IT201800002353A1

IT201800002353A1 - Procedimento di identificazione batterica tramite analisi multivariata di profili spettrali

Info

Publication number: IT201800002353A1
Application number: IT201800002353A
Authority: IT
Inventors: Paolo Galiano
Original assignee: Alifax Srl
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2019-08-02
Also published as: CN111742055A; KR20200118113A; US11326198B2; CN111742055B; RU2020128820A; CA3089903A1; US20200354766A1; JP2021512321A; BR112020015784A2; EP3746562A1; WO2019150408A1; JP7271561B2

Description

Descrizione del trovato avente per titolo:

"PROCEDIMENTO DI IDENTIFICAZIONE BATTERICA TRAMITE ANALISI MULTIVARIATA DI PROFILI SPETTRALI"

CAMPO DI APPLICAZIONE

Il presente trovato si riferisce ad un procedimento di identificazione batterica che utilizza la tecnica dell’analisi multivariata di profili spettrali per ottenere indicazioni relative alla crescita batterica in tempi estremamente ridotti rispetto a metodi convenzionali.

In particolare, il trovato si basa sullo sviluppo di uno stmmento analitico per l’identificazione di batteri tramite l’analisi del profilo spettrale ATR-FTIR di un campione sconosciuto, ed il confronto di tali profili spettrali con quelli di campioni presenti in una banca dati.

STATO DELLA TECNICA

La spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR) è una tecnica di analisi non distruttiva, che permette di ottenere informazioni sulla composizione chimica di un campione analizzato. Fin dall’inizio degli anni ’90 tale tecnica è stata impiegata per l’analisi di campioni biologici (Diem M. et. Al., The Analyst [27 Aug 2004, 129(10):880-885]).

Contemporaneamente è stata dimostrata la capacità della tecnica FTIR di identificare e classificare microorganismi sconosciuti (Helm D. et Al., Journal of General Microbiology (1991, 137, 69-79) e Marley L. et Al., Vibrational Spectroscopy 26,2, 2001, 151-159).

Le diverse specie batteriche sono caratterizzate da una precisa composizione biochimica, in termini di proteine, lipidi, acidi nucleici e polisaccaridi, che si riflette in un distinto spettro vibrazionale (Griffiths and Chalmers eds, 2001 Handbook of vibrational spectroscopy, John Wiley & sons, New-York, vol. 5).

Alcune potenziali applicazioni suggerite della tecnica FTIR in microbiologia includono:

(i) identificazione di patogeni in laboratorio clinico;

(ii) investigazioni epidemiologiche, argomento di studio, screening di patogeni, controlli di igiene, elucidazione di catene infettive, terapie di controllo e rilevamento di infezioni ricorrenti; (iii) caratterizzazione e screening di microorganismi dall’ambiente; (iv) monitoraggio di processi biotecnologici;

(v) controllo qualità microbiologica in industrie alimentari o farmaceutiche;

(vi) mantenimento di raccolte di ceppi.

Lo stato dell’arte presenta, oltre a numerose pubblicazioni scientifiche, anche diversi documenti brevettuali, i più rilevanti dei quali sono riportati e commentati, qui sotto.

In “Method for thè rapid detection of microorganisms in samples” US 5660998 A, Naumann e Labischinski dimostrano che è possibile ottenere il riconoscimento di specie batteriche tramite l’analisi infrarossa in trasmissione o riflessione di microorganismi prelevati da singole colonie e trasferiti su substrati adatti alla misura. L’identificazione si basa sul confronto degli spettri ottenuti con quelli presenti in un database precedentemente ottenuto. Non viene fatta menzione all’estensione del database e al metodo usato per il confronto degli spettri.

In “Classification and Identification upon 13 pathogenic bacteria by using Fourier transform infrared spectroscopic technology”, CN 103217398 A, gli spettri FTIR sono raccolti su batteri depositati su ZnSe e classificati utilizzando hierarchical cluster analysis (HCA) (analisi di cluster gerarchica). L’applicazione, tuttavia, è limitata a 13 specie batteriche.

L’US 6379920 Bl, intitolato “Spectroscopic diagnostics for bacteria in biologie sample”, riguarda l' identificazione dei microorganismi presenti in pazienti infetti direttamente tramite il confronto dello spettro vibrazionale di fluidi biologici raccolti rispetto a spettri di Haemophilus influenzae (HI), Morazella catarrhalis (MC), e Streptococcus pneumoniae (SP). Questi spettri di riferimento sono ottenuti da pellet di batteri sospesi in soluzione fisiologica. Anche in questa applicazione la geometria di campionamento scelta è la trasmissione.

“Method for the spectral Identification of microorganisms”, WO 2006002537 Al, “Method for thè spectral Identification of microorganisms”, US 9551654 B2 e “Method for thè spectral Identification of microorganisms”, US 20170167973 A1, sono di fatto lo stesso brevetto presentato da Ashraf Ismail et Al. della Mcgill University e riguardano l’identificazione delle specie batteriche dall’analisi degli spettri raccolti tramite FPA-FTIR (Focal Plane Array).

Questa modalità di acquisizione consente di registrare simultaneamente da decine a migliaia di spettri infrarossi, uno per ogni pixel del detector, del campione in analisi. Tuttavia la limitazione principale di questo tipo di detector è l’inferiore rapporto segnale rumore ottenibile per pixel rispetto a detector a singolo punto DTGS o MCT. Gli spettri raccolti vengono classificati tramite HCA (Hierarchical Cluster Analysis tramite il calcolo delle distanze euclidee e utilizzando l’algoritmo di Ward) o PC A (Analisi delle Componenti Principali), generalmente impiegata nell’ambito della statistica multivariata.

Nella maggior parte dei lavori precedentemente illustrati le geometrie di acquisizione utilizzate sono trasmissione o riflessione o basate su imaging; tuttavia, il segnale ottenuto in questo modo è direttamente dipendente dallo spessore e dalla morfologia del campione, che può essere troppo spesso e generare saturazione del segnale, oppure disomogeneo e generare distorsioni dovute allo scattering.

Il presente trovato è stato sviluppato per risolvere o quanto meno limitare uno o più degli inconvenienti sopra indicati della tecnica nota.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato è espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti. Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del trovato, o varianti dell’idea di soluzione principale.

Secondo una forma di realizzazione del presente trovato, si prevede una identificazione e classificazione batterica tramite tecnica FTIR (Fourier Transform Infra Red) ATR (Attenuated Total Reflection), mediante la quale un profilo spettrale di un campione biologico sconosciuto viene confrontato con il profilo spettrale di campioni noti e raccolti in un database per identificare e classificare crescite batteriche in tempi estremamente ridotti rispetto a tecniche convenzionali.

In particolare, il presente trovato prevede di applicare la tecnica FTIR ed una geometria di acquisizione ATR. Com’è noto, l’ATR è una tecnica di campionamento della spettroscopia infrarossa che sfrutta la riflessione del raggio che attraversa un campione, ad esempio un cristallo ad elevato indice di rifrazione.

In particolare, la geometria di acquisizione, o campionamento, ATR permette di acquisire un segnale che risulta indipendente dallo spessore del campione, e di evitare disturbi nella misura quali scattering o saturazione di segnale.

In questa modalità di acquisizione, lo spessore campionato è una funzione dell’angolo di incidenza e della lunghezza d’onda della luce utilizzata, nonché dell’indice di rifrazione del materiale utilizzato per il cristallo ATR, e quindi può essere considerato costante per tutti i campioni analizzati.

Secondo il presente trovato, pertanto, l’uso di un sistema FTIR ATR viene impiegato per identificare una pluralità di specie batteriche di interesse clinico.

Vantaggiosamente, il presente trovato prevede una geometria di acquisizione in ATR che garantisce una maggiore ripetibilità della misura e una preparazione del campione più semplice. Il database realizzato e il metodo predittivo sviluppato permettono di ottenere l’identificazione dei campioni sconosciuti analizzati.

In possibili forme realizzative, il suddetto metodo prevede di acquisire profili spettrali di specie batteriche, i quali profili spettrali vengono sottoposti ad analisi multivariata.

In possibili forme realizzative, il suddetto database prevede la creazione di una libreria di riferimento di batteri ottenuti da pellet da brodo liquido di crescita, da utilizzare quale standard di analisi e riferimento comparativo per la crescita di ogni specie batterica su terreni solidi di crescita.

In possibili forme realizzative, per la classificazione ed identificazione vengono utilizzate colonie di specie batteriche cresciute in piastre di Petri di vario tipo e configurazione.

In ulteriori possibili forme realizzative, il suddetto metodo prevede un’analisi degli spettri di rilevazione FTIR ATR in merito a peculiari segnali IR di proteine, lipidi e carboidrati, distintivi di una particolare composizione della parete cellulare batterica.

In ancora ulteriori possibili forme realizzative, il suddetto metodo prevede la creazione di una libreria peculiare di ogni famiglia batterica identificata.

In possibili forme realizzative, il suddetto metodo prevede un tempo di analisi medio di circa 1 minuto a campione.

In ulteriori possibili forme realizzative, il suddetto metodo prevede di raccogliere i dati, processarli ed analizzarli dando come responso la percentuale di appartenenza del campione alle specie presenti nel database.

Ulteriori forme realizzative si riferiscono ad un’apparecchiatura di analisi per la classificazione ed identificazione batterica tramite tecnica FTIR ATR. In una forma realizzativa, la suddetta apparecchiatura comprende uno spettrofotometro FTIR ATR accoppiato con un computer per l’acquisizione spettrale e l’analisi dei dati, in cui detto computer comprende un elaboratore configurato per eseguire un metodo in accordo con le forme di realizzazione qui descritte.

Ancora ulteriori forme realizzative si riferiscono ad un programma per elaboratore, memorizzabile in un mezzo leggibile da un computer e che contiene le istruzioni che, una volta eseguite da un apparato di analisi, determinano l’esecuzione di un metodo in accordo con le forme di realizzazione qui descritte.

Questi ed altri aspetti, caratteristiche e vantaggi della presente divulgazione saranno meglio compresi con riferimento alla seguente descrizione, alle tavole di disegno e alle annesse rivendicazioni. Le tavole di disegno, che sono integrate e facenti parte della presente descrizione, illustrano alcune forme di realizzazione del presente oggetto e, unitamente alla descrizione, si propongono di descrivere i principi della divulgazione.

ILLUSTRAZIONE DELLE FIGURE

Il presente trovato viene meglio descritto ed illustrato con l’ausilio delle figure che seguono, nelle quali:

- la fig. 1 è una rappresentazione di una geometria ATR utilizzata nel procedimento di identificazione e classificazione secondo il presente trovato;

- le figg. 2a e 2b rappresentano dati sperimentali raccolti con l’uso della tecnica FTIR-ATR, in cui fig. 2a mostra dati grezzi raccolti, in cui ciascun specie è rappresentata da un diverso colore, mentre fig. 2b rappresenta i dati trasformati;

- la fig. 3 riproduce i dati acquisiti, ed analizzati tramite PCA, nello spazio PC1-PC2, in cui ciascuna specie batterica è rappresentata con una diversa gradazione di grigio;

- la fig. 4 rappresenta: pannello a), rappresentazione dello spazio PCA colorato come GRAM positivo (grigio chiaro) e GRAM negativo (grigio scuro); pannello b), matrice di confusione presentante i dati “Predetti” rispetto a quelli “Effettivi” ottenuti dal metodo; pannello c), risultati di prestazioni del metodo matematico applicato alle forme di realizzazione qui descritte nel predire il tipo GRAM;

- fig. 5 è una matrice di confusione ottenuta dalla validazione tramite “cross validation” del metodo secondo le forme di realizzazione qui descritte con gli spettri del database.

DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE

Si farà ora riferimento nel dettaglio alle varie forme di realizzazione del trovato, delle quali uno o più esempi sono illustrati nelle figure allegate. Ciascun esempio è fornito a titolo di illustrazione del trovato e non è inteso come una limitazione dello stesso. Ad esempio, le caratteristiche illustrate o descritte in quanto facenti parte di una forma di realizzazione potranno essere adottate su, o in associazione con, altre forme di realizzazione per produrre un’ulteriore forma di realizzazione. Resta inteso che il presente trovato sarà comprensivo di tali modifiche e varianti.

Prima di descrivere le forme di realizzazione, si chiarisce, inoltre, che la presente descrizione non è limitata nella sua applicazione ai dettagli costruttivi e di disposizione dei componenti come descritti nella seguente descrizione utilizzando le figure allegate. La presente descrizione può prevedere altre forme di realizzazione ed essere realizzata o messa in pratica in altri svariati modi. Inoltre, si chiarisce che la fraseologia e terminologia qui utilizzata è a fini descrittivi e non deve essere considerata come limitante.

Salvo che siano definiti altrimenti, tutti i termini tecnici e scientifici utilizzati qui e di seguito hanno lo stesso significato comunemente inteso da una persona di ordinaria esperienza nel campo della tecnica cui appartiene il presente trovato. Anche se metodi e materiali simili o equivalenti a quelli qui descritti possono essere utilizzati nella pratica o nelle prove di verifica della presente divulgazione, di seguito sono descritti, a titolo di esempio, i metodi e i materiali. In caso di conflitto prevale la presente domanda, incluse le definizioni. I materiali, metodi ed esempi hanno carattere puramente illustrativo e non devono essere intesi in modo limitativo.

La Fig. 1 è utilizzata per descrivere schematicamente un’applicazione del presente trovato in cui può essere utilizzata un’apparecchiatura di analisi per la classificazione ed identificazione batterica tramite tecnica FTIR ATR in accordo con le forme di realizzazione qui descritte, che ad esempio comprende uno spettrofotometro FTIR ATR accoppiato con un computer per l’acquisizione spettrale e l’analisi dei dati.

In una forma di realizzazione, gli spettri ATR sono acquisiti da singole colonie o pellets, precedentemente preparate e trasferiti su un cristallo con una bacchetta sterile monouso. La geometria ATR (Figura 1) è indipendente dallo spessore del campione, quindi permette di ottenere una riproducibilità più elevata rispetto agli approcci che utilizzano la trasmissione o la dilettanza.

In una forma di realizzazione del trovato, come geometria ATR viene utilizzato un cristallo di diamante in quanto esso è un materiale più durevole rispetto al ZnSe, silicio o germanio, utilizzato in misure paragonabili, ed ha un intervallo di trasparenza maggiore.

Gli spettri acquisiti sono con lunghezza d’onda compresa tra 400 cm e 4000 cm<-1>.

Una forma di realizzazione del trovato prevede di utilizzare la parte NIR o la parte FIR dello spettro.

La configurazione del sistema può utilizzare, ma non è limitata a, un rilevatore DLaTGS (Deuterated L-alanine doped triglycine sulphate), ed una sorgente di corpo nero “Glow-bar”.

Una forma di realizzazione del presente trovato prevede di costruire preliminarmente un database (training dataset) composto misure indipendenti su campioni ottenuti da colture monomicrobiche, ad esempio circa 10.000 misure indipendenti.

I campioni batterici, previa crescita su vari terreni solidi, sono ottenuti come riferimento di specie batterica con l’uso di un brodo eugonico in fase liquida, o terreno di coltura liquido, e successiva centrifugazione da cui ottenere un pellet concentrato per ogni singola specie batterica.

Secondo il trovato, il pellet batterico ottenuto da crescita di batteri monomicrobica viene poi applicato sul sistema FTIR ATR e fornisce una serie di spettri per ogni batterio cresciuto in detto brodo eugonico. Gli spettri ottenuti dai relativi batteri cresciuti in brodo liquido, e poi pellettizzati, vengono utilizzati per ottenere dati sui diversi batteri senza alcuna interferenza derivante dal diverso mezzo di coltura.

Per costruire il summenzionato database sono stati quindi seminati in piastre di Petri ceppi di batteri selezionati e certificati tipo NNCCLS di Atlanta.

Per ogni singolo batterio seminato su piastra di Petri sono stati ottenuti spettri peculiari; inoltre è stato seminato ogni singolo ceppo in vari terreni di crescita, utilizzando piastre di Petri di vari produttori, al fine di verificare se, nella rilevazione tramite FTIR, la componente del terreno di crescita delle varie piastre di Petri fornisse risultati differenti causa la differente composizione del substrato di crescita peculiare di ogni piastra di Petri.

I terreni utilizzati sono stati selezionati tra:

- CLED Agar

- MacConkey Agar

- Chromogenic Agar

- CNA Agar

- ORI Agar

Per ogni batterio sono state ottenute 500 crescite batteriche al fine di avere una casistica ampia e completa in merito all’ottenimento di un cluster numerico atto ad verificare la correlazione dei dati in comparazione con altre metodologie in uso.

Dallo spettro di crescita per ogni singola specie batterica, sono stati individuati i range spettrali contenenti discriminanti tali da poter discriminare ogni specie batterica (Figura 2b).

In una forma di realizzazione, i dati vengono analizzati col metodo che segue:

- Calcolo della derivata prima o seconda;

- Normalizzazione delle derivate utilizzando un algoritmo di normalizzazione vettoriale su tutto il range spettrale;

- Selezione delle zone spettrali più utili per la classificazione delle specie batteriche.

o 950-1280 cm<-1>: Acidi nucleici, carboidrati e polisaccaridi o 1280-1480 cm<-1>: Amide III delle proteine, metili e metileni dei lipidi.

o 1700-1800 cm<-1>: Carbonile dei lipidi

o 2800-3000 cm<-1>: catene alifatiche dei lipidi

La figura 2a rappresenta i dati grezzi raccolti, in cui ciascun specie è rappresentata da un diverso colore. La Figura 2b rappresenta i dati trasformati. Le summenzionate regioni spettrali sono quindi utilizzate per classificare e successivamente identificare le singole specie batteriche.

La diversa presenza delle 4 classi chimiche, acidi nucleici, lipidi, proteine, carboidrati, costituenti le cellule batteriche, ha permesso di ottenere dei segnali caratteristici per ogni specie batterica, tali per cui è stato possibile realizzare un metodo predittivo capace di identificare le diverse specie batteriche.

Una forma di realizzazione utilizza un’analisi PC A (Analisi in Componenti Principali) per analizzare gli spettri infrarossi nell’ambito della statistica multivariata.

La figura 3 rappresenta i dati acquisiti nello spazio PC1-PC2, in cui ciascuna specie è rappresentata con una diversa gradazione di grigio. Esempio 1

In una forma di realizzazione, il metodo secondo il trovato può essere utilizzato per predire il batterio tipo GRAM. Un esempio dei risultati sulla classificazione GRAM+GRAM- è presentato in Figura 4.

Il pannello a) di Fig. 4 è una rappresentazione dello spazio PC A colorato come GRAM positivo (grigio chiaro) e GRAM negativo (grigio scuro).

Il pannello b) di Fig. 4 è la matrice di confusione presentante i dati “Predetti” rispetto a quelli “Effettivi” ottenuti dal metodo.

Il pannello c) di Fig. 4 rappresenta i risultati di prestazioni del metodo matematico nel predire il tipo GRAM.

Esempio 2

In una forma di realizzazione del metodo, esso può essere utilizzato per identificare specie batteriche. Si veda Figura 5 che mostra una matrice di confusione ottenuta dalla validazione del metodo con gli spettri del database. Si può osservare una corrispondenza dal 99,9% al 96% tra l’effettivo ed il predetto.

Una forma di realizzazione prevede un programma per elaboratore, o software, utilizzato per raccogliere i dati ed analizzarli rispetto al database, che è memorizzabile in un mezzo leggibile da un computer e che contiene le istruzioni che, una volta eseguite da un apparato di analisi per la classificazione ed identificazione batterica, determinano l’esecuzione del metodo in accordo con la presente descrizione.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo di classificazione ed identificazione batterica, in cui detto metodo prevede di classificare ed identificare batteri tramite tecnica FTIR ATR usando colonie di specie batteriche cresciute in brodo liquido eugonico.
2. Metodo come nella rivendicazione 1, in cui detto metodo prevede di acquisire profili spettrali di specie batteriche, i quali profili spettrali vengono sottoposti ad analisi multivariata.
3. Metodo come nella rivendicazione 1 o 2, in cui, tramite detta tecnica FTIR ATR, un profilo spettrale di un campione biologico sconosciuto viene acquisito e confrontato con il profilo spettrale di campioni noti e raccolti in un database per identificare e classificare crescite batteriche.
4. Metodo come nella rivendicazione 3, in cui detto database prevede la creazione di una libreria di riferimento di batteri ottenuti da pellet da brodo liquido di crescita, da utilizzare quale standard di analisi e riferimento comparativo per la crescita di ogni specie batterica su terreni solidi di crescita.
5. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui vengono utilizzate colonie di specie batteriche cresciute in piastre di Petri di vario tipo e configurazione.
6. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, detto metodo prevedendo un’analisi degli spettri di rilevazione FTIR ATR in merito a peculiari regioni della membrana di superfìcie batterica corrispondente alla composizione di proteine, lipidi e carboidrati.
7. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, detto metodo prevedendo la creazione di una libreria peculiare di ogni famiglia batterica identificata.
8. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, detto metodo prevedendo un tempo di analisi medio di circa 1 minuto a campione.
9. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, detto metodo prevedendo di raccogliere i dati, processarli ed analizzarli dando come responso la percentuale di appartenenza del campione alle specie presenti nel database.
10. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, detto metodo prevedendo di utilizzare un cristallo di diamante come geometria ATR.
11. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, in cui gli spettri sono acquisiti con lunghezza d’onda compresa tra 400 cm<-1 >e 4000 cm<-1>.
12. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, in cui detta tecnica FTIR ATR prevede di utilizzare la parte NIR o la parte FIR dello spettro.
13. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, in cui detto metodo prevede l’utilizzo di un rilevatore DLaTGS (Deuterated L-alanine doped triglycine sulphate), ed una sorgente di corpo nero “Glowbar”.
14. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, in cui detto metodo prevede di utilizzare un’analisi PCA (Analisi in Componenti Principali) multivariata per analizzare gli spettri infrarossi.
15. Apparecchiatura di analisi per la classificazione ed identificazione batterica tramite tecnica FTIR ATR, detta apparecchiatura comprendendo uno spettrofotometro FTIR ATR accoppiato con un computer per l’acquisizione spettrale e l’analisi dei dati, in cui detto computer comprende un elaboratore configurato per eseguire un metodo in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14.
16. Programma per elaboratore, memorizzabile in un mezzo leggibile da un computer e che contiene le istruzioni che, una volta eseguite da un apparato di analisi, determinano l’esecuzione di un metodo in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14.