玻璃容器，在培养期间，通过铝箔使小玻璃容器对环境光完全屏蔽。对于大规模单次使用生物反应器(如用于商业制造过程)，由于这些反应器的大小和所使用的材料，这是不容易实现的。例如，在顶部和侧面具有开口(用于传感器入口)的箔袋不能被容易地包裹在铝箔中。

在已知的基于拉曼光谱学的生物过程测量系统中，在处理批次(batch)之前获取一次“暗”拉曼光谱(在光学探针的激光器关闭的情况下)。如有必要，使用该暗拉曼光谱来校正环境光的影响。然而，在处理批次时，与单个暗测量相比，在环境光的强度发生改变的情况下，该校正失败。

此外，用于拉曼光谱测量的硬件的差异使得特别难以基于所获取的拉曼光谱来获得对介质的某些参数或特征(例如葡萄糖浓度/含量)的正确预测，并且它们对预测误差具有负面影响。主要原因在于各个光纤探针的光通量不同以及探针的光学连接中不期望的可变性。此外，在非浸入式探针的情况下，必须考虑光学接口对过程的变化。

应当注意的是，目前光学探针的光通量的差异没有得到彻底校正。大多数情况下，它们甚至不被认为是模型误差增加的原因。经典的拉曼光谱的数据预处理(例如，散射校正诸如标准正态变量变换(SNVT)和导数)在最佳情况下减小了探针差异的影响，但同时损害了信噪比。目前，通常仅接受其余差异。

通过测量校准物质(标准溶液)的拉曼光谱，可以确定探针差异并将光谱强度归一化。在该确定中必须包括全部光学器件。利用这样的方法，在对相同的样本进行测量时，不同的强度将处于同等水平，并且光学器件仅在拉曼光谱中引起略微不同的噪声分量。虽然对于可重复使用的系统而言，这是可行的方式，但是在将探针光学连接至介质的光谱接口被集成在大规模单次使用容器中的情况下，该方法将失败。由于同一单次使用生物反应器不能被使用两次，因此在获取实际生物过程中待观察的介质的拉曼光谱之前，不可能首先获取该单次使用生物反应器中的标准溶液(例如1000L)的拉曼光谱。因此，在单次使用系统中，任何校准或归一化都必须利用实际的细胞培养基来完成。

Jens A.Iverson等人在出版物“Quantitative monitoring of yeastfermentation using Raman spectroscopy”，Analytical and BioanalyticalChemistry，2014年8月，第406卷，第20期，第4911页至第4919页中提及了包括水带(waterband)的校正。根据该出版物，水带被用作内部标准并且细胞浓度是基于该内部标准计算的。应当注意的是，结果没有被归一化为水带(在这种情况下，将不再给出作为内部标准的函数)。而是，仅根据所获得的细胞浓度来校正拉曼强度的消退(extinction)，即，该校正仅针对细胞数量的差异(这根据仅使用单个装置或探针记录数据的事实是明显的)。该出版物中没有解决不同组件之间的模型的转换。

本发明的目的是使得能够基于拉曼光谱学更精确地预测生物过程中待观察的介质的参数。特别地，本发明旨在消除由用于获取拉曼光谱的光学硬件的差异所引起的不期望的变化。

上述问题通过根据权利要求1所述的方法解决。根据相应的从属权利要求，本发明的有利且合宜的实施方式是明显的。

本发明提供了一种基于拉曼光谱学预测生物过程中待观察的介质的参数的方法。根据本发明的方法包括下述步骤：使用第一测量组件获取水性介质的第一系列制备拉曼光谱；基于来自利用第一测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对第一系列制备拉曼光谱进行归一化；基于经归一化的制备拉曼光谱构建参数的多变量模型；利用另一测量组件获取生物过程期间待观察的介质的预测拉曼光谱；基于来自利用另一测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对预测拉曼光谱进行归一化；以及将经构建的模型应用于预测拉曼光谱以用于对参数进行预测。

应当注意的是，在下文中，与拉曼光谱相关的术语“所获取的”可以指已经经受了公知的暗电流校正和/或基线校正但没有根据本发明的归一化的拉曼光谱。

本发明基于以下发现：在拉曼光谱中，特征水带的强度(特定波长处的峰值)或积分(在限定波长范围内在峰值下方的面积)与用于测量拉曼光谱的硬件(在下文中称为“测量组件”)的光通量成正比。由于水总是存在于上游过程的任何介质中，因此这种关系可以用于显著减小或者甚至消除由下述引起的拉曼光谱的不期望变化的影响：(i)不同测量组件(其包括到单次使用生物反应器的相应光学接口)的不同光通量和/或(ii)不同的介质不透明度和/或(iii)不同的焦点。还可以校正由细胞引起的阴影效应。

简而言之，前面提及的关于由硬件引起的在所获取的拉曼光谱方面的差异的关系可以如下表述：如果第一测量组件对分析物的灵敏度低于第二测量组件并因此产生分析物的较弱信号，则由第一测量组件产生的特征水带的信号同样比由第二测量组件产生的相应信号弱。因此，基于来自利用相同的测量组件获取的拉曼光谱的特征水带分别对每个拉曼光谱进行归一化，使不同的测量组件的不同灵敏度处于同等水平。

本发明还促进了技术的跨规模应用以及不同工艺规模之间的模型转换。因此，本发明优化了拉曼光谱在细胞培养中的使用。

优选地，使用约1640cm^-1处的特征水带对制备拉曼光谱和/或预测拉曼光谱进行归一化。与其他特征水带例如在2950cm^-1与3600cm^-1之间的特征水带相比，鉴于噪声和潜在的叠加效应，在约1640cm^-1处的特征水带产生最佳结果。

应当注意的是，在本发明的意义上，“归一化”拉曼光谱意指利用校正因子对拉曼光谱的每个波长进行处理。该校正因子可以基于特征水带的峰值(带强度)和/或峰面积(积分)。特别地，可以将特定波长的强度和/或限定波长范围内的特征水带下方的面积(积分)定义为1。校正因子对应于原始拉曼光谱与特定特性被设置为1的拉曼光谱之间的差。因此，被改变的是光谱的总体强度，而形状和其他特征保持不变。

当然，构建多变量模型不限于仅一个测量组件的经归一化的制备拉曼光谱。相比之下，本发明在使用多于一个生物反应器和多于一个测量组件来构建多变量模型的用例中特别有利。在这些情况下，还使用第二测量组件获取水性介质的(至少)第二系列制备拉曼光谱。因此，基于来自利用第二测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对第二系列制备拉曼光谱进行归一化。该方法可以被扩充到任何多个测量组件。参数的多变量模型则基于归一化的第一系列制备拉曼光谱和归一化的第二(以及任何其他)系列制备拉曼光谱。

根据第一方法，对制备拉曼光谱和/或预测拉曼光谱中的每一个分别使用来自完全相同的拉曼光谱的特征水带进行归一化。该方法通常在细胞培养中产生良好可接受的结果，这是因为该方法还考虑了培养过程中由细胞的数量增大而引起的不透明度的变化(在焦点处的辐照度由于测量组件与焦点之间的细胞处的散射而减小的情况下)。另一方面，由于细胞的数量增大，光谱质量(信噪比)通常在培养过程中劣化。

根据第二方法，对利用一个测量组件获取的一系列预备拉曼光谱和/或一系列预测拉曼光谱中的每个光谱使用从利用相同测量组件获取的同一系列拉曼光谱或另一系列拉曼光谱得出的特征水带的统计平均值特别是中值或平均值来进行归一化。这种方法简化了归一化程序，这是因为可以针对利用相同测量组件获取的一系列拉曼光谱使用相同的统计平均值。例如，可以将一个平均数据集应用于从生物过程中的一个批次获取的所有拉曼光谱。这种方法的优点在于：可以在信噪比最佳的时间点处，特别地在培养开始时，甚至可能在纯培养基中接种之前，确定用于系列中的所有拉曼光谱的归一化数据。然后，将相同的归一化数据应用于该系列的所有拉曼光谱以进行归一化。

在大多数情况下，利用与构建多变量模型所用的试验装置不同的装备来运行生物过程。这意指利用与用于获取制备拉曼光谱的测量组件不同的测量组件来获取生物过程期间待观察的介质的预测拉曼光谱。

通常，将具有一个或更多个测量组件的优选地以多并行装置(multi-parallelset-up)方式布置的若干小规模生物反应器用于建模，而将具有不同测量组件的大规模生物反应器——通常是具有固有光谱端口的单次使用生物反应器——用于要应用所述模型的生物过程。例如，光谱端口提供光学接口并且可以被焊接至袋箔。

为了构建参数的稳健定量模型，有利的是：采集水性介质的样本，执行参数的样本参考测量，以及将至少一个制备拉曼光谱与样本参考测量关联，所述至少一个制备拉曼光谱优选地为在采集样本的同时获取的制备拉曼光谱。样本参考测量可以在采样之后立即执行。样本还可以在采样与稍后的参考测量之间被冷却或冷冻，以避免进一步的代谢或使进一步的代谢最小化。

为了构建定性模型，可以得出来自制备拉曼光谱的统计值，特别地，根据主成分分析(PCA)或(正交)偏最小二乘((O)PLS)回归得出的得分值。

本发明还提供一种用于预测生物过程中待观察的介质的参数的装置组件。该装置组件适于执行根据本发明的预测参数的方法。

根据用于执行构建合适模型所需的初始实验的优选装置，装置组件包括多个小规模生物反应器，所述多个小规模生物反应器包含被获取制备拉曼光谱的水性介质。小规模生物反应器优选地是自动化的并且以多并行装置方式布置。这样的装置能够实现高通量和工艺条件如pH、溶解氧(dO)、接种种子密度、葡萄糖设定值、温度等的变化，从而允许快速且稳健的模型构建。

在从多个小规模生物反应器获得用于构建多变量模型的制备拉曼光谱的情况下，以下变型是可能的：

根据第一变型，每个小规模生物反应器都配备有用于获取制备拉曼光谱的单独的测量组件。这意指在生物反应器中通过各自不同的测量组件获取制备拉曼光谱。

根据第二变型，每个小规模生物反应器可连接至用于获取制备拉曼光谱的单个测量组件。这意指仅使用一个测量组件例如流动池来获取制备拉曼光谱。虽然第二变型可能因为必须顺序地记录制备拉曼光谱而需要更多时间，但是由于仅使用一个测量组件而使归一化程序得以简化。

为了运行应用所构建的模型的生物过程例如大规模制造生物过程，通常使用大规模单次使用生物反应器，该大规模单次使用生物反应器具有用于获取预测拉曼光谱的固有光谱端口。由于可以减小甚至消除固有光谱端口对测量组件的灵敏度的影响，因此即使在将具有新的光谱端口的新的生物反应器用于每个批次的情况下，应用根据本发明构建的模型导致改进的结果。

根据本发明的装置组件优选地包括多变量数据分析软件模块，该多变量数据分析软件模块用于构建多变量模型并实时应用该多变量模型。此外，该装置组件可以包括控制软件模块，该控制软件模块用于对用于获取生物过程期间的预测拉曼光谱的测量组件中的光谱仪进行控制。所述软件模块可以作为单独的“插件”解决方案来提供，其经由适当的软件接口与装置组件的其他软件部件进行通信。另一方面，所述软件模块可以组合和/或集成在装置组件的其他软件部件中。

本发明还提供了一种控制生物过程的方法，该方法包括以下步骤：通过上面定义的方法来预测生物过程中待观察的介质的参数；以及实时基于所述预测来修改生物过程的至少一个过程参数；以及/或者实时基于所述预测来启动控制动作。

例如，控制单元可以启动控制动作，所述控制动作诸如控制馈送供应(feedsupply)；添加消泡剂或采集样本(采样)。

本发明还提供了一种用于控制生物过程的装置组件。用于控制生物过程的装置组件适于执行根据本发明的控制生物过程的方法。

该装置组件可以包括用于预测上面定义的参数的装置组件，以及连接到控制软件模块和多变量数据分析软件模块的控制单元。控制单元适于实时基于预测来修改生物过程的至少一个过程参数以及/或者实时基于预测来启动控制动作。

根据以下描述以及根据所参照的附图，本发明的其他特征和优点将变得明显。在附图中：

-图1示出了根据本发明的控制生物过程的方法的详细流程图；

-图2示出了用于在生物过程中获取拉曼光谱的基本装置；

-图3示出了根据本发明的在控制生物过程的方法中使用的硬件和软件部件的示意框图；

-图4示出了利用不同探头和过程接口获取并通过现有技术方法校正的若干葡萄糖样本的拉曼光谱；

-图5示出了基于根据现有技术的校正方法的不同探针/接口组合的葡萄糖浓度的预测图；

-图6示出了通过根据本发明的方法校正的图4的拉曼光谱；以及

-图7示出了基于通过根据本发明的方法进行的校正的图5的预测图。

在下文中，在参照图4至图7说明一些示例测量和模型应用之前，参照图1的流程图以及图2和图3所示的装置来描述本发明的典型用例，其不应以限制性方式来理解。

假设生物制药制造商(用户)想要控制大规模制造生物过程并选择要整合的拉曼光谱学。用于定量预测某一参数(例如葡萄糖浓度)的稳健模型要求足够的参数变化范围、分析物之间和/或分析物与时间之间的相关性的打破、以及在制造生物过程中发生的所有过程变化的覆盖(例如pH为7并不总是精确地为7，而是可能在6.8与7.2之间变化)。这样的变化应该被覆盖在校准数据集中。

应当注意的是，在制备阶段构建稳健模型所需的实验无法以制造规模来进行，至少在经济上不行。例如，不容易引起大规模参数设置的改变。这需要太昂贵的实验设计。因此，对于用户来说，以小规模来开发模型更为有效，特别地在多个玻璃或单次使用容器中开发模型，每个玻璃或单次使用容器的容量高达10L，优选地低于5L并且最优地在1mL与0.5L之间。

为了以最有效的方式获取所需的校准点，在小规模容器中并行地进行若干培养。这是因为，与操作若干涉及更多人为干预(例如馈送、采样等)的单独的生物反应器相比，需要较少的工作的自动化的多并行微生物反应器是可用的。在理想情况下，使用多达48个完全自动化的多并行生物反应器，包括pH、溶解氧(DO)、馈送添加、采样和温度的自动控制。这样的多并行生物反应器装置的示例是英国The Automation Partnership(Cambridge)有限公司的细胞培养微生物反应器系统。

作为第一替选方案，在每个小规模生物反应器中获取拉曼光谱。这意指使用N个(对应于生物反应器的数量)不同的“测量组件”来测量拉曼光谱。如以上所提及的，术语“测量组件”用于硬件部件的单个集合，该单个集合用于获取每个生物反应器中的介质的拉曼光谱，通常包括光谱仪、探针(头)或流动池，以及任何光学接口，如生物反应器光谱端口、光纤等。尽管用于获取拉曼光谱的N个测量组件可以由相同类型的相似部件组成，但实践中它们在原理上不可能完全相同。

作为第二替选方案，从每个小规模生物反应器中采集样本并将样本顺序地转移至同一流动池，然后进行自动化光谱采集。在这种情况下，仅使用一个测量组件来获取拉曼光谱。

为了简单起见，在下文中假设使用第一替选方案。然而，如果选择第二替选方案，则涉及“每个测量组件”的说明可以简单地转换为仅一个测量组件。

具有多个多并行生物反应器的实验装置覆盖了预期的过程变化并且/或者引起变化以打破分析物之间和/或分析物与时间之间的相关性。可以使用实验设计(DoE)方法有意地引起变化，即变化是通过设计引起的而不是由巧合引起的，以便用最少的先前实验来覆盖生产中的预期变化。

为了稳定地适当校正环境光的变化，在使用每个测量组件期间，通过每个测量组件重复获取“暗”拉曼光谱(在光学探针的激光器或流动池关闭的情况下)。应当注意的是，光谱化学受体中的暗电流在很大程度上依赖于环境光。因此，暗拉曼光谱可以用于适当校正“规则的”拉曼光谱(激光器开启)。如果例如由于夜间关闭光而导致环境光的强度发生变化，则仅单个拉曼光谱出现故障，并且可以使用下一个拉曼光谱再次正确地校正环境光的影响。优选地，在每次获取规则拉曼光谱紧之前获取暗拉曼光谱，使得可以通过在前的暗拉曼光谱对每个规则拉曼光谱进行最佳校正。

除了上述暗电流校正(消隐)之外，使用例如基于非对称最小二乘(ALS)算法、滚球算法、所获取的拉曼光谱的曲线的导数或散射校正算法的方法对每个获取的规则拉曼光谱进行基线校正。

如下文将进一步描述的，对制备阶段的由此校正的拉曼光谱(在下文中称为“制备”拉曼光谱)进行归一化。归一化之后，可以反向进行基线校正。这使得能够利用任何常见的预处理，而无需必须使用经基线校正的拉曼光谱。

根据第一方法，为了对制备拉曼光谱进行归一化，根据完全相同的拉曼光谱确定特征水带尤其是约1640cm^-1处的水带的强度和/或积分。通过将每个波长处的强度除以特征水带的强度和/或积分来执行归一化。针对每个制备拉曼光谱重复该过程，即分别使用每个制备拉曼光谱自身的水带单独对其进行归一化。

根据第二方法，为了对利用相同测量组件获取的一系列制备拉曼光谱进行归一化，根据利用完全相同的测量组件获取的一系列至少两个拉曼光谱确定特征水带的统计平均值例如中值或平均值。如上所述执行归一化本身。利用这种方法，可以仅使用单个数据集来同时对一系列制备拉曼光谱进行归一化。虽然这简化了归一化程序，但结果可能不像用第一方法那样精确。然而，通过根据多于一个的拉曼光谱确定水带的统计平均值并使用该统计平均值，归一化结果仍然具有高质量，因为水带的噪声被降低了。

在水带归一化之后，将制备拉曼光谱与参考数据和生物反应器信息自动组合和/或对准。所融合的数据被用于构建一个或更多个多变量预测模型。

多变量建模可以基于定量算法，如偏最小二乘法(PLS)或正交偏最小二乘法(OPLS)，并且/或者可以基于定性算法，如批演化模型(BEM)或批级模型(BLM)，定性算法进而可以基于PLS、OPLS或主成分分析(PCA)。

定量模型需要参考数据。可以利用参考数据来构建定性模型，定性模型通常使用产品参数如产品质量或滴度(BLM)。对于BEM，通常使用批成熟度或批年龄，并且因此不需要额外的参考测量。可以从取自小规模生物反应器之一(采样)的至少一个样本获取参考数据。参考测量本身，即使用精确测量工具对参数进行精确测量，可以在采样之后直接进行，但是也还可以在数小时或数周后进行。然后，将在采样时在同一生物反应器中获取的制备拉曼光谱与参数的参考值关联。

可以构建定性模型并随后将该定性模型应用于揭示过程趋势(BEM)或者将该定型模型用于对整个批次进行比较(BLM)。在随后的生物过程中获取的每个拉曼光谱都是过程时间的指纹(pingerprint)。根据这些拉曼光谱(例如3200波长)得出的信息被压缩为每个光谱的几个得分值(BEM)，或者根据一个批次的所有拉曼光谱得出的信息被压缩为几个得分值(BLM)。可以相对于批成熟度/时间来绘制得分值以示出批过程随时间的演变(BEM)，或者鉴于目标参数如最终滴度(BLM)对得分值进行评估以说明已完成批次的所有数据。

再参照上述用例，基于制备拉曼光谱构建的至少一个多变量模型将应用于用户的大规模制造生物过程。对于商业生产，可以使用如图2中作为示例示出的生物反应器组件10。生物反应器组件10包括带框架14的推车12，推车12承载不锈钢的袋托架16。袋托架16具有上玻璃窗18和下切口，在下文中，下切口被称为传感器入口20。

在袋托架16中容纳主要由柔性箔形成的袋式大规模单次使用生物反应器22。生物反应器22的工作容积为至少10L，典型的最大工作容积在50L至5000L的范围内。目前优选的大小为50L、200L、500L、1000L和2000L。生物反应器22可以具有各种开口，例如顶部填料开口、用于(预安装)叶轮轴的开口或下排放开口，然而，这些开口在本文中并不重要。

生物反应器22具有例如被焊接到袋箔中的集成式单次使用光谱端口24。光谱端口24提供包含在生物反应器22中的介质与直接或间接地附接至光谱端口24的光学探针26之间的光学接口。光学探针26经由光纤30连接至光谱仪28。光谱端口24、光学探针26、光纤30和光谱仪28形成用于获取生物反应器22中的介质的拉曼光谱的测量组件。

上述装置仅是包括特定测量组件的商业生物反应器组件10的一个示例。其他装置也是可能的，例如，包括使用浸入式探针、流动池或其他硬件部件或组合的测量组件。以下也可能的：除了单次使用光谱端口24之外，测量组件实际上是在制备阶段中使用的N个测量组件之一(第一替选方案：在每个小规模生物反应器中获取拉曼光谱)，或者测量组件与制备阶段使用的唯一一个测量组件相同(第二替选方案：具有一个流动池)。由于光谱端口24是大规模单次使用生物反应器22固有的，因此在制造生物过程中使用的测量组件至少在这方面不同于在制备阶段使用的一个或多个测量组件。

还应当注意的是，此处讨论的制造生物过程通常不是连续过程，而是批次过程、馈送批次过程或准连续灌注过程。因此，在每个批次之后或一定时间之后，用新的生物反应器替换单次使用生物反应器22，并且因此，作为测量组件的一部分的光谱端口24随着所使用的每个袋子而改变。

在制造生物过程期间获取的拉曼光谱以与之前校正制备拉曼光谱相同的方式经受暗电流和基线校正。

在制造生物过程期间获取并校正的拉曼光谱被称为“预测”拉曼光谱，因为它们被用于实时预测生物反应器22中的介质的一个或更多个参数，例如葡萄糖浓度。

在用于进行这样的预测之前，预测拉曼光谱经受水带校正，该水带校正通常以与制备拉曼光谱相同的方式执行。

根据第一方法，为了对预测拉曼光谱进行归一化，根据完全相同的拉曼光谱确定特征水带尤其是在约1640cm^-1处的水带的强度和/或积分。通过将每个波长处的强度除以特征水带的强度和/或积分来执行归一化。将该过程应用于每个预测拉曼光谱，即，分别使用每个预测拉曼光谱自身的水带单独对其进行归一化。

根据第二方法，为了对预测拉曼光谱进行归一化，或者根据之前(例如在批次开始时)利用完全相同的测量组件获取的拉曼光谱确定单个水带，或者根据之前利用完全相同的测量组件获取的一系列至少两个拉曼光谱确定特征水带的统计平均值例如中值或平均值。如上所述执行归一化本身。利用这种方法，可以仅使用单个数据集对一个批次的所有的制备拉曼光谱进行归一化。

通常可以利用一个或更多个预测拉曼光谱的数据及相应的参考值来更新基于制备拉曼光谱构建的多变量模型。特别地，利用多并行生物反应器装置获取的数据可以由利用商业生物反应器组件10获取的数据补充并且适用于利用商业生物反应器组件10获取的数据，即，与在制造生物过程的一个或几个或所有批次期间获取的预测拉曼光谱相关的数据集。例如，可以在每日采样时增加预测拉曼光谱，包括相应的参考分析。

将(经更新的)多变量模型应用于预测拉曼光谱以得到关于参数的期望信息。多变量模型实际上为参数的预期确定(预测)提供计算规则。参数可以是定量的，例如葡萄糖、乳酸盐、氨、谷氨酰胺或其他氨基酸、谷氨酸、糖基化形式等的浓度。还可以确定定性参数，例如上文说明的得分值。

如下文将进一步说明的，基于从预测拉曼光谱得出的信息来实时控制制造生物过程。

图3示出了如何在生物过程中获得、处理和应用拉曼光谱信息的示意性示例。除了已经提及的具有集成式光谱端口24的单次使用生物反应器22、光学探针26和光谱仪28之外，硬件和软件部件还包括控制单元32、用于控制光谱仪28的控制软件模块34以及用于模型构建和应用的多变量数据分析(MVDA)软件模块36。

控制单元32控制包括阀、泵等的生物过程装备的物理相互作用，控制单元32可以是基于监控和数据采集(SCADA)的自动化系统或生物反应器自动化平台，例如德国Sartorius Stedim Biotech GmbH的DCU数字控制单元。控制单元32的软件包括引导自动化系统或平台的所谓的配方结构(工作流)。此外，控制单元32向MVDA软件模块36传输特定过程数据，包括任何参考数据、生物反应器ID、批次ID、质量数据等。

控制软件模块34控制光谱仪28并启动测量以获取生物反应器22中所含的介质的拉曼光谱。继而，MVDA软件模块36从光谱仪28接收原始光谱数据并且能够如以上所说明的那样基于光谱数据和过程数据来构建多变量模型并实时应用该模型。

一般地，可以通过将多变量模型应用于稍后获取的拉曼光谱例如制造生物过程中的拉曼光谱来预测参数。也可能的是，模型不基于在如上文讨论的用例中说明的制备实验，而是基于先前(已完成的)生物过程或基于正在运行的生物过程中的某个批次。这意指针对分别从先前的生物过程或在前的批次获取的制备拉曼光谱来构建所述模型。然后将该模型应用于随后的生物过程或批次。

在任何情况下，由于制备拉曼光谱和预测拉曼光谱的水带归一化，由使用不同测量组件引起的预测中的任何变化被极大地消除。

基于对参数的预测，控制单元32可以建议修改正在运行的生物过程的预测参数和/或一个或更多个过程参数。控制单元32还可以启动控制动作。在(半)自动化过程控制的情况下，控制单元32适于直接修改过程参数和/或启动控制动作，而无需操作人员的任何交互或使操作人员的交互减少。控制动作的示例是控制馈送供应、添加消泡剂以及采集样本以用于进一步的检查(采样)。

在所描绘的示例中，控制单元32期望来自MVDA软件模块36的用于反馈控制的数据作为单变量数据(尽管其仍然可以包含多个参数)。因此，MVDA软件模块36能够根据多变量数据输入参数计算单变量数据输出。

例如，代替使用适当的软件接口来传输信息，可以将软件模块34、36中的一者或两者集成到光谱仪28或控制单元32的内在软件中。此外，控制单元32和/或光谱仪控制软件可以连接至数据记录装置(data historian)。

如以上所说明的，预测上述生物过程中待观察的介质的参数的方法优于迄今已知的方法。这将通过参照图4至图7中的示意图和预测图的实际示例进行说明。

图4的示意图是通过五个不同的测量组件——特别地具有不同的光学探头和光学接口(流动池、生物反应器光谱端口)的测量组件——获取的一系列若干葡萄糖溶液(此处：7.5g/L)的一个示例的经基线校正的拉曼光谱的节选。该拉曼光谱示出了波数测量范围在1000cm^-1到1200cm^-1之间的葡萄糖带。可以看出，取决于探头而存在相当多的散射，并且特别地在较高浓度处，峰没有位于彼此之上。当每个探头/接口组合的灵敏度变化时，出现差异。特别地，较不敏感的探头/接口组合示出较弱的葡萄糖信号。以相同的方式和幅度，在约1640cm^-1(未示出)处的特征水带被减小。换句话说：水带信号与葡萄糖信号相关。在介质中的水浓度始终相似的假设下，可以得出结论，基于特征水带对拉曼光谱进行归一化将使不同装置的葡萄糖带的变化减小。

图5示出了葡萄糖浓度的预测图(参考葡萄糖相对于预测葡萄糖)。将利用某一探针/接口的葡萄糖浓度的构建模型与利用其他探头/接口的类似测量进行比较。此外，探头/接口组合的不同灵敏度引起斜率的变化并且因此引起与模型的较高偏差。第一系列(浅灰色)的探针/接口组合的灵敏度接近于用于模型构建的探针/接口组合的灵敏度。第二系列(中灰色)对葡萄糖浓度的增加较不敏感，第三系列(黑色)对葡萄糖浓度的增加更敏感。

图6示出了在根据本发明的基于约1640cm^-1处的特征水带进行归一化之后的图4的拉曼光谱。所有拉曼光谱都很好的落在彼此之上。这是因为探针/接口的变化影响水带的方式与影响所获取的光谱中的分析物的带的方式相同，并且在使用特征水带对所获取的光谱进行归一化之后，灵敏度的差异被极大地消除。

图7描绘了与图5相同但基于根据本发明进行了水带校正的拉曼光谱的图。探针/接口的差异得到了很好的补偿，并且预测的斜率与同样利用经水带校正的拉曼光谱构建的模型完全吻合。

因此，根据本发明的校正技术在生物过程监测中提供了关于用于测量的硬件(测量组件)的差异特别是探针的差异以及在使用光谱仪、探针、流动池、单次使用光谱端口等的不同组合时关于灵敏度的变化的拉曼信号的更好校正。

附图标记列表

10 生物反应器组件

12 推车

14 框架

16 袋托架

18 玻璃窗

20 传感器入口

22 生物反应器

24 光谱端口

26 光学探针

28 光谱仪

30 光纤

32 控制单元

34 控制软件模块

36 MVDA软件模块

Claims (28)

1.一种基于拉曼光谱学预测生物过程中待观察的介质的参数的方法，所述方法包括下述步骤：

-使用第一测量组件获取作为所述待观察的介质的水性介质的第一系列制备拉曼光谱；

-基于来自利用所述第一测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对所述第一系列制备拉曼光谱进行归一化；

-基于经归一化的制备拉曼光谱构建所述参数的多变量模型；

-获取利用另一测量组件获取的所述生物过程期间待观察的介质的预测拉曼光谱；

-基于来自利用所述另一测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对所述预测拉曼光谱进行归一化；以及

-将经构建的模型应用于所述预测拉曼光谱以用于预测所述参数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用约1640cm^-1处的特征水带进行归一化。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用所述特征水带的强度进行归一化。

4.根据权利要求中1或2所述的方法，其特征在于，使用所述特征水带的积分进行归一化。

5.根据权利要求中1或2所述的方法，还包括下述步骤：

-使用第二测量组件获取水性介质的至少第二系列制备拉曼光谱；以及

-基于来自利用所述第二测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对所述第二系列制备拉曼光谱进行归一化；

其中，构建所述参数的多变量模型的步骤基于经归一化的第一系列制备拉曼光谱和经归一化的第二系列制备拉曼光谱。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，对所述制备拉曼光谱和/或所述预测拉曼光谱中的每一个分别使用来自完全相同的拉曼光谱的特征水带进行归一化。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，对利用一个测量组件获取的一系列制备拉曼光谱和/或一系列预测拉曼光谱中的每个光谱使用从利用相同测量组件获取的同一系列拉曼光谱或另一系列拉曼光谱得出的特征水带的统计平均值来进行归一化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述统计平均值包括中值或平均值。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用与用于获取所述制备拉曼光谱的测量组件不同的测量组件来获取所述生物过程期间待观察的介质的预测拉曼光谱。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在一个或更多个小规模生物反应器中获取所述制备拉曼光谱。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述小规模生物反应器以多并行装置方式布置。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在大规模生物反应器中获取所述预测拉曼光谱。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述大规模生物反应器是具有固有光谱端口的单次使用生物反应器。

14.根据权利要求1或2述的方法，其特征在于，为了构建定量模型，采集所述水性介质的样本，执行所述参数的样本参考测量，以及将所述制备拉曼光谱中的至少一个制备拉曼光谱与所述样本参考测量关联。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述制备拉曼光谱中的所述至少一个制备拉曼光谱是在采集所述样本的同时获取的制备拉曼光谱。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，为了构建定性模型，得出来自所述制备拉曼光谱的统计值。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述统计值包括根据主成分分析PCA、正交偏最小二乘OPLS回归或偏最小二乘PLS回归得出的得分值。

18.一种用于预测生物过程中待观察的介质的参数的装置组件，所述装置组件包括软件部件，所述软件部件用于：

-使用第一测量组件获取作为所述待观察的介质的水性介质的第一系列制备拉曼光谱；

-基于来自利用所述第一测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对所述第一系列制备拉曼光谱进行归一化；

-基于经归一化的制备拉曼光谱构建所述参数的多变量模型；

-获取利用另一测量组件获取的所述生物过程期间待观察的介质的预测拉曼光谱；

-基于来自利用所述另一测量组件获取的至少一个拉曼光谱的特征水带对所述预测拉曼光谱进行归一化；以及

-将经构建的模型应用于所述预测拉曼光谱以用于预测所述参数。

19.根据权利要求18所述的装置组件，其特征在于，还包括：多个小规模生物反应器，所述多个小规模生物反应器包含被获取所述制备拉曼光谱的水性介质。

20.根据权利要求19所述的装置组件，其特征在于，所述小规模生物反应器以多并行装置方式布置。

21.根据权利要求20所述的装置组件，其特征在于，每个小规模生物反应器与用于获取所述制备拉曼光谱的单独的测量组件相关联。

22.根据权利要求21所述的装置组件，其特征在于，每个小规模生物反应器能够连接至用于获取所述制备拉曼光谱的单个测量组件。

23.根据权利要求18所述的装置组件，其特征在于，还包括：大规模单次使用生物反应器(22)，所述大规模单次使用生物反应器(22)具有用于获取所述预测拉曼光谱的固有光谱端口(24)。

24.根据权利要求18至23中任一项所述的装置组件，其特征在于，所述软件部件包括多变量数据分析软件模块(36)，所述多变量数据分析软件模块(36)用于构建所述多变量模型并实时应用所述多变量模型。

25.根据权利要求18至23中任一项所述的装置组件，其特征在于，所述软件部件包括控制软件模块(34)，所述控制软件模块(34)用于对用于获取所述生物过程期间的所述预测拉曼光谱的测量组件中的光谱仪(28)进行控制。

26.一种控制生物过程的方法，包括下述步骤：

-通过根据权利要求1至17中任一项所述的方法来预测所述生物过程中待观察的介质的参数；以及

-实时基于所述预测来修改所述生物过程的至少一个过程参数；以及/或者

-实时基于所述预测来启动控制动作。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所启动的控制动作包括下述之一：控制馈送供应；添加消泡剂；采样。

28.一种用于控制生物过程的装置组件，所述装置组件包括：

根据权利要求18至25中任一项所述的用于预测参数的装置组件；以及

控制单元(32)，用于实时基于所述预测来修改所述生物过程的至少一个过程参数以及/或者实时基于所述预测来启动控制动作。