CN112708684A - 一种超敏感的电化学lcr传感器用于检测关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 - Google Patents

一种超敏感的电化学lcr传感器用于检测关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种超敏感的电化学LCR传感器用于检测关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，包括如下步骤：（1）根据MecA基因的保守系列设计特异性的两条双链短探针（S‑dsDNA）。（2）在LCR反应体系中，以MecA基因为模板，通过DNA连接酶将两条短系列的探针连接形成长的双链DNA（L‑dsDNA）。接着以L‑dsDNA模板，进行循环扩增形成大量L‑dsDNA。（3）将形成的带有巯基及生物素修饰的L‑dsDNA通过金‑硫键固定于BSA修饰的金电极上，通过滴加亲和素‑PolyHRP与L‑dsDNA上的生物素结合，最后将电极置于含TMB和H2O2的底液中，在HRP的催化下，H2O2能氧化TMB产生电化学信号。本方法具有经济、快速、高灵敏度及特异性等优点，可用于单碱基突变系列的检测，并且实现了对关节假体周围感染病人关节液中MRSA的检测。

Description

一种超敏感的电化学LCR传感器用于检测关节液中耐甲氧西 林金黄色葡萄球菌
技术领域
本发明涉及一种超敏感的电化学LCR传感器用于检测关节假体周围感染病人关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），尤其涉及一种基于LCR的电化学传感技术检测关节假体周围感染病人关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的方法。
背景技术
髋关节与膝关节假体周围感染（PJI）是人工关节置换术后的一种灾难性的严重并发症，大约发生于1%-2%的人工关节置换术后病人。大多数PJI的致病菌为革兰氏阳性菌包括葡萄球菌属。一些研究表明大约74%的PJI病人是由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染引起的。传统的检测MRSA的方法是通过细菌培养。但由于许多PJI患者其MRSA位于生物膜内，单纯用关节液进行细菌培养很难得到足够量的细菌，同时这种方法需要较长的培养时间，这就导致结果出来前广谱抗生素的大量使用从而产生抗生素相关的副作用及增加病人的治疗费用。因此，迫切需要一种能够简单、快速、灵敏的方法用于关节液中MRSA的早期检测。
近年来研究表明，通过检测MRSA内的特异性基因MecA基因可实现MRSA的快速检测。MecA基因是一种特异性的MRSA耐药基因，它编码青霉素结合蛋白2a，有助于细菌细胞壁的生物合成，可极大地降低细菌β-内酰胺类的亲和力，导致对整个β-内酰胺类家族抗生素耐药。分子生物学的方法如PCR及实时定量PCR（RT-PCR）目前已被用于MecA基因的快速、灵敏地检测。然而，由于MecA基因的多态性特别是单拷贝系列的变化，导致基于引物扩增的PCR及RT-PCR很难区分这些单碱基的变化，从而引起假阳性或者假阴性结果的产生。因此，建立一种高特异性检测MecA基因的方法对检测MRSA具有重要意义。
近年来，连接酶链式反应（LCR）作为一种特异性的扩增技术，已被用于基因检测并显示出对DNA序列单碱基突变的高度特异性。与通过一对引物扩增的PCR技术不同，LCR设计了两对探针序列，每对探针序列只有与目标序列完全互补杂交时才会进行连接，生成的长双链DNA产物作为下一个循环的模板进行指数扩增产生大量的长双链DNA产物。最后，特异性的DNA产物通过凝胶电泳或者标记荧光探针进行检测。为了避免RT-PCR产物检测中的昂贵的荧光染料，电化学传感技术作为一种简单、经济的检测方法被引入到LCR产物的检测，通过将LCR产物固定到电极表面，利用电化学信号的改变实现对特定基因的快速测定。我们课题组之前利用该方法对临床样本中的HBV及CYP CYP2C19*2 等位基因进行了检测，均获得满意的结果。
下面所述为本发明人提出的将LCR技术与电化学传感技术相结合，设计了一种检测MRSA中MecA基因的高特异性检测方法。该体系将LCR扩增产物固定于BSA修饰金电极上，滴加亲和素-PolyHRP与L-dsDNA上的生物素结合后，将三电极体系置于含TMB和H2O2的底液中，在HRP的催化下，H2O2氧化TMB生成双偶氮联苯胺类物质，产生电流信号，通过电化学三电极体系，利用电流-时间曲线法（i-t）及循环伏安法（CV）检测电流信号的改变，从而实现对目标基因进行检测。该方法与传统方法比较具有简便、快捷、经济、灵敏、高特异性等优点，并实现了对关节假体周围感染患者的关节液MRSA的快速检测，具有重要临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种超敏感的电化学LCR传感器用于检测关节假体周围感染病人关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），特别是提出了一种基于LCR的电化学传感技术检测关节假体周围感染病人关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的方法。
为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所述的一种超敏感的电化学LCR传感器用于检测关节假体周围感染病人关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。
所述的待测MRSA能通过检测其MecA基因实现，通过NCBI查找出MecA基因的各种同源体系列，选取其中共同的保守系列设计探针，设计的探针系列分别为：完全匹配DNA目标链, T-full DNA target 的MecA基因 : 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTCCAGATTACAACTTCACCAGGTT CAACTC-3’； 5’端修饰SH-C6的捕获探针, CP: 5’-SH- TTTT TTTTTTGAGTTGAACCTGGTGA AGTTGTAA-3’； 5’ 端修饰PO4- , 3’ 端修饰生物素biotin的信号探针，SP: 5’-PO4-TCTGGA ACTTGT TGAGCAG AGG-Biotin-3’；部分目标探针1，Half-target1, hT-1:5’-CCTCTGCTCA ACAAGTTCCAGA-3’;部分目标探针2，Half-target 2, hT-2: 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTC CAGA-3’。
所述的超敏感的电化学LCR 传感器的检测方法，依序包含如下步骤：(1)LCR反应相关条件的设定，并向反应体系中加入扩增反应所需的标本探针、试剂及DNA连接酶；(2)金电极的预处理及BSA修饰金电极的制备；(3) 将LCR扩增产物固定于BSA修饰金电极表面，滴加亲和素-PolyHRP与L-dsDNA上的生物素结合后，将步骤（2）制得的电极置于含TMB和H2O2的底液中，在HRP的催化下，H2O2氧化TMB生成双偶氮联苯胺类物质，产生电化学信号进行检测。
所述的超敏感的电化学LCR 传感器的检测方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过NCBI查找出MecA基因的各种同源体系列，选取其中共同的保守系列设计探针，设计的探针系列分别为：MecA基因 : 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTCCAGATTACAACTTCACCAGGTT CAACTC-3’；捕获探针，其端修饰SH-C6, CP: 5’-SH- TTTT TTTTTT GAGTTGAACCTGGTGA AGTTGTAA-3’；信号探针，其5’ 端修饰PO4- , 3’ 端修饰生物素biotin，SP: 5’-PO4-TCTGGAACTTGTTGAGCAGAGG-Biotin-3’；部分目标探针1 :5’-CCTCTGCTCA ACAAGTTCCAGA-3’; 部分目标探针2: 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTC CAGA-3’；
（2）向PCR反应体系中加入扩增反应所需的标本、试剂以及连接酶；并对LCR反应中相关的温度、时间、循环数、连接酶浓度参数进行设定；
（3）金电极AuE预处理：AuE分别用0.3 μm和0.05 μm Al2O3粉末的混悬液各打磨3min，然后依次在无水乙醇和双蒸水中各超声1 min以除去残留的Al2O3粉末及其他杂质；超声完的AuE放于新鲜的0.5 M H2SO4溶液中，用电化学的循环伏安法在电位0 ~1.6 V之间不断扫描直至获得稳定的金的循环伏安特征峰；
（4）dsDNA-BSA-AuE电极的制备：将步骤（1）预处理好的AuE浸泡于100 μL含有0.1mg/mL BSA的EP管中，室温下浸泡15 min，组装好的BSA-AuE用PB冲洗掉未结合上去的BSA，并用N2吹干；接下来，将BSA修饰过的电极浸入上述LCR反应产物中，室温组装1 h；再用PB冲洗干净，N2吹干获得dsDNA-BSA-AuE电极备用；
（5）PolyHRP-dsDNA-BSA-AuE电极的制备：在步骤（4）获得的dsDNA-BSA-AuE电极表面滴加3 µL SA-PolyHRP酶，室温下反应15 min，用含有0.05wt% Tween-20的PBT溶液冲洗浸泡5 min，再用超纯水冲洗后获得PolyHRP-dsDNA-BSA-AuE电极立即进行电化学检测；
（6）电化学信号检测: 电化学检测在CH Instruments公司的CHI660E型电化学工作站上进行，电化学测定采用三电极体系，以步骤（5）获得的PolyHRP-dsDNA-BSA-AuE电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl 为参比电极；电化学检测在室温下进行，将三电极体系浸入到500 μL的TMB底物溶液中，记录电流时间曲线i-t，初始电位100 mV，t=100 s和循环伏安曲线CV，扫描速度0.1 V/s。
所述的LCR反应体系相关条件，能根据待测基因系列采用特定的变性-杂交/连结温度、时间、循环圈数及连接酶量，确保LCR扩增的特异性。
所述的超敏感的电化学LCR 传感器的检测方法，其特征在于将LCR产物固定于BSA修饰金电极上，滴加亲和素-PolyHRP与L-dsDNA上的生物素结合后，将三电极体系置于含TMB和H2O2的底液中，在HRP的催化下，H2O2氧化TMB生成双偶氮联苯胺类物质，产生电化学信号，并利用电流-时间曲线法（i-t）及循环伏安法（CV）对目标基因进行检测；电化学三电极体系：金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极；初始电位为100 mV，t=100s，扫描速度0.1 V/s，实验时间根据所需测定扩增循环数所需时间而定。
本发明所述的超敏感的电化学LCR 传感器的检测方法，应用于关节假体感染患者关节液中MRSA的检测。
具体地说，为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
（1）通过NCBI查找出MecA基因的各种同源体系列，选取其中共同的保守系列设计探针，设计的探针系列分别为：MecA基因 (完全匹配DNA目标链, T-full DNA target):5’-CCTCTGCTCAACAAGTTCCAGATTACAACTTCACCAGGTT CAACTC-3’；捕获探针 (端修饰SH-C6,CP): 5’-SH- TTTT TTTTTT GAGTTGAACCTGGTGA AGTTGTAA-3’；信号探针 (5’ 端修饰PO4-, 3’ 端修饰生物素biotin，SP): 5’-PO4-TCTGGA ACTTGTTGAGCAGAGG-Biotin-3’；部分目标探针1 (Half-target 1, hT-1):5’-CCTCTGCTCA ACAAGTTCCAGA-3’; 部分目标探针2(Half-target 2, hT-2): 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTC CAGA-3’。
（2）向PCR反应体系中加入扩增反应所需的标本、试剂以及连接酶；并对LCR反应中相关的温度、时间、循环数、连接酶浓度等参数进行设定。
（3）金电极（AuE）预处理：AuE（直径为2 mm）分别用0.3 μm和0.05 μm Al2O3粉末的混悬液各打磨3 min，然后依次在无水乙醇和双蒸水中各超声1 min以除去残留的Al2O3粉末及其他杂质。超声完的AuE放于新鲜的0.5 M H2SO4溶液中，用电化学的循环伏安法在电位0~1.6 V之间不断扫描直至获得稳定的金的循环伏安特征峰。
（4）dsDNA-BSA-AuE的制备：将预处理好的AuE浸泡于100 μL含有0.1 mg/mL BSA的EP管中，室温下浸泡15 min，组装好的BSA-AuE用PB冲洗掉未结合上去的BSA，并用N2吹干。接下来，将BSA修饰过的电极浸入上述LCR反应产物中，室温组装1 h。再用PB冲洗干净，N2吹干备用。
（5）PolyHRP-dsDNA-BSA-AuE的制备：在电极表面滴加3 µL SA-PolyHRP酶，室温下反应15 min，用含有0.05% Tween-20的PBT溶液冲洗浸泡5 min，再用超纯水冲洗后立即进行电化学检测。
（6）电化学信号检测: 电化学检测在CH Instruments公司的CHI660E型电化学工作站上进行，电化学测定采用三电极体系，以AuE为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极。电化学检测在室温下进行，将三电极体系浸入到500 μL的TMB底物溶液中，记录电流时间曲线（i-t，初始电位100 mV，t=100 s）和循环伏安曲线（CV，扫描速度0.1 V/s）。
（7）关节液中细菌DNA的提取：按照说明书提示，利用Ezup柱状细菌基因组DNA纯化试剂盒提取关节液中的细菌DNA。
与现有的技术相比，上述技术方案的特点为：将电化学技术与LCR技术相结合，在LCR反应体系中，设计两个短的双链DNA，当变性后，只有与目标链完全互补的的两条短单链DNA才能够通过连接酶结合形成长的双链DNA，这就保证了该方法的特异性。与传统基于引物扩增的PCR方法相比，该方法对单碱基突变的序列敏感性高。同时，通过电化学三电极体系，将生成的LCR产物固定于金电极表面，通过电化学电流差异实现对目标基因的特异性检测。本发明应用于临床上关节假体周围感染病人关节液中MRSA的检测，对避免广谱抗生素的过度使用从而产生抗生素相关的副作用及增加病人的治疗费用具有重要的临床意义。且该技术的所需检测操作过程简单、检测成本低廉且检测结果灵敏准确，有利于推广使用。
附图说明
图1为基于LCR扩增反应的电化学传感器构建原理图。
图2A为本发明的安培电流与目标DNA浓度对数的线性关系（目标链浓度从1.0 ×10-13 到 1.0 ×10-8 M）。
图2B为本发明的在0, 200 aM, 500 aM, 1 fM, and 10 fM 目标DNA存在下的安培电流强度。
图3本发明构建的电化学传感器检测图；图中： (A) 构建的电化学传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）德电流强度图；(B) 构建的电化学传感器对假体周围感染病人关节液样本检测结果（CS-1，CS-2为临床培养出MRSA感染的患者，CS-3，CS-4，CS-5为临床培养出MSSA感染的患者）；(C) CS-1，CS-2关节液样本测出的MRSA基因序列；(D) 提取质粒构建的用于荧光定量PCR的标准曲线；(E)CS-1，CS-2荧光定量PCR的检测结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种基于LCR的电化学传感技术检测关节假体周围感染病人关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的方法（如图1所示），包括如下步骤：
（1）通过NCBI查找出MecA基因的各种同源体系列，选取其中共同的保守系列设计探针，设计的探针系列分别为：MecA基因 (完全匹配DNA目标链, T-full DNA target):5’-CCTCTGCTCAACAAGTTCCAGATTACAACTTCACCAGGTT CAACTC-3’；捕获探针 (端修饰SH-C6,CP): 5’-SH- TTTT TTTTTT GAGTTGAACCTGGTGA AGTTGTAA-3’；信号探针 (5’ 端修饰PO4-, 3’ 端修饰生物素biotin，SP): 5’-PO4-TCTGGA ACTTGTTGAGCAGAGG-Biotin-3’；部分目标探针1 (Half-target 1, hT-1):5’-CCTCTGCTCA ACAAGTTCCAGA-3’; 部分目标探针2(Half-target 2, hT-2): 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTC CAGA-3’。
（2）向PCR反应体系中加入扩增反应所需的标本、试剂以及连接酶；并对LCR反应中相关的温度、时间、循环数、连接酶浓度等参数进行设定。
（3）金电极（AuE）预处理：AuE（直径为2 mm）分别用0.3 μm和0.05 μm Al2O3粉末的混悬液各打磨3 min，然后依次在无水乙醇和双蒸水中各超声1 min以除去残留的Al2O3粉末及其他杂质。超声完的AuE放于新鲜的0.5 M H2SO4溶液中，用电化学的循环伏安法在电位0~1.6 V之间不断扫描直至获得稳定的金的循环伏安特征峰。
（4）dsDNA-BSA-AuE的制备：将预处理好的AuE浸泡于100 μL含有0.1 mg/mL BSA的EP管中，室温下浸泡15 min，组装好的BSA-AuE用PB冲洗掉未结合上去的BSA，并用N2吹干。接下来，将BSA修饰过的电极浸入上述LCR反应产物中，室温组装1 h。再用PB冲洗干净，N2吹干备用。
（5）PolyHRP-dsDNA-BSA-AuE的制备：在电极表面滴加3 µL 1:1000的SA-PolyHRP酶，室温下反应15 min，用含有0.05% Tween-20的PBT溶液冲洗浸泡5 min，再用超纯水冲洗后立即进行电化学检测。
（6）电化学信号检测: 电化学检测在CH Instruments公司的CHI660E型电化学工作站上进行，电化学测定采用三电极体系，以AuE为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极。电化学检测在室温下进行，将三电极体系浸入到500 μL的TMB底物溶液中，记录电流时间曲线（i-t，初始电位100 mV，t=100 s）和循环伏安曲线（CV，扫描速度0.1 V/s）。
（7）关节液中细菌DNA的提取：按照说明书提示，利用Ezup柱状细菌基因组DNA纯化试剂盒提取关节液中的细菌DNA。
实施例2
一种基于传感技术检测关节假体周围感染病人关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的方法，步骤如下：
（1）采用三电极体系进行测定，以实施例1制得的dsDNA-BSA-AuE修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用电化学工作站进行检测。将三电极体系浸入到500 μL的TMB底物溶液中，记录电流时间曲线（i-t，初始电位100 mV，t=100 s）和循环伏安曲线（CV，扫描速度0.1 V/s）。
（2）在LCR反应体系中，分别加入1.0 × 10-13 - 1.0 ×10-8 M一系列不同浓度的DNA目标链，所得产物利用步骤（1）的方法进行电化学检测，并记录不同的电流信号，绘制工作曲线。图2A安培电流与目标DNA浓度对数的线性关系（目标链浓度从1.0 × 10-13 到 1.0×10-8 M）。图2B为在0, 200 aM, 500 aM, 1 fM, and 10 fM 目标DNA存在下的安培电流强度。
（3）利用构建的基于LCR的电化学方法，检测临床关节假体周围感染病人关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。图3中的A为分别检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌（MRSA）及甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌标准菌（MSSA）的电流强度。图3中的B为分别检测5个临床关节假体周围感染病人关节液标本的电流强度图，其中CS-1，CS-2为临床培养出MRSA感染的患者，CS-3，CS-4，CS-5为临床培养出MSSA感染的患者。图3中的C为对CS-1，CS-2两个关节液标本中MRSA基因的测序结果。图3中的D，E分别为对CS-1，CS-2两个关节液标本进行real-time PCR（RT-PCR）定量结果。
本发明的实施例还做了不同方法检测MRSA的比较，具体数据见表1。
表1. 不同方法检测MRSA的比较
Figure 18139DEST_PATH_IMAGE002
本发明为本发明应用于临床上关节假体周围感染病人关节液中MRSA的检测，对避免广谱抗生素的过度使用从而产生抗生素相关的副作用及增加病人的治疗费用具有重要的临床意义。且该技术的所需检测操作过程简单、检测成本低廉且检测结果灵敏准确，有利于推广使用。表1为不同检测方法检测MRSA的比较。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种超敏感的电化学LCR传感器用于检测关节假体周围感染病人关节液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。
2.根据权利要求1所述的检测关节假体周围感染病人关节液中MRSA，其特征在于，所述的待测MRSA能通过检测其MecA基因实现，通过NCBI查找出MecA基因的各种同源体系列，选取其中共同的保守系列设计探针，设计的探针系列分别为：完全匹配DNA目标链, T-fullDNA target 的MecA基因 : 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTCCAGATTACAACTTCACCAGGTT CAACTC-3’； 5’端修饰SH-C6的捕获探针, CP: 5’-SH- TTTT TTTTTT GAGTTGAACCTGGTGAAGTTGTAA-3’； 5’ 端修饰PO4- , 3’ 端修饰生物素biotin的信号探针，SP: 5’-PO4-TCTGGA ACTTGT TGAGCAG AGG-Biotin-3’；部分目标探针1，Half-target 1, hT-1:5’-CCTCTGCTCA ACAAGTTCCAGA-3’;部分目标探针2，Half-target 2, hT-2: 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTC CAGA-3’。
3.权利要求1所述的超敏感的电化学LCR 传感器的检测方法，依序包含如下步骤：(1)LCR反应相关条件的设定，并向反应体系中加入扩增反应所需的标本探针、试剂及DNA连接酶；(2) 金电极的预处理及BSA修饰金电极的制备；(3) 将LCR扩增产物固定于BSA修饰金电极表面，滴加亲和素-PolyHRP与L-dsDNA上的生物素结合后，将步骤（2）制得的电极置于含TMB和H2O2的底液中，在HRP的催化下，H2O2氧化TMB生成双偶氮联苯胺类物质，产生电化学信号进行检测。
4.根据权利要求所述的超敏感的电化学LCR 传感器的检测方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过NCBI查找出MecA基因的各种同源体系列，选取其中共同的保守系列设计探针，设计的探针系列分别为：MecA基因 : 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTCCAGATTACAACTTCACCAGGTT CAACTC-3’；捕获探针，其端修饰SH-C6, CP: 5’-SH- TTTT TTTTTT GAGTTGAACCTGGTGAAGTTGTAA-3’；信号探针，其5’ 端修饰PO4- , 3’ 端修饰生物素biotin，SP: 5’-PO4-TCTGGA ACTTGTTGAGCAGAGG-Biotin-3’；部分目标探针1 :5’-CCTCTGCTCA ACAAGTTCCAGA-3’; 部分目标探针2: 5’-CCTCTGCTCAACAAGTTC CAGA-3’；
（2）向PCR反应体系中加入扩增反应所需的标本、试剂以及连接酶；并对LCR反应中相关的温度、时间、循环数、连接酶浓度参数进行设定；
（3）金电极AuE预处理：AuE分别用0.3 μm和0.05 μm Al2O3粉末的混悬液各打磨3 min，然后依次在无水乙醇和双蒸水中各超声1 min以除去残留的Al2O3粉末及其他杂质；超声完的AuE放于新鲜的0.5 M H2SO4溶液中，用电化学的循环伏安法在电位0 ~1.6 V之间不断扫描直至获得稳定的金的循环伏安特征峰；
（4）dsDNA-BSA-AuE电极的制备：将步骤（1）预处理好的AuE浸泡于100 μL含有0.1 mg/mL BSA的EP管中，室温下浸泡15 min，组装好的BSA-AuE用PB冲洗掉未结合上去的BSA，并用N2吹干；接下来，将BSA修饰过的电极浸入上述LCR反应产物中，室温组装1 h；再用PB冲洗干净，N2吹干获得dsDNA-BSA-AuE电极备用；
（5）PolyHRP-dsDNA-BSA-AuE电极的制备：在步骤（4）获得的dsDNA-BSA-AuE电极表面滴加3 µL SA-PolyHRP酶，室温下反应15 min，用含有0.05wt% Tween-20的PBT溶液冲洗浸泡5min，再用超纯水冲洗后获得PolyHRP-dsDNA-BSA-AuE电极立即进行电化学检测；
（6）电化学信号检测: 电化学检测在CH Instruments公司的CHI660E型电化学工作站上进行，电化学测定采用三电极体系，以步骤（5）获得的PolyHRP-dsDNA-BSA-AuE电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl 为参比电极；电化学检测在室温下进行，将三电极体系浸入到500 μL的TMB底物溶液中，记录电流时间曲线i-t，初始电位100 mV，t=100 s和循环伏安曲线CV，扫描速度0.1 V/s。
5.根据权利要求3所述的超敏感的电化学LCR 传感器的检测方法，其特征在于所述的LCR反应体系相关条件，能根据待测基因系列采用特定的变性-杂交/连结温度、时间、循环圈数及连接酶量，确保LCR扩增的特异性。
6.根据权利要求3所述的超敏感的电化学LCR 传感器的检测方法，其特征在于将LCR产物固定于BSA修饰金电极上，滴加亲和素-PolyHRP与L-dsDNA上的生物素结合后，将三电极体系置于含TMB和H2O2的底液中，在HRP的催化下，H2O2氧化TMB生成双偶氮联苯胺类物质，产生电化学信号，并利用电流-时间曲线法（i-t）及循环伏安法（CV）对目标基因进行检测；电化学三电极体系：金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极；初始电位为100 mV，t=100s，扫描速度0.1 V/s，实验时间根据所需测定扩增循环数所需时间而定。
7.根据权利要求3-6任一所述的超敏感的电化学LCR 传感器的检测方法，应用于关节假体感染患者关节液中MRSA的检测。
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