JP6389248B2 - 液体試料中の分析物を検出する電気化学発光法および分析システム - Google Patents

Description

本発明は、発光をもたらすことによる、例えば発光免疫アッセイを用いることによる液体試料中の分析物の検出、およびそれぞれの分析システムの分野に関する。

数多くの方法およびシステムが、生化学的および生物学的物質中の対象の分析物の検出および定量化のために開発されてきた。痕跡量の微生物、医薬、ホルモン、ウイルス、抗体、核酸および他のタンパク質を測定することができる方法およびシステムは、研究者および臨床医にとって大いに価値がある。

当該技術の非常に実質的な本体（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｂｏｄｙ）は、周知の結合反応、例えば抗原−抗体反応、核酸ハイブリダイゼーション技法、およびタンパク質−リガンド系に基づいて開発されてきた。多くの生化学的および生物学的結合系における高い程度の特異性は、研究および診断において価値のある多くのアッセイ法およびアッセイシステムをもたらしてきた。典型的には、対象の分析物の存在は、結合物質の１つ以上に取り付けられた観察可能な“標識”の存在または非存在により示される。

対象の分析物を含有する試料が化学発光標識で標識された反応物と混合される化学発光アッセイ技法が開発されてきた。反応混合物がインキュベートされ、標識された反応物の一部が分析物に結合する。インキュベーション後、どちらかまたは両方の画分中の標識の濃度が化学発光技法により決定され得る。一方または両方の画分において決定された化学発光のレベルは、生物学的試料中の対象の分析物の量を示す。

電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイ技法は、化学発光技法における改良である。それらは、対象の分析物の存在および濃度の高感度かつ正確な測定を提供する。そのような技法において、インキュベートされた試料は、発光を誘発するために、ポテンシオスタットにより、またはガルバノスタットにより制御された作用電極に曝露される。適切な化学的環境において、そのような電気化学発光は、作用電極に対して特定の時点で、そして特定の様式で与えられた電圧または電流により誘発される。標識により生成された光が測定され、それは分析物の存在または量を示す。そのようなＥＣＬ技法のより完全な記載に関して、例えば米国特許第５，２３８，８０８号および国際公開第８６／０２７３４号に対して参照がなされている。

米国特許第６，８８１，５３６号は、発光現象に基づく特異的結合アッセイを示しており、ここで不活性な微粒子物質がアッセイシステムの結合反応物の一つに特異的に結合している。

米国特許第６，５９９，４７３ Ｂ１号は、電気化学発光結合反応分析（ＥＣＬ−ＢＢＡ）を開示している。
ＥＣＬ−ＢＢＡによれば、検出可能な複合体が生成され、その濃度は求められている分析結果の尺度を構成する。ＥＣＬ反応をもたらすことができるマーキング物質（標識）は、分析物に特異的な結合試薬、例えば抗体に連結されている。マーキング物質および結合試薬を含む種は、標識コンジュゲートと呼ばれる。

そのような物質がボルタンメトリー作用電極上で適切な電位に晒された際に、それは光度測定的に測定され得る光を放射する。共反応物と呼ばれる第２の電気化学的に活性な物質が、通常はこの反応に寄与する。実際には、主にルテニウム錯体（ルテニウム−トリス[ビピリジル]）が共反応物としてのＴＰＡ（トリプロピルアミン）との組み合わせでＥＣＬ標識として用いられる。その２種類の電気化学的に活性な物質は、両方とも電極への電圧印加の際に酸化される。それに続くプロトンの喪失は、ＴＰＡを強い還元種へと変えるであろう。それに続く酸化還元反応は、ＥＣＬ標識を励起状態にして、それからそれは光子の放出と共に基底状態に戻る。そのＥＣＬ標識反応は、好ましくは、単一の標識分子が電圧の電極への印加後に複数の光子を放出するような循環式の（ｃｉｒｃｕｌａｒ）反応である。

分析に特徴的なＥＣＬで印を付けられた（ｍａｒｋｅｄ）複合体分子は、磁性微粒子（ビーズ）に固定される。実際には、典型的には２〜３マイクロメートルの直径を有する磁気を帯びたポリスチレンビーズが用いられる。固定は、特異的な生化学的結合パートナーの対により達成される。ストレプトアビジン−ビオチン対は、特に好都合であることが分かっている。ビーズはストレプトアビジンでコートされており、それにビオチン化された抗体が結合するであろう。

結合した印を付けられた複合体を有するビーズは、測定装置の測定セルの中に導入される。そのセルは、ＥＣＬ反応を誘発するために必要とされる電場を生成するために必要である電極を備えている。ビーズは、作用電極の下方に配置された磁石の磁場において作用電極の表面上に引き寄せられる。これは、典型的には連続的に流動する試料の流体を用いる貫流型のセル中で起こるため、ビーズの磁気による沈着は“捕捉”と呼ばれる。次いでＥＣＬ反応を誘発するために必要とされる電位が作用電極に適用され、結果としてもたらされる発光が、適切な光学検出器を用いて測定される。発光の強度は、作用電極の表面上のビーズに結合した標識された抗体の数の濃度に関する尺度であり、それは今度は試料中の分析物の濃度の尺度である。較正は、測定された発光シグナルからの求められている濃度の計算を可能にする。

このタイプのＥＣＬ−ＢＢＡ法の複数の異なるバリエーションが、文献において論じられ、記載されてきた。
発明の概要
本発明は、独立請求項において特許請求されるような液体試料中の分析物を検出する改善された発光法および分析システムを提供する。本発明の態様は、従属請求項において与えられる。

一部の態様において、液体試料中の分析物は、まずタンパク質でコートされた磁性微粒子を含む流体を含有する容器を撹拌ユニットに提供することにより検出される。タンパク質でコートされた磁性微粒子を含む流体の撹拌が必要である、なぜなら微粒子の密度は通常は緩衝流体の密度よりも高いためである。従って、微粒子は容器の底に沈殿する傾向があり、それは弱い相互作用のために微粒子の凝集をもたらす。代表的な測定を得るため、緩衝流体中の微粒子の均一な分布が、それぞれの分析サイクルに関する微粒子の一定の濃度を確実にするために必要である。均一化の他に、さらに微粒子の脱凝集を提供することも必要であり、それも微粒子を含む流体を撹拌することにより実現される。

この文脈において、用語“撹拌すること”は、“何かを混合に適した物体を用いてその中で循環する動きを作ることにより混合すること”として理解されるべきである。
タンパク質でコートされた微粒子を含む流体を撹拌することは、微粒子を脱凝集させるための他の方法および手段を超えるいくつかの利点を有する。例えば、微粒子は、超音波を用いて脱凝集させることができる。しかし、超音波は、微粒子のタンパク質コーティングの損傷を引き起こし得る。別の可能性は、微粒子を含有する流体のボルテックス混合であり得るが、それは深刻な泡の生成を引き起こす可能性があり、それは下記で論じられるような代表的な測定にとって有害である。第３の可能性は、ピストンピペッターにより引き起こされる延伸流動の使用であり得る。しかし、流体を混合するためのピストンピペッターの使用は、タンパク質でコートされた微粒子に関して機械的ストレスを引き起こす可能性があり、それはコーティングの損傷をもたらし得る。

微粒子の脱凝集を提供するため、撹拌されるべき微粒子を含む流体の量に依存するある特定の量のエネルギーが流体に適用されなければならない。撹拌プロセスの間に流体に適用されるエネルギーの量は、撹拌機の回転数および流体がその間撹拌される時間の長さに依存する。

次の方法工程において、容器中に含有される流体の量を示すシグナルが得られる。シグナルは、例えば容器のＲＦＩＤタグもしくは他のメモリーを読むことにより、または下記で記載されるように容器の充填レベルを測定することにより得られてよい。流体を含有する容器の重量を量ることもでき、容器自体の重量および磁性微粒子を含む流体の密度を知ることは、容器中に含有される流体の体積を決定することができるであろう。

予め決定された容器中に含有される流体の量に応じて、撹拌ユニットに関する回転数が、例えば流体の量に関して用いられるべき回転数に関する情報を含む表を参照することにより決定される。適用される回転数は、短期間の間流体の撹拌を提供するために十分に高いべきである。しかし、高すぎる回転数は泡の生成を引き起こす可能性があり、それが今度は望まれない作用をもたらし得るため、回転数は高すぎるべきではない。例えば、予め定められた再現可能な量の流体の抜き出しは、流体が少なくとも部分的に泡立っている場合、不可能である可能性がある。

流体を予め決定された期間の間予め決定された回転数を適用することにより撹拌した後、タンパク質でコートされた磁性微粒子を含有する流体の一部が容器から取り出され、それにより容器中に含有される流体の量を低減する。次いで、磁性微粒子を含む流体の一部が分析物およびマーカーを含む液体試料の一部と混合され、その混合物がインキュベーター中でインキュベートされる。次いで混合物の一部が測定セルに移され、そこでタンパク質でコートされた磁性微粒子の測定セルの作用電極への磁気的付着のために磁場が適用される。

発光を引き起こすための励起エネルギーの適用後、発光が測定シグナルの獲得のために測定される。測定シグナルを用いて、液体試料中の分析物の存在を示す出力シグナルが生成される。

‘分析物’は、本明細書において理解される際、分析されるべき液体試料の構成要素、例えば様々な大きさの分子、タンパク質、代謝産物等である。
‘液体試料’は、本明細書において理解される際、生物学的試料、例えばヒトまたはあらゆる他の生物に由来しているあらゆる種類の組織または体液を包含する。特に、生物学的試料は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、もしくは唾液試料またはそれらのあらゆる派生物であることができる。

用語‘発光’は、本明細書において理解される際、あらゆる種類の発光、例えば放射に誘導される発光、化学発光および電気化学発光、特にＥＣＬ−ＢＢＡを包含する。
用語“発光免疫アッセイ”は、本明細書において理解される際、液体試料中の特定の分析物の存在を示す光学シグナル、すなわち発光シグナルを生成するあらゆる免疫アッセイを包含する。

上記で記載された方法は、個々の分析運転が一定の時間の消費で実施され得るため、特に好都合である。一連の分析サイクルの間、容器中に含有される磁性微粒子を含む流体の量は変化し得る。従って、撹拌の間に流体に適用されるべきエネルギーの量は、容器中に含有される流体の量に適合していなければならない。しかし、上記で記載された方法工程を用いて、撹拌機の回転数は、撹拌に関する時間がそれぞれの撹拌プロセスに関して一定に保たれ得るように、撹拌されるべき流体の量に適合していることができる。

これは、前に記載された分析手順の自動化を促進する。撹拌ユニットを用いる最も一般的な分析システムにおいて、撹拌器の回転数は、撹拌されるべき流体の量にかかわらず、それぞれの分析サイクルに関して同じである。従って、撹拌器の回転数は、容器中に含有される最小量の流体に関してさえも撹拌プロセスにより泡が生成されないように適合していなければならない。しかし、容器が大量の流体を含有する場合、前に記載された低い回転数での撹拌は、撹拌されるべき流体の量に適合している回転数による撹拌よりもかなり多くの時間を消費すると考えられ、従って分析プロセスを遅くするであろう。

一部の態様において、容器中に含有される流体の量を示しているシグナルの獲得は、ピペットプローブを用いて実施され、それは容器から流体の一部を抜き出すためにも用いられる。これは、容器中に含有される流体の量を示すシグナルが生成され得る一方で流体の一部が容器から抜き出されるという利点を有する可能性がある。従って、２つの方法工程が同時に実施され、それにより分析サイクルの時間の消費を低減することができる。

一部の態様において、ピペットプローブは、容器中に含有される流体の量を示しているシグナルを獲得するための容量センサーを含んでいてよい。例えば、その容量センサーは、それがその環境の湿度の変化に応答するように設計されていてよい。その容量センサーは、一度ピペットプローブの先端が容器中に含有される流体の表面と接触したら容量センサーの測定シグナルが生成されるように、ピペットプローブの先端に位置していてよい。前に記載された測定シグナルから容器の充填レベルを得るために、例えば予め定められた工程において既知の開始時の高さからピペットプローブを下げることができる。それぞれの工程の後、容量センサーの電圧またはあらゆる他の指標が測定される。一度ピペットプローブの先端が流体と接触すると、測定された指標の値が変化するであろう。ピペットプローブの開始時の高さは既知であり、下げるプロセスの段階の大きさも既知であるため、容器の充填レベルを容易に決定することができる。

一部の態様において、撹拌ユニットに関する回転数の決定は、容器中に含有される流体の量を示しているシグナルをデータ処理ユニットに提供することを含み得る。データ処理ユニットは、例えば表を含むことができ、ここでその表は容器中に含有されるある特定の量の流体に関してどの回転数を用いるべきかに関する情報を含む。たとえそのような表に関する値を物理法則を用いて、そして例えば数値法を用いて計算することが可能であり得るとしても、好ましい態様によれば、データは経験的に決定することもできる。一度データ処理ユニットが用いるべき回転数を表を参照することにより決定したら、データ処理ユニットは、予め決定されている流体の量に適した回転数を示している第２のシグナルを提供する。

別の観点において、本発明は、液体試料中の分析物を検出するための分析システムに関する。
一部の態様において、分析システムは、容器中に提供された磁性微粒子を含有する流体を撹拌するための撹拌ユニットおよび容器中の流体の量を示すシグナルを生成するように操作できる測定ユニットを含むことができる。タンパク質でコートされた磁性微粒子を含有する流体の一部を容器から抜き出すために、分析システムはさらに抜き出し構成要素を含むことができる。分析物、磁性微粒子の一部および分析物に印を付けるためのマーカーを含む液体の移動を開始するため、分析システムはさらにインキュベーターを含むことができる。分析物に印を付けるためのマーカーは、好ましくは励起エネルギーの適用の際に発光をもたらすことができる。測定シグナルを得るため、分析システムは、さらに発光を引き起こすための励起エネルギーを適用するためのトリガー構成要素およびその発光を測定するための獲得構成要素を含むことができ、獲得ユニットは、測定シグナルを提供するように操作することができ、データ処理ユニットは、容器中の流体の量を示すシグナルを用いて撹拌ユニットに関する適切な回転数を決定するように、そして測定シグナルを用いて液体試料中の分析物の存在を示している出力シグナルを生成するように適合している。

この場合、分析システムのデータ処理ユニットに関する用語“適合した”は、そのデータ処理ユニットが記載された方法工程を実施するように設計されていることを含む。
以下において、本発明の態様が、例としてのみの図を参照してより詳細に記載されており、ここで：

図１は、本発明の分析システムの態様のブロック図であり。 図２は、ＥＣＬ−ＢＢＡ技法を説明している図であり。 図３は、ロボット構成要素を含む分析システムのさらなる態様のブロック図であり。 図４は、容器を受けるためのローターの態様のブロック図であり。 図５は、撹拌ユニットの概略図である。

以下の本発明の態様の記載全体を通して、同じまたは同一の要素は同一の参照数字により示されるであろう。
図１は、液体試料中の分析物を検出するための分析システム１００を示す。分析システム１００は、液体試料の分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）および例えば発光免疫アッセイの分析物に印を付けるためのマーカーの混合物である液体１０４を受けるためのインキュベーター１０２を含む。

分析システム１００は、発光を引き起こす電気化学反応の共反応物を含有するリザーバー１０６を含む。インキュベーター１０２およびリザーバー１０６は、パイプシステム１１０によって、分析システムの測定セル１０８に連結されており、それを通して液体１０４および共反応物の一部が測定セル１０８の中へと流れることができる。

測定セル１０８は、液体１０４の、および共反応物の一部をパイプシステム１１０を通して受け取るための導管１１４を有するセル本体１１２を含む。測定セル１０８は、測定セルにおいて磁場を提供するための磁性構成要素１１６、例えば永久磁石を有する。磁性構成要素１１６は、導管内の磁場をオンまたはオフに切り換えるために、磁性構成要素１１６を導管１１４の方へ、およびそれから離して配置転換する（ｒｏｔａｔｉｎｇ）ためのアクチュエーター１１８に連結されていてよい。

磁性構成要素１１６は、作用電極１２０の下に位置しており、それは電圧源１２２に連結されている。励起領域１２４は、作用電極１２０上の磁性構成要素１１６により引き起こされる磁場内の導管１１４において形成される。

励起エネルギーの適用、すなわち作用電極１２０上のボルタ電気トリガーパルスの適用により励起領域１２４において引き起こされる発光は、光学センサー、例えば光電子増倍管１２６により測定される。光学センサーは、それが測定シグナル、例えば測定セル中に存在し得る内部発光（ａｕｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）分子により引き起こされる発光シグナルを提供するような特定の周波数の範囲内で、発光がセンサーの周波数範囲内である限り、高感度である。

光電子増倍管１２６は、作用電極１２０の対電極１２８により形成されるウインドウにわたる励起領域１２４と反対側に位置しており、それを通して励起エネルギーにより引き起こされる発光光子およびあらゆる干渉する光子が光電子増倍管１２６上で衝突する。結果として生じる時間分解された測定シグナル１３０は、光電子増倍管１２６から分析システム１００の制御ユニット１３２に提供される。

測定が実施された後、導管１１４内に含有される液体は、液体廃棄物容器１３４中へと除去され、測定セル１０８はその後の測定シグナルの獲得のために再生される。
制御ユニット１３２は、電圧源１２２を制御して作用電極１２０にトリガーシグナルを適用するために電圧源１２２に連結されている。制御ユニット１３２は、アクチュエーター１１８を制御して永久磁石を対応して動かすことにより磁場をオンおよびオフに切り換えるために、アクチュエーター１１８にも連結されている。

さらに、制御ユニット１３２は、液体１０４の一部をインキュベーター１０２から、そして共反応物の一部をリザーバー１０６から抜き出すための、ならびに測定セル１０８からの液体の除去および測定セルの再生のための‘シッパーユニット’、すなわちポンプ１３６に連結されていることができる。加えて、制御ユニット１３２は、追加のロボット構成要素、例えばピペットステーションに連結されていてよい（図３の態様を参照）。

測定セル１０８は、様々な発光免疫アッセイを用いたＥＣＬ−ＢＢＡの実施に適合していることができる。
例えば、液体１０４は、液体試料の分割量、ストレプトアビジンでコートされた磁性粒子、ビオチン化された抗体およびいわゆる‘サンドイッチ’を形成するためのルテニル化された（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）抗体の混合物を含有することができ、一方でリザーバー１０６中に含有される共反応物はトリプロピルアミンである。従って、結合した標識を有する磁性粒子１３８が導管１１４中へと流れる。磁性粒子１３８は、磁場がオンに切り換えられた際に作用電極１２０上に固定される。次に、ＥＣＬ−ＢＢＡ技法に従ってトリガーパルスが作用電極１２０に適用されて電気化学発光を引き起こす。

制御ユニット１３２は、容器１６８中に含有されるある特定の量の流体に関してどの回転数を撹拌ユニットに関して用いるべきかを記載しているデータ１４２を保存するための電子メモリー１４０を有する（図３参照）。本明細書で考慮される態様において、データ１４２は、参照表またはデータベース表において保存されており、図３を参照して論じられるであろう。

制御ユニット１３２は、プログラムモジュール１４６および１４８の実行のための少なくとも１個の電子処理装置１４４を有する。プログラムモジュール１４６は、測定シグナル１３２の獲得のために処理装置１４４により実行され、一方でプログラムモジュール１４８は、獲得された測定シグナル１３２の評価のために処理装置１４４により実行される。

制御ユニット１３２は、表示装置１５２または別のヒト−機械インターフェイスを制御ユニット１３２に連結するためのインターフェイス１５０を有する。インターフェイス１５０は、分析システム１００により支援される発光免疫アッセイの１つの使用者による選択のためのウインドウ１５４ならびに分析の結果を表示するためのウインドウ１５６を表示するためのグラフィカルユーザーインターフェイスとして実施されてよい。

分析システム１００により実施される分析の結果は、図１において示されるような表データとしての出力であることができ、ここで縦列Ａは検出されるべき分析物を示し、縦列Ｃは検出された分析物の濃度を示す。

操作において、使用者は、それぞれの選択をウインドウ１５４中に入力することにより、分析システム１００により支援される発光免疫アッセイの１つを選択する。液体試料の分析は、ポンプ１３６が、液体１０４の、および共反応物の一部を導管１１４中に輸送するように制御されるようなプログラムモジュール１４６の実行により開始される。

次に、磁性粒子をそれらの結合した標識と共に作用電極１２０上に固定するために磁場が導管１１４に適用されるような位置に永久磁石を素早く移動させる（ｆｌｉｐ）ために、アクチュエーター１１８は制御される。次に、測定シグナル１３０が結果としてもたらされるような発光の励起のために作用電極上にトリガーパルスを適用するために電圧源１２２が制御される。

発光の時間分解された測定のために、光電子増倍管１２６の出力を、電圧源１２２によるトリガーパルスの適用後に所与の期間、例えば２秒間にわたってサンプリングすることにより、測定シグナル１３０は獲得される。

測定シグナル１３０を構成するデータ試料は、制御ユニット１３２のメモリー１４０内に保存されており、プログラムモジュール１４８は、獲得された測定シグナル１３０の評価のために開始される。プログラムモジュール１４８の実行により、液体中の分析物の濃度Ｃ（存在する場合）が測定シグナル１３０を用いて決定される。

次に、導管１１４からの液体の除去および測定セル１０８の再生のために、制御ユニット１３２によりポンプ１３６が制御される。
図２は、インキュベーター１０２内で形成され、それにトリガーパルスが作用電極１２０上の励起領域１２４内で適用される‘サンドイッチ’を図説している。本明細書で考慮される態様において、磁性粒子１３８のそれぞれは約２．８マイクロメートルの直径を有する。磁性粒子１３８は、検出されるべき分析物１６０に応じて選択される免疫アッセイのビオチン化された抗体１５８に結合している。分析物１６０に応じて選択される抗体１６２に結合したルテニウム錯体（ルテニウム−トリス[ビピリジル]）が、本明細書で考慮される態様において発光標識として利用される。

ボルタ電気トリガーパルスの適用の際に、電気化学反応が、発光が引き起こされるようにＥＣＬ−ＢＢＡ技法に従ってトリプロピルアミンを用いて誘導される。
図３は、分析システム１００のさらなる態様を示す。分析システム１００は、容器、例えば試料チューブを受けるためのローター１６４を有し、ここでそれぞれの試料チューブは液体試料を含有する。ローター１６４は、ピペッター１７６へのランダムアクセスを提供するためにいくつかの試料チューブを保持することができる。

分析システム１００は、ストレプトアビジンでコートされた磁性微粒子を含有する容器１６８、ビオチン化された抗体を含有する容器１７０およびルテニル化された抗体を含有する容器１７２を受けるための第２ローター１６６を有する。第２ローターは、ピペッター１７６の容器１６８、１７０および１７２中に含有される様々な試薬へのアクセスを提供するために、図３において示されているような試薬ディスクとして実施されてよい。第２ローター１６６は、さらに例えば試薬ディスクの中央に取り付けられることができる撹拌ユニット１７８を、撹拌ユニット１７８が容器１６８中に含有されるストレプトアビジンでコートされた磁性微粒子の容器１６８中に含有される流体を撹拌することによる脱凝集を提供することができるように含む（図４、５を参照）。制御ユニット１３２は、撹拌ユニット１７８を制御し、それにより撹拌ユニット１７８に容器１６８中に含有される流体を、容器１６８中に含有される流体の量に適合している回転数で撹拌させる。

分析システム１００は、混合物をインキュベーター１０２に提供するためのロボット構成要素を有する。本明細書で考慮される態様において、ロボット構成要素は、制御ユニット１３２により制御され、ピペッター１７６を有するピペットステーション１７４を含む。

操作において、制御ユニット１３２は、容器１６８中の流体を撹拌する撹拌ユニット１７８に関する回転数を決定する。回転数は、例えば制御ユニット１３２により、容器１６８中に含有される流体の量を決定し、流体の量に関してどの回転数を用いるべきかに関する情報を含む表を参照することにより決定され得る。容器１６８中に含有される流体の量は、例えば下記に記載されるように容器１６８の充填レベルから決定され得る。

一度撹拌ユニット１７８に関する適切な回転数が決定されたら、撹拌ユニットは、制御ユニット１３２により制御され、容器１６８中の流体を決定された回転数により予め決定された長さの時間の間撹拌する。

次いで、制御ユニット１３２はピペッター１７６を制御し、液体試料の分割量をローター１６４により保持されている試料チューブの１つから抜き出し、そしてストレプトアビジンでコートされた磁性粒子、ビオチン化された抗体およびルテニル化された抗体の一部をそれぞれ容器１６８、１７０および１７２から抜き出し、混合物を提供し、次いでそれは予め決定された長さの時間、例えば９〜２７分の間のインキュベーションのためにインキュベーター１０２中に入れられる。

ストレプトアビジンでコートされた磁性微粒子の一部を抜き出す際、容器１６８中に含有される流体の量が決定され得る。例えば、ピペッターは、１度ピペットの先端が容器１６８中に含有される流体の表面に触れたら測定シグナルを提供するために適した容量的手段を含むことができる。ピペットの先端の開始時の高さが既知であり、垂直移動のアクチュエーターにより引き起こされる高さの変化が下げる間に記録されている場合、容器１６８の液体レベルが容量的手段の測定シグナルおよび対応するピペットの先端の高さから決定され得る。

制御ユニット１３２は、‘シッパー’、例えばポンプ１３６（図１参照）を、液体混合物がインキュベーター１０２から測定セル１０８の導管１１４中へと共反応物、すなわちトリプロピルアミンと一緒に流れるように制御する。次に、制御ユニット１３２は、アクチュエーター１１８（図１参照）を制御して磁場をオンに切り替え、次いで電圧源１２２を制御してボルタ電気トリガーパルスを適用する。

結果として得られた測定シグナル１３０は、制御ユニット１３２により、光電子増倍管１２６の出力をサンプリングすることにより獲得される。
図４は、図３を参照して記載されたような分析システムにおける使用のためのローター１６６を示す。ローター１６６は、ストレプトアビジンでコートされた磁性微粒子を含有する容器１６８、ビオチン化された抗体を含有する容器１７０およびルテニル化された抗体を含有する容器１７２を含むｅ−パック（ｅ−ｐａｃｋｓ）１８０を受けるために設計されている。ｅ−パック１８０は、時計回りまたは反時計回りに回転させることができる輪を形成するように配置されている。ストレプトアビジンでコートされた磁性微粒子を含有する容器１６８は、ｅ−パック１８０の最も内側の位置に位置している。

ローター１６６は、さらにｅ−パック１８０を外側の位置１８４から内側の位置１８６へと動かすためのｅ−パックシフター１８２を含む。ｅ−パックシフター１８２は、例えばｅ−パック１８０を動かすためにグラップラー（ｇｒａｐｐｌｅｒ）１８８を用いることができる。選択されたｅ−パック１８０の適切な同定のため、ｅ−パック１８０はＲＦＩＤタグを備えており、それはＲＦＩＤリーダー／ライター１９０により読まれる、または書き込まれることができる。

ｅ−パックシフター１８２は、さらに撹拌ユニット１７８を含む。撹拌ユニット１７８は、それが撹拌のために内側の位置１８６においてｅ−パック１８０のストレプトアビジンでコートされた微粒子を含有する最も内側の容器１６８に届き得るように位置している。ｅ−パックシフター１８２の中心の位置において、撹拌ユニット１７８に関するクリーニングステーション１９２が位置している。

操作において、ｅ−パック１８０は、ｅ−パック１８０の輪を、処理されるべきｅ−パック１８０がＲＦＩＤリーダー／ライター１９０により同定されるまで回転させることにより、処理に関して選択されることができる。次いで、ｅ−パック１８０は、外側の位置１８４から内側の位置１８６へと、ｅ−パックシフター１８２のグラップラー１８８により動かされる。次いで、撹拌ユニット１７８は、最も内側の容器１６８中に含有される流体を、予め決定された回転数で撹拌し、流体中に含有される微粒子の十分な脱凝集を提供することができる。

撹拌ユニット１７８について適用される回転数は、例えば、制御ユニット３２（示されていない）により撹拌ユニット１７８に提供されることができる。その目的に関して、制御ユニット１３２は、情報の交換のためにＲＦＩＤリーダー／ライター１９０と連結されていることができ、それに基づいてｅ−パック１８０は現在処理のために内側の位置１８６にある。次いで、制御ユニット１３２は、対応する容器１６８中に含有される流体の量に関する情報を含む表を参照することができ、次いで決定された流体の量に関してどの回転数を用いるべきかに関する情報を含む別の表を参照することができる。

ｅ−パック１８０の容器１６８中の流体の量に関する情報を、ＲＦＩＤリーダー／ライター１９０を用いて対応するＲＦＩＤタグに書き込むことも可能である。次いで、制御ユニット１３２は、ＲＦＩＤタグからＲＦＩＤリーダー／ライター１９０を用いて流体の量に関する情報を読み取り、決定された流体の量に関してどの回転数を用いるべきかに関する情報を含む表を参照しさえすればよいであろう。これは、さらにｅ−パック１８０がｅ−パック１８０の容器１６８中の流体の量に関する情報を失うことなくある分析システムから別の分析システムへと移され得るという利点を有するであろう。

一度撹拌プロセスが終了したら、ピペットステーション１７４のピペッター１７６は、ストレプトアビジンでコートされた磁性粒子、ビオチン化された抗体およびルテニル化された抗体の一部を、それぞれ容器１６８、１７０および１７２から抜き出し、混合物を提供することができ、次いでそれはインキュベーションのためにインキュベーター１０２中に入れられる。一部が抜き出された後、ｅ−パック１８０は内側の位置１８６から外側の位置１８４へとグラップラー１８８により動かされることができ、別のｅ−パック１８０がｅ−パック１８０の輪を回転させることにより選択されることができる。

その後の撹拌プロセスが開始される前に、撹拌ユニットはクリーニングステーション１９２を用いて洗浄されることができる。撹拌ユニット１７８を最も内側の位置１８６にあるｅ−パック１８０内の試料チューブおよびクリーニングステーション１９２の両方に届かせるために、撹拌ユニットは、例えば撹拌ユニットを混合する位置から洗浄する位置へと（逆もまた同様）動かすことができるスライド上に旋回軸取り付け（ｐｉｖｏｔ−ｍｏｕｎｔｅｄ）されていてよく、または取り付けられていてよい。

図５は、撹拌ユニット１７８の典型的な態様を示す。撹拌ユニット１７８は、モーター１９８により駆動されるシャフト１９６上に取り付けられた撹拌機１９４を含む。モーター１９８、シャフト１９６および撹拌機１９４の組み立て品は、撹拌機１９４の垂直方向の位置を変動させることができるように棒２００上に取り付けられている。撹拌機１９４の下方のブロック２０２は、撹拌されるべき流体を含有する容器の位置を示している。

棒２００、モーター１９８、シャフト１９６および撹拌機１９４の組み立て品は、シャフト２０４により駆動される旋回可能な（ｐｉｖｏｔａｂｌｅ）ソケット上に取り付けられている。従って、少なくとも２つの位置：撹拌機１９４が撹拌されるべき液体を含有する容器の上方に位置している第１の位置、ならびに撹拌機１９４およびシャフト１９６が例えば撹拌機１９４およびシャフト１９６を洗浄液中に沈めることにより洗浄され得る第２の位置の間で撹拌組み立て品を切り替えることが可能である。撹拌組み立て品を旋回可能なソケット上に取り付ける代わりに、撹拌組み立て品は撹拌および洗浄の位置の間で切り替えるためのスライド上に取り付けられることもできるであろう。

操作において、容器は、図４を参照して記載されたように、撹拌機１９４の下方に、例えばｅ−パックシフター１８２のグラップラー１８８により動かされる。続いて、撹拌機１９４、シャフト１９６およびモーター１９８を含む撹拌組み立て品は、撹拌機１９４が完全に流体中に浸されるまで下げられる。次いで、モーター１９８は、制御ユニット１３２（示されていない）により制御され、流体中に含有される微粒子を脱凝集させるために適した回転数を撹拌機に適用する。次いで、その流体は、予め決定された長さの時間の間、予め決定された程度（ａｍｏｕｎｔ）の回転数で撹拌されて微粒子の十分な脱凝集を提供する。一度撹拌プロセスが完了したら、撹拌組み立て品は、撹拌機が流体の上方に十分な高さに位置するまで上げられる。

次の工程において、シャフト２０４は、撹拌組み立て品を洗浄位置中へと回転させるように操作されることができ、そこで撹拌機は洗浄液を含む容器の上方に位置する。撹拌組み立て品を、撹拌組み立て品が洗浄液中に完全に浸されるまで下げた後、モーター１９８は、シャフト１９６および撹拌機１９４を再度回転させ、それによりシャフト１９６および撹拌機１９４を洗浄することができる。撹拌組み立て品を上げて洗浄液から出すと、撹拌組み立て品は、撹拌ユニット１７８が次の撹拌手順の準備ができるように、回転させられて撹拌位置に戻ることができる。

参照番号のリスト

１００ 分析システム
１０２ インキュベーター
１０４ 液体
１０６ リザーバー
１０８ 測定セル
１１０ パイプシステム
１１２ セル本体
１１４ 導管
１１６ 磁性構成要素
１１８ アクチュエーター
１２０ 作用電極
１２２ 電圧源
１２４ 励起領域
１２６ 光電子増倍管
１２８ 対電極
１３０ 測定シグナル
１３２ 制御ユニット
１３４ 容器
１３６ ポンプ
１３８ 粒子
１４０ メモリー
１４２ 参照データ
１４４ 処理装置
１４６ プログラムモジュール
１４８ プログラムモジュール
１５０ インターフェイス
１５２ 表示装置
１５４ ウインドウ
１５６ ウインドウ
１５８ ビオチン化された抗体
１６０ 分析物
１６２ ルテニル化された抗体
１６４ ローター
１６６ ローター
１６８ 容器
１７０ 容器
１７２ 容器
１７４ ピペットステーション
１７６ ピペッター
１７８ 撹拌ユニット
１８０ Ｅ−パック
１８２ Ｅ−パックシフター
１８４ 外側の位置
１８６ 内側の位置
１８８ グラップラー
１９０ ＲＦＩＤリーダー／ライター
１９２ クリーニングステーション
１９４ 撹拌機
１９６ シャフト
１９８ モーター
２００ ロッド
２０２ ブロック
２０４ シャフト

Claims (16)

1. 液体試料中の分析物（１６０）を検出する電気化学発光法であって、該方法が以下の工程：
   ・タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）を含む流体を含有する容器（１６８）を撹拌ユニット（１７８）に提供し、
   ・該容器（１６８）中に含有される流体の量を示しているシグナルを獲得し、
   ・該容器（１６８）中の流体の量に応じて該撹拌ユニット（１７８）に関する回転数を決定し、該回転数は流体の量に比例する、
   ・予め定められた期間の間該予め決定された回転数を適用することにより該流体を撹拌し、
   ・該タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）を含有する流体の一部を該容器（１６８）から取り出し、それにより該容器（１６８）中に含有される流体の量を低減し、
   ・該液体試料の一部を、該タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）を含む流体の一部と、そしてマーカーと混合し、
   ・該分析物（１６０）、該タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）、および該マーカーを含む混合物をインキュベーター（１０２）中でインキュベートし、
   ・該混合物の一部を該インキュベーター（１０２）から測定セル（１０８）に移し、
   ・該タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）の該測定セル（１０８）の作用電極（１２０）への磁気的付着のために、該測定セル（１０８）に磁場を適用し、
   ・発光を引き起こすために励起エネルギーを適用し、
   ・測定シグナル（１３０）の獲得のために発光を測定し、そして
   ・該液体試料中の該分析物（１６０）の存在を示している出力シグナルを、該測定シグナル（１３０）を用いて生成する、
   を含む前記方法。
2. 該容器（１６８）からの流体の一部の抜き出しはピペットプローブを用い、そして該容器（１６８）中に含有される流体の量を示しているシグナルの獲得が該ピペットプローブを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
3. 該容器（１６８）中に含有される流体の量を示しているシグナルの獲得は容量的方法を用いる、請求項１または２に記載の方法。
4. 該撹拌ユニット（１７８）に関する回転数の決定が以下の工程：
   ・該容器（１６８）中に含有される流体の量を示している第１シグナルをデータ処理ユニット（１３２）に提供し、
   ・該第１シグナルの該データ処理ユニット（１３２）への提供に応じて、該データ処理ユニット（１３２）から流体の量に適した回転数を示す第２シグナルを受け取る；
   を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 該データ処理ユニット（１３２）が表（１４２）を含み、該表（１４２）が定められた量の流体に関してどの回転数を用いるべきかを示す情報を含み、ここで該データ処理システム（１３２）は、該第１シグナルを受けることに応答して、該第１シグナルが示す流体の量に適した回転数に関して該表（１４２）を参照し、該流体の量に適した回転数を示している第２シグナルを提供する、請求項４に記載の方法。
6. 該表（１４２）に含まれるデータが経験的に決定される、請求項５に記載の方法。
7. 該タンパク質でコートされた微粒子（１３８）を含む流体を撹拌するための予め定められた期間がそれぞれの分析手順に関して一定に保たれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 撹拌が該容器（１６８）から流体を抜き出す前にのみ実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 該方法工程の後に続く実行が、該容器（１６８）中に含有される低減した量の流体を用いて実施される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 該励起エネルギーが、電気エネルギー、放射エネルギーおよび／または化学エネルギーを適用することにより適用される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 該マーカーが電気化学発光をもたらすことができ、ここで電気化学的に活性な物質が該マーカーとの電気化学発光反応に寄与し、結果として発光がもたらされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. さらに以下の工程：
    ・該液体試料中の分析物（１６０）の存在の結果として複合体を形成する少なくとも１つの特異的な生化学的結合反応を含む反応シークエンスを実施し、該複合体はマーカーを含み、前記の複合体はさらに磁性微粒子（１３８）に結合しており、
    ・前記の分析物（１６０）の存在の決定のために、作用電極（１２０）を有する測定セル中で検出サイクルを実施し、前記の検出サイクルは捕捉工程を含み、その間に、前記の微粒子（１３８）が該作用電極（１２０）の試料に面しない側に位置する磁性構成要素（１１６）の磁場により引き寄せられるような様式で、該複合体は作用電極（１２０）と接触し、それにより前記の作用電極（１２０）の該試料に面する表面上に沈着し、そして電位を該作用電極（１２０）に適用して該マーカーの電気化学的に活性な物質との電気化学発光反応を誘発し、該マーカーの発光を引き起こし、それにより該液体試料中の分析物（１６０）の存在を決定する；
    を含む、請求項１０に記載の方法。
13. 該発光が光学センサーを用いて測定され、該測定シグナル（１３０）が該光学センサーの出力シグナルをサンプリングすることにより獲得される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 液体試料中の分析物（１６０）を検出するための電気化学発光分析システム（１００）であって、以下：
    ・容器（１６８）中で提供される磁性微粒子（１３８）を含有する流体を撹拌するための撹拌ユニット（１７８）、
    ・該容器（１６８）中の流体の量を示すシグナルを生成するように操作可能である測定ユニット、
    ・タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）を含有する流体の一部を該容器（１６８）から抜き出すための抽出構成要素、
    ・該分析物（１６０）、磁性微粒子（１３８）の一部および該分析物（１６０）に印を付けるためのマーカーを含む流体を受けるためのインキュベーター（１０２）、該マーカーは励起エネルギーの適用の際に発光をもたらすことができる、
    ・該発光を引き起こすための励起エネルギーを適用するためのトリガー構成要素、
    ・該発光を測定するための獲得構成要素、該獲得ユニットは測定シグナル（１３０）を提供するように操作可能である、
    ・以下の工程に適合したデータ処理ユニット（１４４）：
    −該容器（１６８）中の流体の量を示すシグナルを用いて該撹拌ユニット（１７８）に関する回転数を決定し、該回転数は該流体の量に比例しており、
    −該撹拌ユニット（１７８）を制御し、該流体を予め定められた期間の間予め決定された回転数を適用することにより撹拌する、
    −該液体試料中の分析物（１６０）の存在を示している出力シグナルを、該測定シグナル（１３０）を用いて生成する；
    を含む、前記電気化学発光分析システム。
15. さらにデータベースを含む請求項１４に記載の分析システム（１００）であって、該データベースが定められた量の流体に関してどの回転数を用いるべきかを示す情報を含む表（１４２）を含み、該データ処理ユニット（１４４）がさらに該データベースにアクセスして該第１シグナルが示している流体の量に適した回転数に関する表を参照するように操作可能である、前記分析システム。
16. 液体試料中の分析物（１６０）を検出する電気化学発光法であって、該方法が以下の工程：
    ・タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）を含む流体を含有する容器（１６８）を撹拌ユニット（１７８）に提供し、
    ・該容器（１６８）中に含有される流体の量を示しているシグナルを獲得し、
    ・該容器（１６８）中の流体の量に応じて該撹拌ユニット（１７８）に関する回転数を決定し、該回転数は流体の量に比例する、
    ・予め定められた期間の間該予め決定された回転数を適用することにより該流体を撹拌し、
    ・該タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）を含有する流体の一部を該容器（１６８）から取り出し、それにより該容器（１６８）中に含有される流体の量を低減し、
    ・該液体試料の一部を、該タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）を含む流体の一部と、そしてマーカーと混合し、
    ・該分析物（１６０）、該タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）、および該マーカーを含む混合物をインキュベーター（１０２）中でインキュベートし、
    ・該混合物の一部を該インキュベーター（１０２）から測定セル（１０８）に移し、
    ・該タンパク質でコートされた磁性微粒子（１３８）の該測定セル（１０８）の作用電極（１２０）への磁気的付着のために、該測定セル（１０８）に磁場を適用し、
    ・発光を引き起こすために励起エネルギーを適用し、
    ・測定シグナル（１３０）の獲得のために発光を測定し、そして
    ・該液体試料中の該分析物（１６０）の存在を示している出力シグナルを、該測定シグナル（１３０）を用いて生成する、
    を含む、
    該容器（１６８）からの流体の一部の抜き出しはピペットプローブを用い、そして該容器（１６８）中に含有される流体の量を示しているシグナルの獲得が該ピペットプローブを用いて実施される、
    前記方法。

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