CN112595759B - 一种基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的均相分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的均相分析方法,将生物识别分子分别修饰在绝缘微球的表面,然后加入待测目标物进行生物反应,在微通道两端施加恒定的电压或电流,形成闭环电路,混合液在电渗流驱动下流经微通道,绝缘微球在通过微通道时导致闭环电路的电阻上升,并且上升幅度与绝缘微球的聚集状态相关,通过检测闭环电路的电流或电压的变化值从而可间接得到待测目标物含量。本发明无需任何洗涤、分离步骤,仅涉及一步生化反应,从而在保证准确度的前提下,极大地缩短了分析时间,具有准确、快速、成本低等优点,在食品安全、体外诊断、环境监测等需要现场快速检测的领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于检测领域,涉及一种均相分析方法,尤其是一种基于绝缘微球分散状态变化导致微通道电阻改变的均相分析方法。
背景技术
发展准确、操作简便、检测速度快、成本低的检测方法和配套设备在食品安全、体外诊断、环境监测等领域具有重大意义。一种有效的策略是利用无需分离特异性识别组分和其与目标物形成的复合物的方式,即均相测定形式。此类方法依赖如下原理,检测信号的开启或关闭取决于特异性结合反应。相反,异相测定形式依赖于对结合和游离的特异性识别组分进行物理分离,其中包含大量洗涤步骤,不仅费时费力,而且使操作更加复杂,容易出现累积误差。目前,应用较为广泛的均相测定形式主要基于荧光或化学发光检测,如荧光共振能量转移(FRET)、空间邻近化学发光(SPARCL)等方式。应该指出,在分析测定领域,“均相”仅代表无需分离步骤,与物理化学中的定义不同。例如,一种基于电极邻近的钌离子的氧化还原反应的电化学发光测定,虽然涉及固相(修饰电极)的使用,但其并不需要分离步骤,依然属于均相测定范畴。
通常,传统的均相测定形式之所以可以避免分离步骤,在于生物识别分子和目标物的特异性结合导致标记物距离拉近或局部浓度升高,从而可以发生能量共振转移或局部反应速率加快,致使特异性信号与背景信号区分开来。但是,此类方法通常需要专门的标记物和精密的检测设备,成本较高;另外,这种特异性信号属于距离诱导间接产生,附加了后续物理化学过程,如能量共振转移、氧化还原反应等,增加了方法的不稳定性。然而,食品安全、体外诊断、环境监测等领域不断追求分析方法的低成本、稳定性,如何从根本上克服当前均相测定方法的不足依然存在着挑战。
为解决这一问题,前期工作中,我们将生物识别分子修饰在微米级别的绝缘微球上,目标物的存在会引起绝缘微球分散状态的改变,以双抗夹心法为例,待测抗原与抗体的结合会导致绝缘微球的聚集,之后以小孔电阻颗粒计数技术对溶液中绝缘微球的粒径分布进行检测,从而对目标物进行定量分析。该方法仅需一步生物化学反应,即目标物的特异性识别结合,不仅稳定性好,同时不需要分离、洗涤,是一种“样品进、结果出”的均相反应模式。但是,该方法采用小孔电阻颗粒计数需要较昂贵的仪器,不利于该方法的进一步应用。
于是,我们提出基于微通道的电阻分析方法。在该方法中,绝缘微球在电渗流的作用下通过微通道时,由于存在阻塞效应,将会导致微通道内电阻的改变,进而可以引起电流或电压的改变。同时,我们预测绝缘微球分散状态的不同,其引起电阻改变的能力也不同。因此,目标物和生物识别分子的特异性结合将诱导溶液中绝缘微球状态发生改变,绝缘微球从原来的分散状态变成聚集状态。在相同条件下,处于聚集状态的绝缘微球聚集体和处于分散状态绝缘微球在电渗作用下通过微通道时引起电阻改变的能力不同,可以直接将电信号作为读出信号,因此无需分离步骤,即达到均相测定的目的。同时,采用电流或者电压为读出信号,设备简单便宜,有利于实现现场、快速检测。
发明内容
本发明目的是为解决现有的均相测定方法原理复杂、成本高、稳定性差等问题,而提供一种成本低、稳定性好、操作简便的基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的均相分析方法,实现一系列目标物的现场快速检测。
上述目的是通过以下技术方案实现的:
一种基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的均相分析方法,包括以下步骤:
(1)将生物识别分子分别修饰在绝缘微球的表面,然后加入待测目标物进行生物反应,使分散状态的绝缘微球发生聚集,分散状态的改变量与待测目标物浓度相关;
(2)向反应后的溶液中加入电解质,然后置入正极电极和负极电极并施加恒定的电压或电流,形成闭环电路,反应混合液在电渗流驱动下流经设在正极电极和负极电极之间的微通道,绝缘微球在通过微通道时产生阻塞效应,导致闭环电路的电阻上升,并且上升幅度与绝缘微球的聚集状态呈正相关,通过检测闭环电路的电流或电压的变化值从而可间接得到待测目标物含量;
所述生物识别分子为能够与待测目标物发生竞争免疫反应的抗体及其抗原;或所述生物识别分子为能够与待测目标物发生双抗夹心免疫反应的包被抗体及其标记抗体;或所述生物识别分子为能够与待测目标物发生DNA分子杂交反应的捕获探针及其检测探针。
优选地,所述微通道的内径为10~500μm,长度为0.5~10mm。最佳地,所述微通道的内径为25μm,长度为1mm。
优选地,所述绝缘微球的粒径为0.1-50μm,最佳为5μm。
优选地,当向正极电极和负极电极施加恒定的电压时,所述电压为10-500v,最佳为60v。
优选地,所述绝缘微球为聚苯乙烯微球或聚丁二烯微球或聚异戊二烯微球。
优选地,所述电解质为PBS。
本发明进一步提供一种基于绝缘微球分散状态变化导致微通道电阻改变的均相分析装置,该装置包括第一导电池和第二导电池,所述第一导电池和第二导电池之间设有微通道,所述微通道的内径为10~500μm,长度为0.5~10mm,所述第一导电池和第二导电池的内部分别设有正极电极和负极电极,所述正极电极和负极电极分别通过导线与直流电源的正、负极连接,形成闭环电路,所述闭环电路上设有检测仪表和电源输出控制器。
本发明再进一步提供一种基于绝缘微球分散状态变化导致微通道电阻改变的均相分析芯片,该芯片上设有第一导电池、第二导电池、微通道和反应通道,所述微通道的内径为10~500μm,长度为0.5~10mm,所述第一导电池和第二导电池通过微通道相连通,所述反应通道与第一导电池相连通,所述第一导电池和第二导电池的内部分别设有正极电极和负极电极,所述正极电极和负极电极分别通过导线与直流电源的正、负极连接,形成闭环电路,所述闭环电路上设有检测仪表和电源输出控制器,所述反应通道的末端设有两个进样口,所述两个进样口与设在芯片外部的蠕动泵连通。
本发明的检测原理如下:针对不同的目标物,将其对应的生物识别分子修饰在绝缘微球表面。将待测物与上述绝缘微球-生物识别分子偶联物在导电池中进行孵育,待目标物与绝缘微球-生物识别分子偶联物完成特异性结合后,无需分离步骤,直接向导电池中施加恒定的电压(或电流),电渗流驱动溶液通过微通道,而绝缘微球-生物识别分子偶联物分散状态的不同,其改变微通道内电阻的能力不同,而绝缘微球-生物识别分子偶联物状态的改变和目标物的含量相关,从而以电流(或电压)为读出信号进行定量分析。
所述微通道由于其内壁表面带有负电荷,溶液中的正电荷可与上述负电荷相互作用,形成双电层,在高电压的作用下,微通道内溶液将整体向负极移动。溶液中的绝缘颗粒或者绝缘微球聚集体会被电渗流驱动经过微通道,由于存在阻塞效应,将会导致电阻的增大,如下式所示:
其中,R表示微通道电阻,l表示微通道长度,S表示微通道横截面积,d表示绝缘颗粒直径,σ表示溶液的电导率。
从上式可以看出,在微通道长度l和横截面积S一定时,微通道电阻R与绝缘颗粒直径d相关。由于绝缘颗粒d远小于通道长度l,因此上式第二项可视为定值,从而可得到,微通道电阻R与绝缘颗粒直径d正相关,即绝缘微球越聚集,微通道电阻越大。而绝缘颗粒的聚集状态由生物识别反应决定,因而可进行定量分析。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1)分析速度快:整个分析过程仅涉及一步生物化学反应,即目标物的识别结合;无需任何洗涤分离步骤;检测信号可瞬时读出;因此可大大缩短分析时间,实现快速检测,整个检测时间在5min-15min。
2)仪器成本低:与传统的均相分析技术相比,本发明的设备极为简单,仅需完成电流或电压测量的基本物理元件,可批量生产,整个设备的成本价格在500元左右。
3)准确性好、抗干扰力强:读出信号为电流、电压或电阻,不易受到环境因素的影响,方法稳定可靠,可实现现场检测。
4)应用范围广:采用不同的生物识别分子对绝缘微球进行修饰,可满足一系列小分子、蛋白质、核酸的定量分析,在食品安全、体外诊断、环境监测等领域有着潜在的应用价值。
附图说明
图1:均相分析装置的结构示意图。
图2:均相分析芯片的结构示意图。
图3:电流与绝缘颗粒分散状态的相关性。
图4:微通道内径分别为25μm、50μm、100μm,长度为1mm;施加电压为60v;PS微球直径为2μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
图5:微通道内径分别为25μm、50μm、100μm,长度为1mm;施加电压为60v;PS微球直径为5μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
图6:微通道内径为25μm,长度分别为1mm、2mm、3mm;施加电压为60v;PS微球直径为2μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
图7:微通道内径为25μm,长度分别为1mm、2mm、3mm;施加电压为60v;PS微球直径为5μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
图8:微通道内径为25μm,长度为1mm;施加电压为0、30、40、50、60v;PS微球直径为2μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
图9:微通道内径为25μm,长度为1mm;施加电压为0、30、40、50、60v;PS微球直径为5μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
图10:检测氯霉素的工作曲线。
图11:检测降钙素原的工作曲线。
图12:检测李斯特菌的工作曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
试验材料及相关术语说明
羧基化聚苯乙烯(PS)微球:粒径2μm、5μm,50mg/mL,购自Bangs Laboratories,Inc.。
氯霉素抗体(1mg/mL)、氯霉素-BSA偶联物(1mg/mL)、氯霉素标准品:购自河南路非凡生物科技有限公司。
降钙素原(1.4mg/mL)、降钙素原捕获抗体、降钙素原检测抗体:购自abcam公司。
李斯特菌DNA检测探针和捕获探针:由生工生物工程(上海)有限公司设计合成。
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺活泼酯(sulfo-NHS):购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
MES、MEST:分别为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸-Tween20缓冲液。
微流控芯片可以采用各种塑料材料,例如聚苯乙烯(PS),PMMA等材料,也可以采用PDMS等材料。
实施例1均相分析装置和微流控芯片的组建
如图1所示,一种基于绝缘微球分散状态变化导致微通道电阻改变的均相分析装置,该装置包括第一导电池和第二导电池,所述第一导电池和第二导电池之间设有微通道,所述微通道的内径为10~500μm,长度为0.5~10mm,所述第一导电池和第二导电池的内部分别设有正极电极和负极电极,所述正极电极和负极电极分别通过导线与直流电源的正、负极连接,形成闭环电路,所述闭环电路上设有检测仪表和电源输出控制器,所述检测仪表用于检测并显示电路上的电压、电流、或电阻,所述电源输出控制器用于控制直流电源的电压或电流输出。
如图2所示,一种基于绝缘微球分散状态变化导致微通道电阻改变的均相分析芯片,该芯片上设有第一导电池、第二导电池、微通道和反应通道,所述微通道的内径为10~500μm,长度为0.5~10mm,所述第一导电池和第二导电池通过微通道相连通,所述反应通道与第一导电池相连通,所述第一导电池和第二导电池的内部分别设有正极电极和负极电极,所述正极电极和负极电极分别通过导线与直流电源的正、负极连接,形成闭环电路,所述闭环电路上设有检测仪表和电源输出控制器,所述反应通道的末端设有两个进样口,所述两个进样口与设在芯片外部的蠕动泵连通。
实施例2微通道电阻与绝缘微球分散状态的相关性探究
对微通道电阻和绝缘颗粒分散状态的相关性进行探究,将生物素化的PS微球分别和不同浓度的链霉亲和素混合,加入导电池1中,导电池2中加入PBS,施加电压,同时记录回路中的电流,具体如下:
试验1)微通道内径为25μm,长度为1mm;生物素化的PS微球直径为2μm,浓度为100μg/mL;链霉亲和素浓度分别为0、10、20、30、40、50、60μg/mL;分别等体积混合,孵育15min,取300μL反应溶液加入导电池1中,导电池2中加入300μL PBS溶液;施加60v直流电压,测回路中的电流。
试验2)微通道内径为25μm,长度为1mm;生物素化的PS微球直径为5μm,浓度为100μg/mL;链霉亲和素浓度分别为0、10、20、30、40、50、60μg/mL;分别等体积混合,孵育15min,取300μL反应溶液加入导电池1中,导电池2中加入300μL PBS溶液;施加60v直流电压,测回路中的电流。
结果如图3所示,对于直径为2μm和5μm的生物素化PS微球,随着链霉亲和素浓度的增加,电流呈现出明显的下降趋势。这是由于链霉亲和素和PS微球表面的生物素发生了结合,从而使溶液中的PS微球由分散状态成为聚集状态,导致微通道的电阻增加,随着聚集状态的PS微球增多,其对微通道内电阻的影响更为显著,因此导致电阻增加更加明显。
然后对微通道内径及长度、施加电压等实验参数进行了优化,将粒径为2μm、5μm的PS微球加入导电池1中,导电池2中加入PBS,施加不同强度的电压,同时记录回路中的电流,具体如下:
实验1)微通道内径分别为25μm、50μm、100μm,长度为1mm;施加电压为60v;PS微球直径为2μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
实验2)微通道内径分别为25μm、50μm、100μm,长度为1mm;施加电压为60v;PS微球直径为5μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
实验3)微通道内径为25μm,长度分别为1mm、2mm、3mm;施加电压为60v;PS微球直径为2μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
实验4)微通道内径为25μm,长度分别为1mm、2mm、3mm;施加电压为60v;PS微球直径为5μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
实验5)微通道内径为25μm,长度为1mm;施加电压为0、30、40、50、60v;PS微球直径为2μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
实验6)微通道内径为25μm,长度为1mm;施加电压为0、30、40、50、60v;PS微球直径为5μm,测得的电流差值(ΔI)与PS微球浓度对数值之间的相关性。
从图4-9的试验结果可以看出,电流差值(ΔI)与PS微球浓度之间均存在较好的正相关性。同时还能看出,在合理范围内,微通道的内径越低、长度越小、施加电压越大则相关性越明显;另外,PS微球的内径为5μm时效果优于2μm。
因此,最终确定使用5μm的PS微球,微通道内径为25μm、长度为1mm,施加电压为60v时,检测效果最佳。
实施例3采用均相分析法检测氯霉素
氯霉素的检测原理如下:导电池1内,氯霉素抗体修饰的PS微球、氯霉素-BSA偶联物修饰的PS微球、样品中的氯霉素发生竞争性免疫反应。当样品中无氯霉素时,氯霉素抗体修饰的PS微球和氯霉素-BSA偶联物修饰的PS微球结合形成复合物,从而使溶液中聚集状态的颗粒比例增加;当样品中有氯霉素时,氯霉素和氯霉素-BSA偶联物修饰的PS微球会竞争性去结合氯霉素抗体修饰的PS微球,导致聚集状态的颗粒比例减少,氯霉素含量越高,形成的聚集状态微球越少,微通道两端的电阻越小。通过检测电流的变化量得到溶液中PS微球分散状态的改变量,即可间接得到样品中的氯霉素浓度。
具体过程如下:
1、利用生物识别分子修饰PS微球
首先用氯霉素抗体、抗原分别修饰的PS微球,修饰前需对PS微球表面的羧基进行活化,本发明所使用的活化及偶联方法均为本领域所熟知的常规方法,具体如下:
1)取2mg PS微球(平均直径为5μm)于离心管中,用500μL MEST(10mM MES,0.05%Tween 20,pH 6.0)洗涤2次,离心(10000rpm,6min),除去上层清液;
2)用10mM MES(pH 6.0)配制5mg/mL EDC溶液和5mg/mL NHS溶液;
3)向装有PS微球的离心管中分别加入100μL EDC(5mg/mL)和50μL NHS(5mg/mL),使用涡旋器混匀使PS微球充分悬浮,用MES稀释至500μL,放置于旋转混匀仪上,37℃活化30min;
4)离心(10000rpm,6min),除去上层清液,用500μL MEST洗涤3次;
5)将100μg氯霉素抗体加入到上述装有PS微球的离心管中,用PBST调节总体积至500μL,轻摇混匀PS微球和氯霉素抗体;
6)将上述混合物置于旋转混匀仪上,37℃反应3h;
7)离心(10000rpm,6min),除去上层清液,加入含1%BSA的PBST(pH 7.4)500μL,重新悬浮PS微球,置于旋转混匀仪上,37℃封闭30min;
8)离心(10000rpm,6min),除去上层清液,500μL PBST洗涤3次;
9)离心(10000rpm,6min),除去上层清液,所得到的氯霉素修饰的PS微球用1mLPBST(pH 7.4,含0.02%NaN3,0.5%BSA)重新悬浮,置于4℃保存。
以上步骤以氯霉素抗体为例,对修饰过程进行说明,其余生物识别分子包括氯霉素-BSA偶联物、降钙素原抗体,氨基修饰的DNA探针等也能采用类似的方法。
2、氯霉素检测
具体过程如下:
1)分别将氯霉素抗体修饰的PS微球(5μm)和氯霉素-BSA偶联物修饰的PS微球(5μm)用PBS稀释至100μg/mL;
2)用乙醇配制1mg/mL的氯霉素标准品储备液,并配制成浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL的标准品溶液;
3)分别向导电池1中加入100μL氯霉素抗体修饰的PS微球(100μg/mL)、100μL氯霉素-BSA偶联物修饰的PS微球(100μg/mL)、氯霉素标准品溶液(0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL),孵育5-15min;
4)向导电池2内加入300μL PBS溶液,插入正、负电极,控制直流电源的输出,使其向导电池A和导电池B施加60v直流电压,此时,在电渗流的作用下,溶液整体向负极移动,由于溶液中PS微球分散状态会引起微通道(内径25μm、长度1mm)电阻的改变,此时,可用检测仪表记录电流,与空白组对照,可得电流差值;
5)以氯霉素浓度的对数值为横坐标,电流差值为纵坐标,作标准曲线。
如图10所示,在0.01~1000ng/mL范围内电流差值与氯霉素浓度对数值之间具有良好的线性关系,说明方法可以用于氯霉素的快速定量检测。
实施例4采用均相分析法检测降钙素原
降钙素原的检测原理如下:导电池1内,降钙素原捕获抗体修饰的PS微球、降钙素原检测抗体修饰的PS微球、样品中的降钙素原发生“夹心式”免疫反应。当样品中无降钙素原时,降钙素原捕获抗体修饰的PS微球和降钙素原检测抗体修饰的PS微球无法结合形成复合物,从而无法引起溶液中PS微球的分散状态改变;当样品中有降钙素原时,降钙素原、降钙素原捕获抗体修饰的PS微球和降钙素原检测抗体修饰的PS微球三者结合形成复合物,从而使溶液中聚集状态的颗粒比例增加,导致其改变微通道两端电阻的能力增大。通过检测微通道两端电阻或者电流的改变,可间接得到样品中的降钙素原浓度。
具体过程如下:
1)分别将降钙素原捕获抗体修饰的PS微球(5μm)和降钙素原检测抗体修饰的PS微球(5μm)用PBS稀释至100μg/mL;
2)用PBS配制1mg/mL的降钙素原标准品储备液,并配制成浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL的标准工作溶液;
3)分别向导电池1中加入100μL降钙素原捕获抗体修饰的PS微球(100μg/mL)、100μL降钙素原检测抗体修饰的PS微球(100μg/mL)、降钙素原标准品溶液(0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL),孵育5-15min;
4)向导电池2内加入300μL PBS溶液,插入正、负电极,控制直流电源的输出,使其向导电池A和导电池B施加60v直流电压,此时,在电渗流的作用下,溶液整体向负极移动,由于溶液中PS微球分散状态会引起微通道(内径25μm、长度1mm)电阻的改变,此时,可用检测仪表记录电流,与空白组对照,可得电流差值;
5)以降钙素原浓度的对数值为横坐标,电流差值为纵坐标,作标准曲线。
如图11所示,在0.01~1000ng/mL范围内电流差值与降钙素原浓度对数值之间具有良好的线性关系,说明方法可以用于降钙素原的快速定量检测。
实施例5采用基于微流控芯片的均相分析法检测李斯特菌DNA
采用基于微流控芯片的均相分析法检测李斯特菌DNA,其原理如下:导电池1内,李斯特菌DNA捕获探针修饰的PS微球、检测探针修饰的PS微球、样品中的李斯特菌DNA发生“夹心式”杂交反应。当样品中无李斯特菌DNA时,捕获探针修饰的PS微球和检测探针修饰的PS微球无法结合形成复合物,从而无法引起溶液中PS微球的分散状态改变;当样品中有李斯特菌DNA时,李斯特菌DNA、捕获探针修饰的PS微球和检测探针修饰的PS微球三者结合形成复合物,从而使溶液中聚集状态的颗粒比例增加。通过检测微通道两端电流的变化,可得到样品中的李斯特菌DNA浓度。
具体过程如下:
1)设计和待测李斯特菌DNA对应的两条DNA的探针(捕获探针和检测探针),并且将这两条探针分别偶联在PS微球的表面。
2)按照试剂盒方法对李斯特菌基因组DNA进行提取,并按下述体系进行扩增:10×PCR缓冲液5.0μL,5.0μL上述基因组DNA清液,上、下游引物各1.0μL(10μM),1.0μL DNA聚合酶(5U/μL),1.0μL dNTP(10mM),3.0μL MgCl2和33μL超纯水。反应条件如下:94℃预变性4min,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸1min,扩增30个循环;72℃延伸10min。
3)分别将捕获探针修饰的PS微球(5μm)和检测探针修饰的PS微球(5μm)用PBS稀释至100μg/mL;
4)将100μL捕获探针修饰的PS微球、100μL检测探针修饰的PS微球、10μL柠檬酸钠溶液、40μL无菌水混合;将100μL李斯特菌DNA样品、10μL柠檬酸钠溶液、40μL无菌水混合;两种混合液分别置于95℃水浴中10min,然后迅速置于冰浴中10min;
5)利用蠕动泵将上述两种混合液注入到反应通道,50℃下反应5~15min;
6)利用蠕动泵将反应溶液注入导电池1内,向导电池2内加入300μL PBS溶液,控制直流电源的输出,使其向导电池A和导电池B施加60v直流电压,此时,在电渗流的作用下,溶液整体向负极移动,由于溶液中PS微球分散状态会引起微通道电阻的改变,此时,可用检测仪表记录电流,与空白组对照,可得电流差值;
7)以李斯特菌浓度的对数值为横坐标,电流差值为纵坐标,作标准曲线。
如图12所示,在10~106CFU/mL范围内电流差值与李斯特菌浓度对数值之间具有良好的线性关系,说明方法可以用于李斯特菌的快速定量检测。
上述的分析方法也可以通过测量电压来实现,具体原理如下:微米尺寸的通道内,当绝缘颗粒穿过时,会产生明显的阻塞效应。若在通道两端施以恒定的电流,则绝缘颗粒的存在会导致电阻的上升,并且上升幅度与绝缘颗粒的聚集状态相关。根据这一原理,我们首先将生物识别分子分别修饰在绝缘微球表面,然后加入待测目标物进行孵育,溶液中绝缘微球的聚集状态与目标物浓度相关。将该溶液置于导电池内,施加恒定的电流,电渗流驱动溶液流经微通道,电压表读取电压值,与空白对照组进行对比,可得到电压差值,该差值大小取决于绝缘微球浓度,从而与目标物浓度相关,可进行定量分析。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用的材料的等效替换及药物成分的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (6)
1.一种基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的均相分析方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将生物识别分子分别修饰在绝缘微球的表面,然后加入待测目标物进行生物反应,使分散状态的绝缘微球发生聚集,分散状态的改变量与待测目标物浓度相关;
(2)向反应后的溶液中加入电解质,然后置入正极电极和负极电极并施加恒定的电压或电流,形成闭环电路,反应混合液在电渗流驱动下流经设在正极电极和负极电极之间的微通道,绝缘微球在通过微通道时产生阻塞效应,导致闭环电路的电阻上升,并且上升幅度与绝缘微球的聚集状态呈正相关,通过检测闭环电路的电流或电压的变化值从而可间接得到待测目标物含量;
所述生物识别分子为能够与待测目标物发生竞争免疫反应的抗体及其完全抗原;或所述生物识别分子为能够与待测目标物发生双抗夹心免疫反应的包被抗体及其标记抗体;或所述生物识别分子为能够与待测目标物发生DNA分子杂交反应的捕获探针及其检测探针;
所述微通道的内径为25μm,长度为1mm;
所述绝缘微球的粒径为5μm;
当向正极电极和负极电极施加恒定的电压时,所述电压为60v。
2.如权利要求1所述的均相分析方法,其特征在于:所述绝缘微球为聚苯乙烯微球或聚丁二烯微球或聚异戊二烯微球。
3.如权利要求1所述的均相分析方法,其特征在于:所述电解质为PBS。
4.一种基于绝缘微球分散状态变化导致微通道电阻改变的均相分析装置,其特征在于:该装置包括第一导电池和第二导电池,所述第一导电池和第二导电池之间设有微通道,所述微通道的内径为25μm,长度为1mm,所述第一导电池和第二导电池的内部分别设有正极电极和负极电极,所述正极电极和负极电极分别通过导线与直流电源的正、负极连接,形成闭环电路,所述闭环电路上设有检测仪表和电源输出控制器。
5.一种基于绝缘微球分散状态变化导致微通道电阻改变的均相分析芯片,其特征在于:该芯片上设有第一导电池、第二导电池、微通道和反应通道,所述微通道的内径为25μm,长度为1mm,所述第一导电池和第二导电池通过微通道相连通,所述反应通道与第一导电池相连通,所述第一导电池和第二导电池的内部分别设有正极电极和负极电极,所述正极电极和负极电极分别通过导线与直流电源的正、负极连接,形成闭环电路,所述闭环电路上设有检测仪表和电源输出控制器,所述反应通道的末端设有两个进样口,所述两个进样口与设在芯片外部的蠕动泵连通。
6.权利要求4所述的装置或权利要求5所述的芯片在均相分析中的应用。
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