CN111398137A - 一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法及其应用，涉及食品安全、临床诊断和环境监测领域，该方法包括以下步骤：根据待测物的种类N，N大于等于1，选取N份粒径不同的绝缘微球并与待测物一一对应；根据待测物，在相应的绝缘微球表面修饰特异性识别分子，与待测物作用后磁分离，使用颗粒计数器对未反应的绝缘微球数量进行测定；待测物包括生物标志物、药物残留物、抗生素和/或细菌。本发明通过免疫反应、DNA分子杂交等方法建立待测物与微球个数之间的定量关系，再通过电阻微米孔颗粒计数器对绝缘微球的个数进行测定，间接得到待测物的浓度，本发明不仅能够实现多指标同时检测，且成本较低，稳定性好，准确度较高。

Description

一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及食品安全、临床诊断和环境监测领域，具体涉及一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法及其应用。
背景技术
食品安全、环境污染和人类健康是目前备受关注的民生问题，与之相应的食品检测、环境监测和临床诊断是改善上述问题的基础。目前，食品检测、环境检测和临床诊断中使用最广泛的检测方法通常包括仪器分析法、免疫分析法和分子诊断技术。
仪器分析法具有灵敏度高、准确性好的优势，但是样品前处理较复杂、耗时较长、检测成本较高，且不适合现场或者临床检测。
胶体金免疫层析试纸条法、酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法是目前应用最为广泛的免疫检测方法，胶体金免疫层析试纸条因其具有分析速度快、操作简单的特点，在食品安全快速检测和临床诊断等领域得到了广泛的应用，但该试纸条的灵敏度偏低，难以检测痕量的目标物；酶联免疫分析法的灵敏度虽然比胶体金免疫层析试纸条高，但是每次只能针对一种目标物进行检测，且每次检测均需要进行较为繁琐的操作，检测速度较慢；化学发光免疫分析法具有较高的灵敏度，但是不仅需要酶的催化，而且操作步骤比较繁琐，每次只能针对一种目标物进行检测，当目标物较多时，需要耗费大量的时间和成本。
分子诊断技术具有灵敏度高、特异性强等优点，但是，对检测环境要求较苛刻，容易被外部环境污染，且设备成本较高，难以用于现场快速检测。
近年来，流式细胞仪、液相悬浮芯片技术和基于纳米孔的电化学检测方法逐步兴起并受到一定关注，流式细胞仪和液相悬浮芯片技术因其灵敏度高、可实现多个目标物同时检测的特性得到了研究者的广泛关注，但其仪器昂贵，检测成本高，不利于推广使用；而基于纳米孔的电化学检测方法虽然具有较高的灵敏度，但是在检测时，随着灵敏度的提高，其受到的外部干扰因素越多，例如复杂样品中基质的干扰，导致稳定性较差，难以用于复杂样品的检测分析。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法及其应用，不仅能够实现多指标同时检测，且成本较低，抗干扰能力强，准确度较高。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，包括以下步骤：
根据待测物的种类N，N大于等于1，选取N份粒径不同的绝缘微球并与待测物一一对应，根据所述待测物，在相应的绝缘微球表面修饰特异性识别分子后与待测物作用后磁分离，使用颗粒计数器对未反应的所述绝缘微球数量进行测定；
所述待测物包括生物标志物、药物残留物、抗生素和细菌。
在上述技术方案的基础上，所述绝缘微球选用高分子微球，所述高分子微球包括聚苯乙烯微球、聚乳酸微球、聚丁二烯微球和聚异戊二烯微球。
在上述技术方案的基础上，所述颗粒计数器包括小孔管和电解液，所述小孔管浸泡在电解液中，所述小孔管的侧壁上开有供颗粒物通过的小孔结构，所述小孔管的外部和内部各设置有一电极，位于小孔管内部的电极为阴电极，位于小孔管外部，且浸润在电解液中的电极为阳电极，两所述电极之间通过一电源连接，且两所述电极之间设置有信号测量仪。
在上述技术方案的基础上，所述电源上串联一电阻，一电压器并联在所述电源、电阻的两端，用于测定信号。
在上述技术方案的基础上，当所述待测物为生物标志物时，制备纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物，将过量的纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物加入相应的生物标志物溶液中进行双抗夹心免疫反应后进行磁分离，取上清液中未反应的微球-检测抗体偶联物用颗粒计数器测定颗粒数。
在上述技术方案的基础上，当所述待测物为药物残留物时，制备纳米磁颗粒-药物抗体偶联物、微球-完全抗原偶联物，加入待测药物残留物溶液中，进行竞争免疫反应后进行磁分离，取上清液中未反应的微球-完全抗原偶联物用颗粒计数器测定颗粒数。
在上述技术方案的基础上，当所述待测物为多种抗生素时，制备相应的纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-完全抗原偶联物，不同抗生素对应的微球大小不同，将所有的过量纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-完全抗原偶联物加入相应的待测抗生素溶液中反应后进行磁分离，取上清液用颗粒计数器测量未反应微球-完全抗原偶联物的颗粒个数。
在上述技术方案的基础上，当所述待测物为细菌时，制备微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针，提取细菌DNA并进行目标基因单重PCR扩增，扩增后加入过量的微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针进行DNA杂交反应后磁分离，用颗粒计数器测定上清液中未反应微球-检测探针的颗粒数。
一种基于所述检测方法的应用，其用于检测生物标志物、药物残留物、抗生素和/或细菌。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的检测方法比较简单、稳定性好、成本较低，由于聚苯乙烯(PS)微球本身为绝缘体，其与识别分子(抗体、DNA探针等)特异性结合后也为绝缘体，将识别分子-PS微球分散在电解液中，通过测定电解液中的电压脉冲峰值大小和数量，能够计算出识别分子-PS微球的粒径和数量，由于识别分子-PS微球的数量和待测物的含量是相关的，因此通过计算PS微球的数量，可以间接得到待检测物质的含量，这是该方法定量的原理和基础。
因此，整个方法的分析性能很大程度上取决于信号探针PS微球的性质，而PS微球本身具有良好的稳定性、粒径大小可控、价廉、易进行标记等优点，与荧光微球或者免疫标记酶相比，PS微球的稳定性更为优异，不需要避光保存，室温下可以稳定存储6个月，并且合成PS微球的难度也远远低于荧光微球，因此更加稳定，价格也更低。正是由于PS微球具有如此优异的性质，所以整个方法具有稳定性好，成本低等优势。
(2)本发明的检测方法可以实现多指标同时检测并且线性范围可调，在该方法中，电压脉冲峰值和PS微球的粒径成三次方的关系，粒径越大，单个PS微球产生的信号就越强。因此，不同粒径PS微球在颗粒计数器中的灵敏度和脉冲信号是有显著差别的，进而可以实现对不同粒径PS微球的信号读出。基于此，以不同粒径大小的PS微球作为多元信号探针，可以实现对同一样品中不同目标物的同时检测。
在此基础上，我们还可以根据目标物浓度的不同，有针对性地选择粒径不同的PS微球。对于低浓度的目标物，我们选择粒径大的PS微球作为信号探针，实现高灵敏的检测；对于浓度比较高的目标物，我们可以选择小粒径的PS微球作为信号探针，从而实现线性范围的可调。
因此，本方法相比于传统的检测方法，不仅灵敏度高，而且线性范围可调，同时仅仅通过改变PS微球的粒径就可以实现对同一样品中浓度高和浓度低的不同目标物进行检测。更为重要的是，合成粒径不同的PS微球的方法和技术已极为成熟，因此可以保证该方法的可操作性和实用性。
(3)本发明的检测方法抗干扰能力强：在复杂的样品中，存在复杂的蛋白质、脂肪等组分，在相同的数量级的条件下，这些蛋白质、脂肪的粒径和PS微球的粒径相比，基本可以忽略不计，故样品中的蛋白质，脂肪等对信号的影响可以忽略不计，使得本发明方法的信噪比很高，几乎是零信号背景，基于此，本发明方法的抗干扰能力很强，可以实现复杂样品中的痕量目标物的检测。
(4)本方法的分析对象广泛，设备便携性能好。本发明中基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，能够实现对PS微球的定量检出，且经修饰特异性识别分子后能够对抗生素、病毒、细菌、蛋白质等进行特异性结合，因此，能够对相对应的抗生素、病毒、细菌、蛋白质进行定量检测，其检出限较低，灵敏度高，检测范围较宽，方法简单，耗时较短，仪器设备成本较低，体积较小，便于随身携带并实现现场和临床检测。
附图说明
图1为本发明实施例中基于电阻微米孔颗粒计数器检测方法的原理图；
图2为本发明实施例中基于电阻微米孔颗粒计数器的结构示意图；
图3为本发明实施例中基于电阻微米孔颗粒计数器的分析方法检测不同待检测的示意图；
图4为本发明实施例中不同粒径PS微球偶联HRP后信号读出方式灵敏度比较结果；
图5为本发明实施例中检测降钙素原的反应原理图；
图6为本发明实施例中检测降钙素原时微球颗粒数随PCT浓度变化的示意图；
图7为本发明实施例中检测莱克多巴胺的反应原理图；
图8为本发明实施例中检测莱克多巴胺时颗粒数随莱克多巴胺浓度变化的示意图；
图9为本发明实施例中检测不同抗生素的反应原理图；
图10a为本发明实施例中检测不同抗生素时颗粒数随抗生素浓度变化的示意图；
图10b为不同抗生素的线性范围示意图；
图11为本发明实施例中检测沙门氏菌的反应原理图；
图12为本发明实施例中检测沙门氏菌时颗粒数随沙门氏菌浓度变化的示意图；
图13为本发明实例中“PS微球-检测探针-沙门氏菌核酸-MNPs-捕获探针”杂交复合物扫描电镜表征图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
参见图1所示，本发明实施例提供一种基于电阻微米孔颗粒计数器的计数原理图，其计数原理如下：
对一长度为L，横截面积为S的圆柱形小孔，其内部充满电阻率为ρ的电解液，该小孔两端的电阻为：
Figure BDA0002436503530000071
当有绝缘颗粒进入小孔时，会占去一部分导电空间，导致小孔两端的电阻发生改变，设颗粒是任意形状的，取小孔的任一轴向位置z，在该位置颗粒的横截面积为A(显然，A是z的函数)，该截面上小孔的有效导电面积为：
S-A(z)
故该位置一小段长度dz上的电阻值为：
Figure BDA0002436503530000072
当
Figure BDA0002436503530000073
时，
Figure BDA0002436503530000074
故小孔总电阻为：
Figure BDA0002436503530000075
因为
Figure BDA0002436503530000076
Figure BDA0002436503530000077
(颗粒体积)
故
Figure BDA0002436503530000078
其中，电阻增量
Figure BDA0002436503530000079
即电阻增量与颗粒的体积成正比。
参见图2所示，将小孔管浸泡在电解液中，小孔管的侧壁上开有供颗粒物通过的小孔结构，该小孔管的外部和内部各设置有一电极，且两电极之间通过一电源连接，电源上串联一电阻，一电压器并联在电源、电阻的两端，位于小孔管内部的电极为阴电极，位于小孔管外部，且浸润在电解液中的电极为阳电极。
电流可以通过孔壁上的小孔结构从阳极流到阴极，当小孔管内部处于低气压状态时，管外的液体将源源不断地流动到管内，此时，分散在电解液中的颗粒物能够随着电解液的运动通过小孔结构进入小孔管内部。
当颗粒物经过小孔时，两电极之间的电阻增大，电压升高，产生一个电压脉冲。当电源是恒流源时，电压脉冲的峰值正比于小孔电阻的增量，也正比于颗粒体积，在圆球假设下，可换算成颗粒直径，因此，只要准确测出每一个电压脉冲的峰值，即可得出各颗粒的大小，统计出颗粒分布。
本发明将不同粒径的绝缘微球作为信号探针，其中，绝缘微球选用高分子微球，包括聚苯乙烯微球、聚乳酸微球、聚丁二烯微球和聚异戊二烯微球。本实施例中，选用粒径为1～50μm的PS微球(聚苯乙烯微球)作为信号探针，在实际使用中，绝缘微球可以根据实际需要进行选择，本发明通过在PS微球表面修饰识别分子，与待检测的物质：兽药、抗生素、蛋白质、食源性致病菌发生特异性结合。通过基于抗体-抗原的免疫反应、DNA杂交反应等建立待测物与微球个数之间的定量关系，再通过电阻微米孔颗粒计数器对绝缘微球的个数进行测定，间接得到待测物的浓度。
对于球形PS微球颗粒，其体积为：
Vps＝(4/3)πr3
因此，对于不同粒径大小的PS微球，可以得出其对电解液的电阻增量存在显著差别，颗粒越大，电阻增量越大，即不同粒径PS微球在颗粒计数器中的灵敏度和脉冲信号是有显著差别的，脉冲信号和PS微球的粒径成三次方的比例。
故可以通过不同粒径PS微球对电解液电阻增量的影响，实现对不同颗粒大小PS微球的粒径分析和体积分析，并对单位体积内颗粒数进行准确读出，基于此，参见图3所示，以不同大小的PS微球对应不同的待检测物质，由于PS微球本身为绝缘体，其偶联识别分子后也为绝缘体，将识别分子-PS微球分散在上述电解液中，通过检测电解液中的电压脉冲峰值大小和数量，进而计算出识别分子-PS微球的粒径和数量，由于不同粒径的PS微球对应不同的待检测物质，进而能够得到待检测物质的浓度，据此通过不同粒径大小的PS微球实现多指标同时检测，针对不同物质的检测需求，实现线性范围可调。
本实施例通过在不同粒径的PS微球表面修饰辣根过氧化物酶(HRP)和抗体(Ab)后，将Ab-PS-HRP其作为一种酶标记的抗体探针，构建基于PS微球的酶催化的免疫分析方法，作为该方法的对比方法。
参见图4所示，在相同条件下，与传统的酶联免疫法相比，本实施例检测方法的响应浓度更低，即具有更高的灵敏度。
下面，通过4个实施例进行详细说明。
实施例1采用“双抗夹心法”检测生物标志物降钙素原(以下简称PCT)
S1、制备磁纳米颗粒-捕获抗体(MNPs-Ab1)偶联物，其中磁纳米颗粒是粒径为180nm
S101、取200μL浓度为10mg/mL、粒径为180nm的COOH-MNPs，用去离子水洗涤两次，再用500μL去离子水重悬，加入30μL浓度为10mg/mL的EDC和15μL浓度为10mg/mL的NHS在室温下活化15～20分钟。
S102、磁分离去除多余的EDC和NHS，用pH＝7.4的500μLPBS重悬，得到MNPs重悬液，用PBS将识别PCT的Ab1稀释至1mg/mL，取100μL 1mg/mLAb1加入至MNPs重悬液中，室温下震荡反应2h后，再加入200μL浓度为3％的BSA溶液，室温下震荡反应30min，磁分离后去除清液，用PBST洗涤4-5次，得到MNPs-Ab1，将MNPs-Ab1置于1mLPBS中重悬保存于4℃备用。
S2、PS微球-检测抗体偶联物(PS-Ab2)的制备，PS微球的粒径为3μm。
S201、取100μL浓度为3μm COOH-PS，用去离子水洗涤两次，离心分离，再用100μL去离子水重悬，加入50μL浓度为10mg/mL的EDC和25μL浓度为10mg/mL的NHS活化20分钟，离心分离，去除多余的EDC和NHS，用100μLPBS重悬，得到PS重悬液。
S202、用PBS将PCT检测抗体(Ab2)稀释至1mg/mL，取100μL 1mg/mLAb2加入至PS重悬液中，室温下震荡反应2h，加入50μL的3％BSA溶液于反应液中，室温下震荡反应30min进行封闭，离心分离后去除清液，用PBST洗涤4-5次，得到PS-Ab2，将PS-Ab2加入1mL PBS中重悬保存于4℃备用。
S3、“双抗夹心法”检测PCT
S301、使用PBS缓冲液将浓度为1μg/mL的PCT进行梯度稀释至500、100、50、10、5、2、1、0.5ng/mL，将MNPs-Ab1偶联物重悬液稀释2倍，将PS-Ab2偶联物重悬液稀释100倍。
S302、取100μLPCT加入到100μLMNPs-Ab1偶联物重悬液中，37℃下震荡反应1小时，磁分离，去除清液，用PBST洗涤2次，得到MNPs-Ab1-PCT复合物。
S303、取100μLPS-Ab2重悬液分别加至MNPs-Ab1-PCT复合物中，37℃下震荡反应1小时，磁分离后，用PBST洗涤4次，收集清液，取100μL清液用颗粒计数器测定颗粒数。
参见图5所示，为本实施例的检测示意图，根据上述步骤可知，本实施例中待测的PCT先与过量的MNPs-Ab1偶联物反应，使所有PCT均与MNPs-Ab1反应，磁分离后使MNPs-Ab1-PCT与过量的PS-Ab2反应得到MNPs-Ab1-PCT-Ab2-PS，经过再次磁分离，将未反应的PS-Ab2分离出来，并加入计数器的电解液中，测定电压脉冲峰值并确定颗粒数，样品中PCT含量越高，形成的MNPs-Ab1-PCT-Ab2-PS复合物就越多，未反应的PS-Ab2偶联物就越少。根据未反应PS-Ab2颗粒数与PCT浓度之间的对应关系，由此可以实现对PCT的定量检测。
参见图6所示，测定的PS-Ab2颗粒数与PCT浓度的变化呈现良好的线性关系，当PCT的浓度为0.5ng/mL～100ng/mL时，未反应的PS-Ab2颗粒数和PCT的浓度具有良好的线性相关性，相关方程是Y＝－609X+2845.8(R2＝0.99，X为PCT浓度的对数值)。
实施例2通过竞争免疫分析反应，实现了对猪尿液中兽药残留莱克多巴胺的检测
S1、磁纳米颗粒-莱克多巴胺抗体(MNPs-Ab)偶联物的制备，磁纳米颗粒是粒径为1μm的COOH-MNPs
取200μL浓度为10mg/mL、粒径为1μm的COOH-MNPs，用纯水清洗两次，磁分离，再用500μL纯水重悬，加入50μL浓度为10mg/mL的EDC和25μL浓度为10mg/mL的NHS，在室温下活化15～20分钟后磁分离，去除多余的EDC和NHS，用pH＝7.4的500μL的PBS重悬，加入0.2mg莱克多巴胺抗体，室温下震荡反应2h，再加入200μL的3％BSA溶液于反应液中，室温下震荡反应30min进行封闭，磁分离并去除清液，用PBST洗涤4-5次，得到MNPs-Ab，用1mLPBS重悬保存于4℃备用。
S2、PS微球-完全抗原偶联物的制备，PS微球的粒径为3μm
取300μL浓度为10mg/mL、粒径为3μm的COOH-PS，用纯水清洗两次，离心分离，用2mL纯水重悬，加入50μL浓度为10mg/mL的EDC和25μL浓度为10mg/mL的NHS，在室温下活化20分钟，离心分离，去除多余的EDC和NHS，用pH＝7.4的2mL PBS重悬，加入0.2mg BSA-Rac完全抗原，室温下震荡反应2h，再加入500μL的3％BSA溶液于反应液中，室温下震荡反应30min进行封闭，离心分离后去除清液，用PBST洗涤4-5次，得到PS-BSA-Rac，最后用2mLPBS重悬保存于4℃备用。
S3、一步竞争免疫法检测莱克多巴胺(Rac)
使用PBS缓冲液将Rac标准品稀释至500、200、100、10、1、0.1ng/mL；将MNPs-Ab用PBS稀释1.5倍；将PS-BSA-Rac用PBS稀释50倍，取50μLMNPs-Ab稀释液和100μL PS-BSA-Rac稀释液混合；向所有混合液中分别加入50μL不同浓度的Rac标品溶液，在37℃下震荡反应45min，磁分离后，取上清液稀释10倍用颗粒计数器检测未反应的PS-BSA-Rac颗粒数。
参见图7所示，Rac和PS-BSA-Rac竞争性地与MNPs-Ab进行免疫反应，当样品中Rac浓度高时，PS-BSA-Rac和MNPs-Ab结合的量就少，未反应的PS-BSA-Rac的量较多，因此通过测量未反应的PS-BSA-Rac的量就可以建立PS-BSA-Rac颗粒个数和Rac浓度的相关性。因此未反应的PS-BSA-Rac与反应的Rac浓度相对应。
参见图8所示，测定的未反应的PS-BSA-Rac颗粒数与莱克多巴胺(Rac)浓度的变化呈现良好的线性关系，当Rac的浓度为10-1000ng/mL,未反应的PS-BSA-Rac颗粒数和莱克多巴胺(Rac)的含量有良好的线性关系，其相关方程为Y＝631.1X－360.4(X为Rac浓度的对数值，R2＝0.998)。
实施例3
通过免疫分析反应，实现了对牛奶中抗生素(新霉素、磺胺类、氯霉素)的多指标同时检测。
S301、除所使用的抗体不同外，其与步骤均与S301相同，得到MNPs-抗体，包括MNPs-新霉素抗体，MNPs-磺胺类抗体和MNPs-磺胺类抗体，其中，磁纳米颗粒是粒径为1000nm。
S302、除所使用的抗原不同，新霉素、磺胺类、氯霉素所对应的PS微球粒径分别为1μm、3μm和10μm外，其余步骤均与S302相同，制备PS微球-完全抗原包括制备PS-氯霉素完全抗原，PS-磺胺类完全抗原和PS-新霉素类完全抗原，其中，不同的抗生素对应的PS微球直径不相同，本实施例中，氯霉素对应的微球直径为10μm，磺胺类对应的微球直径为3μm，新霉素对应的微球直径为1μm。
S303、用PBS缓冲液将氯霉素稀释至5×105、5×104、5000、1000、500、200、100、10pg/mL，将磺胺类抗生素稀释至1000、500、200、100、10、1ng/mL，将新霉素稀释至100、50、20、10、5、2、1、0.1μg/mL，MNPs-抗体偶联物用PBS稀释1.5倍；将PS-完全抗原偶联物用PBS稀释50倍。
S304、取50μLMNPs-抗体稀释液和100μL PS-抗生素完全抗原稀释液混合，分别加入50μL不同浓度的相应抗生素标准品溶液，在37℃下震荡反应45min，磁分离后，取不同上清液各100μL用颗粒计数器检测溶液中未反应的PS-抗生素完全抗原的颗粒数，经换算即可得到目标物浓度。
参见图9所示，不同粒径的PS微球所对应的脉冲大小不相同，因此，能够对PS微球进行有效分辨，新霉素、磺胺类、氯霉素在浓度不相同的情况下，所对应的微球数量不相同，因此，能够通过测定未反应的PS微球的个数，来确定相对应的新霉素、磺胺类、氯霉素的浓度。
参见图10a和图10b所示，测定的颗粒数与新霉素、磺胺类、氯霉素的浓度的变化均呈现良好的线性关系，且氯霉素浓度为10～5×104pg/mL时，磺胺类浓度为0.5～500ng/mL时，新霉素浓度为0.05～50μg/mL时，不同粒径PS的个数分别与抗生素的浓度呈线性关系，，相关的线性方程分别是Y＝149.2X+338.4(R2＝0.998)，Y＝249.5X+128.1(R2＝0.995)，Y＝261.8X－311.7(R2＝0.997)，不仅具有较高的灵敏度，且具有较宽的线性范围。
实施例4通过DNA双链杂交和磁分离检测牛奶中的沙门氏菌
S401、“PS微球-检测探针”偶联物的制备，PS微球的粒径为3μm
取300μL浓度为10mg/mL、粒径为3μm NH2-PS微球，用去离子水洗涤两次后，离心分离，用含NaHCO3浓度为10mM的PBS缓冲液重悬，加入292μg 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)在室温下反应4小时进行活化，活化后PS微球用PBS洗涤3次，备用。
在含有10mM NaOH的PBS缓冲液中加入125mM的二硫苏糖醇，再加入50nM经巯基修饰的寡核苷酸探针，室温下反应2h后加入Sulfo-SMCC活化的PS微球，在4℃下反应12h，用PBS缓冲液洗涤4-5次，得到PS微球-检测探针。
S402、“MNPs-捕获探针”偶联物的制备，磁纳米颗粒的粒径为180nm
取500μL 180nmNH2-MNPs，用去离子水洗涤两次后，磁分离，用含10mM NaHCO3的PBS缓冲液重悬，加入472μg Sulpho-SMCC在室温下反应4小时进行活化，活化后磁分离用PBS洗涤3次。
在含有10mM NaOH的PBS缓冲液中加入125mM的二硫苏糖醇，再加入50nM经巯基修饰的寡核苷酸探针，室温下反应2h后加经活化的MNPs在4℃下反应12h，再用PBS缓冲液洗涤4-5次，得到MNPs-捕获探针。
S403、沙门氏菌DNA的提取及目标基因单重PCR扩增
将沙门氏菌在37℃肉汤培养基中培养至生长稳定期，取3mL菌液在4℃10000rpm条件下离心5min，取沉淀物用超纯水清洗后，100μL超纯水重悬，在100℃下水浴15分钟后立即用冰水浴冷却，离心后收集上层中包含沙门氏菌DNA的清液，作为PCR反应的模板。
将10×PCR缓冲液5.0μL，5.0μL含沙门氏菌DNA的清液，上、下游引物各1.0μL(10μM)，1.0μL DNA聚合酶(5U/μL)，1.0μL dNTP(10mM)，3.0μLMgCl2和33μL超纯水混合后，在94℃预变性4min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，72℃延伸10min，完成目标基因单重PCR扩增。
其中，沙门氏菌DNA，上、下游引物，DNA聚合酶，dNTP均为现有的结构，目前公开的文献中已详细记载，此处不再赘述。
S404、DNA杂交反应检测沙门氏菌
取10μL的PCR扩增产物、20μL的PS微球-检测探针偶联物和20μL的MNPs-捕获探针偶联物，用杂交缓冲液补至200μL后于40℃下孵育30min，得到杂交复合物，使用杂交缓冲液洗涤杂交复合物5次，磁分离，保留上清液，用颗粒计数器测定清液中未反应PS微球颗粒个数，即可得沙门氏菌含量。
参见图11所示可知，过量的PS微球-检测探针偶联物先与PCR扩增产物互补配对，然后与过量的MNPs-捕获探针偶联物作用，得到杂交复合物，经过磁分离去除未反应的MNPs-捕获探针偶联物和杂交复合物后，溶液中残留的为未反应的PS微球-检测探针偶联物，通过测定未反应的PS微球-检测探针偶联物的数量，与总反应的PS微球-检测探针偶联物进行差值计算，即可以对应计算出PCR扩增产物的数量。
参见图12可知，沙门氏菌的浓度与测量的颗粒数呈良好的线性关系，在沙门氏菌的浓度为103～107范围内，沙门氏菌的浓度与颗粒数呈线性关系，相关方程是Y＝－94.9X+3266.9(R2＝0.99)，不仅具有较高的灵敏度，且具有较宽的线性范围。
参见图13所示，该图为“PS微球-检测探针-沙门氏菌核酸-MNPs-捕获探针”杂交复合物的扫描电镜表征图，沙门氏菌核酸-MNPs-捕获探针紧密结合在PS微球的表面，且每个PS微球表面能够结合多个沙门氏菌核酸-MNPs-捕获探针，由此可知，通过DNA杂交能够实现PS微球与磁颗粒的特异性结合，说明本发明的方法具有可行性。
本发明实施例中使用的试剂和材料、溶液、仪器如下：
试剂和材料：
牛血清白蛋白(BSA)(Amresco，USA)，1000nm羧基磁性纳米颗粒(10mg/mL)(OceanNanoTech，USA)。辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素、新霉素、磺胺甲基嘧啶来自Sigma-Aldrich公司，氯霉素-BSA偶联物、新霉素-BSA偶联物、磺胺-BSA偶联物、鼠抗氯霉素抗体、鼠抗新霉素抗体和鼠抗磺胺抗体来自于北京泽扬生物科技有限公司。粒径为1、3、10μm的羧基聚苯乙烯(PS)微球，3μm氨基PS微球(10mg/mL)来自Bangs Laboratories,Inc。180nm羧基和氨基磁性纳米颗粒(10mg/mL)购自上海奥润微纳新材料科技有限公司。莱克多巴胺完全抗原、鼠抗莱克多巴胺抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG来自碧云天生物技术有限公司。吐温-20(Amresco,USA)，0.9％氯化钠生理盐水来自湖北宏远达生物科技有限公司。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活泼酯(sulfo-NHS)购自美国Sigma公司。沙门氏菌检测探针和捕获探针由武汉擎科生物有限公司设计并合成。
溶液配制：
磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.00g NaCl，0.20g KCl，0.20g KH2PO4和2.90g Na2HPO4·12H2O溶于1000mL水中，摇匀。
封闭液：称取1.2g BSA于40mL PBS中，摇匀，配成3％BSA封闭液。
洗涤液：在配制好的1000mL磷酸盐缓冲液中加入0.5mL吐温-20，摇匀，配成PBST洗涤液。
仪器：
电阻法(库尔特)颗粒计数器购自珠海欧美克仪器有限公司；磁分离架购自OceanNanoTech(USA)。
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (9)

1.一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
根据待测物的种类N，N大于等于1，选取N份粒径不同的绝缘微球并与待测物一一对应，根据所述待测物，在相应的绝缘微球表面修饰特异性识别分子后与待测物作用后磁分离，使用颗粒计数器对未反应的所述绝缘微球数量进行测定；
所述待测物包括生物标志物、药物残留物、抗生素和/或细菌。
2.如权利要求1所述的一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，其特征在于：所述绝缘微球选用高分子微球，所述高分子微球包括聚苯乙烯微球、聚乳酸微球、聚丁二烯微球和聚异戊二烯微球。
3.如权利要求1所述的一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，其特征在于：所述颗粒计数器包括小孔管和电解液，所述小孔管浸泡在电解液中，所述小孔管的侧壁上开有供颗粒物通过的小孔结构，所述小孔管的外部和内部各设置有一电极，位于小孔管内部的电极为阴电极，位于小孔管外部，且浸润在电解液中的电极为阳电极，两所述电极之间通过一电源连接，且两所述电极之间设置有信号测量仪。
4.如权利要求3所述的一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，其特征在于：所述电源上串联一电阻，一电压器并联在所述电源、电阻的两端，用于测定信号。
5.如权利要求1所述的一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，其特征在于：当所述待测物为生物标志物时，制备纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物，将过量的纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物加入相应的生物标志物溶液中进行双抗夹心免疫反应后进行磁分离，取上清液中未反应的微球-检测抗体偶联物用颗粒计数器测定颗粒数。
6.如权利要求1所述的一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，其特征在于：当所述待测物为药物残留物时，制备纳米磁颗粒-药物抗体偶联物、微球-完全抗原偶联物，加入待测药物残留物溶液中，进行竞争免疫反应后进行磁分离，取上清液中未反应的微球-完全抗原偶联物用颗粒计数器测定颗粒数。
7.如权利要求1所述的一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，其特征在于：当所述待测物为多种抗生素时，制备相应的纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-完全抗原偶联物，不同抗生素对应的微球大小不同，将所有的过量纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-完全抗原偶联物加入相应的待测抗生素溶液中反应后进行磁分离，取上清液用颗粒计数器测量未反应微球-完全抗原偶联物的颗粒数。
8.如权利要求1所述的一种基于电阻微米孔颗粒计数器的检测方法，其特征在于：当所述待测物为细菌时，制备微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针，提取细菌DNA并进行目标基因单重PCR扩增，扩增后加入过量的微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针进行DNA杂交反应后磁分离，用颗粒计数器测定上清液中未反应微球-检测探针的颗粒数。
9.一种基于权利要求1至8中任一项所述检测方法的应用，其特征在于：其用于检测生物标志物、药物残留物、抗生素和/或细菌。
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