CN112098389B

CN112098389B - 一种单增李斯特菌的检测方法

Info

Publication number: CN112098389B
Application number: CN202010896650.4A
Authority: CN
Inventors: 孙大文; 张翠云; 黄伦杰; 蒲洪彬; 张道瑞
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-08-31
Also published as: CN112098389A

Abstract

本发明公开了一种单增李斯特菌的检测方法。本发明利用纳米银笼作为基底，将其与已知浓度的单增李斯特菌标准样品液混合、孵化后进行拉曼检测，建立单增李斯特菌浓度‑拉曼信号强度标准曲线，再将纳米银笼基底与实际待测样品混合、孵化后进行拉曼检测所得的拉曼信号强度与标准曲线对比，从而得到实际待测样品中单增李斯特菌的含量。本发明结合空间限位效应和拉曼指纹光谱，实现对单增李斯特菌的快速特异性检测。所述方法简单，无需制备模板，环保无污染，制备的纳米银笼基底外壳和内壁均粗糙，极大增加了单增李斯特菌与基底的接触面积，从而显著提高了SERS检测的效果。

Description

一种单增李斯特菌的检测方法

技术领域

本发明属于光谱检测领域，具体涉及一种单增李斯特菌的检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌，兼性厌氧，革兰氏阳性菌，大小为(0.4-0.5)μm×(0.5-2)μm，广泛存在于自然界中。单增李斯特氏菌导致的细菌性食物中毒主要是通过食用受污染的食物，例如乳制品，即食肉和海鲜以及蔬菜和水果而发生的，且污染主要发生在加工过程中。单增李斯特菌感染会导致胃肠道疾病，对于免疫功能低下的患者会导致脑部和血液感染，或导致孕妇出现胎儿并发症。单增李斯特菌是一种会形成生物膜的嗜冷菌，对大多数消毒剂具有抵抗力。因此及时准确识别出食品中的单增李斯特菌的存在十分重要。

传统的分离鉴定法成本较低，但是存在步骤繁琐、容易出现假阴性的缺点，需要专业技术人员的操作，并且从富集、分离到鉴定需要3-5天。新兴的微生物快速检测技术，如聚合酶链式反应、酶联免疫吸附法(ELISA)、疏水性栅格滤膜法技术、免疫磁性分离技术、电阻抗技术、生物发光技术、探针技术等，虽然比起传统的分离鉴定方法需要的时间大为缩短，并且各有优势，但是也各自存在一定的局限性，如需要耗时复杂的前期准备、需要熟练的专业操作能力、抗体制备过程复杂且不稳定、仪器设备庞大昂贵、检测时间长等。

表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering)是一种高灵敏度、快速无损的检测技术，无需样品制备，可对微生物进行原位实时研究。银具有很强的拉曼增强效应，因而被广泛应用为拉曼增强基底。然而，在复杂基质中单一的银纳米粒子用于检测时光谱变化大，灵敏度低，且无法特异性识别单增李斯特菌。

随着科学技术的发展，特异标记法也有了进展，具体的做法是在纳米粒子表面修饰目标识别片段(如抗体、适配体、小分子配体)以形成SERS标签。此类SERS标签可以特异性结合微生物，从而有超灵敏性、高定量能力等优点，但基底制备步骤复杂，需要复杂的化学修饰工艺，抗体、适配体昂贵且不稳定，而且还增加了成本和产生抗生素耐药性的风险。例如，专利申请CN 106645090 A中，在表面修饰了拉曼报告分子的金纳米颗粒的表面合成了一层SiO₂层，后又在其表面修饰了致病菌的抗体，以此作为拉曼信号探针，修饰了致病菌抗体的磁性纳米粒子用于磁分离，需要复杂的制备步骤和较长的基底制备时间，从而导致了总分析时间的延长，且需要使用抗体。专利申请CN 110702662 A中，使用硼酸官能化的聚多巴胺涂层Au@Ag纳米颗粒作为SERS标签，修饰IgG的Fe₃O₄磁性纳米颗粒用于磁性分离，可以对细菌实现灵敏的检测，然而，基底制备步骤繁琐，耗时费力，且仍需要抗体的使用。因此，寻求一种新的检测思路，以实现单增李斯特菌的快速特异性检测仍是一个大的挑战。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种单增李斯特菌的检测方法，结合空间限位效应和拉曼指纹光谱，实现对单增李斯特菌的快速特异性检测，无需以微生物的大小、形状或者其代谢产物制备模板，也无需使用昂贵且不稳定的抗体及适配体。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种单增李斯特菌的检测方法，包括以下步骤：

(1)在振荡条件下，向水中依次加入AgNO₃、Na₂CO₃和没食子酸，常温避光振荡反应0.5～2.5小时，离心去除上清液，得到纳米银笼基底，所得纳米银笼基底重新分散于水中；

(2)将培养至对数期的单增李斯特菌用水配制成浓度为0～10⁸CFU/mL的单增李斯特菌标准样品液，取相同体积各浓度的单增李斯特菌标准样品液与步骤(1)的纳米银笼基底混合均匀，孵化后，用毛细管检测的方法进行拉曼检测，以单增李斯特菌浓度为横坐标，拉曼信号强度为纵坐标，建立标准曲线；

各浓度的单增李斯特菌标准样品液中加入纳米银笼基底的质量相同；

(3)将实际待测样品与步骤(1)的纳米银笼基底混合均匀，孵化后，用毛细管检测的方法进行拉曼检测，所得拉曼信号强度与步骤(2)标准曲线进行对比，即可得出实际待测样品中单增李斯特菌的含量。

优选的，步骤(1)所述AgNO₃、Na₂CO₃和没食子酸的比例为(0.4～0.65)mg：(2.5～7.5)μmol：(2～4)μmol。

优选的，步骤(1)所述AgNO₃在水中的质量浓度为0.005～0.013％。

优选的，步骤(1)所述AgNO₃以AgNO₃水溶液的形式加入，其水溶液的质量浓度为0.5～2％；所述Na₂CO₃以Na₂CO₃水溶液的形式加入，其水溶液的浓度为0.1～1mol/L；所述没食子酸以没食子酸水溶液的形式加入，其水溶液的浓度为0.05～0.5mol/L。

优选的，步骤(1)所述振荡的频率为600～800rpm；所述离心的转速为4000～6500rpm，离心时间为3～8min。

优选的，步骤(1)所述AgNO₃、Na₂CO₃和没食子酸加入的时间间隔均为3～8秒。

更优选的，步骤(1)中，向5～8mL的水中依次加入40～65μL质量浓度为1％的AgNO₃水溶液、5～15μL浓度为0.5mol/L的Na₂CO₃水溶液和20～40μL浓度为0.1mol/L没食子酸水溶液。

优选的，步骤(1)所述纳米银笼基底重新分散于水中并于4℃保存。

优选的，步骤(1)所述纳米银笼基底重新分散于水中的质量浓度为0.04～0.15mg/mL。

优选的，步骤(2)所述对数期的单增李斯特菌由以下方法培养得到：单增李斯特菌纯菌种进行划线培养，培养12～15h后，用接种环取单菌落分散于液体培养基中，培养至对数期。

优选的，步骤(2)所述浓度为0～10⁸CFU/mL的单增李斯特菌标准样品液的浓度梯度为10²CFU/mL。

优选的，步骤(2)所述单增李斯特菌标准样品液的浓度分别为0、10²、10⁴、10⁶和10⁸CFU/mL；其中0为空白对照。

优选的，步骤(2)和(3)所述纳米银笼基底以水分散液的形式加入到单增李斯特菌标准样品液和实际待测样品中，纳米银笼基底水分散液的质量浓度为0.04～0.15mg/mL，纳米银笼基底水分散液与步骤(2)中单增李斯特菌标准样品液或步骤(3)中实际待测样品的体积比均为1：1。

优选的，步骤(2)和(3)所述孵化的时间为2～3分钟。

优选的，上述方法中所述的水均为去离子水。

所述毛细管检测的方法进行拉曼检测为本领域的常规方法。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明提出了一种新的检测思路：结合空间限位效应和拉曼指纹光谱，实现对单增李斯特菌的快速特异性检测。通过调控纳米银笼的大小和开口尺寸，就可以实现对特定微生物的特异性检测，无需以微生物的大小、形状或其代谢产物制备模板，也无需使用昂贵且不稳定的特异性识别元件，如抗体及适配体。

(2)本发明纳米银笼的制备过程简单快捷，无需使用模板，省去制备模板和刻蚀模板的步骤，通过银纳米颗粒自组装即可得到具有中空超结构的纳米银笼，且银笼具有开口；制备所需时间短，仅需1-2小时即可完成纳米银笼基底的制备，且所用试剂环保无污染，适合快速及大批量的检测场景。

(3)本发明制备的纳米银笼基底外壳和内壁均粗糙，大大增加了单增李斯特菌与基底的接触面积，从而大大提高了SERS检测的效果。

附图说明

图1为实施例1中纳米银笼在20000倍放大下的扫描电子显微镜(SEM)图。

图2为实施例2中以纳米银笼和银纳米粒子溶胶为基底测得的拉曼光谱图。

图3为实施例3中单增李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的归一化比值。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1建立单增李斯特菌浓度-拉曼强度线性关系

(1)纳米银笼的制备：

在10mL离心管中加入6mL超纯水，将离心管置于振荡器上，调节振荡器振幅为700rpm，按顺序加入60μL质量分数为1％的AgNO₃溶液、12μL的0.5mol/L的Na₂CO₃溶液、30μL的0.1mol/L的没食子酸溶液，试剂添加的时间间隔保持为5秒；不改变振幅，在常温避光条件下振荡反应1.5小时；将离心管取下，在6000rpm转速下离心6min；取出上清液，加入5mL超纯水重悬，将得到的纳米银笼基底水分散液置于4℃下保存待用。

(2)建立单增李斯特菌标准曲线：

单增李斯特菌纯菌(ATCC19115)种进行划线培养，培养12h后，用接种环取单菌落分散于液体培养基中，培养至对数期，取出一定量的液体培养基的单增李斯特菌，离心，用蒸馏水重悬，并用蒸馏水稀释成浓度分别为0、10²、10⁴、10⁶、10⁸CFU/mL的标准样品液。取相同体积的各浓度的标准样品液与步骤(1)纳米银笼基底水分散液以体积比1:1混合，剧烈振荡混匀后，孵化2分钟，用毛细管检测的方法进行拉曼检测。使用配备了785nm、50mW近红外二极管激光器，高稳定性共聚焦显微镜的拉曼仪器，物镜工作距离(LWD)为10倍，扫描光谱范围为400～2000cm^-1，信号收集时间为10秒。信号采集完毕后通过拉曼软件对数据进行基线处理，得到清晰直观的光谱图。随后，以单增李斯特菌浓度为横坐标，拉曼信号强度为纵坐标，建立标准曲线，即可用于实际样品中单增李斯特菌的定量检测。

图1为纳米银笼在20000倍放大下的SEM图。从图1可以看出，在放大20000倍下，制备的纳米银笼形状近似于立方体，立方体棱长为800～1000nm。银笼表面粗糙，呈颗粒状特征，银笼的笼壁具有一定的厚度，壁厚约150～200nm。在纳米银笼的一面具有开口，开口边长为400～600nm，边缘不平整。从开口可以看出纳米银笼内部为空心的。

由结果可以看出，随着单增李斯特菌浓度增大，采集的拉曼信号也逐渐增强，线性关系良好，线性范围为10²～10⁸CFU/mL，检测限可达10CFU/mL。可以看出，纳米银笼基底可以用于单增李斯特菌的定量检测。

实施例2纳米银笼基底与单纯银纳米颗粒基底比较检测效果

(1)分别取相同体积的单增李斯特菌浓度为10²、10⁴、10⁶CFU/mL的标准样品液(实施例1所得)与浓度为0.2mg/mL银纳米粒子溶胶基底以体积比1:1的比例混合，剧烈振荡混匀后，孵化2分钟，用毛细管检测的方法进行拉曼检测。使用配备了785nm、50mW近红外二极管激光器，高稳定性共聚焦显微镜的拉曼仪器，物镜工作距离(LWD)为10倍，扫描光谱范围为400～2000cm^-1，信号收集时间为10秒。信号采集完毕后通过拉曼软件对数据进行基线处理，得到清晰直观的光谱图。

(2)按照实施例1中制备纳米银笼基底水分散液，取相同体积的单增李斯特菌浓度为10²、10⁴、10⁶CFU/mL的标准样品液(实施例1所得)与纳米银笼基底水分散液以体积比1:1混合，剧烈振荡混匀后，孵化2分钟，用毛细管检测的方法进行拉曼检测。检测条件和参数设置与(1)同。

由实验结果发现，以纳米银笼为基底检测单增李斯特菌可以获得更好的检测效果。以单纯的银纳米粒子为基底时，仅可测到单增李斯特菌浓度为10⁶CFU/mL的拉曼光谱，10²和10⁴CFU/mL的样品液的检测光谱中单增李斯特菌所属的谱峰强度几乎被荧光背景淹没。

与单纯的银纳米粒子相比，纳米银笼为基底可以检测至10²CFU/mL，由实施例1可知，纳米银笼基底甚至可以获得低至10CFU/mL的检测限。可以看出，基底的空间尺寸效应设计可以大大提高单增李斯特菌的SERS检测效果。

实施例3特异性检测的效果

为检测纳米银笼基底对单增李斯特菌的特异性检测效果，用蒸馏水分别配制浓度均为10²和10⁴CFU/mL的单增李斯特菌(实施例1所得)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC6538)、沙门氏菌(Salmonella，ATCC14028)、大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC700728)O157:H7的标准样品液。取相同体积的各菌种的标准样品液与纳米银笼基底水分散液(实施例1所得)以体积比1:1混合，剧烈振荡混匀后，孵化2分钟，用毛细管检测的方法进行拉曼检测。拉曼检测和数据处理方式均与实施例1相同。

实验结果表明，纳米银笼基底仅对单增李斯特菌有拉曼信号增强效果，说明制备的纳米银笼基底对单增李斯特菌有很强的特异性。

实施例4实际样品的检测效果

以在冰箱中预冷5小时的牛奶为示例样品，用传统分离鉴定法确认该牛奶样品无单增李斯特菌污染。取10⁸CFU/mL单增李斯特菌标准样品液(培养制备方法与实施例1同)于无菌操作台，用上述牛奶样品稀释至浓度分别为10⁶、10⁴、10²CFU/mL。随后将纳米银笼基底水分散液(实施例1所得)与样品稀释液分别按体积比1:1混合，剧烈振荡混匀后，孵化2分钟，用毛细管检测的方法进行拉曼检测，拉曼检测和数据处理方式均与实施例1相同。

依据实施例1中获得的标准曲线，通过测得的拉曼光谱的谱峰的强度，计算得到样品中的单增李斯特菌浓度，计算回收率。

表1牛奶样品中检测单增李斯特菌检测效果

实际浓度(CFU/mL)	计算浓度(CFU/mL)	回收率(％)	相对标准偏差(％)
				1×10<sup>2</sup>	1×10<sup>2.05</sup>	112.20	6.43
1×10<sup>4</sup>	1×10<sup>4.03</sup>	107.15	11.26
				1×10<sup>6</sup>	1×10<sup>5.97</sup>	93.33	9.74
1×10<sup>8</sup>	1×10<sup>8.02</sup>	104.71	7.23

从表1可以看出，本方法检测牛奶中的单增李斯特菌回收率在93.33～112.20％，相对标准偏差<12％，说明本方法可以定量检测牛奶中的单增李斯特菌，准确性高，稳定性好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在振荡条件下，向水中依次加入AgNO₃、Na₂CO₃和没食子酸，常温避光振荡反应0.5～2.5小时，离心去除上清液，得到纳米银笼基底，所得纳米银笼基底重新分散于水中；

（2）将培养至对数期的单增李斯特菌用水配制成浓度为0～10⁸ CFU/mL的单增李斯特菌标准样品液，取相同体积各浓度的单增李斯特菌标准样品液与步骤（1）的纳米银笼基底混合均匀，孵化后，用毛细管检测的方法进行拉曼检测，以单增李斯特菌浓度为横坐标，拉曼信号强度为纵坐标，建立标准曲线；

（3）将实际待测样品与步骤（1）的纳米银笼基底混合均匀，孵化后，用毛细管检测的方法进行拉曼检测，所得拉曼信号强度与步骤（2）标准曲线进行对比，即可得出实际待测样品中单增李斯特菌的含量；

步骤（1）所述AgNO₃、Na₂CO₃和没食子酸的比例为（0.4～0.65）mg：（2.5～7.5）μmol：（2～4）μmol；

所述纳米银笼基底不仅为空心，且具有开口。

2.根据权利要求1所述一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，步骤（2）和（3）所述纳米银笼基底均以水分散液的形式加入到单增李斯特菌标准样品液和实际待测样品中，纳米银笼基底水分散液的质量浓度为0.04～0.15mg/mL，纳米银笼基底水分散液与步骤（2）中单增李斯特菌标准样品液或步骤（3）中实际待测样品的体积比均为1：1。

3.根据权利要求1所述一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述AgNO₃在水中的质量浓度为0.005～0.013%。

4.根据权利要求1所述一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述AgNO₃、Na₂CO₃和没食子酸加入的时间间隔均为3～8秒。

5.根据权利要求1所述一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，步骤（2）和（3）所述孵化的时间为2～3分钟。

6.根据权利要求1所述一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述浓度为0～10⁸ CFU/mL的单增李斯特菌标准样品液的浓度梯度为10² CFU/mL。

7.根据权利要求6所述一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述单增李斯特菌标准样品液的浓度分别为0、10²、10⁴、10⁶和10⁸ CFU/mL；其中0为空白对照。

8.根据权利要求1所述一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述AgNO₃以AgNO₃水溶液的形式加入，其水溶液的质量浓度为0.5～2%；所述Na₂CO₃以Na₂CO₃水溶液的形式加入，其水溶液的浓度为0.1～1 mol/L；所述没食子酸以没食子酸水溶液的形式加入，其水溶液的浓度为0.05～0.5 mol/L。

9.根据权利要求1所述一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，向5～8mL的水中依次加入40～65μL质量浓度为1 %的AgNO₃水溶液、5～15μL浓度为0.5 mol/L的Na₂CO₃水溶液和20～40μL浓度为0.1 mol/L没食子酸水溶液；

步骤（2）所述对数期的单增李斯特菌由以下方法培养得到：单增李斯特菌纯菌种进行划线培养，培养12～15 h后，用接种环取单菌落分散于液体培养基中，培养至对数期。