CN110849866A - 一种利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法 - Google Patents

一种利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法。本发明以区分新生隐球菌和格特隐球菌为切入点，有针对性地研发了能够增强这两种真菌拉曼光谱信号并进行区分的检测方法。结果显示，真菌表面带有负电荷，可很好的吸附正价胶体银，研制合适粒径的正价胶体银可以很好的增强真菌拉曼检测信号，并能够鉴别极其近缘的真菌，有望将此种方法及材料应用于更多的真菌检测中，推动临床真菌鉴定的发展。

Description

一种利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法
技术领域
本发明属于临床微生物检验技术领域，具体涉及一种利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法。
背景技术
新生隐球菌和格特隐球菌是引起人类感染的两种主要致病菌性隐球菌。新生隐球菌导致了多数的隐球菌感染。自1970年Gatti和Eeckels报道了世界上第1例格特隐球菌感染病例以来，相关感染开始较多报道。最初格特隐球菌被称为新生隐球菌格特变种。2002年Kwon-Chung等基于遗传分类学、生物学和表型学的差异，将新生隐球菌格特变种命名为格特隐球菌。新生隐球菌主要感染免疫抑制人群，常引起中枢神经系统感染，而格特隐球菌主要感染免疫力正常人群并以肺部感染为主。新型隐球菌与格特隐球菌在流行性、致病性、症状及诊断治疗方面均有明显差异。
临床上常须对两种隐球菌进行区分，传统的隐球菌检查方法包括印度墨汁染色、真菌培养、血培养以及荚膜多糖抗原抗体免疫反应都难以区分两种隐球菌。近年来随着生物技术的快速发展，PCR、基因芯片、质谱技术以及二代测序技术作为传统检测方法的补充在病原菌的鉴定与药敏实验中得到了一些探索与应用，但仍存在不少问题。例如，基因芯片技术虽然具有高通量、快速和自动化的优势，但仪器设备成本高，难以用于临床。因此临床急需一种能够用于两种隐球菌区分的快速、准确、灵敏度高、特异性强的新方法。
1928年印度科学家拉曼(Raman)首次发现了拉曼散射现象，其携带的分子结构信息，能直观地为分子的振动、化学键、基团的研究提供检测手段，因此是一种表征分子结构振动的指纹谱早在1989年，Holt和Cotton首次报道细菌的SERS图谱。4年之后，Magee教授指出利用整个生物体的指纹谱图谱对病原菌进行检测是完全有可能实现的，SERS为病原菌的快速检测打开了新的大门，并且SERS光谱的高灵敏及指纹谱等特点可以满足病原微生物快速、准确鉴定的要求。由于新生隐球菌与格特隐球菌的组成和性质相似，因此利用普通AgNPs作为增强基底的SERS技术来区分两种病原菌具有一定困难。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明的目的是通过制备新的增强基底材料从而更好的完成新生隐球菌和格特隐球菌的区分。
本发明的另一个目的是能够帮助隐球菌感染的病人实现快速鉴别诊断，方便临床用药进行治疗。
一种利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法，以带正电荷的纳米银为增强基底，用表面增强拉曼散射法区分新生隐球菌和格特隐球菌。
所述普通纳米银共振吸收峰在416nm处，正电荷纳米银的紫外吸收峰在400nm处。
所述新生隐球菌和格特隐球菌是细胞壁表面携带负电荷的真核生物，其Zeta电位如图1和图2所示，带正电荷的纳米银可直接吸附于其细胞壁表面，起到增强拉曼散射信号的作用。
所述带正电荷的纳米银的制备方法如下：
(1)制备A溶液：20mL超纯水中加入3.26mM AgNO3，0.4M NH4OH，0.5Mm十六烷基三甲基溴化铵；
(2)制备B溶液：20mL超纯水中加入8mM NaBH4和0.5Mm十六烷基三甲基溴化铵；
(3)将A液倒入50mL规格锥形瓶中并置于冰浴中，在加热电磁搅拌器上进行剧烈搅拌，搅拌速度设为700rpm/min，然后，为保证分散系的均匀，将B液滴入A液中，继续在加热电磁搅拌器上搅拌4小时，4小时后停止搅拌，将混合液进行加热，加热时间为10min，目的是去除剩余的NH3和NaBH4，到最后，关闭加热，待溶液冷却至室温，加入超纯水将溶液定容至40mL，正电荷纳米银制备完成。
所述正电荷纳米银的最终浓度为1.63mM，其粒径为128.7nm(图3)。
本发明的有益效果：本发明以区分新生隐球菌和格特隐球菌为切入点，有针对性地制作了能够增强这两种真菌拉曼光谱信号的基底材料。结果显示，真菌表面带有负电荷，可很好的吸附正价胶体银，因此正价胶体银在真菌的拉曼信号测量上具有很好的增强作用，有望将此种材料应用于更多真菌拉曼信号的检测，以推动临床真菌鉴定的发展。
附图说明
图1为新生隐球菌Zeta电位。
图2为格特隐球菌Zeta电位。
图3为正电荷纳米银粒径图。
图4为制备得到普通带负电荷纳米银的扫描电镜图。
图5为制备得到的带正电荷的纳米银的扫描电镜图。
图6为普通纳米银的紫外吸收光谱。
图7为正电荷纳米银的紫外吸收光谱。
图8为普通负电荷纳米银与正电荷纳米银在所测拉曼信号强度对比图。
图9为以带正电荷的纳米银为基底，新生隐球菌和格特隐球菌的归一化后的平均SERS光谱对比图。
图10为所有测试的拉曼光谱数据进行Opls-da分析。
图11为十折交叉试验结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除特别说明，本发明所用试剂盒材料均为市购。
实施例1
1.试剂
硝酸银(AgNO3)：北京现代东方公司商贸有限公司；硼氢化钠(NaBH4)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；氢氧化铵(NH4OH)：西陇化工集团有限公司；单晶硅片：浙江立晶硅材料有限公司；去离子水：Milli-Q纯水仪沙保罗培养基：上海科玛嘉微生物技术有限公司。
2.仪器
Hitachi H-7650透射电镜：日本日立；JEOL 2010高分辨透射电子显微镜：日本电子株式会社；i-Raman Plus BWS465-785H拉曼光谱仪：美国B&W Tek Zeta potential wasmeasured using Zetasizer analyzer(Zetasizer Nano ZSP,Malvern Inc.,UK；Shimadzu2600紫外-可见分光光度计日本岛津；MiniSpin离心机：德国；Eppendorf ZNCL-BS230*230加热电磁搅拌器：北京世纪华科HZQ-F160；恒温振荡培养箱：东联电子技术开发有限公司；Milli-Q超纯水仪：美国Millipore。
3.实验隐球菌株的准备
实验菌株：新生隐球菌和格特隐球菌均由海军军医大学附属上海长征医院临床送检脑脊液样本分离，经仪器及显色培养基鉴定确认。菌株浸润于高压灭菌纸片中，于-80℃长期保存。实验前，将菌株从保种管中划线转接至SDA固体培养基(麦芽糖4％,蛋白胨1％,琼脂2％，蒸馏水)于25℃静置培养72小时备用。
4.普通纳米银和正电荷纳米银的准备
4.1普通纳米银的制备
(1)200mL超纯水中加入33.72mg AgNO3，置于加热电磁搅拌器上加热至沸腾。
(2)待其沸腾后开启搅拌，搅拌时间为45min，搅拌速度设为600rpm/min。
(3)加热搅拌过程中放入1％柠檬酸钠溶液8mL。
(4)45min后关闭加热，待冷却至室温，加入超纯水将溶液定容至200mL。
(5)再从上述溶液中取1mL于Eppendorf(EP)管中，在加热电磁搅拌器上开始剧烈搅拌，7000rpm离心7min，离心后弃上清，并用100μL去离子水重悬，即可得到均匀乳灰色溶液，室温避光封存待用。
4.2正电荷纳米银的制备
(1)制备A溶液：20mL超纯水中加入3.26mM AgNO3，0.4M NH4OH，0.5mM CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)。
(2)制备B溶液：20mL超纯水中加入8mM NaBH4和0.5mM CTAB。具体地，将A、B溶液进行混合搅拌：为防止反应过于剧烈，先将A、B溶液冰浴十分钟。
(3)将A液倒入50mL规格锥形瓶中并置于冰浴中，搅拌转速为700rpm/min(4)将B液一滴一滴滴入A液中，继续在加热电磁搅拌器上搅拌4小时。
(5)4小时后停止搅拌，将混合液进行加热，加热时间为10min，目的是去除剩余的NH3和NaBH4。
(6)关闭加热，待其冷却至室温，加入超纯水将溶液定容至40mL。
(7)再从上述溶液中取1.5mL于Eppendorf(EP)管中，7500rpm离心7min，离心后弃1450μL上清，将剩下的溶液重悬，即可得到均匀棕褐色溶液，室温避光封存待用。
图4为普通负电荷纳米银的扫描电镜图，可观察到在制备过程中有棒状纳米银产生，但其分布较均匀。图5是制备得到的带正电荷的纳米银的电镜图。
图6和图7描绘了普通纳米银和正电荷纳米银的紫外吸收光谱，可见普通纳米银共振吸收峰在416nm处，正电荷纳米银的紫外吸收峰在400nm处。且两者的吸收光谱都没有其他杂峰出现，谱线具有较窄的半峰宽且峰形比较对称，因而说明两者的溶胶颗粒较均匀且单分散性良好。
为了进一步证明制备的两种溶胶对病原菌的增强效果，加入普通纳米银的隐球菌信号很弱，而加入带正电荷纳米银的各峰的拉曼信号较强，且明显优于普通胶体银作为增强基底的增强效果。
分别以两种纳米银为基底，检测新生隐球菌和格特隐球菌的SERS信号，取10μL病原菌样本与之前浓缩普通胶体银和正价胶体银增强基底各10μL在离心管中吹打混匀后，分别取2μL点样至单晶硅片上，自然风干后采用配置显微平台的便携式拉曼光谱仪(i-RamanPlus BWS465785H)检测。该型号的最大激光功率为275mW，激光波长785nm，光斑直径约为105μm。检测条件如无特殊说明情况下均采用如下参数：激发功率为最大功率的20％，积分时间10s，同一个样品随机检测40次取平均强度作为光谱数据。需要进行光谱的平滑，可以提高信噪比，但也要根据我们自身的信号强度来调节平滑强度。
用SIMCA软件对两种隐球菌进行区分：建立正交偏最小二乘判别分析方法对数据进行统计学分析，使用SIMCA软件OPLS-DA算法分别建立新生隐球菌和格特隐球菌的分类模型；分析模型参数，确定模型有效性；使用十折交叉验证来评估该学习算法对独立于训练数据的数据集的泛化能力。
图8为普通负电荷纳米银与正电荷纳米银在所测拉曼信号强度对比图，图9为以带正电荷的纳米银为基底，新生隐球菌和格特隐球菌的归一化后的平均SERS光谱对比图，图中拉曼谱是由两个样本每个测量40次后取平均值后，同种隐球菌拉曼结果再取平均值，且进行面积归一化运算之后经Origin2018汇总画图得出，横坐标为拉曼位移，纵坐标为拉曼信号强度。
利用SERS光谱进一步对菌株进行OPLS-DA分析，可以准确直观地观察指纹图谱的差异。基于SIMCA14.1软件(Umetrics，Umea，Sweden)，对所有检测的两种隐球菌光谱拉曼位移在550到1700cm-1之间的所有数据进行OPLS-DA分析。通过扣除自体荧光背景对拉曼光谱数据进行预处理，并用Origin2018进行平滑归一化处理。
利用SERS谱，进一步对新生隐球菌和格特隐球菌进行了opls-da鉴定，可以直观地观察到二者指纹图谱的差异。基于SIMCA14.1软件(Umetrics,Umea，瑞典)对来自所有测试的拉曼光谱数据进行Opls-da分析。如图10所示，设椭圆为样本分析结果的95％置信区间，每个点代表一个样本。可以发现所有的数据点在中轴的两边都是分开的，没有交集，它们在两边都很集中。opls-da模型显示R2X(cum)＝0.986,R2Y(cum)＝0.994,Q2(cum)＝0.992，表明所建立的模型质量参数良好。R2X表示模型在x轴方向的解译率为98.6％，R2Y表示模型在y轴方向的解译率为99.4％，Q2表示模型的预测率为99.4％。
使用十折交叉验证来评估模型的可用性，将所有隐球菌样本的光谱数据随机分为10个亚组，每个亚组(测试集)用其余9个亚组构建的训练集模型进行测试。然后，在10次操作后得到训练集和测试集的平均准确率。如图11所示，训练集和测试集的平均准确率分别为100％和100％，说明该模型具有良好的准确率。

Claims (5)

1.一种利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法，其特征在于，以带正电荷的纳米银为增强基底，用表面增强拉曼散射法区分新生隐球菌和格特隐球菌。
2.根据权利要求1所述利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法，其特征在于，所述普通纳米银共振吸收峰在416nm处，正电荷纳米银的紫外吸收峰在400nm处。
3.根据权利要求1所述利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法，其特征在于，所述新生隐球菌和格特隐球菌是细胞壁表面携带负电荷的真核生物，带正电荷的纳米银可直接吸附于其细胞壁表面，起到增强拉曼散射信号的作用。
4.根据权利要求1所述利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法，其特征在于，所述带正电荷的纳米银的制备方法如下：
(1)制备A溶液：20mL超纯水中加入3.26mM AgNO3，0.4M NH4OH，0.5Mm十六烷基三甲基溴化铵；
(2)制备B溶液：20mL超纯水中加入8mM NaBH4和0.5Mm十六烷基三甲基溴化铵；
(3)将A液倒入50mL规格锥形瓶中并置于冰浴中，在加热电磁搅拌器上进行剧烈搅拌，搅拌速度设为700rpm/min，然后，为保证分散系的均匀，将B液滴入A液中，继续在加热电磁搅拌器上搅拌4小时，4小时后停止搅拌，将混合液进行加热，加热时间为10min，目的是去除剩余的NH3和NaBH4，到最后，关闭加热，待溶液冷却至室温，加入超纯水将溶液定容至40mL，正电荷纳米银制备完成。
5.根据权利要求4所述利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法，其特征在于，所述正电荷纳米银的最终浓度为1.63mM，其粒径为128.7nm。
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