CN109060917B - 一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109060917B
CN109060917B CN201810927473.4A CN201810927473A CN109060917B CN 109060917 B CN109060917 B CN 109060917B CN 201810927473 A CN201810927473 A CN 201810927473A CN 109060917 B CN109060917 B CN 109060917B
Authority
CN
China
Prior art keywords
escherichia coli
enteropathogenic escherichia
solution
sensor
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810927473.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109060917A (zh
Inventor
王海霞
赵堉文
李正
贾广成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN201810927473.4A priority Critical patent/CN109060917B/zh
Publication of CN109060917A publication Critical patent/CN109060917A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109060917B publication Critical patent/CN109060917B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器，包括通过S‑Au键连接于金电极表面的捕获探针，以及与捕获探针杂交形成双链的信号探针；本发明还提供了所述传感器的制备方法以及其应用。采用本发明实施例提供的核酸适配体电化学传感器，可以用于肠致病性大肠杆菌的检测，采用该传感器检测肠致病性大肠杆菌，与现有检测方法相比，用时较少且操作更加便捷。

Description

一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及电化学传感器技术领域，特别是涉及一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体的电化学传感器、以及其制备方法和应用。
背景技术
肠致病性大肠杆菌是众多病原微生物中存在最为广泛且危险系数高的细菌之一，对人和动物均有病原性，可引起腹痛、腹泻、炎症、溃疡等病症，严重者还会引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合征等，对于婴幼儿尤其危险。所以，对肠致病性大肠杆菌的定量检测一直是环境卫生学领域中重要的任务。目前，肠致病性大肠杆菌的检测方法主要有三大类：传统的培养计数法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法。
传统培养检测方法被视为肠致病性大肠杆菌检测的金标准，它是将细菌经过分离培养后，在特定的培养基中观察细菌的菌落形态、颜色变化和生化反应。这种方法检测成本低，操作相对简单，但该方法检测耗时需72-120h，限制了该方法的广泛应用。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是典型的分子生物学检测方法，此方法相对于传统方法来说，检测时间大大缩短，一般只需5-24h即可完成。它的特点是能将微量的DNA进行大幅扩增，然后将扩增的DNA进行杂交检测。这种方法灵敏度较高，但需要专业的技术人员操作，且极易产生假阳性结果，也在一定程度上限制了它的应用。免疫学检测方法中最常用的是酶联免疫吸附技术(ELISA，enzyme linked immunosorbent assay)，这种方法是用酶作为标记物，以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。这种方法使用简单、快速，但检测限较高，在含低浓度细菌样品检测中应用受限，且抗体的免疫原性、基体耐药性和不稳定性等缺点极大的限制了该方法的应用和发展。
电化学方法由于其灵敏度高、费用低廉、操作简单易行，在分析检测领域应用很广。但是传统的裸电极带来的电沉积现象和高的过电位是分析工作者尽量避免的，修饰电极的方法可以提高分析测定的灵敏度，从而扩大电化学检测的应用范围和提升应用效果。适配体是一类经过指数富集配体系统进化技术，从体外筛选得到的能与蛋白和其他小分子发生特异性结合的单链寡聚核苷酸。适配体具有易合成、易修饰、高稳定性、高亲和性和高特异性等优点，已经作为电极修饰材料在分析测试中获得了比较好的应用效果。目前，运用适配体电化学传感器对肠致病性大肠杆菌进行分析检测的文献还比较少。丁世家教授课题组选用能与肠致病性大肠杆菌细胞壁上脂多糖发生高选择性结合的L9F核酸适配体，制备得到电流型-电化学传感器，对肠致病性大肠杆菌进行快速检测，取得了较好的应用效果。但是该方法中电化学传感器的制备过程比较繁琐，还需要进一步简化。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种用于检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器，以实现肠致病性大肠杆菌的快速检测；本发明还提供了所述检测器的制备方法和应用。具体技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器，包括通过S-Au键连接于金电极表面的捕获探针，以及与捕获探针杂交形成双链的信号探针；
所述捕获探针为巯基修饰的核酸适配体：SH-(Xm)n-CAG ATG CAC GAC TTC GAGTCT TAG GGC ACA CGA TGG CAG T；
所述信号探针为生物素修饰的核酸适配体：Biotin-CAG CTC AGA AGC TTG ATCCTA CCA GTA GAC TTT CAA CTT TAC TGC CAT CGT GTG CCC TAA GAC TCG AAG TCG TGCATC TG；
其中，n＝0或1；X代表-CH2-或A、T、C、G，当X为-CH2-时，m＝6；当X 为A、T、C或G时，m＝4～10。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1：对金电极预处理，去除金电极表面杂质；
S2：将预处理后的金电极与所述捕获探针的水溶液反应，得到表面通过 S-Au键固定有捕获探针的金电极；
S3：表面连有捕获探针的金电极经清洗液清洗后，置于封闭液中，以封闭未结合捕获探针的金电极表面；
S4：封闭后的金电极经清洗液清洗后，与所述信号探针的水溶液反应，使信号探针结合于捕获探针上，得到传感器。
在本发明第二方面的一些实施方式中，金电极的预处理包括：
1)先后用0.3mm和0.05mm铝粉抛光金电极表面；
2)依次用超纯水、食人鱼溶液、超纯水分别超声清洗5分钟；
3)在1mol/L的硫酸中进行循环伏安法电化学扫描，直到出现稳定的峰形。
在本发明第二方面的一些实施方式中，S2中捕获探针水溶液的浓度为 2μmol/L，反应条件为4℃过夜。
在本发明第二方面的一些实施方式中，S3、S4中的清洗液成分包含： Tris-HCl20mmol/L、NaCl 0.1mol/L、KCl 0.1mol/L、MgCl2 5.0mmol/L及吐温-20 0.005％v/v；所述清洗液的pH为7-8。
在本发明第二方面的一些实施方式中，S3中的封闭液为2mmol/L巯基己醇水溶液；封闭条件为：37℃静置反应(0.8-1.2)小时。
在本发明第二方面的一些实施方式中，S4中信号探针水溶液的浓度为(3-5) μmol/L，反应条件为37℃反应1小时。
在本发明第二方面的一些实施方式中，在步骤S4，将封闭后的金电极用清洗液清洗之前，还包括：
先后采用鲑鱼精DNA溶液和牛血清白蛋白溶液淋洗金电极，以封闭金电极表面的非特异性位点。
本发明第三方面提供了一种采用本发明第一方面所述的核酸适配体电化学传感器检测肠致病性大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
a1：将所述传感器分别浸泡在含有已知浓度为C1-Cn的肠致病性大肠杆菌的 PBS溶液中反应；使信号探针与肠致病性大肠杆菌结合；
a2:清洗液清洗反应后的传感器，并将清洗后的传感器分别与链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液反应；
a3:将连接有链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶的传感器用PBST溶液冲洗后，分别浸泡于1-萘基磷酸盐-二乙醇胺水溶液中，并运用电化学工作站进行差分脉冲伏安法测量，记录峰电流值；
a4:以峰电流值为纵坐标或横坐标，以肠致病性大肠杆菌浓度C1-Cn的对数值为横坐标或纵坐标建立标准曲线，得到肠致病性大肠杆菌浓度对数值与峰电流值间的线性方程；
a5:以待测样品溶液代替肠致病性大肠杆菌PBS溶液，执行a1，a2，a3，获得峰电流值，根据a4中的线性方程确定待测样品溶液中肠致病性大肠杆菌的浓度。
在本发明第三方面的一些实施方式中，所述链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液的浓度为(0.1-1.0)mg/mL；所述1-萘基磷酸盐-二乙醇胺水溶液中 1-萘基磷酸盐的浓度为(0.2-2.0)mg/mL，二乙醇胺的体积分数为2.5％。
本发明实施例提供的一种核酸适配体电化学传感器，可以用于肠致病性大肠杆菌的检测，采用该传感器检测大肠杆菌，与现有检测方法相比，用时较少且操作更加便捷。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明检测原理示意图；
图2为传感器不同制备阶段的电化学阻抗图，其中a为裸金电极，b为捕获探针修饰的金电极，c为传感器，d为与肠致病性大肠杆菌孵育后的传感器；
图3为不同浓度肠致病性大肠杆菌孵育后的传感器电流信号图，图中a-f 所代表的肠致病性大肠杆菌的浓度依次为5.0×102CFU/mL、5.0×103CFU/mL、 5.0×104CFU/mL、5.0×105CFU/mL、5.0×106CFU/mL、5.0×107CFU/mL；
图4为肠致病性大肠杆菌浓度与传感器电流信号的线性关系图。
具体实施方式
本发明第一方面提供了一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器，包括通过S-Au键连接于金电极表面的捕获探针，以及与捕获探针杂交形成双链的信号探针；
所述捕获探针为巯基修饰的核酸适配体：SH-(Xm)n-CAG ATG CAC GAC TTC GAGTCT TAG GGC ACA CGA TGG CAG T；
所述信号探针为生物素修饰的核酸适配体：Biotin-CAG CTC AGA AGC TTG ATCCTA CCA GTA GAC TTT CAA CTT TAC TGC CAT CGT GTG CCC TAA GAC TCG AAG TCG TGCATC TG；
其中，n＝0或1；X代表-CH2-或A、T、C、G；当X为-CH2-时，m＝6；当X 为A、T、C或G时，m＝4～10，优选为m＝8。本发明所述A、T、G、C分别代表不同的脱氧核糖核苷酸，所述Xm代表A、T、C或G的重复序列，此为本领域公知常识，在此不做赘述。
本发明所述的传感器中的信号探针具有一段能够特异性识别肠致病性大肠杆菌的碱基序列，能够与肠致病性大肠杆菌结合；所述信号探针的其3’-端具有一段与捕获探针互补的碱基序列，能够与所述捕获探针结合；发明人在研究中意外地发现，采用本发明所述的捕获探针与所述信号探针配对，当信号探针与肠致病性大肠杆菌识别并结合后会与捕获探针发生解链作用，进而与金电极分离。基于此，通过检测金电极上剩余的信号探针的量，可以间接反映出肠致病性大肠杆菌的量。
本发明所述的捕获探针中的核酸适配体的5’-末端可以直接或优选地通过连接元件【-(Xm)n-】与巯基(-SH)相连；示例性地，在本发明第一方面的一些实施方式中，所述捕获探针可以为SH-CAG ATG CAC GAC TTC GAG TCT TAG GGC ACA CGA TGG CAG T，在本发明第一方面的另一些实施方式中，所述捕获探针可以为SH-(CH2)6-CAG ATG CAC GAC TTC GAGTCT TAG GGC ACA CGA TGG CAG T；在本发明第一方面的另一些实施方式中，所述捕获探针还可以为SH-TTTTTTTT-CAG ATG CAC GAC TTC GAG TCT TAG GGC ACA CGA TGG CAG T或SH-GGGGGGGG-CAG ATG CAC GAC TTC GAG TCT TAG GGC ACA CGA TGG CAG T。所述捕获探针中使用连接元件的目的是使捕获探针中的核酸适配体与金电极表面保持适当的距离，从而使捕获探针中的核酸适配体保持伸展的状态；在此状态下，信号探针能够更充分地与捕获探针结合，以保证制备的传感器上信号探针的量更稳定。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1：对金电极预处理，去除金电极表面杂质；
S2：将预处理后的金电极与所述捕获探针的水溶液反应，得到表面通过 S-Au键固定有捕获探针的金电极；
S3：表面连有捕获探针的金电极经清洗液清洗后，置于封闭液中，以封闭未结合捕获探针的金电极表面；
S4：封闭后的金电极经清洗液清洗后，与所述信号探针的水溶液反应，使信号探针结合于捕获探针上，得到传感器。
本发明的方法制备的传感器可于4℃下保存72小时。
在本发明第二方面的一些实施方式中，金电极的预处理包括：
1)先后用0.3mm和0.05mm铝粉抛光金电极表面；
2)依次用超纯水、食人鱼溶液、超纯水分别超声清洗5分钟；
3)在1mol/L的硫酸中进行循环伏安法电化学扫描，直到出现稳定的峰形。
本发明所述超纯水指电阻率大于18.2MΩ·cm的水，本发明中所用的水均为灭菌超纯水。
本发明所述的食人鱼溶液为浓硫酸和质量分数为30％的H2O2水溶液的混合物，所述浓硫酸和H2O2水溶液的体积比为3:1；此为本领域常用试剂，本领域技术人员也可根据实际需要调整所述浓硫酸和H2O2水溶液的比例，本发明在此不做限定。
本发明中，所用捕获探针相对于金电极是过量的，以保证金电极表面能够与捕获探针充分反应。在本发明第二方面的一些实施方式中，S2中捕获探针水溶液的浓度为2μmol/L，发明人在研究中发现，在此浓度下，既可以保证捕获探针过量，又不至于由于捕获探针使用量过多而造成大量浪费。将捕获探针水溶液覆盖金电极的表面，4℃反应过夜，使捕获探针与金电极表面充分反应，形成S-Au键，以连接于金电极表面。
采用清洗液将未与金电极表面形成S-Au键的捕获探针洗掉，并采用封闭液封闭未形成S-Au键的金电极表面；在本发明第二方面的一些实施方式中，S3 中的封闭液为2mmol/L巯基己醇水溶液；封闭条件为：37℃静置反应(0.8-1.2) 小时。
在本发明第二方面的一些实施方式中，封闭后的金电极采用清洗液清洗过量的封闭液，随后将连接有捕获探针的金电极表面与过量的信号探针反应，使信号探针与捕获探针结合。在本发明第二方面的一些实施方式中，S4中信号探针水溶液的浓度为(3-5)μmol/L，反应条件为37℃反应1小时。
在本发明第二方面的另一些实施方式中，在步骤S4，将封闭后的金电极用清洗液清洗之前，还包括：
先后采用鲑鱼精DNA溶液和牛血清白蛋白溶液淋洗金电极，以封闭金电极表面的非特异性位点。
所述鲑鱼精DNA溶液可以为摩尔浓度为0.1mg/mL的水溶液，所述牛血清白蛋白溶液可选用质量体积比为1％的牛血清白蛋白水溶液。
在本发明第二方面的一些实施方式中，S3、S4、S5中的清洗液成分包含： Tris-HCl20mmol/L、NaCl 0.1mol/L、KCl 0.1mol/L、MgCl2 5.0mmol/L及吐温-20 0.005％v/v；所述清洗液的pH为7-8。本发明所述清洗液为本领域常用的清洗液，所述清洗液需要具备一定的离子强度和pH，所述离子通常包括Na+、K+和/或 Mg2+等生物体内的常见的一价、二价离子，本领域技术人员也可在此基础上调整所述清洗液的成分，本发明在此不做限定。
本发明第三方面提供了一种采用本发明第一方面所述的核酸适配体电化学传感器检测肠致病性大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
a1：将所述传感器分别浸泡在含有已知浓度为C1-Cn的肠致病性大肠杆菌的 PBS溶液中反应；使信号探针与肠致病性大肠杆菌结合；
a2:清洗液清洗反应后的传感器，并将清洗后的传感器分别与链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液反应；
a3:将连接有链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶的传感器用PBST溶液冲洗后，分别浸泡于1-萘基磷酸盐-二乙醇胺水溶液中，并运用电化学工作站进行差分脉冲伏安法测量，记录峰电流值；
a4:以峰电流值为纵坐标或横坐标，以肠致病性大肠杆菌浓度C1-Cn的对数值为横坐标或纵坐标建立标准曲线，得到肠致病性大肠杆菌浓度对数值与峰电流值间的线性方程；
a5:以待测样品溶液代替肠致病性大肠杆菌PBS溶液，执行a1，a2，a3，获得峰电流值，根据a4中的线性方程确定待测样品溶液中肠致病性大肠杆菌的浓度。
在本发明第三方面的一些实施方式中，a1中所述传感器分别浸泡在含有已知浓度为C1-Cn的肠致病性大肠杆菌的PBS溶液中，37℃，反应0.5-3.5小时。
在本发明第三方面的一些实施方式中，a2中所述链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液的浓度为(0.1-1.0)mg/mL，反应条件为37℃，反应时间30分钟。发明人在研究中发现，采用所述浓度的链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶溶液，可以使电信号达到最大，有利于提高检测结果的灵敏度。
在本发明第三方面的一些实施方式中，a3中所述1-萘基磷酸盐-二乙醇胺水溶液中1-萘基磷酸盐的浓度为(0.2-2.0)mg/mL，二乙醇胺的体积分数为2.5％。
本发明所述试剂均可购自商业途径。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
检测原理
如图1所示，金电极表面连有捕获探针，所述捕获探针与信号探针一端互补形成双链；当传感器与肠致病性大肠杆菌接触时，信号探针能够特异性结合肠致病性大肠杆菌，并与捕获探针解链；余下的未与肠致病性大肠杆菌结合的信号探针仍然通过捕获探针连接于金电极上；通过与链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶反应，并在1-萘基磷酸盐-二乙醇胺水溶液中检测金电极上信号探针产生的电信号的强度，反映肠致病性大肠杆菌溶液的浓度。
传感器的制备实施例
本发明实施例中所用的捕获探针和适配体探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；巯基己醇(MCH)，购自天津希恩思生化科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；鲑鱼精DNA 购自北京索莱宝科技有限公司；金电极(型号CHI101)，购自上海辰华仪器有限公司；肠致病性大肠杆菌(编号CICC 21531)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
(1)先后用0.3mm和0.05mm铝粉抛光金电极后，依次用超纯水、食人鱼溶液(浓硫酸和30％的H2O2水溶液体积比为3:1)、超纯水分别超声清洗5分钟后，再在1mol/L的硫酸中进行循环伏安法电化学扫描(CHI660E电化学工作站，上海辰华仪器有限公司)，检测参数为：Init E(V)＝0，High E(V)＝1.5，Low E(V) ＝0，Scan Rate(V/S)＝0.1，Segment＝12，Sensitivity(A/V)＝1e-5；直到出现稳定的峰形；
(2)将预处理后的金电极清洗干燥后，向其表面滴加10μL，2μmol/L的捕获探针SH-(CH2)6-CAG ATG CAC GAC TTC GAG TCT TAG GGC ACA CGA TGG CAG T的水溶液，于4℃过夜；
(3)用清洗液清洗步骤(2)中反应后的金电极，并将其浸没于2mmol/L的巯基己醇水溶液中，37℃下静置反应1小时；
(4)取出金电极，依次用质量浓度为0.1mg/mL的鲑鱼精DNA溶液和质量体积比为1％的牛血清白蛋白溶液润洗15分钟后，用清洗液将金电极冲洗干净，并于室温下自然晾干；
(5)向晾干后的金电极表面上滴加10μL，3μmol/L的信号探针水溶液，于 37℃下反应1小时，得到传感器。
实施例2
按照实施例1的方法制备传感器，与实施例1的不同之处在于：步骤(2) 中的捕获探针为SH-TTTTTTTT-CAG ATG CAC GAC TTC GAG TCT TAG GGC ACA CGA TGG CAG T。
实施例3
按照实施例1的方法制备传感器，与实施例1的不同之处在于：步骤(4) 中，取出金电极后，直接用清洗液将金电极冲洗干净，并于室温下自然晾干。
传感器制备过程的表征
为了验证传感器的制备及检测情况，配制含1×10-3mol/L铁氰化钾、 1×10-3mol/L亚铁氰化钾、0.1mol/L氯化钾的溶液，在该溶液中检测金电极制备过程中的阻值，其电化学阻抗谱如图2所示。裸金电极(a)阻抗呈现出一条直线，这是因为裸金电极上电子可以进行自由的转移，阻值低。当捕获探针连接到金电极上后，由于单链核苷酸阻碍了电子在电极和Fe(CN)6 3-/4-溶液中的转移，导致了电极阻值的增大(b)。当信号探针与捕获探针杂交形成双链DNA结构后，金电极上带有负电荷的磷酸盐骨架进一步增多，进而导致电极阻值进一步增加(c)。当传感器接触肠致病性大肠杆菌后，一部分信号探针与大肠杆菌作用而从传感器上脱离下来，使电极阻力又减小(d)。由此说明，采用本申请的方案能够制备适配体可以用于肠致病性大肠杆菌的检测。
肠致病性大肠杆菌检测实施例
本实施例所用链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(ST-AP)，购自北京鼎国昌盛生物科技有限公司；1-萘基磷酸盐(1-NP)，购自TCI(上海)化成工业发展有限公司；肠致病性大肠杆菌(编号CICC 21531)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
实施例4标准曲线建立
(1)将实施例1的方法制备的传感器分别浸泡于含有不同浓度肠致病性大肠杆菌的PBS溶液中，37℃孵育2小时；其中所述PBS溶液浓度为5mmol/L，pH7.4；所述PBS溶液中肠致病性大肠杆菌的浓度分别为5.0×102CFU/mL、5.0×103 CFU/mL、5.0×104CFU/mL、5.0×105CFU/mL、5.0×106CFU/mL和5.0×107CFU/mL；
(2)清洗液清洗孵育后的传感器，并分别向清洗后的传感器的金电极表面滴加20μL 0.5mg/mL的链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液，37℃下反应30分钟；
(3)反应后的传感器以PBST溶液(含有体积分数为0.05％Tween-20的 0.005mol/LPBS)冲洗后，分别浸泡于含有1mg/mL的1-萘基磷酸盐的体积分数为2.5％的二乙醇胺水溶液中，并运用电化学工作站进行差分脉冲伏安法测量，记录电流值，结果如图3所示；
(4)以图3中各浓度肠致病性大肠杆菌对应的峰电流值(ip)为纵坐标，肠致病性大肠杆菌浓度的对数值为横坐标，建立标准曲线，如图4所示，获得峰电流值与肠致病性大肠杆菌的浓度对数值的回归方程ip(μA)＝-3.68×10-7n+ 4.54×10-6(R2＝0.996)。
实施例5样品中肠致病性大肠杆菌浓度的检测
对中药甘草溶液进行灭菌处理后，向所述甘草溶液中加入不同浓度的肠致病性大肠杆菌，分别得到待测样品1、待测样品2和待测样品3。以实施例1的方法制备的传感器分别检测待测样品1-3中肠致病性大肠杆菌的浓度：
(1)将实施例1的方法制备的传感器分别浸泡于待测样品1-3中，37℃孵育2小时；
(2)清洗液清洗孵育后的传感器，并分别向清洗后的传感器金电极表面滴加20μL0.5mg/mL的链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液，37℃下反应30 分钟；
(3)反应后的传感器以PBST溶液(含有体积分数为0.05％Tween-20的 0.005mol/LPBS)冲洗后，分别浸泡于含有1mg/mL的1-萘基磷酸盐的体积分数为2.5％的二乙醇胺水溶液中，并运用电化学工作站进行差分脉冲伏安法测量其电流值；
(4)根据差分脉冲伏安法测量的峰电流值和实施例4中获得的回归方程，分别计算得到待测样品1-3中肠致病性大肠杆菌的浓度。
对比例1平板计数法检测甘草溶液中肠致病性大肠杆菌
采用平板计数法分别检测实施例5中待测样品1-3中肠致病性大肠杆菌的浓度：
(1)分别取待测样品1-3进行梯度稀释，每个稀释度接种3个无菌结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)平皿，每皿1ml，用涂布器涂均匀后，静置10min，翻转平皿，置于37℃培养24h。
(2)分别计数平皿上的菌落数，再从VRBA平皿上挑取10个典型菌落，移种于10支BGLB肉汤管中，37℃培养24-48h，观察产气情况，产气者为阳性管。
(3)阳性管比例乘以平皿上的菌落数，再乘以样品稀释倍数，即为每毫升样品中的肠致病性大肠杆菌菌群数。
实施例5和对比例1的方法检测待测样品1-3中肠致病性大肠杆菌菌群数 (即肠致病性大肠杆菌的浓度)结果如表1所示。
表1
Figure BDA0001765753700000121
通过表1中的结果可见，采用本发明的方法与国标的方法(平板计数法) 相比，两者检测结果数量级相同，说明采用本发明的传感器检测肠致病性大肠杆菌可以达到与标准方法相近的准确性；而采用本发明的方法检测所需要的时间明显缩短，可以实现肠致病性大肠杆菌的快速检测。
以上对本发明所提供的一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

Claims (2)

1.一种采用核酸适配体电化学传感器检测肠致病性大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a1：将所述传感器分别浸泡在含有已知浓度为C1-Cn的肠致病性大肠杆菌的PBS溶液中反应；使信号探针与肠致病性大肠杆菌结合；
a2:清洗液清洗反应后的传感器，并将清洗后的传感器分别与链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液反应；
a3:将连接有链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶的传感器用PBST溶液冲洗后，分别浸泡于1-萘基磷酸盐-二乙醇胺水溶液中，并运用电化学工作站进行差分脉冲伏安法测量，记录峰电流值；
a4:以峰电流值为纵坐标或横坐标，以肠致病性大肠杆菌浓度C1-Cn的对数值为横坐标或纵坐标建立标准曲线，得到肠致病性大肠杆菌浓度对数值与峰电流值间的线性方程；
a5:以待测样品溶液代替肠致病性大肠杆菌PBS溶液，执行a1，a2，a3，获得峰电流值，根据a4中的线性方程确定待测样品溶液中肠致病性大肠杆菌的浓度；
其中，所述核酸适配体电化学传感器包括：
通过S-Au键连接于金电极表面的捕获探针，以及与捕获探针杂交形成双链的信号探针；
所述捕获探针为巯基修饰的核酸适配体：SH-(Xm)n-CAG ATG CAC GAC TTC GAG TCTTAG GGC ACA CGA TGG CAG T；
所述信号探针为生物素修饰的核酸适配体：Biotin-CAG CTC AGA AGC TTG ATC CTACCA GTAGAC TTT CAA CTT TAC TGC CAT CGT GTG CCC TAA GAC TCG AAG TCG TGC ATCTG；
其中，n＝0或1；
X代表-CH2-或A、T、C、G，当X为-CH2-时，m＝6；当X为A、T、C或G时，m＝4～10。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶水溶液的浓度为(0.1-1.0)mg/mL；所述1-萘基磷酸盐-二乙醇胺水溶液中1-萘基磷酸盐的浓度为(0.2-2.0)mg/mL，二乙醇胺的体积分数为2.5％。
CN201810927473.4A 2018-08-15 2018-08-15 一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用 Active CN109060917B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810927473.4A CN109060917B (zh) 2018-08-15 2018-08-15 一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810927473.4A CN109060917B (zh) 2018-08-15 2018-08-15 一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109060917A CN109060917A (zh) 2018-12-21
CN109060917B true CN109060917B (zh) 2020-10-02

Family

ID=64678410

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810927473.4A Active CN109060917B (zh) 2018-08-15 2018-08-15 一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109060917B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110108624B (zh) * 2019-05-08 2020-06-16 中国科学院化学研究所 一种功能化磷脂制备纳米单颗粒的方法及该纳米单颗粒的检测
CN112525965B (zh) * 2020-10-15 2022-06-17 南京农业大学 一种大肠杆菌电化学检测方法
CN113970586A (zh) * 2021-09-10 2022-01-25 中国十七冶集团有限公司 建筑工地检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法
CN113984863B (zh) * 2021-10-28 2024-03-15 上海市临床检验中心 一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法
CN114624305B (zh) * 2022-03-25 2024-07-12 江苏大学 一种可更新电化学传感器及其构建方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080082858A (ko) * 2007-03-09 2008-09-12 한국화학연구원 탄소나노튜브 트랜지스터 어레이를 이용한 미생물 검출센서및 이를 이용한 미생물 검출방법
CN104764774A (zh) * 2015-01-22 2015-07-08 济南大学 一种检测大肠杆菌的生物传感器及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080082858A (ko) * 2007-03-09 2008-09-12 한국화학연구원 탄소나노튜브 트랜지스터 어레이를 이용한 미생물 검출센서및 이를 이용한 미생물 검출방법
CN104764774A (zh) * 2015-01-22 2015-07-08 济南大学 一种检测大肠杆菌的生物传感器及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Rapid and Sensitive Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Direct Detection of Escherichia Coli O111;Caihui Luo et.al;《Electroanalysis》;20120315;第24卷(第5期);第1187-1190页 *
Novel impedimetric aptasensor for label-free detection of Escherichia coli O157:H7;Sergi Brosel-Oliu et.al;《Sensors and Actuators B: Chemical》;20170920;第255卷;第2988-2995页 *
基于DNA 电化学生物传感技术的甘草提取液中大肠杆菌快检方法研究;赵堉文 等;《中国中药杂志》;20180331;第43卷(第6期);第1209-1214页 *
肠致病性大肠杆菌适配体筛选研究;段诺 等;《食品安全质量检测学报》;20151231;第6卷(第12期);第4803、4806页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109060917A (zh) 2018-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109060917B (zh) 一种检测肠致病性大肠杆菌的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和应用
Xu et al. An electrochemical biosensor for rapid detection of E. coli O157: H7 with highly efficient bi-functional glucose oxidase-polydopamine nanocomposites and Prussian blue modified screen-printed interdigitated electrodes
JP5902159B2 (ja) 集積ブロスに希釈された生物学的サンプル中における微生物を直接的に検出し同定する方法
Cheng et al. Rapid detection of Listeria monocytogenes in milk by self-assembled electrochemical immunosensor
CN104630869B (zh) 一种检测金黄色葡萄球菌的dna传感器及其制备与应用
CN113075269B (zh) 一种用于特异性检测氯霉素的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用
Wang et al. Development of an electrochemical biosensor for rapid and effective detection of pathogenic Escherichia coli in licorice extract
CN112432979B (zh) 纳米复合材料、esat-6电化学适体传感器及其制备与检测方法
CN105784799B (zh) 一种基于核酸适配体和纳米模拟酶检测卡那霉素残留的电化学检测方法
CN110632160B (zh) 一种三维细胞纸芯片传感器及在细菌脂多糖检测中的应用
WO2020114124A1 (zh) 一种基于金纳米颗粒和二碳化钛MXenes的双重催化鲁米诺电化学发光生物传感器
CN103048369A (zh) 一种基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的金黄色葡萄球菌无标记电化学适配体传感器
CN107843629B (zh) 一种检测a549肿瘤细胞电化学传感器工作电极的制备方法
Zhou et al. Development of a phage-based electrochemical biosensor for detection of Escherichia coli O157: H7 GXEC-N07
CN114858898B (zh) 荧光/电化学双信号模式生物传感器及其构建方法和应用
Ren et al. Rapid detection of antibiotic resistance in Salmonella with screen printed carbon electrodes
CN115078495A (zh) 一种结合夹心式生物传感器的便携式幽门螺杆菌检测仪
CN105891473A (zh) 基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器的制备方法及其应用
CN111537584A (zh) 一种亚甲基蓝-纳米花、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用
CN110609071B (zh) 纳米复合材料、lps电化学适体传感器的制备方法及检测方法
CN112708684A (zh) 一种超敏感的电化学lcr传感器用于检测关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
CN111272847A (zh) 一种用于检测绵羊支原体肺炎的电化学生物传感器的制备及检测方法
US10768177B2 (en) Bacteriophage-based electrochemical biosensor
CN111521664B (zh) 一种单增李斯特菌印迹电化学传感器及其制备方法
CN114624305B (zh) 一种可更新电化学传感器及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant