CN108918864A - 一种MnO2杂化纳米花及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种MnO2杂化纳米花及其制备方法和应用，属于食源性致病菌快速检测领域，解决了传统食源性病原菌检测存在成本高且设计复杂的问题。本发明的一种MnO2杂化纳米花，其组成成分为MnO2、刀豆蛋白Con A、CuSO4和磷酸盐缓冲液。其制备方法为：取1.5mL离心管，依次加入10～100μL、0.1～0.15mg/mL MnO2、0.01～0.1mg刀豆蛋白Con A悬浮于800～1500μL、10mM的PBS中，所述PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的PBS悬浮，4℃保存备用。本发明还提供了一种含有上述MnO2杂化纳米花的具有催化H2O2产生气体的MnO2杂化纳米花传感器体系。本发明特异性强、灵敏度好、检测成本低、设计简单。

Description

一种MnO2杂化纳米花及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食源性致病菌快速检测技术领域，具体涉及一种MnO2杂化纳米花及其制备方法和应用。
背景技术
近几年，食品安全问题得到了愈加广泛的关注，在所有食源性疾病致病因素包括微生物因素、化学物理以及有毒动植物因素中，微生物因素是最重要的致病因素，高居第一位。食源性病原菌作为一种常见微生物，分布极为广泛，是影响食品安全的最重要的因素之一。因此，开展食源性致病菌的快速检测研究势在必行。
目前用于检测鉴定食源性致病菌的方法主要包括传统的分离鉴定检测方法，免疫学法及分子生物学检测方法。传统培养方法如平板划线法，由于操作繁琐、所需时间长、低灵敏度等原因，已经无法满足现代检测工作中对快速便捷检测的要求。酶联免疫法(ELISA)方法容易污染，检测灵敏度受抗原-抗体结合能力影响，且需要制备高效抗体。常用的聚合酶链式反应技术(PCR)，具有较好的灵敏性，但是PCR技术需要反复的变温加热，所需仪器复杂，对操作人员技术要求较高。随着现代食品卫生及检测速度的发展要求，对食源性致病菌的检测手段要求操作简便、灵敏快速、适应性强，显然上述方法已不能满足这些要求。
自纳米技术问世以来，因其具有制备简单、价格低廉、使用寿命长及对环境要求低等优点，通常可以结合不同生物技术，提高生物传感器的灵敏度，是影响最深远的重大科技进展之一。在食品监测以及人类环境生活等领域中显示了独特的优势并得到了广泛的应用。
2012年Ge等首次发现蛋白质与无机金属盐类可以自组装形成花状的有机无机杂化纳米结构，称为纳米花。研究发现与纳米花杂化的酶同游离酶相比，杂化纳米花在酶的活性与稳定性方面表现出更加稳定优越的性能，同时作者对其形成机理做了初步探究。杂化纳米花结构一经发现，便引起了研究人员的高度关注。目前纳米花已经成功运用于多种领域，如生物传感器、生物分析、生物医药、污水处理等，但其应用范围及对象有待进一步开拓创新。因此，开发新型纳米花，在生物监测应用等领域具有广阔的应用前景。
发明内容
为了解决传统食源性病原菌检测存在成本高且设计复杂的问题，本发明提供一种操作简单、成本低廉、实用性强的一种MnO2杂化纳米花及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种MnO2杂化纳米花，其组成成分为：MnO2、刀豆蛋白Con A、CuSO4和PBS。
本发明还提供了一种MnO2杂化纳米花的制备方法，包括以下步骤：
取1.5mL离心管，依次加入10～100μL、0.1～0.15mg/mL MnO2、0.01～0.1mg刀豆蛋白Con A悬浮于800～1500μL、10mM的PBS中，所述PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的PBS悬浮，4℃保存备用。
本发明还提供了一种含有上述MnO2杂化纳米花的具有催化H2O2产生气体的MnO2杂化纳米花传感器体系。
作为优选的实施方式，该MnO2杂化纳米花传感器体系包括：修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体、链霉亲和素SA标记的磁珠、MnO2杂化纳米花和H2O2，用于检测靶标食源性病原菌。
本发明还提供了一种采用上述的MnO2杂化纳米花传感器体系检测靶标食源性病原菌的方法，主要包括以下步骤：
步骤一、制备修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体；
步骤二、将修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体固定在标记链霉亲和素SA的磁珠上；
步骤三、加入待测样品，37℃恒温孵育2h进行磁性分离，用0.1～0.5mM的PBS清洗3次后吸干；
步骤四、加入MnO2杂化纳米花，在靶标食源性病原菌存在时，磁珠上的靶标抗体与MnO2杂化纳米花之间形成三明治夹心免疫复合物；
步骤五、加入产气底物H2O2，激发H2O2分解并产生气体，采用一次性医用注射器延长线作为气体信号输出平台，利用一次性医用注射器延长线内的染料标记物所行走的距离计算出靶标食源性病原菌的浓度，实现对靶标食源性病原菌的定量及定性检测。
作为优选的实施方式，步骤二的具体过程为：
将1～10μL标记链霉亲和素SA的磁珠原液置于离心管中，用0.1～0.5mM的PBS清洗3次后，加入5～15μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的靶标病原菌抗体，37℃孵育1～2h，然后用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
作为优选的实施方式，步骤四的具体过程为：
加入3～10μLMnO2杂化纳米花，37℃恒温孵育1h进行磁性分离，用0.1mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，使其悬浮于10μL磷酸盐缓冲液PBS中，得到三明治夹心免疫复合物。
作为优选的实施方式，所述链霉亲和素SA标记的磁珠粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL。
作为优选的实施方式，所述磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.4，其组成成分为：0.1mMNa2HPO4和0.1mM NaH2PO4。
作为优选的实施方式，步骤五中，加入H2O2的体积为1mL，反应时间为5min。
作为优选的实施方式，一次性医用注射器延长线内的染料标记物可以采用墨水、ABTS等带颜色的染料均可。
发明原理：如图1所示，本发明利用刀豆蛋白(Con A)和MnO2通过一步法合成MnO2杂化纳米花。Con A作为一种凝集素，具有识别细菌表面糖蛋白功能，可与靶标细菌细胞膜糖蛋白专一结合，利用这种特性，可成功识别分离食源性致病菌靶标。MnO2可催化H2O2产气，将其合成一种可识别致病菌特性的纳米聚合物：MnO2杂化纳米花，可以有效催化H2O2，且对外界条件敏感度低。利用本发明的MnO2杂化纳米花可以迅速的催化H2O2产生大量氧气，同时利用一次性医用注射器延长线作为气体信号输出平台，用于食源性致病菌大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌的灵敏检测，最低检测限分别可达2.46cfu/mL及7.62cfu/mL。
本发明的有益效果是：本发明结合MnO2杂化纳米花和MnO2杂化纳米花传感器技术来测定食源性致病菌：大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌，MnO2杂化纳米花具有催化H2O2作用，其具有以下优点：
(1)通过一步法合成MnO2杂化纳米花，操作简便，且催化效率高，与传统过氧化氢酶相比，具有更好的稳定性及实用性，抗外界干扰能力强，敏感度低。
(2)通过磁珠的分离作用，有效消除了复杂环境的干扰，可以成功运用于实际样品中大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌的检测，无需任何前期处理过程。
(3)用于食源性病菌大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌的检测方法具有较好的重现性及准确度，且特异性良好，可以实现在牛奶等样品中对大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌的检测。
(4)利用医学上常见的一次性注射器延长线作为信号读取平台，利用其标记物所行走的距离数据对靶标病原菌进行定量及定性，具有检测灵敏度高、成本低廉、无需电子设备辅助、重复利用率高、实用性强等优势，可实现快速低浓度食源性致病菌，符合现代食品卫生及检测领域的发展要求。
附图说明
图1为本发明的可视化检测原理图。
图2为本发明的MnO2杂化纳米花电镜图。其中，图2A和图2B均为扫描电镜(SEM)图，图2C为透射电镜(TEM)图。
图3为MnO2杂化纳米花催化反应效率分析图。其中，图3A为MnO2不同浓度H2O2催化效率的分析图。图3B为10mM的H2O2与不同浓度MnO2杂化纳米花的催化效应线性图。
图4为利用本发明的检测方法对大肠杆菌O157:H7进行检测的灵敏性分析结果图。其中，图4A为不同大肠杆菌O157:H7浓度(0cfu/mL至105cfu/mL)对产气底物的影响图，由左至右染料标记物所行走的距离逐渐增大。图4B为浓度10cfu/mL至105cfu/mL的大肠杆菌O157:H7对染料标记物所行走的距离变化的线性分析。
图5为利用本发明的检测方法对大肠杆菌O157:H7进行检测的特异性分析结果图。
图6为利用本发明的检测方法对沙门氏菌进行检测的灵敏性分析结果图。其中，图6A不同沙门氏菌浓度(0cfu/mL至105cfu/mL)对产气底物的影响图，由左至右染料标记物所行走的距离逐渐增大。图6B为浓度10cfu/mL至105cfu/mL的沙门氏菌对染料标记物所行走的距离变化的线性分析。
图7为利用本发明的检测方法对沙门氏菌进行检测的特异性分析结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本方明作进一步详细说明。下述实施例中，未进行详尽描述的试剂、方法均为常规试剂及方法。其中，所有使用的化学用品都是化学纯，所有的溶液都用超纯水配制。大肠杆菌抗体从英国的艾比康生物公司购买。刀豆蛋白Con A及硫酸铜从美国奥尔德里奇公司购买、MnO2购于北京德科岛津科技有限公司，H2O2从上海凌峰化学试剂公司购买。标记SA磁珠从美国赛默飞世尔科技公司购买。一次性医用注射器延长线购于浙江苏嘉医疗器械股份有限公司。
实施例1MnO2杂化纳米花的制备
取1.5mL离心管，依次加入10-100μL、0.1～0.15mg/mL MnO2、0.01-0.1mg刀豆蛋白Con A悬浮于800-1500μL、10mM的PBS中，所述PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的PBS悬浮，4℃保存备用。
实施例2MnO2杂化纳米花的电镜扫面分析
对实施例1中所获得的MnO2杂化纳米花进行电镜扫面分析，观察其微观形态表征，结果如图2(图2A和图2B)所示，从电镜图片可以清晰地看到MnO2杂化纳米花的大小约为5μm，形状大多为花状球形结构，由此可以证明本发明所制备的MnO2杂化纳米花成花形态明显。
实施例3MnO2杂化纳米花的催化效率分析
本方法灵敏度受到MnO2杂化纳米花的催化效率反应影响，因此，如图3A所示，测定了具有催化效率的MnO2杂化纳米花在分别不同H2O2(1-10mM)浓度的效率测定。在此基础上，对不同纳米花浓度进行进一步分析，并记录实时数据。如图3B所示。在MnO2杂化纳米花中，MnO2的浓度与H2O2线性相关，且最终压力值明显，因此，本发明的MnO2杂化纳米花具有优异的H2O2分解效率，并可成功地应用于生成气体分析。
实施例4制备标记修饰Biotin的大肠杆菌抗体的磁珠
将1-10μL链霉亲和素SA标记的磁珠原液置于离心管中，用0.1-0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次后，加入5-15μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的靶标病原菌抗体，37℃孵育1-2h，然后用0.1-0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于磷酸盐缓冲液PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
实施例5食源性致病菌-大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌的制备
利用LB培养基培养大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌。分别准确称取各成分：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g、蒸馏水50mL；在恒温摇床37℃、180转振摇过夜，超净台内分装菌液，最终分别置于4℃保存备用。
实施例6灵敏度分析
向待检液中加入1mL的H2O2，反应3min后，在MnO2杂化纳米花的作用下，催化H2O2产气，根据产气反应的强弱进行定量测定。
如图4所示，验证了本发明的检测方法测定大肠杆菌O157:H7灵敏度及线性定量分析范围特性。在最佳反应条件下，靶标大肠杆菌O157:H7的浓度在10～105cfu/mL范围内的线性方程为：Y＝4.089*X+0.8033(R2＝0.984)；其中，Y表示最终信号值即一次性医用注射器延长线内染料标记物所行走的距离，X表示大肠杆菌O157:H7浓度，单位为cfu/mL。该线性方程的线性范围是101到105cfu/mL之间，根据上述所测得的吸光值以及线性方程计算含有大肠杆菌O157:H7的待检液中大肠杆菌的浓度，最低检测限可达7.62cfu/mL。
如图6所示，验证了本发明的检测方法测定沙门氏菌灵敏度及线性定量分析范围特性。在最佳反应条件下，靶标沙门氏菌的浓度在10～105cfu/mL范围内的线性方程为：Y＝7.342*X+0.2561(R2＝0.996)；其中，Y表示最终信号值即一次性医用注射器延长线内染料标记物所行走的距离，X表示沙门氏菌浓度，单位为cfu/mL。该线性方程的线性范围是10到105cfu/mL之间，根据上述所测得的吸光值以及线性方程计算含有沙门氏菌的待检液中大肠杆菌的浓度，最低检测限可达2.47cfu/mL。
实施例7特异性试验
为了验证本发明的检测方法的特异性，如图5和图7所示，分别选择大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Sta)、李斯特菌(Lis)、沙门氏菌(Sal)以及PBS作为对照组进行分析，根据试验结果，在相同的试验条件下，只有靶标大肠杆菌及沙门氏菌可产生明显的气体信号，由此证明本发明的检测方法具有很好地选择性，不会与非靶标产生特异性反应。
实施例8牛奶样品中的大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌检测
运用本发明的检测方法对牛奶样品中的大肠杆菌O157:H7及沙门氏菌浓度(10～104cfu/mL)进行测定。具体检测过程如下：
将10倍浓度梯度稀释好的大肠杆菌及沙门氏菌混入纯牛奶中，进行检测，利用对应的线性方程中的Y值，即一次性医用注射器延长线内染料标记物所行走的距离，表示最终产生气体距离信号值进行计算得到靶标食源性病菌的浓度。
利用实施例6得到的线性方程进行测定并计算。结果如表1、2所示。通过回收率对本发明的检测方法准确性及精密度进行分析，大肠杆菌O157:H7在83.7到108.7.2％之间；沙门氏菌回收率在99.9到110.6％之间。
表1大肠杆菌O157:H7回收率测定
表2沙门氏菌回收率测定
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种MnO2杂化纳米花，其特征在于，其组成成分为：MnO2、刀豆蛋白ConA、CuSO4和磷酸盐缓冲液。
2.制备权利要求1所述的一种MnO2杂化纳米花的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取1.5mL离心管，依次加入10～100μL、0.1～0.15mg/mL MnO2、0.01～0.1mg刀豆蛋白ConA悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，所述磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的PBS悬浮，4℃保存备用。
3.一种含有权利要求1所述的MnO2杂化纳米花的具有催化H2O2产生气体的MnO2杂化纳米花传感器体系。
4.根据权利要求3所述的MnO2杂化纳米花传感器体系，其特征在于，该体系包括：修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体、链霉亲和素SA标记的磁珠、MnO2杂化纳米花和H2O2，用于检测靶标食源性病原菌。
5.采用权利要求3或4所述的MnO2杂化纳米花传感器体系检测靶标食源性病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体；
步骤二、将修饰生物素Biotin的食源性病原菌抗体固定在标记链霉亲和素SA的磁珠上；
步骤三、加入待测样品，37℃恒温孵育2h进行磁性分离，用0.1～0.5mM的PBS清洗3次后吸干；
步骤四、加入MnO2杂化纳米花，在靶标食源性病原菌存在时，磁珠上的靶标抗体与MnO2杂化纳米花之间形成三明治夹心免疫复合物；
步骤五、加入产气底物H2O2，激发H2O2分解并产生气体，采用一次性医用注射器延长线作为气体信号输出平台，利用一次性医用注射器延长线内的染料标记物所行走的距离计算出靶标食源性病原菌的浓度，实现对靶标食源性病原菌的定量及定性检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤二的具体过程为：
将1～10μL标记链霉亲和素SA的磁珠原液置于离心管中，用0.1～0.5mM的PBS清洗3次后，加入5～15μL、0.1mg/ml的修饰生物素Biotin的靶标病原菌抗体，37℃孵育1～2h，然后用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次，置于PBS中混合均匀，得到终产物，4℃保存备用。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤四的具体过程为：
加入3～10μLMnO2杂化纳米花，37℃恒温孵育1h进行磁性分离，用0.1mM PBS清洗3次，使其悬浮于10μLPBS中，得到三明治夹心免疫复合物。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素SA标记的磁珠粒径为2.8μm，浓度为10mg/mL。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PBS的pH为7.4，其组成成分为：0.1mMNa2HPO4和0.1mM NaH2PO4。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤五中，加入H2O2的体积为1mL，反应时间为5min。
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