CN112098494B - 一种检测作物中cp4-epsps蛋白的电化学免疫传感器 - Google Patents

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Abstract

一种检测作物中CP4‑EPSPS蛋白的电化学免疫传感器，包括玻碳电极及识别元件，其玻碳电极表面经复合材料修饰，所述复合材料由石墨烯与富含氨基的PAMAM超声形成；以金标抗体作为识别元件，胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb通过共价结合的方式连接于玻碳电极表面的复合材料上，经5％BSA封闭后构建电化学免疫传感器，本发明中，金纳米粒子的引入提高了电活性物质的固载量，放大检测信号，对耐除草剂蛋白CP4‑EPSPS的检测特异性和灵敏性均较高，操作简单，反应迅速，灵敏度高，稳定性好，实现对痕量CP4‑EPSPS抗原的定量检测，为转基因作物的高灵敏、定量分析提供了新思路。

Description

一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器
技术领域
本发明属于抗除草剂蛋白的检测领域，具体涉及一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器。
背景技术
截至2018年，转基因作物种植面积达1.971亿公顷，与1996年相比增加了100倍之多。在转基因作物的品系中，耐除草剂作物是转基因作物中的一个重要品系，是通过将外源的CP4-epsps基因插入到作物的基因组中构建而成，使作物对草甘膦农药有一定的耐受性。
转基因技术的迅速发展给农业生产带来便利的同时，也对环境产生一定的威胁，如转基因蛋白可通过根系释放到土壤中，使非靶标作物产生对草甘膦农药的耐药性。同时，转基因作物的非法种植及流转到超市的现象也时有发生，因而需要加强对转基因作物实时及有效的监控。
目前，用于检测转基因作物的方法是基于PCR的检测技术，如常规PCR法，Realtime PCR法等，该类方法定位于核酸水平的检测，其检测灵敏度高，但样品预处理获得DNA的过程及操作步骤繁琐，不适用于转基因作物的快速筛查；基于蛋白分析的检测方法，如ELISA法、蛋白芯片等，需要较长的孵育时间；而试纸条法操作简单，使用方便，但仅能提供定性或半定量的检测结果，同时也面临灵敏度提升困难的瓶颈。
电化学免疫传感器，将免疫学技术与电化学分析技术相结合，可实现对靶标待测物的定量分析，目前，该技术已应用于多种分析物的检测，如生物毒素、抗生素、致病菌、农药残留、癌症标记物等。
中国发明专利CN107356646公开了一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器，其采用介孔碳与胶体金的复合材料修饰电极，硫堇与抗体的混合液耦连于复合材料上，BSA封闭后用于CP4-EPSPS蛋白的检测，该方案仅以单一的目标蛋白样品为测定对象，无法对作物中的混合蛋白样品进行定量分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器，通过以复合材料为基底材料修饰于电极表面，将胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb通过共价结合的方式连接于复合材料上，提高了抗体的负载量及检测信号，操作简单，反应迅速，灵敏度高，稳定性好，能够实现对痕量抗原CP4-EPSPS的检测，为转基因作物的高灵敏、定量分析提供了新思路。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器，其包括玻碳电极和识别元件；所述玻碳电极表面经复合材料修饰，所述复合材料由石墨烯与乙二胺核的树状分子PAMAM超声形成；所述识别元件为金标抗体，其为胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb，金标抗体通过共价结合的方式连接于玻碳电极表面的复合材料上，再由5％BSA对修饰电极的非特异性结合位点进行封闭。
优选地，所述乙二胺核的树状分子PAMAM溶于甲醇溶液，与石墨烯在N,N-二甲基甲酰胺中超声4h以上获得所述复合材料，所述石墨烯、N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液的质量体积比为石墨烯、N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液＝0.5-1：1：0.025-0.05，石墨烯单位为mg，N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液单位为mL。
又，所述玻碳电极表面用于修饰的复合材料用量为5-7.5μL，金标抗体的使用量为1.5-1.8μg。
进一步，所述金标抗体中，所述胶体金的粒径为20-40nm，单克隆抗体CP4mAb与胶体金的质量体积比为60-72μg：1mL。
优选地，在储存33天后，仍保持90％以上的原始电流信号值，电流变化的相对标准偏差为0.31％；所述电化学免疫传感器对RRS大豆的检出限为0.01％，对NK603玉米的检出限为0.03％。
一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)制备胶体金溶液
采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制得胶体金溶液，其为酒红色透明溶液，胶体金粒径20-40nm，最大紫外吸收峰在525nm；
2)制备金标抗体
取制备好的胶体金溶液，加入碳酸钾调pH至8.0，边搅拌边加入单克隆抗体CP4mAb，混匀，室温反应45-60min，加入体积分数1-3％的BSA封闭反应45-60min，离心去除沉淀部分的游离金，再离心去掉上清液，沉淀用金标抗体保存液重悬，重悬液离心后去上清，再重悬，得到复合物AuNPs-mAb即金标抗体；
其中，单克隆抗体CP4mAb与胶体金溶液的质量体积比为60-72μg：1mL；
3)制备石墨烯-PAMAM复合材料
称取固体石墨烯粉末分散于N,N-二甲基甲酰胺中，超声处理至少4h，然后加入乙二胺核的树状分子PAMAM，室温超声处理至少30min，制得石墨烯-PAMAM复合材料；
4)组装电化学免疫传感器
将玻碳电极分别用粒径逐次减小的氧化铝粉多次抛光打磨至镜面，冲洗，依次在水、乙醇、水中超声，向玻碳电极表面滴加5-7.5μL石墨烯-PAMAM复合材料进行修饰，并在红外灯下干燥；
然后滴加戊二醛室温活化PAMAM中的氨基30-40min，将1.5-1.8μg金标抗体滴于经石墨烯-PAMAM修饰后的玻碳电极，进行反应结合，反应完毕后去除未结合的AuNPs-mAb，再滴加5-10μL含5％BSA的PBS溶液，封闭非特异性结合位点，得到所述电化学免疫传感器。
本发明提供所述检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器在转基因蛋白的定量检测中的应用。
本发明通过差分脉冲伏安法(DPV)法，测定一系列浓度梯度的标准品，获得最高电流值I，将空白样品滴加到传感器上，测定空白样品电流峰值I0，以I-I0值绘制标准曲线，检测样品的DPV峰值Is，将样品DPV值Is减去I0后带入标准曲线中，进而获得样品中转基因蛋白的实际含量，实现作物中转基因蛋白的定量检测。
进一步，在含有[Fe(CN)6]3-/4-和KCl的PBS缓冲液中，采用差分脉冲伏安法检测CP4-EPSPS蛋白，CV扫描范围为-0.2V～0.6V，扫描速率为50mV/s，以[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原探针。
本发明采用PAMAM功能化的石墨烯修饰玻碳电极的表面，石墨烯(GN)是一种二维纳米材料，粉末直径0.5-5μm，比表面积＞500m2/g，具有大的比表面积、良好的导电性，选用的聚酰胺-胺树状分子(PAMAM)具有大量表面官能团，可用于固定抗体，其用量与电流值有关；以金标抗体作为识别元件，可提高检测信号，胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb通过共价结合的方式连接于复合材料上，金纳米粒子具有导电性，其引入提高了电活性物质的固载量，实现检测信号的放大。
本发明本发明在制备石墨烯-PAMAM复合材料时，选用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，限定了石墨烯的直径、比表面积及超声处理的时间，在电极表面形成均匀致密的膜结构，若超声时间过短，则材料不均匀，导致电极表面成膜差，易脱落。
本发明采用滴涂法构建电化学免疫传感器，由于石墨烯具有良好的导电性，结合PAMAM的表面活性，在检测转基因CP4-EPSPS蛋白时具有良好的信号响应及满意的检测灵敏度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的采用PAMAM功能化的石墨烯对电极进行修饰，配合合适的溶剂进行适当的超声处理后，可在电极表面形成均匀致密的膜结构，由于成膜均匀致密，将电极与外界氧气隔绝，使制备的免疫传感器具有较高的稳定性，该电化学免疫传感器在储存33天后，仍保持90％以上的原始电流信号值，电流变化的相对标准偏差RSD为0.31％。
利用本发明的电化学免疫传感器，识别元件中以胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb通过共价结合的方式连接于复合材料上，并采用5％BSA封闭了特异性结合位点，实现对转基因作物中耐除草剂蛋白CP4-EPSPS的定性定量检测，在实际样品的定性定量检测上具有较高的实用性及适用价值，可解决现有核酸检测技术中对仪器及专业人员的依赖，同时可以解决免疫学方法如试纸条法、ELISA法等，检测灵敏度较低、不能定量的现状。
本发明的电化学免疫传感器，具有良好的准确性，样品的回收率在80％～120％之间，RSD小于15.0％；可以检出样品中含CP4-EPSPS蛋白的转基因作物H7-1、GT73、MON88913、RRS和NK603，与含PAT蛋白的BT-176，含BT蛋白的MIR162、MON89034、MIR604无交叉反应，特异性良好。
本发明的电化学免疫传感器对作物中CP4-EPSPS蛋白的检测灵敏度高，对实际样品(如大豆、玉米)的检测灵敏度显著高于传统试纸条法的0.1％，对大豆RRS的检测灵敏度为0.01％，对玉米NK603的检测灵敏度为0.03％，且与转基因BT、PAT蛋白无交叉反应，所述电化学免疫传感器对RRS(GTS40-3-2)大豆的检出限为0.01％，对NK603玉米的检出限为0.03％。
附图说明
图1是本发明实施例中电化学免疫传感器的胶体金标记抗体最适pH结果。
图2是本发明实施例中电化学免疫传感器的胶体金标记抗体最佳抗体结合量结果。
图3-5是本发明实施例中GN-PAMAM复合材料的扫描电镜(SEM)表征结果，其中，图3为GN-PAMAM复合材料修饰电极的SEM图像；图4为GN修饰电极的SEM图像；图5为超声3h的GN与PAMAM形成的复合材料的SEM表征图。
图6是本发明实施例中电化学免疫传感器的结构示意图。
图7是本发明实施例中电化学免疫传感器组装过程中的循环伏安法(CV)表征图；其中，a：裸GCE；b：GCE/GN-PAM；c：GCE/GN-PAM/AuNPs-mAb；d：GCE/GN-PAM/AuNPs-mAb/BSA；e：GCE/GN-PAM/AuNPs-mAb/BSA/CP4-EPSPS。
图8-11是本发明实施例中电化学免疫传感器AuNPs的信号放大效果，其中，图8为GCE/GN-PAM/AuNPs-mAb/BSA作为工作电极检测RRS；图9为GCE/GN-PAM/mAb/BSA作为工作电极检测RRS；图10为GCE/GN-PAM/AuNPs-mAb/BSA作为工作电极检测NK603；图11为GCE/GN-PAM/mAb/BSA作为工作电极检测NK603。
图12-15是本发明实施例中电化学免疫传感器检测RRS大豆及NK603玉米标准品的DPV曲线及标准曲线。
图16是本发明实施例中电化学免疫传感器对不同作物的检测特异性结果。
图17是本发明实施例中电化学免疫传感器的稳定性结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
主要试剂：实验所用抗CP4-EPSPS蛋白的单克隆抗体CP4mAb购自上海容晖生物公司；胶体金采用柠檬酸三钠还原氯金酸得到，粒径约为40nm；聚酰胺-胺(PAMAM)甲醇溶液(第0代，20％)购自上海麦克林生物公司；石墨烯购自南京先丰纳米材料科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司；转基因作物种子粉末标准品购自美国AOCS(Urbana，Illinois，USA)，所有溶剂和其他化学品均为分析试剂级。
主要仪器：电化学工作站CHI 660E购自上海辰华，采用三电极体系室温检测，工作电极为玻碳电极(GCE，d＝3mm)，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极；紫外-可见吸收光谱使用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific，MA，USA)进行，磁力搅拌器购自上海司乐仪器公司。
在无特殊说明的情况下，本实施例中的百分含量是指质量分数。
实施例检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器的制备方法及应用
1)制备胶体金
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金：取1mL 1％氯金酸，加入到99mL双蒸水中，加热煮沸，准确吸取l％的柠檬酸三钠1mL，在磁力搅拌的条件下迅速加入，当液体颜色变为酒红色后，继续加热15min，得到粒径为40nm的胶体金；无菌密封，4℃避光保存。
制备的胶体金为透明的酒红色，无沉淀，无杂质，4℃放置2周后进行肉眼观察，无沉淀及聚沉现象，容器壁上无粘附现象，经NanoDrop测定胶体金最大吸收峰在525nm，粒径为40nm。
2)制备金标抗体
取1mL胶体金溶液加到棕色的西林瓶中，加入碳酸钾调节pH，在磁力搅拌下，缓慢加入适量的单克隆抗体CP4mAb，并继续搅拌反应30min，随后加入终浓度为1％的BSA封闭反应1h；
将混合液放置离心管中，4℃、l500 rpm离心15min，去除沉淀部分的游离金；12000rpm离心30min去掉上清液，沉淀用1mL金标抗体保存液(pH 7.4TB含2％蔗糖、1％BSA和0.5％Tween-20)重悬。12000rpm再离心30min去上清，用0.1mL胶体金保存液重悬，即为金标抗体复合物AuNPs-mAb，4℃避光保存。
标记后的1mL胶体金用100μL抗体保存液重悬，经计算，金标抗体的浓度为0.6μg/μL，颜色为透明的酒红色。
不同pH时胶体金和单克隆抗体CP4mAb的耦连情况：取l00μL胶体金溶液，加入0.2mol/L碳酸钾调整溶液pH值分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5后，各加入2mg/mL的单克隆抗体2μL，振荡混匀，室温反应10min。加入10μL 10％的NaCl溶液，震荡混匀，观察各管颜色变化。选择金纳米粒子未出现聚集沉淀，且溶液呈现均匀的透明酒红色的pH值为最佳标记pH值。
图1为最佳标记pH优化结果，由图1可见，肉眼观察可知，当pH为8.0时，胶体金溶液的颜色呈透明酒红色，没有凝集、褪色或变色现象，pH＜8.0及pH＞8.0时管中溶液颜色呈不同程度的灰蓝色，结果表明，pH 8.0对于胶体金和单克隆抗体CP4mAb的耦连是最合适的。
不同单克隆抗体CP4mAb用量时胶体金和单克隆抗体的耦连情况：
取100μL已将pH值调至最佳的胶体金溶液，分别加入1～9μg单克隆抗体，室温反应10min后，各加入10％NaCl溶液10μL，震荡混匀，观察各管颜色变化，选择金纳米粒子未出现聚集沉淀，且溶液呈现透明酒红色的最低抗体浓度为胶体金溶液的最小抗体结合量，图2为最佳标记抗体浓度优化结果。
当pH值处于最佳状态且单克隆抗体的量高于6μg时，如图2所示，红色保持不变且没有金颗粒凝集或溶液褪色的现象；低于6μg时，胶体金呈现较暗的红色，因此，100μL胶体金溶液时，6μg为胶体金标记抗体的最低量。
3)制备石墨烯-PAMAM复合材料
称取固体石墨烯粉末(GN，1mg)分散于1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，超声处理4h，然后加入25μL 20％的乙二胺核的树状分子PAMAM甲醇溶液，室温超声处理30min，制得PAMAM修饰的GN复合材料，备用。
GN超声4h后与PAMAM形成的复合材料如图3所示，GN超声3h后与PAMAM形成的复合材料如图5所示，图4为GN超声4h的扫描电镜表征图。比较图3、5与4可得出，超声4h是GN分散均匀的最短时间，3与5比较可得出，GN与PAMAM形成的复合材料修饰的电极可形成均匀的膜结构，而只有GN修饰时，表面不均匀，空洞较多(如图4箭头所示)，因此，本发明PAMAM的使用可显著改善GN修饰电极的膜结构；同时，由于本方案使用的PAMAM含有4个氨基，增加了抗体的耦连量，进而提高了检测灵敏度。
4)电化学免疫传感器的组装
将玻碳电极(GCE，d＝3mm)分别用不同粒径(粒径依次为1μm、0.3μm、0.05μm)的氧化铝粉在抛光布上打磨至镜面，用蒸馏水冲洗，依次在水、乙醇、水中超声3min。在清洁后的GCE上滴加5μL GN-PAMAM复合材料，并在红外灯下干燥；然后滴加5％戊二醛室温活化氨基30min；将1.8μg金标抗体AuNPs-mAb滴于GN-PAMAM修饰后的GCE电极表面，37℃反应40min。
采用PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)冲洗电极表面以去除未结合的AuNPs-mAb，随后滴加5μL含5％BSA的PBS溶液，37℃反应40min，以封闭非特异性结合位点，4℃储存备用。
图6为电极修饰过程的模拟示意图，修饰后的电极在检测转基因大豆时采用的电化学分析方法为DPV法。
5)电化学分析方法
在含有5mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)中采用差分脉冲伏安法(DPV)检测CP4-EPSPS蛋白。
参数设定为：电位范围，0～0.4V；电位增量，4mV；振幅，0.05V；脉冲宽度，0.06s；采样宽度，0.02s；静置时，2s；孵育时间是30min。电流差(ΔI)计算根据公式(1)：
ΔI＝I0–I (1)
公式中，I0为空白作物上清液电流，I为转基因作物上清液电流，所有测量均在室温下进行。
为了表征电极修饰过程，采用循环伏安法(CV)进行测量，CV扫描范围为-0.2V～0.6V，扫描速率为50mV/s，[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原探针，参见图7。
由图7可见，裸电极经复合材料修饰后，电流值最高，在耦连抗体及BSA封闭后电流均降低，连接抗原后电流值进一步降低，表明电极修饰成功。
6)金纳米粒子的信号放大作用
选择GCE/GN-PAM/AuNPs-mAb/BSA和GCE/GN-PAM/mAb/BSA作为工作电极来评估AuNPs的信号放大效果，采用DPV测定不同电极在含有0.1％，2.5％和5％转基因比例的RRS和NK603的信号值。
由图8-11可知，与GCE/GN-PAM/mAb/BSA电极(图9、11)相比，GCE/GN-PAM/AuNPs-mAb/BSA电极的电流差(ΔI)值(图8、10)减小，信号放大作用明显。
7)对转基因作物的检测灵敏度测定
将作物的种子粉末标准品与0.01M，pH 7.4的PBS缓冲液按质量体积比1：5混合，在种子粉末中加入PBS后，剧烈摇晃3～5min，然后于6000rpm离心5min，使其分层，上清用相应空白样品的上清稀释为呈线性浓度梯度的样品进行分析。
每个样品吸取5μL滴加到修饰的电极上，37℃反应40min后DPV法测定电流值，同体积的空白上清测得的电流值作为阴性对照，RRS大豆及NK603玉米标准品的标准曲线参见图12-15。
由图12-15可见，电流减小量(ΔI)与RRS的浓度范围0.025％～1.0％及NK603的浓度范围0.05％～1.5％成正比，RRS和NK603的线性回归方程分别为：ΔI＝24.874x+3.482和ΔI＝18.169x+3.2223，R2值为0.9935和0.9912，具有较高的线性关系，经计算得出，免疫传感器对RRS和NK603的检出限分别为0.01％和0.03％。
8)对不同转基因作物的检测特异性分析
含不同转基因蛋白的大豆、玉米、油菜、甜菜种子(参见表1)样品粉末(转基因比例为5％)按照质量体积比1：5的比例加入PBS进行提取，剧烈摇晃后，离心分层，取上清液测定各自DPV值I，并与相应空白样品DPV值I0比较，通过ΔI＝I-I0判定该免疫传感器在检测不同作物的特异性。
表1电化学传感器性能评价所用的作物种子粉末标品
编号 种类 转基因类型 含量
1 空白玉米 / /
2 玉米MIR162 BT-VIP3Aa 5％
3 玉米MIR604 BT-Cry3A 5％
4 玉米MON89034 BT-Cry1A105/Cry2Ab 5％
5 玉米BT-176 BT-Cry1Ac/PAT 5％
6 玉米NK603 CP4-EPSPS 5％
7 空白油菜 / /
8 油菜GT73 CP4-EPSPS 100％
9 空白大豆 / /
10 大豆RRS CP4-EPSPS 100％
11 空白棉花 / /
12 棉花MON88913 CP4-EPSPS 100％
13 空白甜菜 / /
14 甜菜H7-1 CP4-EPSPS 100％
注：其中，“/”表示无转基因蛋白。
免疫传感器对不同作物的检测特异性结果见图16，可以看出，本发明的免疫传感器可以检出含CP4-EPSPS蛋白的H7-1、GT73、MON88913、RRS、NK603样品(ΔI＞27.8μA)，与含PAT蛋白的BT-176、含BT蛋白的MIR162、MON89034、MIR604(ΔI＜6.1μA，P＜0.05)无交叉反应，特异性良好。
9)免疫传感器的储存稳定性
将修饰后的玻碳电极(CV峰值118μA)干燥密封包装后置于4℃冰箱储存33天后，采用CV法测定修饰电极储存前后电流的变化率。
免疫传感器在储存33d后，CV法连续扫描15圈的电流信号值(见图17)，储存33d后的最大电流值为106.6μA，即仍保持90.3％的原始电流信号值，计算其15圈的电流变化的相对标准偏差(RSD)为0.31％，表明具有较高的稳定性。
10)对实际样品的回收率
将不同已知浓度的RRS和NK603标准品(含量分别为0.05％、0.1％、0.5％和1％)添加到相应的空白样品中进行回收率测试，并检测相应的空白样品作为对照，结果见表2。
表2免疫传感器对实际样品的回收率实验结果
Figure BDA0002684225760000111
如表2所示，所有样品的回收率均在89.6％～113.8％之间，所有RSD均小于15.0％，表明该传感器具有良好的准确性。
本发明的电化学免疫传感器，可用于检测转基因大豆、玉米、油菜、甜菜等，对大豆RRS的检测灵敏度为0.01％，对玉米NK603的检测灵敏度为0.03％，且与转基因BT、PAT蛋白无交叉反应，具有灵敏度高、特异性强、检测方便、响应速度快等特点。

Claims (10)

1.一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)制备胶体金溶液
采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制得胶体金溶液，其为酒红色透明溶液，胶体金粒径20-40nm，最大紫外吸收峰在525nm；
2)制备金标抗体
取制备好的胶体金溶液，加入碳酸钾调pH至8.0，边搅拌边加入单克隆抗体CP4mAb，混匀，室温反应45-60min，加入体积分数1-3％的BSA封闭反应45-60min，离心去除沉淀中的游离金，再离心去掉上清液，沉淀用金标抗体保存液重悬，重悬液离心后去上清，再重悬，得到复合物AuNPs-mAb即金标抗体；
其中，单克隆抗体CP4mAb与胶体金溶液的质量体积比为60-72μg：1mL；
3)制备石墨烯-PAMAM复合材料
称取固体石墨烯粉末分散于N,N-二甲基甲酰胺中，超声处理至少4h，然后加入乙二胺核的树状分子PAMAM，室温超声处理至少30min，制得石墨烯-PAMAM复合材料；
4)组装电化学免疫传感器
将玻碳电极分别用粒径逐次减小的氧化铝粉多次抛光打磨至镜面，冲洗，依次在水、乙醇、水中超声，向玻碳电极表面滴加5-7.5μL石墨烯-PAMAM复合材料进行修饰，并在红外灯下干燥；
然后滴加戊二醛室温活化PAMAM中的氨基30-40min，将1.5-1.8μg金标抗体滴于经石墨烯-PAMAM修饰后的玻碳电极，进行反应结合，反应完毕后去除未结合的AuNPs-mAb，再滴加5-10μL含5％BSA的PBS溶液，封闭非特异性结合位点，得到所述电化学免疫传感器。
2.利用权利要求1所述方法制备得到的电化学免疫传感器，其包括玻碳电极和识别元件；其特征在于，所述玻碳电极表面经复合材料修饰，所述复合材料由石墨烯与乙二胺核的树状分子PAMAM超声形成；所述识别元件为金标抗体，其为胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb，金标抗体通过共价结合的方式连接于玻碳电极表面的复合材料上，再由5％BSA对修饰电极的非特异性结合位点进行封闭。
3.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述乙二胺核的树状分子PAMAM溶于甲醇溶液，与石墨烯在N,N-二甲基甲酰胺中超声4h以上获得复合材料，所述石墨烯、N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液的质量体积比0.5-1：1：0.025-0.05，石墨烯单位为mg，N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液单位为mL。
4.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述玻碳电极表面用于修饰的复合材料用量为5-7.5μL，金标抗体的使用量为1.5-1.8μg。
5.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述金标抗体中，所述胶体金的粒径为20-40nm，单克隆抗体CP4mAb与胶体金溶液的质量体积比为60-72μg：1mL。
6.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，在储存33天后，仍保持90％以上的原始电流信号值，电流变化的相对标准偏差为0.31％。
7.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述电化学免疫传感器对RRS大豆的检出限为0.01％，对NK603玉米的检出限为0.03％。
8.如权利要求2-7任一项所述的电化学免疫传感器在转基因蛋白的定量检测中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，通过差分脉冲伏安法，测定一系列浓度梯度标准品的最高电流值I，测定空白样品电流峰值I0，以I-I0值绘制标准曲线，检测样品的DPV值Is，将Is-I0带入标准曲线中，获得样品中转基因蛋白的实际含量，实现转基因蛋白的定量检测。
10.如权利要求8所述应用，其特征在于，在含有[Fe(CN)6]3-/4-和KCl的PBS缓冲液中，采用差分脉冲伏安法检测CP4-EPSPS蛋白，CV扫描范围为-0.2V～0.6V，扫描速率为50mV/s，以[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原探针。
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