CN105861646A - 一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用 - Google Patents

一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用，涉及生物医学、电化学检测和单分子自组装领域。该芯片包括构建在芯片表面上的单分子自组装层，芯片表面具有芯片微孔；所述芯片微孔中分别固定有捕获探针和检测探针，所述捕获探针上捕获有病原菌16S rRNA靶分子；所述检测探针形成16S rRNA分子探针识别层。其有益效果在于：采用纳米金与单壁碳纳米管纳米复合物标记检测探针，利用生物素与亲和素高度专一和生物稳定性，用来连接探针和纳米复合粒子；细菌具有简单、迅速、检测成本低、灵敏度高的优点，为指导临床合理用药提供了强、有力的支持。

Description

一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用
技术领域
本发明涉及生物医学、电化学检测和单分子自组装领域，具体地说是一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用。
背景技术
尿路感染(Urinary Tract Infections,UTI)是以膀胱刺激征，即尿频、尿急、尿痛、甚至全身感染为临床特征的感染性疾病。UTI的易感因素和病因已经十分明确，即由病原微生物(主要是细菌)入侵尿道而引发，绝大部分为革兰阴性杆菌，如大肠埃希菌、奇异变形菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌。但UTI是一类发病率高而临床医生较易忽视的疾病，临床症状不典型，容易复发，治疗不当极易造成耐药菌株的出现，形成难治性尿路感染。由UTI引起的肾功能衰竭、高血压等疾病极大地降低了人们的生活质量，给人们的生命健康带来了严重的危害，因此及时准确地诊治UTI尤其重要。
目前UTI的诊断方法虽然较多，但尚无大家公认的简便、特异性高的有效方法。在新近发展的多科学交叉检测体系中，电化学是其中的一种方法。既研究发生在两相界面处伴随电荷转移现象的一门学科，基于电化学原理建立某一化学反应与电流响应的关系，通过测量如电位、电流、电导或电量等物理量，求得物质的含量或考量。自组装技术作为一种新型技术，在分子水平上设计分子的结构，具有灵敏度高、选择性好的优点，在电化学分析领域得到了巨大的应用。
目前，传统UTI的诊断方法检测时间长、成本高、操作繁琐，易发生交叉污染，假阳性率高；可见基因芯片技术并未实现真正意义上的快速检测。
综上所述，目前亟需一种对尿路感染病原菌快速检测的新方法，以实现对尿路感染病原菌多通量、低成本、操作简易，检测快速，并能在普通实验室完成检测，更好地满足各级医院的需要。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，另一个目的是提供上述检测尿路病原菌电化学生物芯片的应用方法。
为实现上述目的，本发明所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，包括芯片，以及构建在芯片表面上的单分子自组装层，芯片表面具有芯片微孔；所述芯片微孔中分别固定有捕获探针和检测探针，所述捕获探针上捕获有病原菌16S rRNA靶分子；所述检测探针形成16S rRNA分子探针识别层，其实现步骤如下：
a.在芯片表面构建单分子自组装层，进行活化单分子自装层；
b.捕获探针在芯片微孔中固定；
c.捕获探针捕获病原菌16S rRNA靶分子；
d.加入检测探针后，构建16S rRNA分子探针识别层；
e.通过电化学生物芯片将分子杂交信息以电子信号的形式输出；
f.加入辣根过氧化物酶以电子传递变化作为指示信号，实现对不同种类病原菌的快速检测。
所述芯片为一种基础界面，该基础界面的实现方法为：第一种就是在处理过程中向芯片微孔加入了极少量的带负电荷的物质，在微孔中形成一个预先覆盖层，减少带负电荷生物分子之间的非特异性反应；第二种化学试剂就是牛血清蛋白，它被加入到芯片微孔中，牛血清蛋白能够包被自组装单分子膜层，通过减少电极表面的非特异性反应降低背景信号，增强检测信号强度；第三种化学试剂是酪蛋白，和酶溶液一起混匀，酪蛋白的功能类似于牛血清蛋白，但能够阻止酶和自组装单分子层链接，增强反应的特异性。
所述单分子自组装层为11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层。
所述捕获探针在芯片微孔中的固定方法：①有机金属硫醇连接上有机复合物或者在末端修饰上醇基后形成单分子层自组装层，该层具有抵抗蛋白质或核酸的沉积的功能，同时可曝露出功能化的末端集团；单分子自组装层在生物交联剂和亲和素的共同作用能够被活化；②在活化后的单分子自组装层表面，加入捕获探针。
所述生物交联剂为EDC、NHS中的一种。
所述捕获探针和检测探针为针对6种尿路病原菌(大肠埃希菌、奇异变形菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌)16S rRNA的特异性核酸分子探针体系，利用序列分析系统ARB(Software environment for sequence data)、NCBI(National Center of Biotechnology Information) 和RDP-Ⅱ：(The Ribosomal Database Project)信息系统进行6种尿路病原菌16S rRNA特异性核酸探针的初步筛选；探针系统设计的区域选择如下：
据文献(SoumiteshChakravorty,DanicaHelb,et al.JMicrobiol CLUSTAL Methods.2007，69(2):330-339):16S rRNA含有V1-V9九个高变区，这九个区保守与特异性兼备，能够用于分子探针体系的构建。以大肠埃希菌为例，在大肠埃希菌16S rRNA的1540个碱基中，选择适合于检测大肠埃希菌的V2与V3之间的保守序列区(242-433)设计检测探针，V3高变序列区(433-497)设计捕获探针。
以NCBI和RDP-II中为探针数据库源，分别输入6种尿路病原菌16S rRNA进行查询，得到该6种尿路病原菌的16S rRNA序列，设定6种尿路病原菌的16S rRNA碱基序列范围，进行FAST比较筛选。利用CLUSTAL X软件进行多序列对位排列，找出特异性最高的序列组合。
以大肠埃希菌为例(如图1)，在设计并筛选出的探针系列中，通过分子生物学方法利用筛选出的特异性较高的探针对大肠埃希菌16S rRNA的检测，得到大肠埃希菌捕获探针和检测探针。
针对奇异变形菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌的检测探针与捕获探针结构设计也是基于上述步骤，构建出常见尿路感染病原菌16S rRNA核酸分子探针库。
所述捕获探针为生物素化的捕获探针。
所述检测探针为合成的生物素化DNA检测探针，所述合成的生物素化DNA检测探针上设置有修饰层。
所述检测探针上设置的修饰层为单壁碳纳米管-纳米金复合物；所述单壁碳纳米管-纳米金复合物的制备方法为：首先制备出含有羧基端单壁层碳纳米管，再用次磷酸钠液相还原方法制备纳米金溶胶；然后在制备出的羟基化的纳米金溶胶中的金颗粒表面原位生长单壁层碳纳米管层；最后利用溶剂萃取法去除有机模板剂，再经超临界干燥后制备出单壁层纳米管-纳米金复合物。
所述单壁层碳纳米管-纳米金复合物在合成的生物素化DNA检测探针上的修饰：生物素-亲和素系统是级联放大检测信号的系统，亲和素的每个亚基含有一个与生物素结合的位点，并与生物素或其衍生物形成高度稳定的复合物，其亲和常数为10-15M-1，仅比一般的共价键低一个数量级，但比抗原抗体反应高10-100 万倍，结合快，呈不可逆反应，而且在pH、温度、有机溶剂或变性剂较大的变化范围内均能稳定存在；由于生物素亲和素系统之间高度专一和强烈的相互作用，利用生物素(Biotin)-亲和素(Avidin)之间的特异性不但可将单壁层碳纳米管-纳米金复合物和检测探针连接到一起，而且具有级联放大信号的作用。
所述检测探针上标记有辣根过氧化物酶生物活性物质。检测探针与待检病原菌核酸杂交后，在辣根过氧化物酶的催化与信号放大作用下，以电化学生物芯片表面各个反应微孔电子传递变化作为指示信号，实现对不同种类病原菌的快速检测
所述检测尿路病原菌电化学生物芯片的应用方法，如图7所示：
A.处理临床收集的尿液标本，裂解尿液中病原菌曝露出16SrRNA序列；
B.芯片微孔中修饰有捕获探针，生物素化的检测探针将识别靶基因序列；
C.捕获探针将靶基因捕获，同时加入具有电化学信号放大作用的亲和素-辣根过氧化物酶；
D.通过化学键的相互作用形成类“三明治”的辣根过氧化物酶-亲和素-生物素-分子探针立体结构；
E.通过酶的电化学传递及信号放大作用，电化学芯片将分子杂交信息以可读的电化学信号输出。
生物传感界面在电化学电极阵列检测应用时的灵敏度和准确度上起着重要作用。在金膜上构建的硫醇自组装单分子层是一种高度组织有序的分子层系统，能抵抗蛋白质或核酸沉积及阻止生物分子间易于产生的非特异性杂交,含有功能化的末端基团，被广泛的应用于电极表面修饰。
细菌检测原理：常见的尿路感染病原菌，其特异性16SrRNA和相应的探针杂交会产生各自的特异性电流信号值，通过电流信号值的不同来区分感染菌种类。
本发明所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用，其有益效果在于：采用纳米金与单壁碳纳米管纳米复合物标记检测探针，利用生物素与亲和素高度专一和生物稳定性，用来连接探针和纳米复合粒子；其中单壁碳纳米管作为电子储备中心，金纳米粒子作为电子高速传输通道，两者结合能够提高分子探针的检测特异性与电化学生物芯片传感阵列的整体性能；该芯片是基于电化学检测系统，得到原始的电流值和分析浓度之间的定量 关系，然后进行一系列电化学分析过程；细菌检测分析速度快，通过对16SrDNA基因保守区进行检测,能够早期、快速判断细菌存在与否及其类别，具有简单、迅速、检测成本低、灵敏度高的优点，为指导临床合理用药提供了强、有力的支持。
附图说明
图1为大肠埃希菌16S rRNA探针组合；
图2为单分子自组装层结构示意图；
图3为电化学生物芯片表面DNA分子识别层的构建；
图4为纳米复合粒子修饰检测探针；
图5中：A.电化学电极阵列经不同修饰后在TMB-H2O2溶液中的循环伏安图，扫速50mV/s；B.电化学电极阵列经不同修饰后在TMB-H2O2溶液中的计时电流图；
图6中：A.靶DNA分子不同浓度下的差分脉冲图(μmol/L)；B.靶DNA分子浓度与峰电流值线性关系；
图7为电化学生物芯片检测流程。
具体实施方式
实施例1
1.尿液标本的收集及处理：
①标本收集对象：
医院门诊及住院尿路感染患者：随机抽样400例，年龄7-60岁。
②处理方法：
收集上述医院门诊及临床住院尿路感染患者的尿液，收集到的分离标本被装在含有15％的甘油布鲁氏菌培养基小瓶中-70℃保存。过夜保存的标本在没有杂菌干扰的情况下接种到LB培养基上去，在生长到对数期为止。正式使用前，将在LB上培养的尿液以冷冻小管的形式储存在-70℃的环境中。
③病原菌的快速检测：
a.在LB培养小管中尿液样本用离心机以1000×10g离心5min，然后丢弃悬浮液，得到细菌裂解液在含有1mol/l NaOH,0.1％TritonX-100,2mmol/l每升EDTA和含有1mg/ml溶解酵素的20mmol/l的TRIS-HCL，Ph8.0的溶液中室温下孵育5分钟；
b.50μl的含有2.5％的牛血清蛋白和0.25μmol/l的检测探针的1mol/l 的磷酸盐缓冲液，pH7.4,在65℃环境温度下加入到细菌裂解液中孵育10min，和靶探针完全杂交；
c.4μl的裂解菌液和检测探针的混合液然后加入到芯片中的工作电极上在65℃潮湿条件下孵育15min，等到被洗干净干燥后，4μl的辣根过氧化物酶(HRP)加到工作电极上孵育15min，在芯片被清洗和干燥后，把一个预先做好的塑料模具覆盖在芯片表面，同时把制备好的50μl催化溶液加入到各个微孔里面，一直到反应液把所有的电极都覆盖住，然后用多通道恒电位仪检测16个微孔上的电化学反应信号，通过不同的输出电化学信号值来鉴定不同的细菌种类。
实施例2
如图5-6所示；在电化学电极阵列表面成功构建11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层后，分别向2、8、14、16号反应槽中加入2μL 0.1μmol/L的生物素化DNA检测探针，将电化学电极阵列放入到充满氮气的孵育盒中10min后取出，用PBS轻轻冲洗5s，分别再往2、8、14、16号反应槽中加入1μL 0.01μmol/L、1μL0.10μmol/L、1μL0.05μmol/L、1μL0.03μmol/L的HRP-Avidin功能化的大肠杆菌DNA靶分子探针序列，然后将孵育盒放入65℃水浴箱中充分孵育杂交40min后取出，用PBS缓冲液冲洗5s，迅速在2、8、14、16号反应槽中分别加入20μL TMB-H2O2溶液，放入读数器内进行检测。
在电化学电极阵列表面成功构建硫醇自组装单分子层的基础上修饰了HRP-Avidin。分别采用循环伏安法和计时电流法对电化学电极阵列的生物功能化进行了研究，其中6号反应槽电极为裸电极，其相对应反应曲线为(6)，当4号电极表面成功构建11-巯基十一烷酸自组装单分子层后，反应曲线为(4)，与曲线(6)相比电流减小，2号电极表面构建有11-巯基十一烷酸-BPA分子组装层，因为有大生物分子BPA的存在，曲线(2)电流明显的减小。8号电极表面成功修饰上HRP-Avidin，曲线(8)反应电流明显增大，因为HRP催化H2O2产生O2氧化TMB，发生强烈的氧化还原反应而产生明显的电流变化。与循环伏安法相应的计时电流检测曲线，其中(10)为裸电极在TMB-H2O2的计时电流曲线，(12)为构建11-巯基十一烷酸单分子自组装层后的反应曲线，(14)是构建有11-巯基十一烷酸—BPA分子组装层曲线，(16)为在分子自组装层修饰上HRP-Avidin的反应曲线。研究表明经生物功能化修饰后的电化学电极阵列性能良好，10、12、14、16号电极的计时电流稳态值(单位：1×10-5A)分别为0.0051、0.3020、 0.9640、1.0900，能检测出因构建和修饰不同生物大分子后电化学电极阵列表面产生的1.26×10-6A电流变化。表1为常见尿路感染菌属及其16S rDNA相互补的探针基因序列。
表1：
常见尿路感染菌属及其16SrDNA相互补的探针基因序列

Claims (10)

1.一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，包括芯片，其特征在于：在芯片表面上构建单分子自组装层，芯片表面具有芯片微孔；所述芯片微孔中分别固定有捕获探针和检测探针，所述捕获探针上捕获有病原菌16S rRNA靶分子；所述检测探针形成16S rRNA分子探针识别层，其实现步骤如下：
a.在芯片表面构建单分子自组装层，进行活化单分子自装层；
b.捕获探针在芯片微孔中固定；
c.捕获探针捕获病原菌16S rRNA靶分子；
d.加入检测探针后，构建16S rRNA分子探针识别层；
e.通过电化学生物芯片将分子杂交信息以电子信号的形式输出；
f.加入辣根过氧化物酶以电子传递变化作为指示信号，实现对不同种类病原菌的快速检测。
2.如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所述芯片为一种基础界面，该界面的实现方法为：第一种就是在处理过程中向芯片微孔加入了极少量的带负电荷的物质，在微孔中形成一个预先覆盖层，在我们先前的试验中已经证实这种分子层能够减少带负电荷生物分子之间的非特异性反应；第二种化学试剂就是牛血清蛋白，它被加入到芯片微孔中，牛血清蛋白能够包被自组装单分子膜层，通过减少电极表面的非特异性反应降低背景信号，增强检测信号强度。第三种化学试剂是酪蛋白，和酶溶液一起混匀，酪蛋白的功能类似于牛血清蛋白，但能够阻止酶和自组装单分子层链接，增强反应的特异性。
3.如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所述单分子自组装层为11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层。
4.如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所述捕获探针在芯片微孔中固定方法：①有机金属硫醇连接上有机复合物或者在末端修饰上醇基后形成单分子层自组装层，该层具有抵抗蛋白质或核酸的沉积的功能，同时可曝露出功能化的末端集团；单分子自组装层在生物交联剂和亲和素三者的共同作用能够被活化；②在活化后的单分子自组装层表面，在最优化条件下加入捕获探针。
5.如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所述生物交联剂为EDC、NHS中的一种。
6.如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所述捕获探针为生物素化的捕获探针。
7.如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所述检测探针为合成的生物素化DNA检测探针，所述合成的生物素化DNA检测探针上设置有修饰层。
8.如权利要求7所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所述检测探针上设置的修饰层为：单壁碳纳米管-纳米金复合物；所述单壁碳纳米管-纳米金复合物的制备方法为：首先制备出含有羧基端单壁层碳纳米管，再用次磷酸钠液相还原方法制备纳米金溶胶；然后在制备出的羟基化的纳米金溶胶中的金颗粒表面原位生长单壁层碳纳米管层；最后利用溶剂萃取法去除有机模板剂，再经超临界干燥后制备出单壁层纳米管-纳米金复合物。
9.如权利要求8所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所述检测探针上标记有辣根过氧化物酶生物活性物质。
10.一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片的应用方法，其特征在于：
A.处理临床收集的尿液标本，裂解尿液中病原菌曝露出16SrRNA序列；
B.芯片微孔中修饰有捕获探针，生物素化的检测探针将识别靶基因序列；
C.捕获探针将靶基因捕获，同时加入具有电化学信号放大作用的亲和素-辣根过氧化物酶；
D.通过化学键的相互作用形成类“三明治”的辣根过氧化物酶-亲和素-生物素-分子探针立体结构；
E.通过酶的电化学传递及信号放大作用，电化学芯片将分子杂交信息以可读的电化学信号输出。
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