CN104136908A - 用于鉴定培养物中微生物的光谱手段和方法 - Google Patents
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Abstract
公开了用于光谱检测和鉴定培养物中细菌的光谱方法。所述方法整合了从怀疑含有所述细菌之经培养样品构建至少一个数据集，其可为光谱、干涉图样或散射图样。针对所述样品中水的存在，对所述数据集进行校正，使用主成分分析提取光谱特征，并使用学习算法对所述特征分类。在本发明的一些实施方案中，例如为将MRSA与MSSA区别，进行多模态分析，其中细菌的鉴定是基于样品的光谱、用来确定细胞壁厚度的干涉图样以及用来确定细胞壁粗糙度的散射图样进行的。还公开了用于进行所述方法的设备，所述设备的一个实施方案整合了多样品分析仪。
Description
相关申请引用
本申请要求于2011年12月19日提交的US临时专利申请号61/577,131的优先权，其通过引用被整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于鉴定培养物中微生物的光谱(spectroscopic)手段(means)和方法。特别地，本发明涉及用于鉴定培养物中微生物的手段和方法，其依赖于整个细胞的光谱测量，而非细胞特定的化学组成，以及涉及整合其他基于光之测量方法(例如干涉分析法)的手段和方法。
背景技术
微生物的鉴定，特别是抗生素抗性细菌的检测，在医药领域中是极其重要的。众所周知，卫生保健机构投入了大量的努力来防止患者受到由环境细菌且特别是由于那些抗生素抗性细菌所引起之二次疾病的感染。
通常用来区分抗生素抗性细菌和抗生素敏感性细菌的方法是直接对样品使用PCR或在培养样品后使用PCR。这样的方法公开在例如US专利号4,683,202中。另一种方法是通过检测蛋白质组，即通过基因组表达的不同蛋白质。
通过常见细菌性病原体的检测用于通用细菌检测的基于DNA的方法也是本领域已知的，例如，如美国专利申请公开号2005/0042606中公开的。在PCT公开号WO90/04041中已经公开了通过将从样品获得的细菌培养物暴露于具有已知宿主范围的转导颗粒检测有活力的细菌。
这些方法的问题在于它们一般花费显著量的时间(通常至少一小时)来产生结果，且仅可由合格的专业技术人员进行。解决这些问题的一个可能途径可为光谱技术的使用，其本质上比这些方法快。一些用于鉴定细菌而不对抗生素抗性菌株特异的光谱方法在本领域中是已经的。
例如，PCT公开号WO98/41842公开了通过拉曼光谱法(Ramanspectroscopy)来检测细菌抗体复合物的系统。将用于测试细菌存在的样品放置于培养基中，所述培养基含有连接到一表面的抗体，所述抗体用于结合至特定细菌以形成抗原-抗体复合物。类似地，共振拉曼反散射作为鉴定细菌的方法在U.S.专利公开号4,847,198中公开。在这些方法中，将与特定细菌相关之标记物在拉曼光谱中的存在作为细菌存在的指示。
U.S.专利号6,379,920公开了用于检测和鉴定生物样品中特定细菌的光谱方法，对于其所要求保护的来说，培养是不必需的。所述方法包括从未感染的患者获得生物样品的光谱作为参考，将所述参考从可能感染的样品光谱减去，并将产生的差异光谱的指纹区与已知细菌的参考光谱进行比较。
Naumann等(Encyclopedia of Analytical Chemistry，R.A.Meyers(编)102-131页，John Wiley&Sons Ltd，Chichester，2000)已经报道了在干燥的样品中用于鉴定和分类细菌的FTIR光谱的用途。通过使用FTIR和近红外FT-拉曼光谱，已经鉴定了活微生物。其他方法包括使用荧光光谱法或以上光谱技术的组合。
现有技术文献均未公开可以快速(少于1小时)且不需要专业技术人员检测并且区分抗生素抗性细菌和抗生素敏感性细菌的手段和方法。而且，现有技术文献均未公开可以排除样品中所含的水对实验信号的干扰从而提供更灵敏和更准确的一般细菌和特定抗生素抗性细菌之检测的手段和方法。
因此，对于迅速、灵敏并准确地从原代培养板样品检测和鉴定微生物，而不使用另外的试剂或复杂的样品制备之手段和方法，特别是可以将抗生素敏感性细菌和抗生素抗性细菌区分的手段和方法，存在长期的需要。
发明内容
本文公开的发明设计为满足该长期需要。本发明公开了用于光谱鉴定培养物中微生物的方法和系统。特别地，本文公开的方法包括将因水产生的光谱中的伪差(artifact)移除的步骤，使用主成分分析(PrincipalComponents Analysis)来提取目的光谱特征，并使用学习算法(learningalgorithm)(例如RANDOM FOREST分类器方法)来将光谱特征图(signature)分类。所述方法还整合了通过使用多模态(multimodal)技术区分抗生素抗性细菌(例如甲氧西林抗性金色链球菌(StreptococcusStreptococcus aureus)(MRSA))与抗生素敏感性细菌(例如甲氧西林敏感性金色链球菌(MSSA))的步骤，所述多模态技术将确定样品中细菌的至少一种化学特征的光谱法以及(suspuses)确定细菌细胞壁厚度的干涉分析法组合。
因此，本发明的目的在于公开用于光谱检测和鉴定培养物中微生物的方法，其中所述方法包括：
1.获得怀疑含有所述微生物的至少一个经培养样品；将所述经培养样品转移至样品池(cell)；将所述样品与从光源获得的光相互作用；在所述相互作用的步骤之后，测量至少一部分剩余的所述光；由所述经测量的光构建至少一个数据集，其中所述数据集包含至少一种类型选自以下的数据集：吸收光谱、反射光谱、荧光光谱、散射图样和干涉图样；
2.如果所述数据集为光谱：则通过进行至少一个选自以下的步骤预处理所述数据集：(a)针对因水在所述经培养样品中的存在产生的信号，对所述数据集进行校正，(b)移除基线，(c)降噪，以及(d)提取目的光谱区，从而产生经校正的数据集；通过使用主成分分析(PCA)方法从所述经校正的数据集提取目的光谱特征，且指定从所述主成分分析获得的最大本征值或成分作为特征，从而产生一组经提取的光谱特征，并通过使用整合了学习算法的方法将所述经提取的光谱特征分类，从而确定所述微生物是否存在于所述经培养样品中；
3.如果所述数据集为干涉图样：则从所述干涉图样估计所述微生物的细胞壁厚度；并将所述细胞壁厚度分类，从而确定所述微生物是否存在于所述经培养样品中；
4.如果所述数据集为散射图样：则从所述散射图样估计所述微生物的细胞壁粗糙度；并将所述细胞壁粗糙度分类，从而确定所述微生物是否存在于所述经培养样品中。
本发明的另一个目的在于公开这样的方法，其中所述获得经培养样品的步骤包括：获得生物样品；培养所述生物样品，从而产生经培养样品；以及将所述菌落(colony)涂抹在表面上。在本发明一些优选的实施方案中，培养的步骤之后进行选择多个菌落的步骤。在本发明一些优选的实施方案中，所述生物样品为选自于固体形式和液体形式的形式。在本发明一些优选的实施方案中，所述生物样品选自喷嚏、唾液、粘液、胆汁、尿、阴道分泌物、中耳抽出物(middle ear aspirate)、脓、胸腔积液、滑液、脓肿、腔拭子(cavity swab)、血清、血液和脊液。在本发明一些优选的实施方案中，所述培养所述生物样品的步骤包括将包含在样品中的所述生物样品在琼脂板中培养12至24小时。在本发明一些优选的实施方案中，所述涂抹的步骤包括在表面上涂抹以覆盖2.5 cm直径的区域。在本发明一些优选的实施方案中，所述涂抹的步骤包括在镜子的反射表面上涂抹。在本发明一些优选的实施方案中，其中所述反射表面为金。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述将所述经培养样品转移至样品池的步骤包括将所述经培养样品转移至多次传递池(multiple pass cell)。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述获得至少一个经培养样品的步骤包括获得多个经培养样品；所述将所述经培养样品转移至样品池的步骤包括将所述多个经培养样品的每个转移至样品池，所述样品池被布置在多室分析仪(multiple compartment analyzer)之分开的室中；且所述构建数据集的步骤包括对所述多个样品的每个分别构建数据集。
在本发明一些优选的实施方案中，所述多室分析仪的每个室包含：入射孔；与所述入射孔对齐的出射孔；池；以及能够将通过所述入射孔进入所述室的光指引至所述池或者至所述出射孔而不进入所述池的切换装置。在本发明一些优选的实施方案中，所述切换装置为可在第一位置和第二位置之间活动之可活动的回转镜(flip mirror)，在所述第一位置中通过所述入射孔进入所述室的光从所述镜反射入所述池，在所述第二位置中通过所述入射孔进入所述室的光传到所述出射孔而不进入所述池。在本发明另一些优选的实施方案中，所述切换装置是光学开关。而在本发明另一些优选的实施方案中，所述光学开关是基于光纤的。
在本发明一些优选的实施方案中，所述池为多次传递池。在本发明一些整合了多次传递池的优选实施方案中，所述多次传递池包含：抛物柱面镜；用于会聚所述光源的输出的光会聚构件，其被布置为使得所述光源的输出射到(impinge)所述抛物柱面镜；用于将来自多次传递池的光指引至检测器的光耦合构件；包含样品保持构件的台(stage)，所述样品保持构件用于保持样品，布置所述台以使得至少一部分从所述光源经由所述光会聚构件传到所述抛物柱面镜，然后从所述抛物柱面镜反射的光，将射到经由所述样品保持构件连接到所述台的样品，并使得从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将被指引至非所述样品的位置；且布置n个折叠镜(nfolding mirror)使得从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将射到所述折叠镜之一；对于m＝1至n-1，射到第m个折叠镜的光将被反射回至所述抛物柱面镜使得其将随后被反射到所述样品上，且使得从所述样品反射的光将从所述抛物柱面镜反射至第(m+1)个折叠镜；而对于m＝n，从所述第m个折叠镜反射的光将被指引至所述光耦合构件。在本发明一些优选的实施方案中，围绕圆周成对布置所述n个折叠镜。在本发明一些优选的实施方案中，所述n个折叠镜包含7对镜子。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述光源包括FTIR光谱仪的光源。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述光源包括拉曼光谱仪的光源。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述光源为激光器。在本发明一些优选的实施方案中，所述激光器选自二极管激光器、光纤激光器和量子级联激光器。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述构建数据集的步骤包括构建选自以下的光谱：红外吸收光谱、红外反射光谱、拉曼光谱、UV-VIS吸收光谱和UV-VIS反射光谱。在本发明一些优选的实施方案中，所述构建数据集的步骤包括构建红外吸收光谱。在本发明一些其中所述构建数据集的步骤包括构建红外光谱的优选的实施方案中，所述预处理的步骤包括提取选自以下的光谱范围：约850-1000cm-1；约990-1190cm-1；约1180-1290cm-1；约1235-1363cm-1；约1300-1350cm-1；约1500-1800cm-1；约1550-1650cm-1；约1720-1780cm-1；约2800-3050cm-1；约2836-2995cm-1；和约3000-3300cm-1。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中针对因水在所述经培养样品中的存在而产生的数据的存在，对所述数据集进行校正的步骤包括选自以下的步骤：(a)通过从所述数据集减去由其他数据集的平均值所构建的数据集来进行简单滤波；(b)从所述数据集减去参考数据集；以及(c)通过使用参考信号的自适应滤波(adaptive filtering)进行自适应滤波以产生将水信号对所测量的样品光谱之作用的最优降低。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述预处理所述数据的步骤包括通过使用选自以下的至少一种技术降噪：线性滤波、自适应滤波、使用Savitzky-Golay滤波器、低通滤波和谱减法(spectralsubtraction)。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述使用PCA方法 的步骤 包括：获得所述数据集的一阶和二阶导数；和获得所得到之每个导数的两个系数。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述经提取的光谱特征组包括选自以下的光谱特征：峰相关性、峰波长、峰高、峰宽、峰截面、峰面积、经拟合多项式曲线的至少一个系数、在信号的至少两个峰下的面积总和，线性预测编码(linear predictive coding，LPC)、信号的平均值、信号的方差值、偏度值、峰度值、参数的高斯集(p，6，Ai)、峰强度比、小波系数及其衍生。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述学习算法选自贝叶斯分类器、支持向量机(support vector machine，SVM)、线性判别函数、Fisher线性判别、C4.5算法树、K最近邻法、加权K最近邻法、分级聚类算法、整合了使用由Breiman和Cutler开发的方法之集成分类器的学习算法、隐马尔科夫模型(hidden Markov model)、高斯混合模型(Gaussian mixtre model，GMM)、K均值聚类算法、Ward聚类算法、最小最小二乘法(minimum least squares)和神经网络算法。在本发明一些优选的实施方案中，所述学习算法整合了使用由Breiman和Cutler开发之方法的集成分类器。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述分类的步骤是基于所述学习算法获得的拟合的参数进行的，所述学习算法基于具有最小显著性阈值的特征。在本发明一些优选的实施方案中，所述最小显著性阈值为95％置信界限。在本发明一些优选的实施方案中，通过选自χ2、Wilcoxon检验和学生t检验的统计检验确定所述最小显著性阈值。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述微生物包括选自以下的细菌：葡萄球菌(Staphylococcus)；凝固酶阴性葡萄球菌(staph coagulase negative)；金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)，链球菌属(Streptococcus spp.)；绿色链球菌(Streptococcus viridans)群；肠球菌属(Enterococcus spp.)；棒杆菌属(Corynebacterium spp.)，气球菌属(Aerococcus spp.)；微球菌属(Micrococcus spp.)；消化链球菌属(Peptostreptococcus spp.)；乳球菌属(Lactococcus spp.)；明串珠菌属(Leuconostoc spp.)；Tothia spp.；孪生球菌属(Gemella spp.)；产碱菌属(Alcaligenes spp.)；链格孢菌属(Alternaria spp.)；黄杆菌属(Flavobacterium spp.)；芽孢杆菌属(Bacillus spp.)；无色杆菌属(Achromobacter spp.)；不动杆菌属(Acinetobacter spp.)；放线杆菌属(Acinobacillus spp.)；产碱菌属(Alcaligenes spp.)；弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)；爱德华氏菌属(Edwardsiella spp.)；埃里希氏体属(Ehrlichia spp.)；肠杆菌属(Enterobacter spp.)；爱文氏菌属(Ewingella spp.)；黄杆菌门(Flavobateria)；哈夫尼菌属(Hafnia spp.)；克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)；克吕沃尔氏菌属(Kluyvera spp.)；军团菌属(Legionella spp.)；莫拉氏菌属(Moraxella spp.)；摩根氏菌属(Morganella spp.)；奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)；巴斯德氏菌属(Pasteurella spp.)；普雷沃氏菌属(Prevotella spp.)；变形菌属(Proteusspp.)；普罗威登斯菌属(Providencia spp)；假单胞菌属(Pseusomonasspp.)；拉恩氏菌属(Rahnella spp.)；沙门氏菌属(Salmonella spp.)；沙雷氏菌属(Serratia spp.)；志贺氏菌属(Shigella spp.)；鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium spp.)；弧菌属(Vibrio spp.)；耶尔森氏菌属(Yershinia spp.)；奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)；金氏菌属(Kingellaspp.)；心杆菌属(Cardiobacterium)；非结核分枝杆菌(non Tuberculosismycobacteria，NTB)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；和鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述微生物包括选自以下的细菌：金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)；表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)；溶血葡萄球菌(Staph.haemolyticus)；路邓葡萄球菌(Staph.lugdunensis)；中间葡萄球菌(Staph.intermedius)；人葡萄球菌(Staph.hominis)；模仿葡萄球菌(Staph.simulans)；沃氏葡萄球菌(Staph.warneri)；解糖葡萄球菌(Staph.saccharolyticus)；头状葡萄球菌(Staph.Capitis)；所有其他的凝固酶阴性葡萄球菌(Staphylococcus)；酿脓链球菌(Strep.pyogenes)群A；无乳链球菌(Str.agalactiae)群B；链球菌(Strep)；，链球菌(Streptococcus)群G；链球菌(Streptococcus)群C；链球菌(Streptococcus)群F；链球菌(Streptococcus)群B；链球菌(Streptococcus)群D；星群链球菌(Strep.constellatus)；中间链球菌(Strep.intermedius)；少酸链球菌(Strep.acidominimus)；牛链球菌(Strep.bovis)；咽峡炎链球菌(Strep.anginosus)；变异链球菌(Strep.mutans)；唾液链球菌(Strep.salivarius)；血链球菌(Strep.sanguis)；嗜热链球菌(Strep.thermophilus)；缓症链球菌(Strep.mitis)；马链球菌(Strep.equi/equisim)；绿色链球菌(Strep viridans)；粪肠球菌(Enteroccocus faecalis)；屎肠球菌(Enter.faecium)；铅黄肠球菌(Enter.casseliflavus)；鹑鸡肠球菌(Enter.gallinarum)；鸟肠球菌(Enter.avium)；耐久肠球菌(Enter.durans)；单核细胞增生利斯塔氏菌(List.monocytogenes)；白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；藤黄微球菌(Micrococcus luteus)；玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)；浅绿气球菌(Aerococcus viridans)；蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)；溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)；鲍氏不动杆菌(Acinetobact.baumanni)；，琼氏不动杆菌(Acinetobact.junii)；鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffi)；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)；温和气单胞菌(Aeromonas sobria)；维罗纳气单胞菌(Aeromonas veronii)；多形拟杆菌(Bacter.thetaiotaomicron)；吉氏拟杆菌(Bacter.distasonis)；粪便拟杆菌(Bacter.stercoris)；单形拟杆菌(Bacter.uniformis)；脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)；卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)；普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)；洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepaeia)；大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)；空肠弯曲杆菌(Campyiobacterjejuni)；无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaficus)；布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)；差异柠檬酸杆菌(Citrobacter diversus)；法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)；弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)；克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)；塞氏柠檬酸杆菌(CitrobactersedlaMi)；杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)；内毒梭菌(Clistridumbotulinum)；艰难梭菌(Clostridum diffitile)；产气荚膜梭菌(Clostridumperfringens)；索氏梭菌(Clostridum sordellii)；破伤风梭菌(Clostridiumtetani)；大肠杆菌(E. coli)；生癌肠杆菌(Enterobact.cancerogenus)；成团肠杆菌(Enterob.agglomerans)；日勾维肠杆菌(Enterob.gergoviae)；中间肠杆菌(Enterob.intermedium)；阪崎肠杆菌(Enterob.sakazaMi)；产气肠杆菌(Enterobact.aerogenes)；阴沟肠杆菌(Enterobacter.cloacae)；赫氏埃希氏菌(Escherichia hermanni)；解鸟氨酸克雷伯氏菌(Kl.ornithinolytica)；植生克雷伯氏菌(Kl.planticola)；肺炎克雷伯氏菌(Kleb.pneumoniae)；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)；侵肺军团菌(L.pneumophila)；粘膜炎莫拉氏菌(Morax.catarrhalis)；摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)；产黑素普雷沃氏菌(Prey.melaninogenica)；二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)；解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)；口腔普雷沃氏菌(Prevotellaoralis)；奇异变形菌(Proteus mirabilis)；彭氏变形菌(Proteus penneri)；普通变形菌(Proteus vulgaris)；拉氏普罗维登斯菌(ProvL rustigianii)；雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)；斯氏普罗维登斯菌(Providenciastuartii)；铜绿假单胞菌(Pseud. aeruginosa)；产碱假单胞菌(Pseud.alcaligenes)；荧光假单胞菌(Pseud.fluorescens)；门多萨假单胞菌(Pseud.mendocina)；睾丸酮假单胞菌(Pseud.testosteroni)；缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)；甲型副伤害沙门氏菌(Salm. paratyphiA)；乙型副伤害沙门氏菌(Salm. paratyphi B)；肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)；沙门氏菌(Salmonella)群B；沙门氏菌(Salmonella)群C；沙门氏菌(Salmonella)群C1；沙门氏菌(Salmonella)群C2；沙门氏菌(Salmonella)群D；伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)；液化沙雷氏菌(Serr.1iquefaciens)；无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)；居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)；粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)；气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)7；普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)；深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)；鲍氏志贺氏菌(Shigella bovdii)/；弗氏志贺氏菌(Shigella，exneri)；索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)；嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotr.maltophilia)；副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)；创伤弧菌(Vibrio VuinifiCUS)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocoliticus)；假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)；脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)；淋病奈瑟氏球菌(Neissseria gonorrhoeae)；干燥奈瑟氏球菌(N.sicca)；微黄奈瑟氏球菌(N.subflava)；长奈瑟氏球菌(Neisseriaelongata)；啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)；粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)；流感嗜血菌(Haemophilus infiuenzae)；副流感嗜血菌(Haemophilusparainfluenzae)；金氏菌属(Kingella spp.)；心杆菌属(Cardiobacteriumspp.)；紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)；结核分枝杆菌(M.tuberculosis)；鸟分枝杆菌(Mycobact.avium)；偶发分枝杆菌(Mycob.fortuitum)；猿分枝杆菌(Mycob.simiae)；所有其他的非TB分枝杆菌(Mycobacteria)；N.T.M；内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)；麦尔放线菌(Actinomyces meyeri)；诺卡氏菌属(Nocardia spp.)；布鲁氏菌属(Brucella spp.)；新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)；和隐球菌属(Cryptococcus spp.)(非新型)；抗p.内酰胺酶和大环内酯类的肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)，抗p-内酰胺酶和氨基糖苷类的绿色链球菌(Streptococcus viridians)群，抗万古霉素和替考拉宁且高度抗青霉素和氨基糖苷类的肠球菌(Enterococci)，对甲氧西林、其他β-内酰胺类、大环内酯类、林可酰胺类(lincosamide)以及氨基糖苷类敏感的和有抗性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，抗大环内酯类的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，大环内酯抗性的链球菌(streptococci)群B、C和G，抗β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、林可酰胺类以及糖肽类的凝固酶阴性葡萄球菌(Staphylococci)，利斯塔氏菌属(Listeria)和棒杆菌属(corynebacterium)的多抗菌株，抗青霉素和大环内酯类的消化链球菌属(Peptostreptococcus)和梭菌属(clostridium)(例如艰难梭菌(C.Difficile))，抗β-内酰胺酶的流感嗜血菌，抗抗生素的铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)以及对抗生素、氨基糖苷类和大环内酯类敏感的肺炎克雷伯氏菌。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述微生物包括选自酵母和真菌的微生物。在本发明一些优选的实施方案中，所述微生物选自假丝酵母属(Candida spp.)；曲霉属(Aspergillus spp.)；镰刀菌属(Fusarium spp.)；和青霉菌属(Penicillium spp.)。在本发明一些优选的实施方案中，所述微生物选自白假丝酵母；光滑假丝酵母；克柔假丝酵母；近平滑假丝酵母；热带假丝酵母；烟曲霉；黄曲霉；黑曲霉；和土曲霉。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的方法，其中所述至少一个数据集包括光谱、干涉图样和散射图样。在本发明的一些实施方案中，所述微生物为细菌单个物种的抗生素抗性和抗生素敏感性菌株；所述光谱用来确定所述样品内细菌的至少一种化学特征；所述干涉图样用来估计所述样品内细菌的细胞壁厚度；所述散射图样用来估计所述样品内细菌的细胞壁粗糙度；而所述分类步骤包括将所述光谱、所述干涉图样和所述散射图样的全部结果分类。在本发明一些优选的实施方案中，抗生素抗性菌株为甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌并且抗生素敏感性菌株为甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌。
本发明的另一个目的在于公开用于光谱检测和鉴定培养物中微生物的设备，其中所述设备包含：光源；包含样品池之构件的样品室，所述样品池用于保持含有怀疑含所述微生物的样品，所述样品室与所述光源光学连接；在由所述光源发出的光与所述样品相互作用后，用于测量光的检测器；与所述光源和所述检测器电子连接来控制数据收集的控制构件；以及用于进行所述数据预处理、所述数据分析和所述数据分类的分析构件。
本发明的另一个目的在于公开这样的设备，其中所述样品室包含多次传递池。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的这样的设备，其中所述样品室包含含有多个室的多室分析仪(multiple compartmentanalyzer)。在本发明一些优选的实施方案中，所述多室分析仪的每个室包含入射孔；与所述入射孔对齐的出射孔；池；以及可在第一位置和第二位置之间活动之可活动的回转镜，在所述第一位置中通过所述入射孔进入所述室的光从所述镜反射入所述池，在所述第二位置中通过所述入射孔进入所述室的光传到所述出射孔而不进入所述池。在一些优选的实施方案中，所述池为多次传递池。
在如上定义之设备的一些优选实施方案中，其中所述设备包含多次传递池，所述多次传递池包含：抛物柱面镜；用于会聚所述光源的输出的光会聚构件并布置其以使得所述光源的所述输出射到所述抛物柱面镜；用于将来自多次传递池的光指引至检测器的光耦合构件；包含样品保持构件的台，所述样品保持构件用于保持样品，布置所述台以使得至少一部分从所述光源经由所述光会聚构件传到所述抛物柱面镜，然后从所述抛物柱面镜反射的光，将射到经由所述样品保持构件连接到所述台的样品，并使得从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将被指引至非所述样品的位置；且布置n个折叠镜使得从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将射到所述折叠镜之一；对于m＝1至n-1，射到第m个折叠镜的光将被反射回至所述抛物柱面镜使得其将随后被反射到所述样品上，且使得从所述样品反射的光将从所述抛物柱面镜反射至第(m+1)个折叠镜；而对于m＝n，从所述第m个折叠镜反射的光将被指引至所述光耦合构件。在本发明一些优选的实施方案中，围绕圆周成对布置所述n个折叠镜。在本发明一些优选的实施方案中，所述n个折叠镜包含7对镜子。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的这样的设备，其中所述光源发出的光所在的波长范围选自紫外(UV)、可见光、红外(IR)、近红外、中红外、远红外、微波和太赫(terahertz)。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的这样的设备，其中所述光源包括FTIR光谱仪的光源。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的这样的设备，其中所述光源包括拉曼光谱仪的光源。
本发明的另一个目的在于公开如上任何所定义的这样的设备，其中所述光源为激光器。在本发明一些优选的实施方案中，所述激光器选自二极管激光器和量子级联激光器。
附图说明
现将参考附图描述本发明，其中
图1呈现了示出针对因水的存在产生的信号对光谱进行校正的样品的光谱；
图2呈现了表示如通过主成分分析所确定之目的光谱特征的光谱实例；
图3呈现了说明本文所公开方法的一个优选实施方案之步骤的流程图；
图4呈现了用于进行本文所公开方法之设备的示意框图；
图5呈现了用于进行本文所公开方法之设备的一个实施方案的示意图；
图6呈现了光通过在本文所公开的设备中使用的本领域已知的一种类型的多次传递样品室的路径的详图。
图7呈现了根据本发明的一个实施方案之干涉分析法装置(setup)的示意图；
图8呈现了根据本发明的一个实施方案用于测量光散射之装置的示意图；
图9呈现了根据本发明的一个实施方案之多室分析仪的示意图；
图10呈现了两个不同细菌物种的红外吸收光谱；
图11-图22呈现了根据本文所公开之发明的一个实施方案确定的多个细菌物种的另外的红外吸收光谱；
图23呈现了PCA空间(space)结果的图，其说明了本文所公开的方法区分细菌不同物种的能力。
一些优选实施方案的具体描述
在下面的描述中，将描述本发明的多个方面。出于解释的目的，阐明特定细节以提供本发明彻底的理解。对本领域技术人员明显的是存在本发明的另一些实施方案，其在细节上不同但不影响其本质。因此，本发明不受在图中说明的和在说明书中描述的限制，而仅如在所附权利要求书中指明的，具有仅由所述权利要求书之最宽泛的解释所确定的合适范围。
如本文所使用的，术语“约”指在标称值(nominal value)之上或之下25％的范围。
如本文所使用的，术语“RANDOM FORESTS”一般指使用整合了由Breiman和Cutler开发之方法的集成分类器的学习算法，且特别地指在可购得之RANDOM FORESTS软件包中执行的算法。
本文公开的方法包括以下步骤：制备怀疑含有至少一种预先确定物种的微生物的经培养样品，将所述样品转移至样品池，将样品与来自预先确定之光源的光相互作用，构建数据集(例如光谱或干涉图样)，并将所述数据集分类，从而确定微生物是否存在于所述经培养样品中。在数据集是光谱的情况下，在将数据集分类的步骤之前预处理所述数据集，其在一些优选的实施方案中包括针对水的存在对所述光谱进行校正、移除基线、滤波或提取目的光谱区中的至少一个步骤，以及通过使用主成分分析(PCA)方法提取目的光谱特征的步骤。在本发明一些优选的实施方案中，其中所述数据集为光谱，通过学习算法完成分类。在一些更优选的实施方案中，所述学习算法为使用了随机子空间方法(random subspace method)的集成分类器，且由许多决策树组成，所述决策树输出通过个体决策树输出之种类模式的种类。在一些最优选的实施方案中，使用可购得的执行RANDOM FORESTS方法的软件。
虽然在一些优选的实施方案中，使用红外吸收光谱来产生数据集，然而本文所公开的方法是通常的并可使用任何适当形式的光谱。可用于本文所公开方法之其他光谱方法的非限制性实例包括红外反射光谱、拉曼光谱、荧光光谱、UV-VIS吸收光谱和UV-VIS反射光谱。
在本方法一个优选的实施方案中，使用下面的样品制备方案。首先，收集生物样品。所述样品可为固体或液体形式。可用在本文所公开之方法的生物样品类别的非限制性实例包括喷嚏、唾液、粘液、胆汁、尿、阴道分泌物、中耳抽出物、脓、胸腔积液、滑液、脓肿、腔拭子、血清、血液和脊液。
培养含在样品中的微生物。在本发明一些优选的实施方案中，在培养皿上培养所述样品。在本发明一些最优选的实施方案中，在血琼脂板中培养所述样品，通常12至24小时。在其中期望分析单个物种微生物分析的实施方案中，在培养后，检查微生物的纯度。在本发明一些优选的实施方案中，随后通过使用一次性棉签挑选多个菌落(通常，对于每个进行的测量挑选约4个菌落)将微生物转移至样品室，并涂抹于表面上以覆盖1英寸直径的区域。然后将所述样品转移至样品池。
在本方法一些优选的实施方案中，将样品转移至包含多次传递池的样品室。在本发明一些更优选的实施方案中，将样品转移至下面详述的多次传递池。在其中使用了该类型多次传递池的实施方案中，将样品涂抹于放置于多次传递池中之镜子的中央。在本发明一些最优选的实施方案中，所述镜子的表面为金。
在本发明的一些实施方案中，同时分析多个样品，在其中进行多样品分析的优选的实施方案中，将所述样品转移至多样品分析仪的一个室中。在本发明一些优选的实施方案中，所述多样品分析仪为下面详述的类型。在本发明一些典型的实施方案中，获得多个光谱并平均；例如，使用可购得的光谱仪(spectrometer)和控制软件，可能在1秒内获得64个吸收光谱。
然后从光源照射样品。所述光源可为本领域已知的任何类型的源，其可产生期望用于分析的数据集类型。在本发明的一些实施方案中，使用光(在与样品相互作用后)来产生光谱。作为一个非限制性的实例，如果所述数据集将为红外吸收或反射光谱，则可使用任何跨期望波长范围的红外光源。IR源可为宽谱带源(例如可购得之IR光谱仪的光源)，或者其可为可调谐窄谱带源(例如二极管激光器或量子级联激光器(QCL))。作为另一个非限制性的实例，如果将获得拉曼或荧光光谱，则可使用窄谱带源(例如激光器或滤光灯(filtered lamp))。作为另一个非限制性的实例，如果待测量的是UV-VIS吸收或反射光谱，则光源可为本领域已知的任何适合于UV-VIS光谱测量的UV源或可见光源。
然后将光从所述源指引至样品，且从所述样品在一次或更多次传递后指引至检测器，在那里测量并分析所述光。所述检测器可为本领域已知的任何适当类型的检测器。在本发明的一些实施方案中，其中从可购得的FTIR或FR-拉曼光谱仪的源获得照射光，所使用的检测器为与所述光谱仪一起提供的检测器。
在本文所公开方法的一些优选的实施方案中，其中使用通过光谱仪测量的光来构建光谱，在分析前将所述光谱进行预处理以产生经校正的光谱。
在本方法一些优选的实施方案中，预处理包括针对因水在样品中的存在产生的信号对所测量的光谱进行校正。在本发明一些最优选的实施方案中，使用三种技术的至少一种进行针对水存在的校正。在一些实施方案中，进行谱减法，其中将被标准化(normalized)为所测量光谱强度的水的光谱从所测量的光谱减去。在另一些实施方案中，对每个样品使用简单滤波，其中对于每个样品，产生多个其他样品光谱的平均值并减去。在又一些实施方案中，通过使用参考信号的自适应滤波进行针对因水的存在产生的信号的校正，以产生将水信号对所测量的样品光谱之作用的最优降低。用于谱减法、简单滤波和自适应滤波的算法是本领域公知的，并且可使用任何适当的可购得的算法或软件。现参考图1，其示出针对因水产生的信号进行校正前所测量的光谱(图lA)，和在进行校正后的同一光谱(图1B)。
在本方法一些优选的实施方案中，所述预处理还包括在所测量的光谱上进行基线校正。用于进行基线校正的方法是本领域公知的，并且可使用本领域已知的任何适当方法。
在本发明公开之方法的一些优选的实施方案中，所述预处理还包括降噪。许多用于在光谱中降噪的技术是本领域已知的。这些在本发明人构想的本发明范围内的技术的非限制性实例包括线性滤波、自适应滤波、使用Savitzky-Golay滤波器、低通滤波、谱减法或其任意组合。
因为目的光谱信息经常仅在光谱的有限部分发现，所以在本发明公开之方法的一些优选的实施方案中，其包括提取目的光谱区的步骤。作为非限制性实例，在其中从样品获得的数据集为振动光谱的许多实施方案中，目的光谱区可为选自以下的光谱范围：约850-1000cm-1；约990-1190cm-1；约1180-1290cm-1；约1235-1363cm-1；约1300-1350cm-1；约1500-1800cm-1；约1550-1650cm-1；约1720-1780cm-1；约2800-3050cm-1；约2836-2995cm-1；和约3000-3300cm-1。
在预处理之后，通过主成分分析(PCA)从经校正的数据集(光谱)提取目的光谱特征。可使用任何本领域已知的主成分分析方法。在本发明公开之方法的一些优选的实施方案中，确定光谱的一阶和二阶导数，从所述导数的每一个确定至少两个系数，即，获得总计至少4个系数。本发明人构想的是，另一些其中获得更高阶导数或者更大量或更少量系数的分析在本发明的范围内。现参考图2，其呈现了两个样品光谱，其中箭头指示对于所分析之细菌物种独特的光谱特征。这些光谱特征为通过PCA从光谱提取之光谱特征的非限制性实例。所述图呈现了两个样品光谱，并通过箭头指示了从所述光谱提取的特征。可从光谱提取的且可用于确定样品中特定类型细菌存在之光谱特征的非限制性实例包括峰相关性、峰波长、峰高、峰宽、峰截面、峰面积、经拟合多项式曲线的至少一个系数、在信号的至少两个峰下的面积总和，线性预测编码(LPC)、信号的平均值、信号的方差值、偏度值、峰度值、参数的高斯集(μ，σ，Ai)、峰强度比、小波系数及其衍生。
一旦已经进行了预处理，随后将提取的光谱特征分类，从而确定目的微生物是否存在于样品中。在本发明一些优选的实施方案中，通过使用选自监督学习、机器学习或模式识别算法的算法进行分类。许多这样的算法是本领域已知的。可用在本文公开之方法的分类算法的非限制性实例包括贝叶斯分类器、支持向量机(SVM)、线性判别函数、Fisher线性判别、C4.5算法树、K最近邻法、加权K最近邻法、分级聚类算法、RANDOMFORESTS、隐马尔科夫模型、高斯混合模型(GMM)、K均值聚类算法、Ward聚类算法、最小最小二乘法和神经网络算法。在本发明一些最优选的实施方案中，使用RANDOM FORESTS算法。所有这些学习算法始于训练方案以产生与已知类型微生物相关之光谱特征的数据库。然后将该数据库存储，然后基于学习算法中将从样品提取的光谱特征与在训练程序中获得的那些光谱特征比较的结果进行未知样品的分类。在本发明的一些实施方案中，选择拟合的参数使得基于具有预先确定之最小显著性阈值的特征完成分类。在本发明一些优选的实施方案中，该最小显著性阈值为95％置信界限。用于确定由PCA获得的特定特征是否通过了预先确定的显著性阈值之统计显著性检验的非限制性实例包括χ2、Wilcoxon检验和学生t检验。
现参考图3，其呈现了说明本文所公开方法的一个优选的实施方案之步骤的流程图。图3A概括地说明了所述方法的步骤。如上所讨论，所述方法分为3个阶段：训练(1000)、记忆(2000)和测试(3000)。所述训练阶段包含针对预先确定数量的已知类型的微生物获得至少一个数据集(1010)，随后预处理所述数据集(1020)以产生经校正的数据集和特征提取(1030)。一旦所述训练程序已经完成，在记忆阶段存储经提取的特征。该图说明了细菌类型的3个非限制性实例(2010,2020,2030)，使用其模式谱作为用于进行决策过程的数据库。所述训练和记忆阶段并不限于任何特定数量的已知微生物。在测试阶段，使用怀疑含有一种或更多种特定类型微生物的样品来产生如上所述的数据集(3010)。将所测量的光谱进行预处理(3020)并如上所述从校正过的光谱提取光谱特征(3030)。然后参考在记忆阶段2000获得的结果运行分类算法(3040)。最终，基于分类算法的结果决定怀疑的微生物是否存在。图3B呈现了在样品中怀疑存在的细菌的三个非限制性实例之测试阶段步骤的更详细的流程图。
因为所述方法包括学习算法的使用，所以其可用在许多不同的情况中。本文所公开的方法可应用于其中的非限制性实例包括：确定特定预先确定类型的微生物是否存在于经培养样品中；确定特定预先确定类型的微生物是否存在于有一种或更多种其他类型微生物存在的经培养样品中；以及确定样品含有微生物并鉴定存在的微生物的一种类型或多种类型或者确认存在的微生物不匹配数据库中的任何类型。
通过本文公开的方法可检测和鉴定之细菌类型的非限制性实例包括：葡萄球菌；凝固酶阴性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌，链球菌属；绿色链球菌群；肠球菌属；棒杆菌属，气球菌属；微球菌属；消化链球菌属；乳球菌属；明串珠菌属；Tothia spp.；孪生球菌属；产碱菌属；链格孢菌属；黄杆菌属；芽孢杆菌属；无色杆菌属；不动杆菌属；放线杆菌属；产碱菌属；弯曲杆菌属；爱德华氏菌属；埃里希氏体属；肠杆菌属；爱文氏菌属；黄杆菌门；哈夫尼菌属；克雷伯氏菌属；克吕沃尔氏菌属；军团菌属；莫拉氏菌属；摩根氏菌属；奈瑟氏球菌属；巴斯德氏菌属；普雷沃氏菌属；变形菌属；普罗威登斯菌属；假单胞菌属；拉恩氏菌属；沙门氏菌属；沙雷氏菌属；志贺氏菌属；鞘氨醇杆菌属；弧菌属；耶尔森氏菌属；奈瑟氏球菌属；金氏菌属；心杆菌属；非结核分枝杆菌(NTB)，结核分枝杆菌；和鸟分枝杆菌。
所述方法还可用来检测和鉴定酵母和真菌。通过本文公开的方法可检测和鉴定之酵母和真菌类型的非限制性实例包括假丝酵母属；曲霉属；镰刀菌属；和青霉菌属。通过本文公开的方法可检测和鉴定之酵母和真菌单个物种的非限制性实例包括白假丝酵母；光滑假丝酵母；克柔假丝酵母；近平滑假丝酵母；热带假丝酵母；烟曲霉；黄曲霉；黑曲霉；和土曲霉。
在本方法的一些实施方案中，取代光谱或除了光谱之外，测量干涉图样或散射图样。这些实施方案对于通过细菌物理特征而非纯化学特征的不同鉴定细菌是特别有用的。作为一个非限制性实例，使用本领域公知的分析方法，可使用由单色光照射样品产生的干涉图样来估计细胞壁或细胞膜厚度，且可使用散射图样来估计细胞壁粗糙度。
作为本发明公开方法的一个实施方案的一个非限制性实例(其整合了非光谱数据集的构建和分析)，已经报道了甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的细胞壁比甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)的细胞壁厚；参见，例如Kawai，M.等，″Cell-Wall Thickness：Possible Mechanismof Acriflavine Resistance in Meticillin-Resistant Staphylococcus Aureus，″J.Med.Microbiol.2009，58(Pt3)，331-336，其通过引用整体并入本文。还已报道MRSA的细胞壁粗糙度与MSSA的细胞壁粗糙度不同；参见，例如Wilkinson，B.J.等，″Cell Wall Composition and Associated Propertiesof Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Strains，″J.Bacteriol.1978，136，976-82，其通过引用整体并入本文。因此提供多模态方法来区别细菌单个物种的抗生素抗性菌株和抗生素敏感性菌株是在本发明的范围内。作为一个非限制性实例，所述方法可用来区别MRSA和MSSA。在这些实施方案中，构建至少一个数据集的步骤包含构建光谱、干涉图样和散射图样。如上详细描述地分析所述光谱以确认目的细菌(例如金黄色葡萄球菌)的存在。通过将从光源到样品的光和由样品散射的光通过干涉仪(在一些优选的实施方案中，使用Mach-Zehnder干涉仪)获得干涉图样，且从所述干涉图样确定所述样品中细菌的细胞壁厚度。然后将测得的细胞壁厚度与已知的抗生素抗性和抗生素敏感性细菌(例如MRSA和MSSA)的细胞壁厚度比较，且根据测得的细胞壁厚度将样品中的细菌分类为抗生素抗性或抗生素敏感性(例如MRSA或MSSA)。在本发明一些优选的实施方案中，所述方法还包括测量从样品中的细菌细胞散射的预先确定波长之光的空间分布。从散射图，使用本领域已知的分析方法估计所述细菌细胞壁的粗糙度，且将测得的粗糙度与已知的抗生素抗性和抗生素敏感性细菌(例如MRSA和MSSA)的细胞壁粗糙度比较，并据此将样品中的细菌分类。
公开用于在本发明公开之方法中进行测量的设备也在本发明的范围内。现参考图4，其呈现了这样的设备20的主要组件。所述设备包含光源200；用于保持样品230的样品室220；用于将光210从源传至样品230的构件240；在由来自源250的光照射样品后用于测量由样品散射的和/或透射的光的检测器；以及将光从样品室传至检测器260的构件。
光源200可为本领域已知的任何适合于产生期望之数据集类型(光谱、干涉图样、散射图样等)的光源。在本发明的许多实施方案中，光源以选自以下的频率范围发出光：紫外、可见光、红外、近红外、中红外、远红外、微波和太赫(terahertz)。取决于期望的数据集类型，所述光源可为宽谱带或单色，且如果为单色，则固定频率或可调谐。在本发明的一些其中所述数据集为红外光谱的实施方案中，光源为标准宽谱带红外光源，例如那些在可购得的红外光谱仪中找到的(例如碳硅棒灯(globarglower)或能斯特灯)。在另一些其中所述数据集为光谱的实施方案中，光源为可调谐激光器。适合用于本文公开之设备的可调谐激光器的非限制性实例包括可调谐二极管激光器和量子级联激光器。在其中使用干涉分析法的实施方案中，光源可为任何本领域已知用于这种测量的基础单色光源(例如与滤波器或单色仪耦合的灯、激光器等)。
现参考图5，其示意性地说明根据本发明的一个实施方案的设备。在该实施方案中，其中数据集为红外光谱，使用可购得之FTIR光谱仪的光源200和检测器260。从存在于FTIP光谱仪的源来的光210射到聚光的球面镜240并指引其至外部样品室220。在所显示的实施方案中，样品室220是在美国专利申请公开号20120002199中公开类型的多次传递池，其通过引用整体并入本文。在所示的特别的实施方案中，所述外部样品室为提供与样品230多次相互作用的多次传递池。通过一系列布置在样品室内的镜子250a将光引至检测器，所述样品室将光引至样品，且在多次传递后，至样品室外至球面镜250b，所述球面镜将光会聚在检测器260上。在所示的实施方案中，使用由FTIR光谱仪提供的检测器，但是可使用任何适合于提供所期望数据集的检测器，且可将所述检测器安置在任何方便于设备操作者的位置。
图5中示出的多次传递池220包括抛物柱面镜221；包含用于保持样品230之样品保持构件的台222，布置所述台以使得至少一部分从所述光源经由所述光会聚构件传到所述抛物柱面镜，然后从所述抛物柱面镜被反射的光，将射到经由所述样品保持构件连接到所述台的样品，并使得从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将被指引至非所述样品的位置；且布置n个折叠镜223使得从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将射到所述折叠镜之一；对于m＝1至n-1，射到第m个折叠镜的光将反射回到所述抛物柱面镜使得其将随后被反射到所述样品上，且使得从所述样品反射的光将从所述抛物柱面镜反射至第(m+1)个折叠镜；而对于m＝n，从所述第m个折叠镜反射的光将被指引至所述光耦合构件，在本发明一些优选的实施方案中，n＝14(即，有7对折叠镜)。现参考图6，其示出镜子排列的更多细节，所述镜子将来自源200的光通过多次传递池传至检测器260。
现参考图7A，其说明了进行干涉测量之装置的一个典型实施方案10。使用Mach-Zehnder干涉仪100。来自源200的光(在一些优选的实施方案中，光来自基础单色源，例如激光器；在一些优选的实施方案中，使用可见光或NIR二极管激光器)通过所述干涉仪传到样品230上，其位于镜130上。然后，经反射的光被传回所述干涉仪并到检测器260元件上。通过x-y扫描仪150扫描所述样品。由此所获得的干涉图样将取决于细胞壁的厚度且对于含有有较厚细胞壁之细菌的样品(图7B)和对于含有有较薄细胞壁之细菌的样品(图7C)是不同的。
现参考图8，其呈现了用于进行散射测量之装置的一个实施方案20的示意图。单色光源200(例如二极管激光器)以预先确定的在可见光/NIR范围内的波长产生输出光。在该实施方案中的检测器260包含在室中以固定距离成半圆排列的一组检测器。激光器和检测器环固定器270可能通过x-y扫描构件150的使用而水平移动，所述x-y扫描构件将使得能够扫描样品的大部分表面。所述检测器将发送数据至分析软件，所述分析软件用来产生散射图。所述散射图将给出另外的数据使得能够确定细胞壁粗糙度这样的物理特征。
在本发明的一些实施方案中，在单批中分析多个样品。在这些实施方案中，样品室220包含多样品分析仪。现参考图9，其示意地呈现了这种多样品分析仪的一个实施方案。所述多样品分析仪包含多个样品室，将单个样品放置在所述样品室的每个中。在本发明一些优选的实施方案中，光源200为可调谐激光器，例如量子级联激光器。在本发明一些最优选的实施方案中，光源在8-12微米的波长范围内可调谐。通过在期望的波长范围内扫描所述光源测量目的光谱区。将来自所述源的光指引通过入射孔到达将光束引至样品的可控回转镜。如果所述回转镜被移动至其其他位置，光通过第二孔传入下一个样品室中。定向且经校准的激光束使得能够用比上图5中示出的FTIR源小得多的会聚镜。在多室分析仪中，将光束扩展以覆盖光学池镜区域(optical cell mirror area)的整个区域；因为光输出是经校准的，单个室比FTIR情况下的小。在本发明一些优选的实施方案中，使用多次传递池。在与样品相互作用后，将光引至检测器。记录并存储到达检测器的信号作为光源输出波长的函数，且由每个波长处的测量值建立光谱。
实施例
提供下面的非限制性实施例来说明本发明的多个实施方案且使得本领域普通技术人员之一能够使用本发明。
实施例1
每种类型的细菌具有独特的光谱特征图。虽然许多类型的细菌具有类似的光谱特征图，但是由于细胞膜上蛋白质的不同和DNA/RNA结构的不同，仍然存在一些光谱差异。现参考图10，其呈现了两个不同物种的细菌，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)(图10A)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(图10B)的典型IR光谱(标准化的吸收度作为能量(cm-1)的函数)。如可从这些图中看到的，虽然两个光谱在结构上大体上类似，然而可在细处看到差异，且这些差异足够大以使得能够通过使用本文所公开方法区分两个物种。
实施例2
现参考图11至22，其提供了示出多个细菌物种之IR吸收光谱(标准化的吸收度作为能量(cm-1)的函数)的另外的实施例。在一些情况下，通过箭头指示光谱的独特特征。在表1中概括了细菌的物种以及通过光谱唯一鉴定的每个物种菌株的数量。如可从所述图中看到的，本文公开的方法不仅能够区别不同物种的细菌，而且能够区别单个细菌物种的不同菌株。
[表1]
实施例3
下面的实施例说明了提供来区别不同种类细菌之方法的体外实施例。
首先，在训练阶段期间，将数据库中的每种细菌样品引入系统，基于其对于每种细菌估计统计模型并在存储器中保存。该过程产生许多统计模型，每个代表一种细菌类型。在测试阶段期间，所述系统被呈现以“新”样品(即，以前从未“见过”的样品)，并进行数据分析和处理。所述系统将每个细菌模式与在训练阶段期间保存在存储器中之模型的每一个进行比较。将可能性得分分配给每个模型。将提供了最大得分的模型选为分类决策。
现参考图23，其呈现了根据本文公开的方法鉴定细菌的两个实施例。所呈现的是PCA特征空间的图。图23A示出给出大肠杆菌和链球菌群A结果的图，而图23B示出给出肺炎克雷伯氏菌(Klebsellia pneumonia)和MRSA结果的图。在这两种情况下，两种类型的受测细菌的区别是清楚的。
实施例4
使用本文公开的方法鉴定10种类型的细菌。在所有情况下，进行最少10次测量。表2示出10种类型的受测细菌的混淆矩阵(confusionmatrix)；在圆括号中示出了进行(mad)测量的次数。
[表2]
系统产生了84.1％的平均正确分类率(15.9％的平均错误率)。对于数据库中具有较少特征图的类别来说，所述分类率较低(例如阴沟肠杆菌(Enterobayct.cloacae)和奇异变形菌(Prot.mirabilis))。在这些情况中，相对少数量的特征导致在本方法的训练阶段期间不太有效的训练。在其中已经进行了足够数量测量以使得训练有效的情况下本方法的全面成功，证明了本文公开的方法能够区分所研究之多种类型的细菌。随着可得的细菌和光谱之数据库规模的增加，本方法将提供更加准确的结果。
Claims (57)
1.一种用于光谱检测和鉴定培养物中微生物的方法，其中所述方法包括：
获得怀疑含有所述微生物的至少一个经培养样品；
将所述经培养样品转移至样品池；
将所述样品与从光源获得的光相互作用；
在所述相互作用的步骤之后，测量至少一部分剩余的所述光；
如果所述数据集为光谱：
则通过进行至少一个选自以下的步骤预处理所述数据集：(a)针对因所述经培养样品中水的存在产生的信号，对所述数据集进行校正，(b)移除基线，(c)降噪，以及(d)提取目的光谱区，从而产生经校正的数据集；
通过使用选自主成分分析(PCA)和线性预测编码的方法从所述经校正的数据集提取目的光谱特征，从而产生一组经提取的光谱特征；
通过使用整合了学习算法的方法将所述经提取的光谱特征分类，从而确定所述微生物是否存在于所述经培养样品中；且
通过使用特征选择方法发现最优的一组特征；
如果所述数据集为干涉图样：
则从所述干涉图样估计所述微生物的细胞壁厚度；且
将所述细胞壁厚度分类，从而确定所述微生物是否存在于所述经培养样品中；
如果所述数据集为散射图样：
则从所述散射图样估计所述微生物的细胞壁粗糙度；且
将所述细胞壁粗糙度分类，从而确定所述细菌是否存在于所述经培养样品中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得经培养样品的步骤包括：
获得生物样品；
培养所述生物样品，从而产生经培养样品；以及
将所述菌落涂抹在表面上。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物样品为选自于固体形式和液体形式的形式。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物样品选自喷嚏、唾液、粘液、胆汁、尿、阴道分泌物、中耳抽出物、脓、胸腔积液、滑液、脓肿、腔拭子、血清、血液和脊液。
5.根据权利要求2所述的方法，其中培养所述生物样品的所述步骤包括将包含在样品中的所述生物样品在血琼脂板中培养12至24小时。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述涂抹的步骤包括在表面上涂抹以覆盖2.5cm直径的区域。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述涂抹的步骤包括在镜子的反射表面上涂抹。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述反射表面为金。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述培养的步骤之后进行选择多个菌落的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述将所述经培养样品转移至样品池的步骤包括将所述经培养样品转移至多次传递池。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得至少一个经培养样品的步骤包括获得多个经培养样品；所述将所述经培养样品转移至样品池的步骤包括将所述多个经培养样品的每个转移至样品池，所述样品池被布置在多室分析仪之分开的室中；且所述构建数据集的步骤包括对所述多个样品的每个分别构建数据集。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述多室分析仪的每个室包含：
入射孔；
与所述入射孔对齐的出射孔；
池；以及
可在第一位置和第二位置之间活动之可活动的回转镜，在所述第一位置中通过所述入射孔进入所述室的光从所述镜反射入所述池，在所述第二位置中通过所述入射孔进入所述室的光传到所述出射孔而不进入所述池。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述池为多次传递池。
14.根据权利要求10或13之一所述的方法，其中所述多次传递池包含：
抛物柱面镜；
光会聚构件，其用于会聚所述光源的输出，并被布置为使得所述光源的输出射到所述抛物柱面镜；
光耦合构件，其用于将来自多次传递池的光指引至检测器；
包含样品保持构件的台，所述样品保持构件用于保持样品，布置所述台以使得至少一部分从所述光源经由所述光会聚构件传到所述抛物柱面镜，然后从所述抛物柱面镜反射的光，将射到经由所述样品保持构件连接到所述台的样品，并使得从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将被指引至非所述样品的位置；且
布置n个折叠镜使得：
从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将射到所述折叠镜之一；
对于m＝1至n-1，射到第m个折叠镜的光将被反射回至所述抛物柱面镜，使得其将随后被反射到所述样品上，且使得从所述样品反射的光将从所述抛物柱面镜反射至第(m+1)个折叠镜；而
对于m＝n，从所述第m个折叠镜反射的光将被指引至所述光耦合构件。
15.根据权利要求14所述的方法，其中围绕圆周成对布置所述n个折叠镜。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述n个折叠镜包含7对镜子。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述光源包括FTIR光谱仪的光源。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述光源包括拉曼光谱仪的光源。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述光源为激光器。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述激光器选自二极管激光器和量子级联激光器。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述构建数据集的步骤包括构建选自以下的光谱：红外吸收光谱、红外反射光谱、拉曼光谱、UV-VIS吸收光谱和UV-VIS反射光谱。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述构建数据集的步骤包括构建红外吸收光谱。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述预处理的步骤包括提取选自以下的光谱范围：约850-1000cm-1；约990-1190cm-1；约1180-1290cm-1；约1235-1363cm-1；约1300-1350cm-1；约1500-1800cm-1；约1550-1650cm-1；约1720-1780cm-1；约2800-3050cm-1；约2836-2995cm-1；和约3000-3300cm-1。
24.根据权利要求1所述的方法，其中针对因水在所述经培养样品中的存在产生的数据的存在，对所述数据集进行校正的步骤包括选自以下的步骤：(a)通过从所述数据集减去由其他数据集的平均值所构建的数据集来进行简单滤波；(b)从所述数据集减去参考数据集；以及(c)通过使用参考信号的自适应滤波进行自适应滤波以产生将水信号对所测量的样品光谱之作用的最优降低。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述预处理所述数据的步骤包括通过使用选自以下的至少一种技术降噪：线性滤波、自适应滤波、使用Savitzky-Golay滤波器、低通滤波和谱减法。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述使用PCA方法的步骤包括：
获得所述数据集的一阶和二阶导数；且
获得所得到之每个导数的两个系数。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述经提取的光谱特征组包括选自以下的光谱特征：峰相关性、峰波长、峰高、峰宽、峰截面、峰面积、经拟合多项式曲线的至少一个系数、在信号的至少两个峰下的面积总和，线性预测编码(LPC)、信号的平均值、信号的方差值、偏度值、峰度值、参数的高斯集(μ，σ，Ai)、峰强度比、小波系数及其衍生。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述特征选择方法选自顺序特征选择和遗传算法。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述学习算法选自贝叶斯分类器、支持向量机(SVM)、线性判别函数、Fisher线性判别、C4.5算法树、K最近邻法、加权K最近邻法、分级聚类算法、整合了使用由Breiman和Cutler开发的方法之集成分类器的学习算法、隐马尔科夫模型、高斯混合模型(GMM)、K均值聚类算法、Ward聚类算法、最小最小二乘法和神经网络算法。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述学习算法整合了使用由Breiman和Cutler开发之方法的集成分类器。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述分类的步骤是基于通过所述学习算法获得的拟合的参数而进行的，所述学习算法基于具有最小显著性阈值的特征。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述最小显著性阈值为95％置信界限。
33.根据权利要求31所述的方法，其中通过选自χ2、Wilcoxon检验和学生t检验的统计检验确定所述最小显著性阈值。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括选自以下的细菌：葡萄球菌(Staphylococcus)；凝固酶阴性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)，链球菌属(Streptococcus spp.)；绿色链球菌(Streptococcus viridans)群；肠球菌属(Enterococcus spp.)；棒杆菌属(Corvnebacterium spp.)，气球菌属(Aerococcus spp.)；微球菌属(Micrococcus spp.)；消化链球菌属(Peptostreptococcus spp.)；乳球菌属(Lactococcus spp.)；明串珠菌属(Leuconostoc spp.)；Tothia spp.；孪生球菌属(Gemella spp.)；产碱菌属(Alcaligenes spp.)；链格孢菌属(Alternaria spp.)；黄杆菌属(Flavobacterium spp.)；芽孢杆菌属(Bacillus spp.)；无色杆菌属(Achromobacter spp.)；不动杆菌属(Acinetobacter spp.)；放线杆菌属(Acinobacillus spp.)；产碱菌属(Alcaligenes spp.)；弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)；爱德华氏菌属(Edwardsiella spp.)；埃里希氏体属(Ehrlichia spp.)；肠杆菌属(Enterobacter spp.)；爱文氏菌属(Ewingella spp.)；黄杆菌门(Flavobateria)；哈夫尼菌属(Hafnia spp.)；克雷伯氏菌属(Klebsiellaspp.)；克吕沃尔氏菌属(Kluyvera spp.)；军团菌属(Legionella spp.)；莫拉氏菌属(Moraxella spp.)；摩根氏菌属(Morganella spp.)；奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)；巴斯德氏菌属(Pasteurella spp.)；普雷沃氏菌属(Prevotella spp.)；变形菌属(Proteus spp.)；普罗威登斯菌属(Providencia spp)；假单胞菌属(Pseusomonas spp.)；拉恩氏菌属(Rahnella spp.)；沙门氏菌属(Salmonella spp.)；沙雷氏菌属(Serratiaspp.)；志贺氏菌属(Shigella spp.)；鞘氨醇杆菌属(Sphingobacteriumspp.)；弧菌属(Vibrio spp.)；耶尔森氏菌属(Yershinia spp.)；奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)；金氏菌属(Kingella spp.)；心杆菌属(Cardiobacterium)；非结核分枝杆菌(NTB)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；和鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括选自以下的细菌：金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)；表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)；溶血葡萄球菌(Staph.haemolyticus)；路邓葡萄球菌(Staph.lugdunensis)；中间葡萄球菌(Staph.intermedius)；人葡萄球菌(Staph.hominis)；模仿葡萄球菌(Staph.simulans)；沃氏葡萄球菌(Staph.warneri)；解糖葡萄球菌(Staph.saccharolyticus)；头状葡萄球菌(Staph.Capitis)；所有其他的凝固酶阴性葡萄球菌(Staphylococcus)；酿脓链球菌(Strep.pyogenes)群A；无乳链球菌(Str.agalactiae)群B；链球菌(Strep)；，链球菌(Streptococcus)群G；链球菌(Streptococcus)群C；链球菌(Streptococcus)群F；链球菌(Streptococcus)群B；链球菌(Streptococcus)群D；星群链球菌(Strep.constellatus)；中间链球菌(Strep.intermedius)；少酸链球菌(Strep.acidominimus)；牛链球菌(Strep.bovis)；咽峡炎链球菌(Strep.anginosus)；变异链球菌(Strep.mutans)；唾液链球菌(Strep.salivarius)；血链球菌(Strep.sanguis)；嗜热链球菌(Strep.thermophilus)；缓症链球菌(Strep.mitis)；马链球菌(Strep.equi/equisim)；绿色链球菌(Strep viridans)；粪肠球菌(Enteroccocus faecalis)；屎肠球菌(Enter.faecium)；铅黄肠球菌(Enter.casseliflavus)；鹑鸡肠球菌(Enter.gallinarum)；鸟肠球菌(Enter.avium)；耐久肠球菌(Enter.durans)；单核细胞增生利斯塔氏菌(Listtmonocytogenes)；白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；藤黄微球菌(Micrococcus luteus)；玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)；浅绿气球菌(Aerococcus viridans)；蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)；溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)；鲍氏不动杆菌(Acinetobact.baumanni)；琼氏不动杆菌(Acinetobact.junii)；鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffi)；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)；温和气单胞菌(Aeromonas sobria)；维罗纳气单胞菌(Aeromonas veronii)；多形拟杆菌(Bacter.thetaiotaomicron)；吉氏拟杆菌(Bacter.distasonis)；粪便拟杆菌(Bacter.stercoris)；单形拟杆菌(Bacter.uniformis)；脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)；卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)；普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)；洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)；大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)；布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)；差异柠檬酸杆菌(Citrobacter diversus)；法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)；弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)；克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)；塞氏柠檬酸杆菌(Citrobactersedlakii)；杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)；内毒梭菌(Clistridumbotulinum)；艰难梭菌(Clostridum difficile)；产气荚膜梭菌(Clostridumperfringens)；索氏梭菌(Clostridum sordellii)；破伤风梭菌(Clostridiumtetani)；大肠杆菌(E.coli)；生癌肠杆菌(Enterobact.cancerogenus)；成团肠杆菌(Enterob.agglomerans)；日勾维肠杆菌(Enterob.gergoviae)；中间肠杆菌(Enterob.intermedium)；阪崎肠杆菌(Enterob.sakazakii)；产气肠杆菌(Enterobact.aerogenes)；阴沟肠杆菌(Enterobacter.cloacae)；赫氏埃希氏菌(Escherichia hermanni)；解鸟氨酸克雷伯氏菌(Kl.ornithinolytica)；植生克雷伯氏菌(Kl.planticola)；肺炎克雷伯氏菌(Kleb.pneumoniae)；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)；侵肺军团菌(L.pneumophila)；粘膜炎莫拉氏菌(Morax.catarrhalis)；摩氏摩根氏菌(Morganella morgan#)；产黑素普雷沃氏菌(Prey.melaninogenica)；二路普雷沃氏菌(Prevotelht bivia)；解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)；口腔普雷沃氏菌(Prevotellaoralis)；奇异变形菌(Proteus mirabilis)；彭氏变形菌(Proteus penneri)；普通变形菌(Proteus vulgaris)；拉氏普罗维登斯菌(Provi.rustigianii)；雷氏普罗维登斯菌(Providencia rettgeri)；斯氏普罗维登斯菌(Providenciastuartii)；铜绿假单胞菌(Pseud.aeruginosa)；产碱假单胞菌(Pseud.alcaligenes)；荧光假单胞菌(Pseud.fiuorescens)；门多萨假单胞菌(Pseud.mendocina)；睾丸酮假单胞菌(Pseud.testosteroni)；缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)；甲型副伤害沙门氏菌(Salm.paratyphi/4)；乙型副伤害沙门氏菌(Salm.paratyphi B)；肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)；沙门氏菌(Salmonella)群B；沙门氏菌(Salmonella)群C；沙门氏菌(Salmonella)群C1；沙门氏菌(Salmonella)群C2；沙门氏菌(Salmonella)群D；伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)；液化沙雷氏菌(Serr.liquefaciens)；无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)；居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)；粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)；气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)1；普城沙雷氏菌(Serrafiaplymuthica)；深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)；鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)1；弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)；索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)；嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotr.maltophilia)；副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)；创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)；小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocoliticus)；假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)；脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)；淋病奈瑟氏球菌(Neissseria gonorrhoeae)；干燥奈瑟氏球菌(N.sicca)；微黄奈瑟氏球菌(N.subflava)；长奈瑟氏球菌(Neisseriaelongata)；啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)；粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)；流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)；副流感嗜血菌(Haemophilusparainfluenzae)；金氏菌属(Kingella spp.)；心杆菌属(Cardiobacteriumspp.)；紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)；结核分枝杆菌(M.tuberculosis)；鸟分枝杆菌(Mycobact.avium)；偶发分枝杆菌(Mycob.fortuitum)；猿分枝杆菌(Mycob.simiae)；所有其他的非TB分枝杆菌(Mycobacteria)；N.T.M；内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)；麦尔放线菌(Actinomyces meyeri)；诺卡氏菌属(Nocardia spp.)；布鲁氏菌属(Brucella spp.)；白假丝酵母(Candida albicans)；光滑假丝酵母(Candida glabrata)；克柔假丝酵母(Candida krusei)；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)；热带假丝酵母(Candida tropicalis)；烟曲霉(Aspergillus fumigatus)；黄曲霉(Aspergillus flavus)；黑曲霉(Aspergillus niger)；土曲霉(Aspergillus terreus)；新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)；和隐球菌属(Cryptococcus spp.)(非新型)；抗β-内酰胺酶和大环内酯类的肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)，抗β-内酰胺酶和氨基糖苷类的绿色链球菌(Streptococcus viridians)群，抗万古霉素和替考拉宁且高度抗青霉素和氨基糖苷类的肠球菌(Enterococci)，对甲氧西林、其他β-内酰胺类、大环内酯类、林可酰胺类以及氨基糖苷类敏感和有抗性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，抗大环内酯类的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，大环内酯抗性的链球菌(streptococci)群B、C和G，抗β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、林可酰胺类以及糖肽类的凝固酶阴性葡萄球菌(Staphylococci)，利斯塔氏菌属(Listeria)和棒杆菌属(corynebacterium)的多抗菌株，抗青霉素和大环内酯类的消化链球菌属(Peptostreptococcus)和梭菌属(clostridium)(例如艰难梭菌(C.Difficile))，抗β-内酰胺酶的流感嗜血菌，抗抗生素的铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)以及对抗生素、氨基糖苷类和大环内酯类敏感的肺炎克雷伯氏菌。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括选自酵母和真菌的微生物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述微生物选自假丝酵母属(Candida spp.)；曲霉属(Aspergillus spp.)；镰刀菌属(Fusarium spp.)；和青霉菌属(Penicillium spp.)。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述微生物选自白假丝酵母；光滑假丝酵母；克柔假丝酵母；近平滑假丝酵母；热带假丝酵母；烟曲霉；黄曲霉；黑曲霉；和土曲霉。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个数据集包括光谱、干涉图样和散射图样。
40.根据权利要求39所述的方法，其中：
所述微生物包括细菌单个物种的抗生素抗性和抗生素敏感性菌株；
所述光谱用来确定所述样品内细菌的至少一种化学特征；
所述干涉图样用来估计所述样品内细菌的细胞壁厚度；
所述散射图样用来估计所述样品内细菌的细胞壁粗糙度；
且所述分类步骤包括将所述光谱、所述干涉图样和所述散射图样的全部结果分类。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述抗生素抗性菌株为甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌，且所述抗生素敏感性菌株为甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌。
42.一种用于光谱检测和鉴定培养物中细菌的设备，其中所述设备包含：
光源；
样品室，其包含用于保持样品池之构件，所述样品池含有怀疑含所述细菌的样品，所述样品室与所述光源光学连接；
检测器，其用于在由所述光源发出的光与所述样品相互作用后测量光；
控制构件，其与所述光源和所述检测器电子连接来控制数据收集；以及
分析构件，其用于进行所述数据预处理、所述数据分析和所述数据分类。
43.根据权利要求42所述的设备，其中所述样品室包含多次传递池。
44.根据权利要求42所述的设备，其中所述样品室包含含有多个室的多室分析仪。
45.根据权利要求42所述的设备，其中所述多室分析仪的每个室包含：
入射孔；
与所述入射孔对齐的出射孔；
池；以及
切换装置，其能够将通过所述入射孔进入所述室的光指引至所述池或至所述出射孔而不进入所述池。
46.根据权利要求45所述的设备，其中所述切换装置为可在第一位置和第二位置之间活动之可活动的回转镜，在所述第一位置中通过所述入射孔进入所述室的光从所述镜反射入所述池，在所述第二位置中通过所述入射孔进入所述室的光传到所述出射孔而不进入所述池。
47.根据权利要求45所述的设备，其中所述切换装置是光学开关。
48.根据权利要求47所述的设备，其中所述光学开关是基于光纤的。
49.根据权利要求45所述的设备，其中所述池为多次传递池。
50.根据权利要求41或49之一所述的设备，其中所述多次传递池包含：
抛物柱面镜；
光会聚构件，其用于会聚所述光源的输出，并被布置为使得所述光源的所述输出射到所述抛物柱面镜上；
光耦合构件，其用于将来自多次传递池的光指引至检测器；
包含样品保持构件的台，所述样品保持构件用于保持样品，布置所述台以使得至少一部分从所述光源经由所述光会聚构件传到所述抛物柱面镜，然后从所述抛物柱面镜反射的光，将射到经由所述样品保持构件连接到所述台的样品，并使得从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将被指引至非所述样品的位置；且
布置n个折叠镜使得：
从所述样品反射至所述抛物柱面镜的光将射到所述折叠镜之一；
对于m＝l至n-1，射到第m个折叠镜的光将被反射回到所述抛物柱面镜使得其将随后被反射到所述样品上，且使得从所述样品反射的光将从所述抛物柱面镜反射至第(m+1)个折叠镜；且
对于m＝n，从所述第m个折叠镜反射的光将被指引至所述光耦合构件。
51.根据权利要求50所述的设备，其中围绕圆周成对布置所述n个折叠镜。
52.根据权利要求51所述的设备，其中所述n个折叠镜包含7对镜子。
53.根据权利要求42所述的设备，其中所述光源发出的光所在的波长范围选自UV、可见光、红外、近红外、中红外、远红外、微波和太赫。
54.根据权利要求42所述的设备，其中所述光源包括FTIR光谱仪的光源。
55.根据权利要求42所述的设备，其中所述光源包括拉曼光谱仪的光源。
56.根据权利要求42所述的设备，其中所述光源为激光器。
57.根据权利要求56所述的设备，其中所述激光器选自二极管激光器、光纤激光器和量子级联激光器。
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