CN108300758B - 一种Hemin杂化纳米花及其制备方法和应用 - Google Patents

一种Hemin杂化纳米花及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种Hemin杂化纳米花及其制备方法和应用，属于食源性致病菌快速检测领域，解决了传统检测食源性致病菌传感器存在的成本高、设计复杂的问题。本发明的一种Hemin杂化纳米花的制备方法，包括：取1.5mL离心管，依次加入0.03mg高铁血晶素Hemin、0.06mg刀豆蛋白ConA悬浮于800μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，所述磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育18～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。本发明操作简单、成本低廉、灵敏度高、特异性好。

Description

一种Hemin杂化纳米花及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食源性致病菌快速检测技术领域，具体涉及一种Hemin杂化纳米花及其制备方法和应用。
背景技术
近几年，食品安全问题得到了愈加广泛的关注，在所有食源性疾病致病因素包括微生物因素、化学物理以及有毒动植物因素中，微生物因素是最重要的致病因素，高居第一位。食源性病原菌作为一种常见微生物，分布极为广泛，是影响食品安全的最重要的因素之一。因此，开展食源性致病菌的快速检测研究势在必行。
目前用于检测鉴定食源性致病菌的方法主要包括传统的分离鉴定检测方法，免疫学法及分子生物学检测方法。传统培养方法如平板划线法，由于操作繁琐、所需时间长、低灵敏度等原因，已经无法满足现代检测工作中对快速便捷检测的要求。酶联免疫法(ELISA)方法容易污染，检测灵敏度受抗原-抗体结合能力影响，且需要制备高效抗体。常用的聚合酶链式反应技术(PCR)，具有较好的灵敏性，但是PCR技术需要反复的变温加热，所需仪器复杂，对操作人员技术要求较高。随着现代食品卫生及检测速度的发展要求，对食源性致病菌的检测手段要求操作简便、灵敏快速、适应性强，显然上述方法已不能满足这些要求。
自纳米技术问世以来,因其具有制备简单、价格低廉、使用寿命长及对环境要求低等优点，通常可以结合不同生物技术，提高生物传感器的灵敏度，是影响最深远的重大科技进展之一。在食品监测以及人类环境生活等领域中显示了独特的优势并得到了广泛的应用。
2012年Ge等首次发现蛋白质与无机金属盐类可以自组装形成花状的有机无机杂化纳米结构，称为纳米花。研究发现与纳米花杂化的酶同游离酶相比，杂化纳米花在酶的活性与稳定性方面表现出更加稳定优越的性能，同时作者对其形成机理做了初步探究。杂化纳米花结构一经发现，便引起了研究人员的高度关注。目前纳米花已经成功运用于多种领域，如生物传感器、生物分析、生物医药、污水处理等，但其应用范围及对象有待进一步开拓创新。因此，开发新型纳米花，在生物监测应用等领域具有广阔的应用前景。
发明内容
为了解决传统检测食源性致病菌传感器存在的成本高、设计复杂的问题，本发明提供一种操作简单、成本低廉、灵敏度高、特异性好的Hemin杂化纳米花及其制备方法和应用。该Hemin杂化纳米花能够结合显色底物发生显色反应，实现食源性致病菌-大肠杆菌O157:H7的可视化快速检测。
本发明的一种Hemin杂化纳米花，其组成成分为：高铁血晶素Hemin、刀豆蛋白ConA、CuSO4和磷酸盐缓冲液PBS。
本发明的一种Hemin杂化纳米花的制备方法，包括以下步骤：
取1.5mL离心管，依次加入0.03mg高铁血晶素Hemin、0.06mg刀豆蛋白ConA悬浮于800μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，所述磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育18～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
本发明还提供一种含有所述Hemin杂化纳米花的具有过氧化物酶活性的Hemin杂化纳米花传感器体系。
作为优选的实施方式，该体系包括：修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体、链霉亲和素SA标记的磁珠、Hemin杂化纳米花、显色底物，用于检测大肠杆菌O157:H7。
作为优选的实施方式，所述显色底物为ABTS与H2O2的混合物。
本发明还提供了一种采用所述Hemin杂化纳米花传感器体系检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括以下步骤：
步骤一、制备修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体；
步骤二、将修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体固定在链霉亲和素SA标记的磁珠上；
步骤三、加入待测样品，37℃恒温孵育2h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后吸干；
步骤四、加入Hemin杂化纳米花，在靶标大肠杆菌存在时，磁珠上的大肠杆菌抗体与Hemin杂化纳米花之间形成三明治夹心免疫复合物；
步骤五、加入显色底物ABTS，在H2O2作用下，激发ABTS显绿色，根据显色效果实现大肠杆菌的测定。
作为优选的实施方式，步骤二的具体过程为：
将5μL链霉亲和素SA标记的磁珠原液置于离心管中，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入10μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体，37℃孵育1h，然后用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
作为优选的实施方式，步骤四的具体过程为：
加入5～8μL Hemin杂化纳米花，37℃恒温孵育1h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，使其悬浮于10μL磷酸盐缓冲液PBS中，得到三明治夹心免疫复合物。
作为优选的实施方式，所述链霉亲和素SA标记的磁珠粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL；所述磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.4，其组成成分为：10mM Na2HPO4和10mM NaH2PO4。
作为优选的实施方式，步骤五中，加入ABTS的体积为10μL，加入H2O2的体积为5μL，反应时间为5min。
发明原理：如图1所示，本发明利用刀豆蛋白(ConA)和高铁血晶素(Hemin)通过一步法合成Hemin杂化纳米花。刀豆蛋白(ConA)作为一种凝集素，具有识别细菌表面糖蛋白功能，可与细菌细胞膜糖蛋白专一结合，利用这种特性，可成功识别分离食源性致病菌靶标。高铁血晶素(Hemin)本身具有低的过氧化物酶活性，将其合成一种具有过氧化物酶活性及识别致病菌特性的纳米聚合物：Hemin杂化纳米花，可以更加有效的放大其过氧化物酶活性，与传统HRP酶相比，具有更高的酶活性，但比HRP酶稳定性更强，对外界条件敏感度低。利用本发明的Hemin杂化纳米花作为显色平台，可以迅速的催化ABTS/H2O2显色底物发生绿色可见显色反应，用于大肠杆菌O157:H7的灵敏检测，最低检测限可达10cfu/mL。
本发明的有益效果是：本发明基于Hemin杂化纳米花信号放大技术来测定食源性致病菌大肠杆菌O157:H7，Hemin杂化纳米花具有过氧化物酶活性，其具有以下优点：
(1)具有检测灵敏度高、成本低廉、样品使用量小等优势，可实现低浓度食源性致病菌-大肠杆菌O157:H7的分析检测。
(2)通过一步法合成，操作简便，且过氧化物酶活性强，与传统HRP酶相比，具有更好的适应性及活性，对外界条件敏感度低，稳定性强。
(3)通过磁珠的分离作用，有效消除了复杂环境的干扰，可以成功运用于实际样品中大肠杆菌的检测，无需任何前期处理过程。
(4)用于食源性病菌大肠杆菌的检测方法具有较好的重现性及准确度，特异性良好，可以实现在牛奶等样品中对大肠杆菌的检测。
(5)本发明的Hemin杂化纳米花制备方法具有操作简便，快速，灵敏特异等优势，为今后病原菌快检提供了新的潜能。在此基础上，研究新型杂化纳米花在食源性致病菌快速检测领域的应用，充分发挥其优势，规避传统检测方法弊端，在人类生物医学领域中具有重大的意义。
附图说明
图1为Hemin杂化纳米花结合磁珠对大肠杆菌可视化检测原理图。
图2为本发明的Hemin杂化纳米花电镜图。其中，图2A为扫描电镜(SEM)图。图2B为透射电镜(TEM)图。
图3为Hemin杂化纳米花对不同显色底物产生显色影响结果图。
图3A中不同溶液的吸光值：a为单纯Hemin杂化纳米花；b为ABTS和H2O2混合液；c为刀豆蛋白杂化纳米花、ABTS和H2O2混合液；d为Hemin杂化纳米花、ABTS和H2O2混合液。图3B为分别以ABTS、TMB、OPD作为显色底物的显色反应结果图。
图4为Hemin杂化纳米花的酶动力学分析图。图4A为4mM的ABTS与不同浓度H2O2的酶动力学分析，对图4A进行双倒数分析，获得图4C。图4B为50mM的H2O2与不同浓度ABTS的酶动力学分析，对图4B进行双倒数分析，获得图4D。
图5为本发明的检测方法的灵敏性分析结果图。图5A为大肠杆菌浓度对显色体系的影响图，由左至右颜色依次加深。图5B为大肠杆菌浓度对显色体系吸光值的曲线影响示意图，由上到下，各曲线依次代表107cfu至Control。图5C为大肠杆菌浓度对显色体系吸光值的线性分析。
图6为本发明的检测方法的特异性分析结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本方明作进一步详细说明。下述实施例中，未进行详尽描述的试剂、方法均为常规试剂及方法。其中，所有使用的化学用品都是化学纯，所有的溶液都用超纯水配制。大肠杆菌抗体从英国的Abcam公司购买。刀豆蛋白ConA、高铁血晶素Hemin、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、H2O2均从美国的Sigma公司购买。标记SA磁珠从美国invitrogen公司购买。
实施例1Hemin杂化纳米花的制备
取1.5mL离心管，依次加入0.03mg高铁血晶素Hemin、0.06mg刀豆蛋白ConA悬浮于800μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，所述磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育18～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
实施例2Hemin杂化纳米花的电镜扫面分析
对实施例1中所获得的Hemin杂化纳米花进行电镜扫面分析，观察其微观形态表征，结果如图2所示，从电镜图片可以清晰地看到Hemin杂化纳米花的大小约为20μm，形状大多为花状球形结构，由此可以证明本发明所制备的Hemin杂化纳米花成花形态明显。
实施例3Hemin杂化纳米花对不同显色底物产生显色的影响
分别通过对单纯Hemin杂化纳米花，ABTS和H2O2混合液，刀豆蛋白杂化纳米花、ABTS和H2O2混合液，Hemin杂化纳米花、ABTS和H2O2混合液进行显色反应分析，结果如图3A所示，充分证明只有在Hemin杂化纳米花和ABTS和H2O2三者同时存在的条件下才能够成功进行氧化显色反应。
分别以ABTS、TMB、OPD作为显色底物的显色反应，结果如图3B所示，充分证明本发明的Hemin杂化纳米花过氧化物酶活性良好，能催化不同底物显色。
实施例4Hemin杂化纳米花的酶动力学分析
通过反应动力学分析为反应过程的优化提供方法和依据，因此，如图4A和图4B所示，测定了具有过氧化物酶活性的Hemin杂化纳米花在分别不同底物浓度(ABTS，0-10mM；H2O2，0-200mM)的酶动力学分析。在此基础上，根据双倒数方程(Lineweaver-Burkplot)进行进一步验证，如图4C和图4D所示。在Hemin杂化纳米花中，ABTS及H2O2的酶动力学分别为0.2248和7.665，因此，本发明的Hemin杂化纳米花与HRP酶相比，过氧化物酶活性更强。
实施例5制备标记修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体的磁珠
将5μL链霉亲和素SA标记的磁珠(链霉亲和素SA标记的磁珠粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL)原液置于离心管中，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS(磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.4，含有10mM Na2HPO4和10mM NaH2PO4，下同)清洗3次后，加入10μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体，37℃孵育1h，然后用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
实施例6食源性致病菌-大肠杆菌O157:H7的的制备
利用LB培养基培养大肠杆菌O157:H7。准确称取各成分：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g、蒸馏水50mL；在恒温摇床37℃、180转振摇过夜，超净台内分装菌液，置于4℃保存备用。
实施例7灵敏度分析
向待检液中加入显色底物：10μL的ABTS和5μL的H2O2，反应5min后，在H2O2作用下，激发ABTS显绿色，根据显色反应的强弱，利用分光光度计对待检液浓度进行定量测定。基本设置为：激发波长为414nm，扫描范围为350～475nm。
如图5所示，验证了本发明的检测方法测定大肠杆菌的灵敏度及线性定量分析范围特性。在最佳反应条件下，靶标大肠杆菌的浓度在10～107cfu/mL范围内的线性方程为：Y＝0.09471*X-0.01929(R＝0.9926)；其中，Y表示荧光信号值，X表示大肠杆菌的浓度，单位为cfu/mL。该线性方程的线性范围是101到106cfu/mL之间，根据上述所测得的吸光值以及线性方程计算含有大肠杆菌的待检液中大肠杆菌的浓度，最低检测限可达10cfu/mL。
实施例8特异性试验
为了验证本发明的检测方法的特异性，如图6所示，分别选择金黄色葡萄球菌(S.aureus)、李斯特菌(L.monocytogenes)、沙门氏菌(S.typhimurium)以及缓冲液PBS作为对照组进行显色分析，根据试验结果，在相同的试验条件下，只有靶标大肠杆菌可产生明显的吸光值信号，由此证明本发明的检测方法具有很好地选择性，不会与非靶标产生特异性反应。
实施例9牛奶样品中的大肠杆菌检测
运用本发明的检测方法对牛奶样品中的大肠杆菌浓度进行测定。具体检测过程如下：
步骤一、制备修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体。
步骤二、将修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体固定在链霉亲和素SA标记的磁珠上：将5μL链霉亲和素SA标记的磁珠(链霉亲和素SA标记的磁珠粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL)原液置于离心管中，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS(磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.4，其组成成分为：10mM Na2HPO4和10mM NaH2PO4，下同)清洗3次后，加入10μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体，37℃孵育1h，然后用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
步骤三、加入待测样品，37℃恒温孵育2h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后吸干。
步骤四、加入5～8μL Hemin杂化纳米花，37℃恒温孵育1h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，使其悬浮于10μL磷酸盐缓冲液PBS中，在靶标大肠杆菌存在时，磁珠上的大肠杆菌抗体与Hemin杂化纳米花之间形成三明治夹心免疫复合物。
步骤五、加入显色底物10μL的ABTS和5μL的H2O2，反应5min，在H2O2作用下，激发ABTS显绿色，根据显色效果实现大肠杆菌的测定。
结果如表1所示。通过回收率对本发明的检测方法准确性及精密度进行分析，回收率在99到105.1％之间。
表1
Figure BDA0001619732080000081
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.采用Hemin杂化纳米花传感器体系检测牛奶样品中大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述Hemin杂化纳米花传感器体系包括：修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体、链霉亲和素SA标记的磁珠、Hemin杂化纳米花、显色底物；所述显色底物为ABTS与H2O2的混合物；所述Hemin杂化纳米花，其组成成分为：高铁血晶素Hemin、刀豆蛋白ConA、CuSO4和磷酸盐缓冲液PBS；所述Hemin杂化纳米花的制备方法，包括以下步骤：取1.5mL离心管，依次加入0.03mg高铁血晶素Hemin、0.06mg刀豆蛋白ConA悬浮于800μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，所述磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育18～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用；
包括以下步骤：
步骤一、制备修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体；
步骤二、将修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体固定在链霉亲和素SA标记的磁珠上；将5μL链霉亲和素SA标记的磁珠原液置于离心管中，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入10μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的大肠杆菌抗体，37℃孵育1h，然后用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用；
所述链霉亲和素SA标记的磁珠粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL；
步骤三、加入牛奶样品，37℃恒温孵育2h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后吸干；
步骤四、加入5～8μL Hemin杂化纳米花，37℃恒温孵育1h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，使其悬浮于10μL磷酸盐缓冲液PBS中，在大肠杆菌O157:H7存在时，磁珠上的大肠杆菌抗体与Hemin杂化纳米花之间形成三明治夹心免疫复合物；
步骤五、加入显色底物ABTS，在H2O2作用下，激发ABTS显绿色，根据显色效果实现牛奶样品中大肠杆菌O157:H7的测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.4，其组成成分为：10mM Na2HPO4和10mM NaH2PO4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五中，加入ABTS的体积为10μL，加入H2O2的体积为5μL，反应时间为5min。
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