CN104630869B - 一种检测金黄色葡萄球菌的dna传感器及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌的DNA传感器及其制备与应用，属于致病菌快速检测技术领域。本发明利用金纳米粒子具有生物固定的作用，同时具有增强电化学电子传递速率的功能，制备一种电化学碳纳米管/金纳米粒子复合膜DNA传感器，可有效提高检测的灵敏度。本发明通过合成金黄色葡萄球菌特异性基因序列作为探针ssDNA，与互补目标ssDNA片段形成杂交体系，以亚甲基蓝作为杂交指示剂的检测技术，初步建立了对金黄色葡萄球菌检测的一种通用性好、高灵敏度和精确度的检验方法及其检测条件。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌的DNA传感器及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的DNA传感器及其制备与应用，属于致病菌快速检测技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，空气、水体、灰尘及人和动物的排泄物中都可以找到。金黄色葡萄球菌是一种重要的致病微生物，它能产生较多的毒素和酶等毒力因子，且毒力强，由金黄色葡萄球菌感染可引起多种疾病，包括食物中毒、假膜性肠炎、烫伤皮肤综合症、毒素休克综合症、化脓性炎症和败血症等，给人类造成了极大的威胁和损失，引起了人们的广泛关注。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性的卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大达45％，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。

目前，金黄色葡萄球菌的检测方法大致包括传统的细菌培养方法及生化鉴定、免疫学方法、荧光定量PCR法、荧光原位杂交法(FISH，Fluorescent in Situ hybridization)以及基因芯片法等，这些检测方法均有各自的优势但同时也存在不同层次上的不足，比如FISH法能够直接运用到复杂样品的检测中，且无需提取样品的DNA，直接保留了样品DNA的完整性；但样品中某些菌体本身的自体荧光，荧光探针信号的衰减，固定的微生物细胞过少等因素均可能导致实验产生假阴性结果；基因芯片法是近年来迅速发展起来的核酸检测技术，其快速、方便简单等优势成为该技术的亮点，但由于该技术需要昂贵的先进检测设备和运行成本，使其难以推广应用。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种电化学碳纳米管/金纳米粒子复合膜DNA传感器，利用碳纳米管具有增强电化学电子传递速率，降低阻抗的功能，金纳米粒子具有生物固定的作用，制备电化学DNA传感器，可有效提高检测的灵敏度。本发明通过合成金黄色葡萄球菌特异性基因序列作为探针ssDNA，与互补目标ssDNA片段形成杂交体系，以亚甲基蓝作为杂交指示剂的的检测技术，初步建立了对金黄色葡萄球菌检测的一种通用性好、高灵敏度和精确度的检验方法及其检测条件。

本发明的第一个目的是提供一种DNA生物传感器。

所述DNA生物传感器的制备方法：是将含壳聚糖的碳纳米管、纳米金依次修饰到清洁的金电极表面，然后将含巯基的探针ssDNA滴加到修饰后的电极上，孵育，再用6-巯基己醇封闭，即制得基于电化学碳纳米管/金纳米粒子自组装DNA传感器。

所述探针ssDNA，在本发明的一种实施方式中，其序列是SEQ ID NO.1所示的序列。该序列是金黄色葡萄球菌的特异性基因序列，使用该序列制备的DNA传感器对金黄色葡萄球菌的检测具有通用性好、高灵敏度和精确度的优点。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，是：(1)碳纳米管修饰金电极：将4～6μL的每mL含有0.5～2mg碳纳米管的碳纳米管溶液滴加到清洁的2mm金电极表面，孵育30～40min；(2)纳米金修饰金电极：将氯金酸溶于硝酸钾溶液中，配制成纳米金溶液，将上一步得到的碳纳米管修饰金电极浸入纳米金溶液中进行电镀沉积，即制备得到修饰好的电极；(3)探针ssDNA滴加：将4～6μL的探针ssDNA滴加到修饰好的电极表面，孵育30～40min；(4)封闭：滴加6～8μL浓度为0.5～2mM的6-巯基己醇，孵育40-60min，即得到自组装电化学DNA传感器。

所述清洁的金电极，是指经如下处理的金电极：将金电极(Φ＝2mm)置于Piranha溶液中浸泡15min，依次用0.3μm，0.05μm的A1₂O₃抛光粉将电极表面抛成镜面，再用l：l(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min，氮气吹干，4℃备用。

所述电镀沉积，在本发明的一种实施方式中，是采用控制电位电解库伦法进行电镀沉积，具体条件：电解电位为-0.2V，电解时间为300s。

所述孵育，在本发明的一种实施方式中，是在35～40℃下进行。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，是(1)将5mg碳纳米管溶于5mL 1％的壳聚糖中，超声分散2h，得到碳纳米管溶液，滴加5ul到抛光的金电极表面，37℃孵育30min，得到碳纳米管修饰的金电极；(2)将1％(v/v)的氯金酸溶于0.1M的硝酸钾中，配制成氯金酸浓度为3.3mM的纳米金溶液，将孵育好碳纳米管修饰的金电极浸入纳米金溶液，并控制电位电解库伦法进行电镀沉积，电解电位为-0.2V，电解时间为300s，制得纳米材料修饰的金电极；(3)滴加1.0x10^-6M的探针ssDNA，37℃下孵育30min；(4)然后滴加8ul浓度为1mM的6-巯基己醇，在室温下孵育50min封闭，即制备得到自组装电化学DNA传感器。放入4℃冰箱待用。

本发明还提供一种所述DNA生物传感器的应用方法，包括以下步骤：(1)滴加不同浓度的互补ssDNA到制备好的传感器上，孵育、清洗，然后用亚甲基蓝溶液浸泡，再采用微分脉冲伏安法(DPV)测定还原电流变化，得到不同浓度的互补ssDNA与电流值变化大小的标准曲线；(2)将待测样品滴加到制备好的传感器上，孵育、清洗，然后用亚甲基蓝溶液浸泡，再测定电流值变化大小，根据上一步得到的标准曲线计算样品中目标ssDNA的浓度。该方法可以确定待测样品中目标ssDNA有无及质量。

所述步骤2中的待测样品，可以是将待测食品或其他材料加水震荡得到细胞悬液，然后提取菌体的DNA，直接以DNA样品作为待测样品，或者进行PCR后将扩增产物作为待检样品。PCR扩增的片段比DNA片段小，相对来说特异性更好。

在本发明的一种实施方式中，PCR所用引物如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，用于扩增金黄色葡萄球菌，扩增产物中包含与探针ssDNA互补的片段。

所述亚甲基蓝溶液浸泡，在本发明的一种实施方式中，具体是在1.0x10^-5～7x10^{- 5}M浓度的亚甲基蓝溶液中浸泡2min～16min，然后清洗氮气吹干。

所述应用方法中，在本发明的一种实施方式中，标准曲线是：取出制备好的DNA传感器，依次滴加5μL不同浓度的互补ssDNA，37℃下孵育30min杂交后，在亚甲基蓝溶液中浸泡12min，清洗氮气吹干，在PBS中采用微分脉冲伏安法考察还原电流的变化，以此作为检测结果。可以用于金黄色葡萄球菌检测的标准曲线制作。

所述互补ssDNA浓度，在本发明的一种实施方式中，为1.0x10^-15～1.0x10^-9M时，所呈现的线性比例最好，若溶液浓度过高或过低都会是线性偏离，造成检测结果出现误差。

所述亚甲基蓝溶液中浸泡，在本发明的一种实施方式中，是使用5.0×10^-5M的亚甲基蓝溶液浸泡12min。

所述标准曲线，在本发明的一种实施方式中，为ΔI(μA)＝11.7238log[c/(M)]+215.9663，相关系数分别为R²＝0.9945，最低检测限为3.3×10^-16mol/L。

所述DNA传感器的应用，在本发明的一种实施方式中，是制备待测样品的细胞悬浮液，然后在修饰好的DNA传感器表面上滴加细胞悬浮液，培养孵育，以达到细胞固定的目的，然后在5.0×10^-5M亚甲基蓝溶液中浸泡12min，在PBS中DPV扫描得出结果。

所述DPV扫描中，扫描溶液PBS的pH＝7.4，浓度为0.01M，扫描电压范围-0.7～0.2V。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，包括：取出已修饰完成的DNA传感电极，采用循环伏安法和交流阻抗法在2.5mM的铁氰化钾溶液中考察工作电极界面的变化，并对电极表进行表征。

本发明的方法具有下述有益效果：

(1)电化学碳纳米管/金纳米粒子复合膜结构改善了纳米金离子的分散性，有效的阻止了金的聚合，从而使其分散的更为均匀。通过控制电位电解库伦法进行电镀沉积，使氯金酸 在电极表面被还原成一粒粒的金颗粒，分散地铺在电极上，从而使传感器表面铺满金颗粒，有助于探针均匀地吸附在电极表面。

(2)碳纳米管具有降低阻抗的功能，从而增强电化学电子传递速率。电化学碳纳米管/金纳米粒子复合膜结构有效的促进了电子的转移，进而有效的提高材料本身的传导性，大大降低了检测限。用于金黄色葡萄球菌检测，对互补ssDNA浓度检测限为3.3×10^-16mol/L。

(3)自组装DNA传感器能够结合多种材料的优点，充分发挥DNA杂交、指示剂亚甲基蓝传感的灵敏性，极大的降低检测限。亚甲基蓝(MB)是具有芳香杂环结构的化合物，它可以嵌插在DNA双链中，并在-0.25V的电位下出现还原峰，却不能与单链DNA很好的结合，因此可以选择性地识别单、双链DNA。

(4)自组装DNA传感器用于检测金黄色葡萄球菌，具有通用性好、检测快、高灵敏度和重现性好的优点。

附图说明

图1表示纳米金在电极表面上的透射电镜图；

图2表示循环伏安法和交流阻抗法分析表征图；其中a：裸金电极；b：碳纳米管/金电极；c：纳米金/碳纳米管/金电极；d：探针/纳米金/碳纳米管/金电极；e：6-巯基己醇/探针/纳米金/碳纳米管/金电极；f：目标DNA/6-巯基己醇/探针/纳米金/碳纳米管/金电极；

图3表示不同亚甲基蓝浓度和浸泡时间的优化图，其中A图为浓度，B图为时间；

图4表示不同浓度互补ssDNA标准品的电流值标准曲线；

图5表示传感器的特异性，其中a：完全不互补序列；b：三碱基不互补序列；c：单碱基不互补序列；d：目标互补序列；

图6表示梯度稀释的金黄色葡萄球菌的SDS-PAGE凝胶电泳图与电化学DNA传感器图，其中a～f即浓度为10⁶～10¹CFU mL^-1的金黄色葡萄球菌。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1DNA传感器的制备方法

将5mg碳纳米管溶于5mL 1％的壳聚糖中，超声分散2h，得到0.001(m/v)浓度的碳纳米管溶液，滴加5μL到清洁的金电极表面，37℃孵育30min，将1％(v/v)的氯金酸溶于0.1M的硝酸钾中，配制成3.3mM的纳米金溶液，并控制电位电解库伦法进行电镀沉积，制得纳米材料修饰的电极。图1为纳米金在电极表面上的透射电镜图，从图中可以看出纳米金颗粒均分地分散在电极表面。

在修饰好的金电极表面，依次滴加5μL的1.0x10^-6M的一端含巯基的探针ssDNA(探针ssDNA序列如SEQ ID NO.1所示)5′-HS-C6-GCGAGG GCGATT GAT GGT GATACG GTT CCTCGC-3′，37℃孵育30min，8μL的1mM的6-巯基己醇，室温下孵育1h，4℃保存，制备得到自组装电化学DNA传感器。

其中，金电极的清洁方法：金电极(Φ＝2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0.3、0.05μm的A1₂O₃抛光粉将电极表面抛成镜面，再用l：l(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min，氮气吹干，4℃备用；

实施例2DNA传感器的电化学表征

取出已制备好的DNA传感器电极，依次滴加5μL不同浓度的互补ssDNA标准品进行杂交，37℃孵育30min后，采用循环伏安法和交流阻抗法考察工作电极界面的变化，并对电极表面进行表征。结果如图2所示。

CV(循环伏安法)测试条件：电压0.2～0.6V，扫描速率0.1V/s；EIS(电化学阻抗谱)测试条件：初幅0.05V，频率为1～100kHz，静置时间2s。反应介质液为2.5mmol Fe(CN)₆ ^3-/4-溶液(所有测试均在室温下进行)。

从图2(A)中，可以看出a、b、c三条线的电流值逐渐增大，说明.滴加的碳纳米管、电镀上的金纳米增大了电子传递速率，而d、e、f三条线的电流值逐渐减小，说明滴加的探针ssDNA、6-巯基己醇、互补ssDNA逐渐增大了阻抗，降低了电子传递速率。从图2(B)中，可以看出a、b、c三条线的阻抗值逐渐减小，说明.滴加的碳纳米管、电镀上的金纳米降低了电极表面的阻抗，增大了电子传递速率，而d、e、f三条线的阻抗值逐渐增大，说明滴加的探针ssDNA、6-巯基己醇、互补ssDNA逐渐增大了阻抗，降低了电子传递速率。..

实施例3DNA传感器的应用

本发明制备的传感器的应用方法如下：

具体是：(1)滴加不同浓度的与探针ssDNA互补ssDNA到DNA传感器上，孵育好后PBS清洗，然后在5.0×10^-5M浓度的亚甲基蓝溶液中浸泡12min，清洗氮气吹干，在PBS中采用微分脉冲伏安法(DPV)测定还原电流变化，得到互补ssDNA与电流值变化大小的标准曲线；(2)将待测样品滴加到DNA传感器上，孵育好后PBS清洗，然后在5.0×10^-5M浓度的亚甲基蓝溶液中浸泡12min，清洗氮气吹干，在PBS中测定电流值变化大小，根据上一步得到的标准曲线计算样品中目标ssDNA的浓度，从而确定目标ssDNA的有无及质量。

当需要检测食品或其他材料中的菌体时，可先将食品或其他材料加水震荡，得到细胞悬液，然后提取菌体的DNA，PCR后将扩增产物作为待检样品。

实施例4DNA传感器对金黄色葡萄球菌的检测

一、检测条件优化

使用实施例3的步骤(1)方法制备标准曲线。同时对亚甲基蓝的浸泡时间和亚甲基蓝浓度进行了优化，结果如图3所示。

从图3可以看出，所述的指示剂亚甲基蓝浸泡时间从2min～16min，当时间达到12min时，电流值不再显著增加，指示剂亚甲基蓝浓度从1.0x10^-5～6.5x10^-5M，当浓度达到5x10^-5时，电流值不再显著增加。

二、标准曲线及检测限

所述依次滴加的不同浓度的互补ssDNA标准品的浓度为1.0×10^-15，1.0×10^-14，1.0×10^-13，1.0×10^-12，1.0×10^-11，1.0×10^-10，1.0×10^-9，微分脉冲伏安法得到电流值，以互补ssDNA标准品浓度为横坐标，电流值的大小为纵坐标作图，得到金黄色葡萄球菌自组装DNA电极检测的标准曲线，结果如图4所示。

电流值的大小与互补ssDNA标准品的浓度分别在1.0x10^-15至1.0x10^-8M之间存在良好的线性关系，线性方程分别为ΔI(μA)＝11.7238log[c/(M)]+215.9663，相关系数分别为R²＝0.9945，最低检测限为3.3×10^-16M。说明传感器的灵敏度很高。

采用微分脉冲伏安法(DPV)测定还原电流变化的具体方法如下：

电化学工作站CHI760在-0.7～0.2V下，在反应介质液为0.01M的PBS溶液中进行测量，采用微分脉冲伏安法，以在超纯水中浸泡12min的电流值作为空白电流值I₀，以此电极与含有不同浓度互补ssDNA标准品在同一溶液中所测电流值为ΔI(I-I₀)，求出在不同互补ssDNA标准品浓度中I的变化值ΔI：

ΔI＝I－I₀，其中I₀为空白电流值，I为浸泡亚甲基蓝溶液后的电极还原电流值，ΔI：反应前后还原电流的变化值；

以还原电流的变化值和互补ssDNA标准溶液浓度的关系作图，即得金黄色葡萄球菌DNA传感器的检测标准曲线。

实施例5传感器的性能测试

(1)传感器选择性、特异性的检测

在制备好的传感器上，分别滴加与探针ssDNA完全不互补的ssDNA序列、三碱基不互补的ssDNA序列、单碱基不互补的ssDNA序列、互补的ssDNA序列，并检测传感器的电流。结果如图5所示。从图中可以看出a～d电流值逐渐增强，说明此传感器特异性强。

(2)传感器稳定性的检测

金黄色葡萄球菌目标DNA的回收率：

将金黄色葡萄球菌在超纯水加标后梯度稀释至10⁶～10¹CFU mL^-1，提取DNA后进行PCR扩增，将扩增产物应用到自组装DNA传感器上进行加标回收测定。回收率见下表1。从表1可以看出使用自组装DNA传感器检测不同的样品，其回收率都保持在95％～104％之间，说明本发明的DNA传感器用于检测的稳定性高、精确度高。

表1不同批次样品的加标回收率

(3)传感器灵敏度的检测

首先从图4的标准曲线可以看出传感器的灵敏度比较高。此外，分别从金黄色葡萄球菌浓度为10⁶～10¹CFU mL^-1的6个样品中(编号为a～f)提取DNA，使用SEQ ID NO.2、SEQIDNO.3的引物进行PCR，将PCR的产物作为待测样品。使用SDS-PAGE和本发明的自组装DNA传感器进行检测，结果如图6所示。

从图6中的SDS-PAGE凝胶电泳图像的a～f(即10⁶～10¹CFU mL^-1)条带中可以看出，从加标液中提取的DNA经PCR扩增后，扩增产物确实为125bp，说明是目标序列；同时也可以看出随着金黄色葡萄球菌浓度的降低，条带也越来越浅，而同样的浓度用电化学传感器来检测，电流强度都在线性范围内，因此说明该传感器具有很高的灵敏度和很低的检测线。

此外，本发明的传感器对金黄色葡萄球菌的最低检测限可达20cfu mL^-1，表明本发明的传感器通用性好、检测快、精确度高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述方法是利用DNA生物传感器；所述DNA生物传感器的制备，是将含壳聚糖的碳纳米管、纳米金依次修饰到清洁的金电极表面，然后将含巯基的探针ssDNA滴加到修饰后的电极上，孵育，再用6-巯基己醇封闭，即制得基于电化学碳纳米管/金纳米粒子自组装DNA传感器；

所述探针ssDNA的序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA生物传感器的制备具体是：(1)碳纳米管修饰金电极：将4～6μL的每mL含有0.5～2mg碳纳米管的碳纳米管溶液滴加到清洁的2mm金电极表面，孵育30～40min；(2)纳米金修饰金电极：将氯金酸溶于硝酸钾溶液中，配制成纳米金溶液，将上一步得到的碳纳米管修饰金电极浸入纳米金溶液中进行电镀沉积，即制备得到修饰好的电极；(3)探针ssDNA滴加：将4～6μL的探针ssDNA滴加到修饰好的电极表面，孵育30～40min；(4)封闭：滴加6～8μL浓度为0.5～2mM的6-巯基己醇，孵育40～60min，即得到自组装电化学DNA传感器。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA生物传感器的制备是(1)将5mg碳纳米管溶于5mL 1％的壳聚糖中，超声分散2h，得到碳纳米管溶液，滴加5μL到抛光的金电极表面，37℃孵育30min，得到碳纳米管修饰的金电极；(2)将1％(v/v)的氯金酸溶于0.1M的硝酸钾中，配制成氯金酸浓度为3.3mM的纳米金溶液，将孵育好碳纳米管修饰的金电极浸入纳米金溶液，并控制电位电解库伦法进行电镀沉积，电解电位为-0.2V，电解时间为300s，制得纳米材料修饰的金电极；(3)滴加1.0x10^-6M的探针ssDNA，37℃下孵育30min；(4)然后滴加8μL浓度为1mM的6-巯基己醇，在室温下孵育50min封闭，即制备得到自组装电化学DNA传感器。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)滴加不同浓度的互补ssDNA到制备好的DNA生物传感器上，孵育、清洗，然后用亚甲基蓝溶液浸泡，再采用微分脉冲伏安法测定还原电流变化，得到互补ssDNA与电流值变化大小的标准曲线；(2)将待测样品滴加到制备好的传感器上，孵育、清洗，然后用亚甲基蓝溶液浸泡，再测定电流值变化大小，根据上一步得到的标准曲线计算样品中目标ssDNA的浓度。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述亚甲基蓝溶液浸泡是使用1.0x10^-5～7x10^-5M浓度的亚甲基蓝溶液中浸泡2min～16min，然后清洗氮气吹干。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述亚甲基蓝溶液中浸泡，是使用5.0×10^-5M的亚甲基蓝溶液浸泡12min。

7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述互补ssDNA浓度为1.0x10^-15～1.0x10^-8M，标准曲线为ΔI(μA)＝11.7238log[c/(M)]+215.9663。