CN111742055A - 使用光谱技术识别微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
对微生物进行分类和鉴定的方法，其提供利用FTIR ATR技术对微生物进行分类和识别。
Description
技术领域
本发明涉及一种识别微生物的方法，该方法使用统计技术(诸如，例如光谱轮廓的多变量分析技术)或者神经网络，以与常规方法相比在极短的时间内获得与微生物生长相关的标志。
具体而言，本发明基于分析仪器的开发，通过分析未知样品的光谱轮廓ATR-FTIR以及将该光谱轮廓与先前收集并存储在数据库中的样品的光谱轮廓进行比较来识别微生物。
背景技术
傅里叶变换红外光谱(FTIR)是一种非破坏性的分析技术，可以获得被分析样品的化学成分信息。自20世纪90年代初以来，该技术已用于生物样品的分析(Diem M.et al.,The Analyst[27Aug 2004,129(10):880-885])。
同时，FTIR技术识别和分类未知微生物的能力已被显示(Helm D.et al.,Journalof General Microbiology(1991,137,69-79)和Marley L.et al.,VibrationalSpectroscopy 26,2,2001,151-159)。
微生物的不同种类、亚种或子类的特征在于蛋白质、脂类、核酸和多糖方面的精确的生物化学组成，这反映在不同的振动光谱中(Griffiths和Chalmers编辑,2001Handbookof vibrational spectroscopy,John Wiley&sons,New York,Volume 5)。
FTIR光谱技术在微生物学中的一些潜在应用包括：
(i)在人类或兽医领域，例如在临床实验室中，识别病原体；
(ii)流行病学调查、研究主题、病原体筛查、卫生检查、传染链的阐明、控制疗法和反复感染的检测；
(iii)从环境中识别和筛选微生物；
(iv)监测生物技术过程；
(v)食品或制药工业的微生物质量控制；
(vi)保存收获的菌株。
基于未知样品的光谱与存储在数据库中的微生物的已知物种的光谱之间的比较分析技术来识别微生物的方法是已知的。
在以下文档中报道了这类型的已知识别方法的示例：US5660998A、CN103217398A、US6379920B1、WO2006002537A1、US9551654B2、US20170167973A1、WO2017/210783A1，Sousaet al.,European Journal of Clinical Microbiology&Infectious Diseases(欧洲临床微生物学与传染病杂志)(2014)33:1345-1353，Whittaker et al.,Journal ofMicrobiological Methods(微生物方法杂志)55(2003)709-716，Wang et al.,International Journal of Food Microbiology(国际食品微生物学杂志)167(2013)293-302。
然而，在许多已知方法中，光谱采集是在透射、反射或成像模式下进行的。
例如，在US5660998和US6379920中报告了透射或反射采集模式，而在WO2006002537A1、US9551654B2、US20170167973A1中采用了成像模式。
这些方法的缺点在于，获得的信号直接取决于样品的厚度和形态，样品可能太厚而产生饱和或者是不均匀的以及由于散射而发生失真。
众所周知，基于成像方式的方法，例如多像素方式，与单点检测器相比，由于每像素可获得的信噪比较低，可能对单个光谱的分辨率有限制。
现有技术的另一个缺点是，由于水或其他污染物的存在，光谱通常会呈现覆盖微生物的特殊信号的信号。
在一些情况下，诸如例如CN103217398A，采用了干燥程序，但如WO 2017/210783A1所报道的，这些程序会对微生物产生显著的不可逆的影响，从而也改变了微生物的光谱。
在某些情况下，例如WO 2017/210783A1，可以依靠多次采集来去除光谱中存在的水成分。然而，这种解决方案的缺点是分析时间更长和比较光谱的分析程序更复杂。
现有技术的另一个缺点是，对照数据库通常包含有限数量的微生物物种，因此不能涵盖广泛的可能物种。
举例来说，在CN103217398A中报道的数据库和相关识别方法涉及13个细菌物种。
此外，随着对照数据库大小的增加，出现了一系列与培养和生长微生物物种的过程、采集光谱的过程和比较分析过程有关的问题。
例如，随着数据库大小的增加，因为未知样品的光谱必须与数据库中包含的大量光谱进行比较，所以未知样本的分析时间也会增加。
此外，同一物种的微生物的光谱特征可能有很大的可变性，这很难将它们与数据库中所包含的光谱进行比较。
这种可变性可能是由于每个物种存在不同的菌株，或者是由于培养基的化学组成和/或生长条件的可能变化导致的同一物种的不同培养物之间的差异。
因此，需要开发新的方法来识别微生物，该方法能够为大量微生物物种、亚种或子类工作，并且具有大量可变性的对照数据库。
因此，本发明的一个目的是开发一种识别微生物的方法，该方法足够通用以能够识别大量的微生物的不同物种、亚种或子类，具有高的识别能力和精确度。
本发明的另一个目的是开发一种识别微生物的方法，该方法可以识别微生物的相同物种、亚种或子类的不同菌株，可能在存在或不存在生物液体的情况下在不同培养基上在不同培养物中生长或者在不同环境条件中生长。
本发明的另一个目的是提供一种识别微生物的方法，该方法是精确的，且即使在大型数据库的情况下，也要求快速分析每次单独分析。
本发明的另一个目的是提供一种设备，该设备将所有不同的分析步骤和仪器部件结合起来，能够以简单的方式实施识别微生物的方法。
申请人已经设计、测试和实施了本发明，以克服现有技术的缺点，并获得这些和其他目的和优点。
发明内容
在独立权利要求中提出和表征本发明，而从属权利要求阐述本发明的其他特征或主要的发明想法的变型。
本发明涉及一种识别微生物的方法，特别是一种通过将未知样品的红外光谱与已知样品的红外光谱进行比较来识别存在于所述未知样品中的微生物的几个物种、亚种和子类的方法，所述已知样品的红外光谱已经预先存档在数据库中。
根据本发明的识别微生物的方法包括：
-制定关于已知微生物的物种、亚种和子类的已知样品的对照光谱数据库的步骤；
-从所述数据库开始，基于最有意义的识别光谱特征，例如与吸收的形状、大小、强度和峰面积相关的信息，或者强度之间或不同峰面积之间的相关性和比率，创建预计算模型或对照库的步骤；
-对取自患者的未知样品进行取样的一个或多个步骤，该未知样品可能随后在固体或液体培养基上生长，并且可能还包含生物流体；
-采集未知样品的光谱的一个或多个步骤；
-处理未知样品的光谱的一个或多个步骤；
-通过将未知样品的光谱与预计算模型进行比较来分析未知样品的光谱的一个或多个步骤，每个步骤提供未知样品属于已知微生物的一个或多个所述物种、亚种或子类的至少一些归属分数(belonging scores)，可能以百分比的形式，以及所述归属分数的可靠性参数；
-一个或多个控制步骤，其中从所述归属分数和所述可靠性参数开始，请求新的采集未知样本的光谱的步骤，或者提供最终结果，该最终结果可以包括失败的识别(failedidentification)或者成功的识别(successful identification)。
在一些实施例中，制定关于已知微生物的物种、亚种或子类的已知样品的对照光谱数据库的步骤，对于每个样品，还包括：
-对可能取自患者、可能随后在固体或液体培养基上生长和可能包含生物液体的已知样品进行取样的步骤；
-采集已知样品的光谱的一个或多个步骤；
-处理已知样品的光谱的一个或多个步骤。
在一些实施例中，制定数据库的步骤可以仅进行一次以创建数据库，然后该数据库可以用于未知样品的每一次后续分析。
在一些实施例中，制定数据库的步骤也可以指数据库更新，每当希望包括微生物的新物种、亚种或子类时，就进行数据库更新，从而扩展了该方法的适用范围。
类似地，预计算模型一旦创建，就可以用于未知样品的每一次后续分析，或者在每次想要增加新的微生物物种、亚种或子类时也可以更新该预计算模型。
根据本发明，光谱是通过包括FTIR-ATR分光光度计的设备获得的。
这种采集模式的优点在于，它获得的光谱与样品的厚度和形态无关，与基于透射率或反射率的技术相比保证了高的再现性。
此外，这种采集模式允许对极小的样品进行操作，并且具有极其简单和快速的操作程序。
在本发明的一些实施例中，FTIR-ATR分光光度计包括单点检测器，这保证了比例如基于多像素和/或成像的方法更好的信噪比。
这一特性也限制或防止信号散射和饱和现象，并保证样品制备更简单。
在一些实施例中，分光光度计具有连续采集模式，这方便了仪器的清洁，并且还能实时诊断水和/或其他污染物的存在量，从而限制现有技术的缺点：水和/或污染物的存在会覆盖微生物的特殊信号。
有利的是，根据本发明，提供了样品干燥水平的光谱监测，使得仅当达到预定的标准干燥水平时才采集光谱。
因此，用这种模式采集的光谱指的是干燥水平基本相同的样品，因此彼此之间更具可比性。
该特性克服或至少限制现有技术的一些缺点，因为不需要烘箱干燥操作来除去样品中的水，因此避免了对微生物和由此对相应光谱的不可逆影响的发生。
在一些实施例中，本发明使用算法，该算法自动识别预先建立的光谱范围中样品的最意义的识别光谱特征。
这一特性显著减少分析步骤所需的时间，使得加快识别时间并提高识别的准确性。
有利的是，与现有技术中已知的方法相比，所述预计算模型的使用加快每个未知样品的识别时间。
这些特性增加数据库的大小，从而可以识别不同微生物的许多物种、亚种或子类，同一物种、亚种或亚科的不同菌株，可能在可能存在生物液体的情况下在不同培养基上生长或者在不同环境条件中生长。
附图说明
通过参考以下阐述、附图和所附的权利要求，将理解本公开的这些和其他方面、特征和优点。附图是说明书的组成部分，示出了本发明的一些实施例，并且与说明书一起打算阐述说明书的原理。
借助以下附图更好地阐述和示出本发明，其中：
-图1是根据本发明的方法的可能设备的示意图；
-图2示出了框图，其中以举例的方式示出了本发明方法的一个实施例的步骤；
-图3a和3b示出了使用FTIR-ATR技术采集的实验数据，其中图3a示出了所采集的原始数据，其中每个物种都用不同的颜色表示，而图3b示出了转变后的数据；
-图4示意性地示出了在两个主成分空间中使用PCA获得的聚类区域，对应于不同物种的微生物的光谱；
-图5示意性地示出了在前两个成分空间中使用LDA获得的聚类区域的示例；
-图6示意性地示出了在两个主成分空间中使用PCA获得的聚类区域的示例，对应于不同物种的微生物的光谱；
-图7示出：板a)是着色为阳性GRAM(浅灰色)和阴性GRAM(深灰色)的PCA空间的表示；板b)是显示“预测”数据相对于通过该方法获得的“实际”数据的混淆矩阵；板c)是应用于这里阐述的实施例的数学方法在预测GRAM型中的性能结果；
-图8是通过对根据本文阐述的实施例的方法与数据库的光谱进行交叉验证而通过验证获得的混淆矩阵。
为了便于理解，在可能的情况下，使用相同的附图标记来标识附图中相同的共同元件。应当理解，一个实施例的元件和特征能便利地结合到其他实施例中，而无需进一步说明。
具体实施方式
现在，将详细参考本发明的各种实施例，其中的一个或多个示例在附图中示出。每个示例都是以举例说明本发明的方式而提供的，不应理解为对本发明的限制。例如，作为一个实施例的部分而示出或描述的特征可以在其他实施例中采用，或者与其他实施例联合以产生另一个实施例。应理解，本发明将包括所有如此的修改和变型。
在阐述这些实施例之前，还必须阐明，本说明书的应用不限于如以下说明书中使用附图所描述的部件构造与布置的细节。本说明书可以提供其他实施例并且能以各种其他方式获得或执行。还必须阐明，此处使用的措词和术语仅出于描述目的，不能视为限制性的。
除非另有定义，否则这里和下文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
尽管在实践中或在测试中可以使用与本文阐述的方法或材料相似或等同的那些方法或材料来验证本公开，但以下通过示例的方式描述了该方法和材料。在发生冲突的情况下，以包括这些定义的本申请为准。材料、方法和示例仅是说明性的，不能以限制性的方式理解。
这里和下文中，样品是指从含微生物生物(例如微生物)的生物物质的较大的同类群(homogeneous set)中抽取的最小数量，但不仅限于分析目的。
在某些情况下，在生物物质的微生物组成分别未知或已知的情况下，如必要的话，将其指定为未知样品或已知样品。
在一些实施例中，微生物的种类、亚种和子类可能具有临床意义。
此外，术语“光谱(spectrum)”参考与所用采集仪器兼容的电磁辐射组来使用，因此，术语“红外光谱(infrared spectrum)”、“振动光谱(vibrational spectrum)”或对振动跃迁范围或某些特定光谱范围的引用不能理解为对根据本发明的方法的适用性的限制。
图1示意性地示出了根据本发明的用于识别微生物的设备10。
举例来说，该设备包括用于ATR(衰减全反射)采集模式下的FTIR光谱(傅里叶变换红外)的分光光度计，即FTIR-ATR分光光度计，其与处理系统和数据显示系统耦合。
例如，处理系统和显示系统可以集成到单个处理和显示系统中和/或可以包括在计算机15中，例如配备有屏幕的个人电脑。
在一些实施例中，处理系统包括计算机程序，该计算机程序可以存储在计算机可读介质中以及包含由设备10每一次执行的指令。
后面为了简化说明，引用计算机15来指示能够管理设备10以及处理和显示数据的软件和硬件系统组。
本身已知其主要部件的FTIR-ATR分光光度计包括红外辐射17的源13、反射元件16、内反射元件和检测器14。
为简单起见，图1中未显示分光光度计的其他组件，诸如单色仪、斩波器、干涉仪。
在一些实施例中，源13可以是碳化硅棒(Globar)类型的黑体源。
举例来说，由源13发射的辐射17，即入射辐射17a，被反射元件16导向以撞击内反射元件。
在一些实施例中，内反射元件可以是例如晶体12。
在一些实施例中，晶体12可以是具有高折射率的晶体12。
在一些实施例中，晶体12可以是金刚石、ZnSe、硅或锗的晶体12。
有利的是，如果晶体12是金刚石晶体12，则其优点在于在可比较的测量中使用比ZnSe、硅或锗更耐用，以及具有更大的透明度范围。
辐射17在晶体12内部的反射在晶体12的表面上产生渐逝场，可以在该表面上限定采集区18，将待分析的生物样品放置在该采集区18上。
渐逝场可以穿透一定的深度范围，根据情况的不同，可以到达样品内部几微米。
具体地，该深度范围是入射角和入射辐射17a的波长以及用于晶体12的材料的折射率的函数，因此，可以认为对于所有待分析的样品来说基本上是恒定的。
因此，有利的是，ATR模式使得获得光谱与穿过样品的辐射光路无关，因此与样品的厚度无关，从而与使用透射率或反射率的方法相比，保证了更高的再现性。
此外，这种模式限制或防止可能对光谱质量产生负面影响的散射和/或信号饱和现象。
因此，这种模式保证了更大的测量再现性和更简单的样品制备。
然后，在与样品相互作用后，辐射17从晶体12离开，即输出辐射17b然后被反射元件16导向至检测器14。
在一些实施例中，检测器14可以是DLaTGS检测器(氘化的L-丙氨酸掺杂的三甘氨酸硫酸盐(Deuterated L-alanine doped triglycine sulphate))。
在替代实施例中，检测器14可以是DTGS检测器。
举例来说，检测器14将包含在输出辐射17b中的光学信息转换成电信号，该电信号被发送到计算机15。
在一些实施例中，该设备被布置成在区域NIR(近IR)和/或MIR(中IR)和/或FIR(远IR)中采集光谱。
在一些实施例中，设备10能以连续采集模式操作，即，在计算机15的屏幕上实时显示每次在采集区18中所采集的内容。
本发明还涉及如图2示意性地示出的一种识别微生物的方法，包括：
-步骤(A1、A2、A3)：制定关于已知微生物的物种、亚种和子类的已知样品的对照光谱数据库；
-步骤A4：从所述数据库开始，基于对已知微生物的每个物种、亚种或子类最有意义的识别光谱特征来创建预计算模型；
-步骤B：对从患者获得的未知样品进行取样，该未知样品随后可能在固体或液体培养基上生长以及可能包含生物液体；
-一个或多个步骤C：采集未知样品的光谱；
-一个或多个步骤D：处理未知样品的光谱；
-分析未知样品的光谱的一个或多个步骤：通过与预计算模型比较来分析未知样品的光谱，每个分析步骤可能以百分比形式至少提供未知样品属于已知微生物的一个或多个所述物种、亚种或子类的一些归属分数，以及所述归属分数的可靠性参数；
-一个或多个控制步骤F：其中，从所述归属分数和所述可靠性参数开始，请求新的采集未知样品的光谱的步骤C，或者提供该方法的最终结果，根据不同的标准，该最终结果可以包括失败的识别J，或成功的识别G、H、I。
在本发明的一些实施例中，制定数据库的步骤A可以依次包括：
-步骤A1：对已知样品进行采样，该已知样品可能取自患者，随后可能在固体或液体培养基上生长并且可能包含生物流体；
-一个或多个步骤A2：采集已知样品的光谱；
-一个或多个步骤A3：处理已知样品的光谱。
在一些实施例中，每次要在数据库中插入新的已知样品时，可以重复所述步骤A1、A2、A3。
在一些实施例中，样品的采样步骤B、A1可以规定样品取自患者。
在一些实施例中，可以对从患者获取的样品进行初步分析程序，该程序设置为对微生物添加营养物质。
在一些实施例中，样品可以在固体培养基上生长。
在一些实施例中，样品可以在皮氏培养皿(Petri dishes)上生长。
在一些实施例中，样品可以在液体培养基上生长，然后离心，以获得浓缩的沉淀(pellet)。
在一些实施例中，样品可以在液体培养基或液体生长肉汤上生长，然后过滤。
在一些实施例中，样品可以在液体培养基或液体生长肉汤上生长，或者可以使其进行浓缩或富集程序以提高存在的微生物的浓度。
在一些实施例中，样品可能包含人或动物来源的生物流体。
在一些实施例中，光谱采集步骤C、A2可以设置清洁与样品接触的设备表面的初始步骤，例如图1所示的采集区18的表面。
在一些实施例中，可以例如通过连续采集模式采集背景光谱，以验证这种清洁的有效性，例如通过观察放置在采集区18上的杂质相关的吸收谱带的消失情况。
在一些实施例中，光谱采集步骤C、A2还规定：采取样品的测定物(assay)并将其放置在分光光度计的晶体12上，例如在采集区18上，以便采集光谱。
在一些实施例中，该测定物以固体形式放置在采集区18上，例如用一次性棒将其移除和放置。
在一些实施例中，可以将该测定物压在采集区18上，例如通过使用测力压机。
在一些实施例中，光谱监测样品的干燥水平。
在一些实施例中，可以以连续采集模式评估离开设备的水含量，并监测与水在各个波数范围内的光谱特征相关的吸收谱带的减少情况，直到可能完全消失。
根据本发明，当达到样品干燥的预定标准水平时，采集光谱。
有利的是，这一特性克服或至少限制现有技术中的问题：由于水的存在而导致光谱可能具有覆盖或干扰微生物的特殊信号的信号。
这一特性还避免用于干燥样品的过程，该过程可能不可逆地修改待分析的微生物。
光谱采集步骤C、A2还规定记录从样品采集的测定的光谱。
在一些实施例中，在预定时间段内记录光谱。
在一些实施例中，记录光谱的时间段小于30秒。
在一些实施例中，光谱记录规定采集预定数量的连续光谱，然后将这些光谱进行平均以改善信噪比。
在一些实施例中，可以采集和平均每次测定的8至512个范围内的光谱，优选每次测定的32至256个范围内，甚至更优选每次测定的64至128个范围内。
在一些实施例中，光谱或可能的光谱平均值显示在屏幕上。
处理光谱或光谱平均值的步骤D、A3可规定：
-使用线性和/或非线性插值和/或拟合算法(光谱轮廓)；
-计算光谱轮廓的一阶和/或二阶导数；
-在整个光谱范围内使用矢量归一化算法来归一化导数；
-选择最有用的光谱区来分类微生物的物种、亚种或子类。
举例来说，光谱区可以包括：对于核酸、碳水化合物和多糖，950-1280cm-1范围；对于淀粉，1280-1480cm-1范围，例如蛋白质、甲基和亚甲基，例如脂类；对于羰基，例如脂类的羰基，1700-1800cm-1范围；对于脂族链，2800-3000cm-1，例如脂类。
在一些实施例中，可以使用人工学习算法(机器学习)来改善光谱范围的选择过程。
举例来说，图2a示出了可以收集的不同样品的光谱，图2b示出了处理后的光谱。
图2a还通过举例的方式示出了对于本发明的方法目的而言有意义的一些识别光谱特征。
在一些实施例中，然后，光谱区域和识别光谱特征被用于分类和随后识别微生物的个别物种、亚种或子类。
在一些实施例中，提供了一种自动识别系统，以识别最感兴趣的光谱范围和识别光谱特征。
有利的是，不同化学类别的存在，例如微生物的核酸、脂类、蛋白质、碳水化合物和其他成分，允许获得微生物的每个物种、亚种或子类的特征信号，从而有可能获得预测方法。
通过对几个已知样品重复步骤A1、A2、A3，可以制定已知微生物的物种、亚种或子类的对照光谱数据库。
但是，在本方法的一些实施例中，还规定：数据库可以包括使用其他方法获得的已知微生物的物种、亚种或子类的光谱。
在一些实施例中，数据库包括关于归属于已知微生物的不同物种、亚种或子类的单微生物培养物的光谱。
在一些实施例中，数据库包括与已知微生物的每个物种、亚种或子类的已知微生物的不同菌株有关的光谱。
在一些实施例中，数据库包括与在不同培养基上生长的样品有关的光谱，所述培养基例如但不仅限于琼脂、CNA琼脂、CLED琼脂、血琼脂、显色琼脂。
在一些实施例中，数据库包含与在液相生长肉汤中生长的样品有关的光谱，所述样品然后经离心、过滤或富集以获得沉淀或浓缩样品。
有利的是，由于通过在液体肉汤中生长以及随后的沉淀或过滤而获得的光谱不包含源自固相生长培养基的基质的干扰，因此可以用作标准对照光谱。
有利的是，从在液体肉汤中生长和随后的沉淀或过滤或富集而获得的光谱测量允许在生物流体(例如体液)存在的情况下直接识别光谱。
数据库中包含的光谱的这种异质性和可变性使得可以执行一般的分析，允许识别微生物的许多物种、亚种或子类，每个物种、亚种或子类的许多不同菌株，还包括源自在不同培养基上生长的效果。
在使用每个光谱的多次采集的实施例中，可以在数据库中插入重复的单个光谱和/或重复计算的平均光谱。
在步骤A4中创建或更新的预计算模型或对照库可以基于最有意义的识别光谱特征，以用于在所选光谱范围内进行分析的目的。
在一些实施例中，最有意义的识别光谱特征可以例如与关于吸收峰的形状、大小、强度和面积的信息相关，或与不同峰的强度之间或面积之间的相关性和比率相关。
在一些实施例中，预计算模型可以包括对已知微生物的物种、亚种或子类的每个已知样品有意义的识别光谱特征的列表。
在一些实施例中，最有意义的识别光谱特征可以通过所述统计分析技术和/或基于神经网络和/或人工学习的方法而被识别。
这些预计算模型可以快速自动地识别最意义的识别光谱特征，以便进行比较。
这样，每次比较两个光谱时，只在光谱范围内和/或与最感兴趣的光谱特征相关的范围内比较，而不是在整个光谱范围内和/或针对所有光谱特征进行比较。
例如，如果想要在整个光谱范围内，将以1cm-1的分辨率采集的未知样品的光谱与包含例如以相同分辨率采集的18000个对照光谱的数据库比较，那么如果使用现有技术的方法，这种比较将需要评估6500万个点。
申请人已经发现，通过使用根据本发明的方法，在选定的光谱范围内并使用预计算模型工作，这种比较所需要的点数评估比现有技术的方法低20到80倍。
因此，即使存在大型数据库的情况下，使用预计算模型显著减少每个未知样品的分析时间。
因此，这一特性使得显著增加数据库的大小，以包括已知微生物的大量物种、亚种或子类，从而改进和扩展本发明方法的预测和识别能力。
这一特性还使得在高分辨率下处理光谱，从而提高方法的准确度和精确度。
此外，例如，列表的存在使得对所有光谱的全部波数范围使用最小二乘法和/或可能的均方抛弃量(average square discards)的计算变得多余。
在其他实施例中，随着该方法的使用，规定使用人工学习(机器学习)和人工智能模型以逐步改进自动识别系统和预计算模型。
在一些实施例中，分析步骤E规定：未知样品的光谱与包含在对照数据库中的对照光谱和/或与预计算模型比较。
在本发明的一些实施例中，统计技术可以用于这种比较。
在本发明的一些实施例中，统计技术可以包括多变量分析，例如，主成分分析(PCA)或线性判别分析(LDA)，以及线性判别偏最小二乘(LDPLS)、二次判别分析(QD)。
在一些实施例中，基于神经网络实施方式的方法、技术或算法可以用于所述比较。
在一些实施例中，基于人工学习(机器学习)实施方式的方法、技术或算法可以用于所述比较。
在本发明的一些实施例中，所述比较还可以提供光谱的一阶和/或二阶导数的比较。
在一些实施例中，有可能使用统计权重以不同方式对光谱的不同区域进行加权。
在本发明的一些实施例中，两个光谱之间的比较可以通过定义两个光谱之间的距离来进行，例如使用基于最小二乘法的方法。
在一些实施例中，该距离可以用作进行统计和/或化学计量分析的度量。
在一些实施例中，光谱之间的差异可以用于PCA分析。
在一些实施例中，分析步骤E提供未知样品属于数据库中表示的一个或多个物种、亚种或子类的分数，例如百分比。
在一些实施例中，分析步骤E提供可靠性参数，该可靠性参数评估分析的可靠性，特别是归属分数。
在一些实施例中，控制步骤F提供处理归属分数和可靠性参数。
根据一些实施例，如果分析的可靠性参数高于预设可接受性水平，则归属分数立即被认为是可靠的。例如，如果使用百分比分数，则可接受性水平可以在80％至100％之间的范围内选择(图2中的框G)。
在一些实施例中，如果在第一次尝试中不能以明确的方式识别微生物的未知物种、亚种或子类，则可以重复步骤C、D、E和F以添加新数据并改善分析结果。
在一些实施例中，如果可靠性参数低于第二预设可接受水平，则可以提供这一点。例如，在使用以百分比表示的分数的实施例中，该第二水平可以在70％至80％之间的范围内选择。
在这种情况下，该方法提供要对取自未知样品的第二测定物实施第二次采集步骤C、第二次处理步骤D和第二次分析步骤E。
例如，第二测定物可以是微生物的不同菌落，取自其上培养和生长有未知样品的同一皮氏培养皿。
如果样品为沉淀形式，则例如可以用一次性棒从与获得第一测定物的相同浓缩沉淀获取第二测定物。
之后，如果第二分析结果的可靠性再次低于第三预设可接受性水平，例如在数值上等于第二可接受性水平，则该方法提供：比较第一次采集步骤C和第二次采集步骤C所获得的两个光谱之间的相似性。
如果发现光谱相似(图2中的框H)，则作为分析结果，该方法提供未知样品属于微生物的一个或多个物种、亚种或子类的归属分数，与两次采集一致。
如果发现光谱不一致，则获取第三测定物，并实施第三次采集步骤C、第三次处理步骤D和第三次分析步骤E。
如果发现三个光谱中的至少两个相似(图2中的框I)，则作为分析的结果，该方法提供样品属于数据库中微生物的物种、亚种或子类的归属分数，与该三个光谱中的两个一致。
另外，(图2中的框J)显示未识别的消息，以及显示与三次采集相关的光谱和三个归属分数。
一个实施例提供了用于收集数据并相对于数据库分析它们的计算机程序或软件，该程序或软件可以存储在计算机可读介质中，并且包含指令，该指令一旦由用于微生物分类和识别的分析设备执行，就确定执行根据本说明书的方法。
示例1
举例来说，图4示意性地示出了根据本发明的数据库中包含的光谱的PCA分析结果。
特别地，图4中的每个点对应于沿着前两个主成分定向的涉及微生物的物种、亚种或子类的光谱或者所获得的光谱的平均值。
基于每个样品的不同菌株和/或不同培养基，光谱也被分成各个区，区的延伸与微生物的每个物种、亚种或子类的光谱可变性有关。
示例2
举例来说，图5示意性地示出了根据本发明的数据库中包含的光谱的LDA分析结果。
特别地，图5中的每个点对应于沿着前两个成分定向的涉及微生物的物种、亚种或子类的光谱或者所获得的光谱的平均值。
基于每个样品的不同菌株和/或不同培养基，光谱也被分成不同的区，区的延伸与微生物的每个物种、亚种或子类的光谱的可变性有关。
示例3
在一个实施例中，根据本发明的数据库是通过在皮氏培养皿中或液体培养基上接种经筛选与验证的NNCCLS型Atlanta微生物获得的。
在该实施例中，获得了接种在皮氏培养皿或液体培养基上的每种微生物的特定光谱；此外，使用不同液体培养基生产商的皮氏培养皿，将每个菌株接种在不同的生长培养基中，以验证光谱相对于生长条件的可变性。
使用的培养基选自：
-CLED琼脂
-麦康凯琼脂(MacConkey Agar)
-CNA琼脂
-血琼脂
对于每种微生物，获得了500种微生物生长，以便就获得与使用的其他方法相比能够验证数据相关性的数值聚类方面进行广泛和完整的案例研究。
图6表示在前两个主成分的空间中获得的数据，其中每个物种由不同的灰色阴影表示。
示例4
在一个实施例中，根据本发明的方法可用于预测GRAM型微生物。关于GRAM+GRAM分类的结果的示例如图7所示。
图7中的板a)是着色为阳性GRAM(浅灰色)和阴性GRAM(深灰色)的PCA空间的表示。
图7中的板b)是混淆矩阵，示出了与从该方法获得的“实际”数据相比较的“预测”数据。
图7中的板c)示出了在预测GRAM型时数学方法的性能结果。
示例5
在一个实施例中，该方法可用于识别微生物的物种、亚种或子类。参见图8，其示出了用根据本发明的数据库的光谱验证该方法获得的混淆矩阵，其中在实际和预测之间可以观察到99.9％至96％的对应。
清楚的是，在不脱离本发明的领域和范围的情况下，可以对前述的方法和/或设备进行部件或步骤的修改和/或添加。同样清楚的是，尽管已经参考一些具体示例阐述了本发明，但是本领域的技术人员当然能够实现许多具有权利要求中所述的特征的方法和/或设备的其他等效形式，而这些等效形式都落入属于本文定义的保护范围内。
Claims (15)
1.使用衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)识别生物样品中微生物的方法，包括：
-步骤(A1、A2、A3)：制定关于已知微生物的物种、亚种和子类的已知样品的对照光谱数据库；
-一个或多个步骤(A4)：从所述数据库开始，基于对已知微生物的每个物种、亚种或子类最有意义的识别光谱特征，创建预计算模型；
-步骤(B)：对未知样品进行取样，所述未知样品是从在固体或液体培养基上生长获得的，可能含有生物液体；
-一个或多个步骤(C)：采集所述未知样品的光谱；
-一个或多个步骤(D)：处理所述未知样品的光谱；
-一个或多个步骤(E)：通过将所述未知样品的光谱与所述预计算模型进行比较来分析所述未知样品的光谱，每个步骤(E)提供所述未知样品属于已知微生物的一个或多个所述物种、亚种或子类的至少一些归属分数以及所述归属分数的可靠性参数；
-一个或多个控制步骤(F)：其中，从所述归属分数和所述可靠性参数开始，请求新的采集所述未知样品的光谱的步骤(C)，或者提供所述方法的最终结果，所述最终结果包括失败的识别(J)，或者成功的识别(G、H、I)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制定关于已知微生物的已知样品物种、亚种或子类的对照光谱数据库的步骤(A1、A2、A3)为每个已知样品提供：
-步骤(A1)：在存在或不存在生物流体的情况下，对通过在固体或液体培养基上生长获得的已知样品进行取样；
-一个或多个步骤(A2)：采集所述已知样品的光谱；
-一个或多个步骤(A3)：处理所述已知样品的光谱。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述对照光谱包括与微生物的不同物种、亚种或子类的样品相关的光谱，和/或与微生物的相同物种、亚种或子类的不同菌株的样品相关的光谱，和/或与生长在可变培养基上、有或没有生物液体的样品相关的光谱。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述未知样品在固体培养基上生长。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少一种所述已知样品在固体培养基上生长。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述未知样品在至少一种生长液体肉汤中生长，随后经离心或过滤或富集以获得沉淀或浓缩样品，并且通过从所述沉淀或浓缩样品中移取测定物来获得光谱。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少一种所述已知样品在至少一种生长液体肉汤中生长，随后经离心或过滤或富集以获得沉淀或浓缩样品，并且通过从所述沉淀或浓缩样品中移取测定物来获得光谱。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述处理步骤(D、A3)使用算法，所述算法自动识别预先定义的光谱范围内的样品的最有意义的识别光谱特征。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析步骤(E)使用统计方法，例如多变量分析。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析步骤(E)使用基于主成分分析(PCA)的方法。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析步骤(E)使用基于神经网络的方法。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述分析步骤(E)使用基于光谱聚类分析的方法。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述预计算模型包括每个未知和已知样品的所述识别光谱特征的列表。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述采集步骤(C、A2)提供对样品的干燥水平的光谱监测，从而仅当达到预定的标准干燥水平时才采集光谱。
15.执行如前述权利要求中任一项所述的识别生物样品中微生物的方法的设备，包括用于ATR(衰减全反射)采集模式下的FTIR光谱(傅里叶变换红外)的分光光度计，所述分光光度计与安装在计算机(15)中的处理系统和数据显示系统、红外辐射(17)的源(13)、反射元件(16)、诸如晶体(12)的内反射元件以及检测器(14)耦合，在所述晶体(12)的表面上界定放置待分析的生物样品的采集区(18)，其中与已知微生物的物种、亚种和子类的已知样品相关的所述预计算模型被存储在所述计算机(15)中。
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