CN111537584A - 一种亚甲基蓝-纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种亚甲基蓝‑纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用，涉及食源性致病菌快速检测领域。本发明的一种亚甲基蓝‑纳米花，其组成成分为：亚甲基蓝、抗菌肽、CuSO4和磷酸盐缓冲液PBS，制备过程为：取离心管，依次加入亚甲基蓝、抗菌肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，该磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。本发明简单、快速、易于操作、实验成本低、灵敏、特异性强，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食源性致病菌快速检测技术领域，具体涉及一种亚甲基蓝-纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用。
背景技术
由于食源性致病菌可以通过食物和饮用水等途径进行传播，对人类健康构成严重危险，每年全球都有数百万人因食源性致病菌引起的传染病而导致住院甚至死亡，造成了严重的经济损失。食源性致病菌已经成为威胁人类生命安全的重要因素，是全球人类死亡的主要原因之一。因此，在临床微生物学领域中建立一种快速、可靠和有效的食源性致病菌检测方法显得至关重要。
目前，用于鉴定食源性致病菌的标准培养和菌落计数方法需要几天才能准确检测，耗时时间长；另外，已经研发了几种基于核酸扩增(例如PCR)或免疫学反应(例如ELISA)的传统检测方法，然而，这些方法都具有一定的缺点，例如耗时且劳动强度大，并且其应用仍然受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种亚甲基蓝-纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用，以解决现有食源性致病菌检测方法存在的上述诸多问题。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种亚甲基蓝-纳米花，其组成成分为：亚甲基蓝、抗菌肽、CuSO4和磷酸盐缓冲液PBS。
本发明的一种亚甲基蓝-纳米花的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取离心管，依次加入亚甲基蓝、抗菌肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，该磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
作为优选的实施该方式，所述亚甲基蓝的体积为10～100μL、浓度为10μM，所述抗菌肽的体积为0.01～0.1mL。
本发明的一种采用亚甲基蓝-纳米花构建的电化学适配体生物传感器体系，该体系包括：亚甲基蓝-纳米花和修饰巯基的靶标适配体AP。
本发明的采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：
步骤一、将修饰巯基的靶标适配体AP于90℃条件下处理5min，冷却至4℃，保持15min后常温放置8min，以折叠形成功能结构；
步骤二、将步骤一所得适配体溶液与Au电极共同孵育并成功连接；
步骤三、将得到的适配体修饰电极浸入到不同浓度的待测样品中，37℃恒温孵育2h进行清洗，用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次；
步骤四、将亚甲基蓝-纳米花滴加到步骤三经孵育后的电极上，经孵育后采用差分脉冲伏安法对食源性致病菌进行定量检测。
作为优选的实施该方式，在步骤二、步骤三、步骤四之后，均采用超纯水洗涤电极表面3次。
作为优选的实施该方式，步骤二的具体过程如下：
(1)Au电极预处理
将Au电极在麂皮垫上用氧化铝浆料抛光，再用食人鱼溶液处理后用超纯水洗涤，再用无水乙醇和超纯水依次超声处理，然后在0.5M的H2SO4溶液中对Au电极进行循环电位扫描，直到获得Au氧化还原峰，最后用超纯水洗涤Au电极后用氮气干燥；
(2)将修饰巯基的靶标适配体AP与TCEP在室温下孵育以减少交联的二硫键；
(3)电极修饰
将修饰巯基的靶标适配体AP滴加在预处理后的Au电极上，经孵育后获得适配体修饰后的电极。
作为优选的实施该方式，步骤(2)中，所述修饰巯基的靶标适配体AP的核酸序列为：
5’-ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGATTTTTTTTT-(SH-C6)-3’。
作为优选的实施该方式，在步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)之后，均采用超纯水洗涤Au电极表面3次。
发明原理：如图1所示，本发明利用抗菌肽(Magainin I)和亚甲基蓝(MB)通过一步法反应合成稳定的亚甲基蓝-纳米花。抗菌肽Magainin I作为一种多肽，具有识别细菌表面膜蛋白功能，利用这种特性，可成功识别分离食源性致病菌靶标；亚甲基蓝MB可作为电催化信号标签，将其合成一种可识别食源性致病菌特性的纳米聚合物，以放大信号。本发明的一种亚甲基蓝-纳米花对外界条件敏感度较低，利用该亚甲基蓝-纳米花构建的电化学适配体生物传感器体系，作为电化学传感器平台，可以产生稳定的电化学信号。
本发明中，修饰巯基的靶标适配体AP通过Au-S键固定在Au电极上，适配体可特异性抓取靶标并稳定覆盖在Au电极表面。适配体AP是一种单链寡核苷酸序列，通过形成独特的二级结构和三级结构，对靶标分子产生高亲和力和特异性。与传统抗体相比，适配体AP具有稳定性好、体积小、无免疫原性和易于化学修饰的优点，可潜在地用于确定食源性致病菌，当引入靶标大肠杆菌O157:H7后，适配体AP发生构象变化以特异性结合到大肠杆菌O157:H7的细胞膜蛋白表面，以紧紧的抓住靶标。此时，亚甲基蓝-纳米花可与靶标大肠杆菌结合，以捕获在Au电极的表面，亚甲基蓝-纳米花特异性结合靶标食源性病原菌，在Au电极上形成三明治夹心结构，从而发挥亚甲基蓝信号标签的功能，在电解液的作用下产生电流信号，即可用于食源性致病菌的定量检测。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过一步法合成亚甲基蓝-纳米花，操作简便，且催化效率高，稳定性及实用性好，抗外界条件能力强。
2、本发明通过一步法合成的亚甲基蓝-纳米花对外界条件敏感度低，利用该亚甲基蓝-纳米花构建的电化学适配体生物传感器体系，作为电化学传感器平台，可以产生稳定的电化学信号。
3、本发明所获得的亚甲基蓝-纳米花结构具有高的比表面积，可增强离子渗透到电极中并加速电化学转移动力学效益，以满足高灵敏分析的要求。
4、本发明采用基于电化学传感器亚甲基蓝-纳米花技术来测定食源性致病菌，同时利用电化学信号作为读取方式对食源性致病菌进行定量检测，具有检测灵敏度高、实用性强等优点，可实现快速低浓度食源性致病菌的检测。
5、本发明的检测策略将生物大分子检测转变为电子水平检测，而无需复杂的检测程序，例如靶标细菌的核酸提取，具有简单、快速、易于操作、实验成本低、灵敏、特异性强等优点。
6、本发明的电化学适配体生物传感器体系可以扩展到各种食源性病原菌的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的电化学结合亚甲基蓝-纳米花对食源性病原菌可视化检测原理图。
图2为本发明的亚甲基蓝-纳米花外貌及性质图。其中，图2a为1μm的SEM图，图2b为100nm的SEM图，图2c为XRD分析图，图2d为电化学适配体传感界面表征的DPV图，图2e为电化学适配体传感器表征的CV图。
图3为本发明的检测方法对大肠杆菌O157:H7灵敏性分析结果图。其中，图3A为DPV检测不同浓度大肠杆菌O157:H7(0～108cfu/mL)下的电流强度关系图。图3B为大肠杆菌O157:H7浓度(102～107cfu/mL)对氢气探测仪读数的线性分析。
图4为本发明的检测方法对大肠杆菌O157:H7的特异性分析结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中，未进行详尽描述的试剂、方法均为常规试剂及方法。其中，所有使用的化学用品都是化学纯，所有的溶液都用超纯水配制。所用适配体(修饰巯基的靶标适配体AP)及抗菌肽(Magainin I)由生工生物工程上海股份有限公司合成，均为采购的现有产品，硫酸铜从美国奥尔德里奇公司购买。
实施例1亚甲基蓝-纳米花的制备
取1.5mL离心管，依次加入50μL、10μM的亚甲基蓝，0.055mL的抗菌肽悬浮于1150μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS(含有20μL、120mM的CuSO4)中，经震荡混匀、常温静置孵育18h后，10000rpm离心4min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
实施例2亚甲基蓝-纳米花的制备
取1.5mL离心管，依次加入10μL、10μM的亚甲基蓝，0.01mL的抗菌肽悬浮于800μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS(含有20μL、120mM的CuSO4)中，经震荡混匀、常温静置孵育12h后，10000rpm离心3min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
实施例3亚甲基蓝-纳米花的制备
取1.5mL离心管，依次加入100μL、10μM的亚甲基蓝，0.1mL的抗菌肽悬浮于1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS(含有20μL、120mM的CuSO4)中，经震荡混匀、常温静置孵育24h后，10000rpm离心5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
实施例4亚甲基蓝-纳米花的性质分析
对实施例1-3中所获得的亚甲基蓝-纳米花进行电镜扫面分析，观察其微观形态表征，结果如图2a和图2b所示，从电镜图片可以清晰地看到，亚甲基蓝-纳米花的大小约为2.5μm，形状大多为花状球形结构，由此可以证明本发明所制备的亚甲基蓝-纳米花成花形态明显，该亚甲基蓝-纳米花结构中具有大量的亚甲基蓝，具有电化学效应。对其进行X射线衍射XRD分析，如图2c所示，可证明本发明所制备的亚甲基蓝-纳米花是基于磷酸铜骨架建立的纳米结构。
采用差分脉冲伏安法(DPV)测试结果如图2d所示，分析实验可行性，证明本方法可行性明显。采用循环伏安法(CV)测试结果如图2e所示，分析实验可行性，证明本方法可行性明显。
其中，测试时采用传统的三电极系统，其中以Au电极作为工作电极，以铂丝作为辅助电极，以Ag/AgCl电极作为参比电极。CV和DPV测量的电解液为含有5mM[Fe(CN)6]3-/4-的PBS(10mM，pH 7.0)。CV测量的电位范围为-0.2～0.6V，扫描速率为50mV/s。EIS测量的频率范围为0.05～100kHz，幅度为5mV。
实施例5食源性致病菌-大肠杆菌O157:H7的制备
利用LB培养基培养大肠杆菌O157:H7：分别准确称取各成分：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g、蒸馏水50mL；在恒温摇床37℃、180转振摇过夜，超净台内分装菌液，最终分别置于4℃保存备用。
实施例6食源性致病菌-大肠杆菌O157:H7的检测
(1)将修饰巯基的靶标适配体AP于90℃条件下冰浴处理5min，冷却至4℃，保持15min后常温放置8min，以折叠形成功能结构；采用超纯水洗涤Au电极表面3次，以去除未结合的物质。
修饰巯基的靶标适配体AP的核酸序列为：
5’-ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGATTTTTTTTT-(SH-C6)-3’。
(2)将步骤(1)所得适配体溶液与Au电极共同孵育并成功连接，具体过程如下：
1)Au电极预处理
在修饰电极之前，将Au电极在麂皮垫上用氧化铝浆料抛光，以获得光滑的表面；再用食人鱼溶液(由H2SO4和H2O2组成，H2SO4和H2O2的体积比为3:1)处理后，并用超纯水彻底洗涤以去除其表面上的有机物，再用无水乙醇和超纯水依次超声处理以除去杂质，然后在0.5M的H2SO4溶液中对Au电极进行循环电位扫描，直到获得典型的稳定的Au氧化还原峰，最后用超纯水洗涤Au电极后用高纯度氮气干燥；采用超纯水洗涤Au电极表面3次，以去除未结合的物质。
2)将修饰巯基的靶标适配体AP与TCEP在室温下孵育以减少交联的二硫键；采用超纯水洗涤Au电极表面3次，以去除未结合的物质。
3)电极修饰
为了制造电化学传感界面，将修饰巯基的靶标适配体AP滴加在预处理后的Au电极上，经孵育后获得适配体修饰后的电极，采用超纯水洗涤Au电极表面3次，以去除未结合的物质。
(3)将得到的适配体修饰电极浸入到不同浓度的待测样品中，37℃恒温孵育2h进行清洗，用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次；采用超纯水洗涤Au电极表面3次，以去除未结合的物质。
(4)将亚甲基蓝-纳米花滴加到步骤(3)经孵育后的电极上孵育0.5-1h，经孵育后采用差分脉冲伏安法(DPV)对食源性致病菌进行定量检测。
实施例7灵敏度分析
DPV测量在含有8mM的H2O2的PBS(10mM，pH 7.0)中进行，振幅和脉冲周期分别为50mV和0.5s，根据食源性致病菌在不同浓度下的电流值得到DPV工作曲线，对待测样品中食源性致病菌进行定量检测。
如图3所示，验证了本发明的检测方法测定大肠杆菌O157:H7灵敏度及线性定量分析范围特性。在最佳反应条件下，靶标大肠杆菌O157:H7的浓度在102～107cfu/mL范围内的线性方程为：Y＝-0.04965×X+0.04137(R2＝0.9932)；其中，Y表示产生的电流信号值，X表示大肠杆菌O157:H7浓度，单位为cfu/mL。该线性方程的线性范围是102到107cfu/mL之间，根据上述所测得的读数可知最低检测限可达32cfu/mL。
实施例8特异性试验
为了验证本发明的检测方法的特异性，如图4所示，分别选择大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Sta)、李斯特菌(Lis)、沙门氏菌(Sal)以及缓冲液PBS作为对照组进行显色分析，根据试验结果，在相同的试验条件下，只有靶标大肠杆菌可产生明显的气体信号，由此证明本发明的检测方法具有很好地选择性，不会与非靶标产生特异性反应。
实施例9牛奶样品中大肠杆菌O157:H7的检测
运用本发明的检测方法对牛奶样品中的大肠杆菌O157:H7浓度(103～105cfu/mL)进行测定。检测结果如表1所示，本发明的检测方法的回收率从85.8±2.8％到126.3±27.2％。结果表明，本发明的电化学适配体生物传感器体系可为初步的实际应用提供可行和可靠的食源性致病菌测量。
表1大肠杆菌O157:H7回收率测定
本发明公开了一种亚甲基蓝-纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 一种亚甲基蓝-纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 81
<212> DNA
<213> 修饰巯基的靶标适配体AP的核酸序列(Primer sequences)
<400> 1
atacgggagc caacaccata atatgccgta aggagaggcc tgttgggagc gccgtagagc 60
aggtgtgacg gatttttttt t 81
Claims (9)
1.一种亚甲基蓝-纳米花，其特征在于，其组成成分为：亚甲基蓝、抗菌肽、CuSO4和磷酸盐缓冲液PBS。
2.制备权利要求1所述的一种亚甲基蓝-纳米花的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取离心管，依次加入亚甲基蓝、抗菌肽悬浮于800～1500μL、10mM的磷酸盐缓冲液PBS中，该磷酸盐缓冲液PBS中含有20μL、120mM的CuSO4，经震荡混匀、常温静置孵育12～24h后，10000rpm离心3～5min，弃上清后加入100μL、0.1mM的磷酸盐缓冲液PBS悬浮，4℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的一种亚甲基蓝-纳米花的制备方法，其特征在于，所述亚甲基蓝的体积为10～100μL、浓度为10μM，所述抗菌肽的体积为0.01～0.1mL。
4.采用权利要求1所述的一种亚甲基蓝-纳米花构建的电化学适配体生物传感器体系，其特征在于，包括：亚甲基蓝-纳米花和修饰巯基的靶标适配体AP。
5.采用权利要求4所述的电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将修饰巯基的靶标适配体AP于90℃条件下处理5min，冷却至4℃，保持15min后常温放置8min，以折叠形成功能结构；
步骤二、将步骤一所得适配体溶液与Au电极共同孵育并成功连接；
步骤三、将得到的适配体修饰电极浸入到不同浓度的待测样品中，37℃恒温孵育2h进行清洗，用0.1～0.5mM磷酸盐缓冲液PBS清洗3次；
步骤四、将亚甲基蓝-纳米花滴加到步骤三经孵育后的电极上，经孵育后采用差分脉冲伏安法对食源性致病菌进行定量检测。
6.根据权利要求5所述的采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法，其特征在于，在步骤二、步骤三、步骤四之后，均采用超纯水洗涤电极表面3次。
7.根据权利要求5所述的采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤二的具体过程如下：
(1)Au电极预处理
将Au电极在麂皮垫上用氧化铝浆料抛光，再用食人鱼溶液处理后用超纯水洗涤，再用无水乙醇和超纯水依次超声处理，然后在0.5M的H2SO4溶液中对Au电极进行循环电位扫描，直到获得Au氧化还原峰，最后用超纯水洗涤Au电极后用氮气干燥；
(2)将修饰巯基的靶标适配体AP与TCEP在室温下孵育以减少交联的二硫键；
(3)电极修饰
将修饰巯基的靶标适配体AP滴加在预处理后的Au电极上，经孵育后获得适配体修饰后的电极。
8.根据权利要求7所述的采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述修饰巯基的靶标适配体AP的核酸序列为：
5’-ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGATTTTTTTTT-(SH-C6)-3’。
9.根据权利要求7所述的采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法，其特征在于，在步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)之后，均采用超纯水洗涤Au电极表面3次。
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