JPH07159407A

JPH07159407A - 光学的免疫測定方法及びこれに用いられる免疫測定装置

Info

Publication number: JPH07159407A
Application number: JP5305192A
Authority: JP
Inventors: Masato Kimura; 正人木村; Takashi Yamada; 隆山田
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1993-12-06
Filing date: 1993-12-06
Publication date: 1995-06-23
Anticipated expiration: 2017-12-09
Also published as: JP3353978B2

Abstract

(57)【要約】【目的】発光光量を正確に検出することができ測定精度
の高い光学的免疫測定方法及びこれに用いられる免疫測
定装置を提供することにある。【構成】不溶性物質（磁性粒子）を用いて得られた特異
親和性結合複合物に、Ｂ／Ｆ分離の後に第１試薬（過酸
化水素溶液２５）を添加して不溶性物質に結合した被発
光誘発物質を解離させ、被発光誘発物質に第２試薬（ア
ルカリ溶液２６）を添加し被発光誘発物質を化学発光さ
せて光量を検出する光学的免疫測定方法において、被発
光誘発物質を解離させたのち、浮遊状態にある不溶性物
質を非浮遊状態とし、不溶性物質と被発光誘発物質とを
分離して被発光誘発物質を化学発光させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えば、免疫反応によ
り生じる化学発光を検出する光学的免疫測定方法及びこ
れに用いられる免疫測定装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体関連物質の測定は、環境衛生の分野
や医療の分野で日常検査として実施されている。特に医
療の分野では、疾病の特定や疾病に対する治療効果の判
定等の目的で、数多くの施設で数多くの種類の検査が実
施されている。中でも、最近公衆衛生上の問題となって
いる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の感染症や、
従来特定が困難であった癌関連物質等も、特異親和性物
質による反応の一つである抗原抗体反応を用いることで
測定することが可能となっている。ＡＩＤＳ等で代表さ
れる感染症の診断も抗原抗体反応を用いて検出すること
は可能であるが、他に感染性微生物の遺伝子であるＤＮ
ＡあるいはＲＮＡをその核酸の特徴部分と結合する相補
核により測定することも可能である。

【０００３】この核酸と相補核酸の反応も特異親和性物
質による反応の一つであるが、他にはホルモンの一つで
あるインシュリンとインシュリンリセプタの反応のよう
なリセプタ反応もその一つとして知られている。

【０００４】上述したような特異親和性反応を用いた分
析方法は数多知られているが、それらの全てに共通する
ことは、特異親和性物質と結合した物質の量を測定しな
ければならないということである。この物質の測定の方
法としては、特異親和性物質と被結合物質とが結合する
ことにより、それ自身あるいはそれに結合しているトレ
−サの性質が変化することを利用して、結合した被結合
物質量を求める均一測定法（ホモジニアス法）と、何ら
かの方法により特異親和性物質と被測定物質の複合体を
不溶性にした後、特異親和性物質と結合した被結合物質
と結合していないそれとを分離するＢ(bound) ／Ｆ(Fre
e)分離の操作を必要とする不均一法（ヘテロジニアス
法）に大別される。

【０００５】これらのうち不均一法は、特異親和性物質
と被結合物質の複合体に、更に複合体と結合する特異的
結合物質を加え、複合体を大きな分子にすることで不溶
性にする方法が古くから知られているが、信頼性に欠け
るため現在ではあまり用いられなくなっている。

【０００６】最近では、この方法に代わり、予め不溶性
物質に特異親和性物質を結合させておき、不溶性物質を
反応液と分離することで結合した被結合物質と、結合し
ていないそれとを分離するＢ／Ｆ分離を行う方法が一般
的である。

【０００７】また、不溶性物質としてビ−ズ、瀘紙等の
ような反応管以外の物質を用いる方法と、反応管自身を
用いる方法が知られている。更に、トレ−サとして、古
くは放射性同位元素を用いた方法が一般的であった。そ
して、近年は非放射性物質である酵素を用いる酵素免疫
分析方法（ＥＩＡ）が普及したが、更に感度を上げるた
めに発光物質をトレ−サとして用いる方法が近年普及し
つつあり、例えば特開平２−２４５６６２号公報に示さ
れている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】化学発光物質のいくつ
かは、対応する基質物質の存在下で瞬間的に強い発光を
生じる。かかる化学発光物質をトレ−サとして不溶性物
質（例えば、反応容器または担体粒子等）の表面に結合
させた後に発光させる方法では、不溶性物質の表面だけ
で発光するため、その発光量を効率的に測定することは
困難であった。特に不溶性物質として微小なビ−ズを用
いる際には、浮遊状態の微粒子の表面からの発光が微粒
子そのものに反射されるため、正確に発光量を測定する
ことが困難であるという欠点がある。また、使用してい
る微粒子を反射の少ない微粒子とすると逆に消光（クエ
ンチング）という現象が発生するため、いずれの場合も
発光量の正確な計測は困難だった。

【０００９】本発明の目的とするところは、発光光量を
正確に検出することができ測定精度の高い光学的免疫測
定方法及びこれに用いられる免疫測定装置を提供するこ
とにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段および作用】上記目的を達
成するために請求項１の発明は、不溶性物質を用いて得
られた特異親和性結合複合物に、Ｂ／Ｆ分離の後に第１
試薬を添加して不溶性物質に結合した被発光誘発物質を
解離させ、被発光誘発物質に第２試薬を添加し被発光誘
発物質を化学発光させて光量を検出する光学的免疫測定
方法において、被発光誘発物質を解離させたのち、浮遊
状態にある不溶性物質を非浮遊状態とし、不溶性物質と
被発光誘発物質とを分離して被発光誘発物質を化学発光
させる。

【００１１】また、請求項３の発明は、不溶性物質を用
いて得られた特異親和性結合複合物に、Ｂ／Ｆ分離の後
に第１試薬を添加して不溶性物質に結合した被発光誘発
物質を解離させ、被発光誘発物質に第２試薬を添加し被
発光誘発物質を化学発光させて光量を検出する免疫測定
装置において、被発光誘発物質と解離して浮遊状態にあ
る不溶性物質を非浮遊状態とし、不溶性物質と被発光誘
発物質とを分離する不溶性物質分離手段を設けた。

【００１２】そして、これらの発明は、発光光量を正確
に検出することができ、測定精度を向上できるようにし
た。アリジニウム化合物はアルカリ性下過酸化水素の存
在で急激に発光することが知られている。しかし、過酸
化水素はアルカリ性では不安定であるため、アルカリ溶
液と過酸化水素溶液を使用直前に混合し、これをアクリ
ジニウム化合物が結合している微小ビ−ズに添加する方
法が自動化の方法としては一般的である。勿論、初めの
試薬を予めアクリジニウム化合物が結合している不溶性
物質に添加し、充分攪拌した後、次の試薬を添加する方
法も半自動化法としては良く知られている。

【００１３】今回、アクリジニウム化合物としてアクリ
ジニウムエステル化合物を用いることで化学発光の現象
を引き起こす前に酸性下でこのエステル結合を開裂させ
ることができることに気付き、このアクリジニウムエス
テル化合物を微小ビ−ズから解離させ、溶液の上清液中
に溶解している状態のアクリジニウム化合物を発光させ
ることが可能となった。

【００１４】具体的には、アクリジニウムエステル化合
物が結合している応磁性の微小な不溶性物質（磁性ビ−
ズ）に過酸化水素を含む酸性溶液を添加し、攪拌してア
クリジニウム化合物を不溶性物質より解離させた後、電
磁石により不溶性物質を一ケ所に集め、上清液にアルカ
リ溶液を添加し、アクリジニウム化合物を発光させる。
そして、その発光量を光検出器により検出する。

【００１５】磁性粒子を用いる場合、磁気的に容器内壁
に引き寄せた状態で容易に反応容器を洗浄したり、光量
測定できるので、任意の粒径であっても効率よく処理で
き、且つ微粒子による光散乱・吸収等の測定上の障害を
有効に回避できる点で好ましい。磁性流体を含まない懸
濁性の微粒子を用いる場合には、適宜のフィルタによる
分離が可能な粒径または遠心分離が可能な比重等を有し
ているものを用いればよい。場合によっては、中空粒子
等の低比重粒子を用いるか、或いは発光試薬の添加時点
で、反応容器中が適宜の高比重な液体を保持しているよ
うに調整することにより、微粒子が発光反応工程にて選
択的に液中に実質的に懸濁せずに安定に水面付近に浮遊
するようにすれば、遠心処理または磁気的操作を経るこ
となく、測定時の粒子の影響を有効に除きながら横方向
または下方から光量測定することができる点で好まし
い。

【００１６】また、微粒子に固相化した試薬を用いる以
外にも、透明部材からなる反応容器の内壁面に抗体等を
固相化したものや、0.5mm 以上の直径もしくは長さから
なる球状その他の形状の試験片を使用しても同様な作用
効果を奏する。一方、抗体等を固相化した反応容器を用
いる場合には、Ｂ／Ｆ分離を含む免疫反応の間、微粒子
等の固相を吸引してしまう恐れがないので、洗浄液を簡
単かつ十分に行えるとともに、検出工程において微粒子
等の固相に邪魔されることなく測定できるという利点が
ある点で好ましい。

【００１７】必要ならば、フロ−チュ−ブの途中の流路
内壁に抗体等を固相化してチュ−ブ内の流速を制御する
ことにより、円滑に反応とＢ／Ｆ分離とを行った後、上
述した酸性溶液と共にアクリジニウム化合物を透明度の
高い測定セルに流入させることで受光効率の向上を図る
こともできる。

【００１８】本発明において、固相化されたアクリジニ
ウム誘導体は、微粒子または反応容器壁面から遊離して
液中に拡散して均一な発光を生じる。従って、必要なら
ば、拡散を早めるために反応容器中の液体を攪拌するよ
うに、適宜の強度の振動を加えたり、適宜の注入速度・
注入角度でもって発光用試薬を注入するなどの処置を行
ってもよい。また、測定原理はサンドイッチ法でも競合
法でも構わない。アクリジニウム誘導体の発光反応を開
始させる発光用試薬としては、過酸化水素が挙げられ
る。一般に、アクリジニウム誘導体および過酸化水素に
よる発光反応は所定のアルカリ条件下では僅かに発光す
るが、酸性条件下では強く発光する。

【００１９】本発明の方法において、アクリジニウムエ
ステル化合物は強酸化条件でエステル結合が切れ、場合
によってはタンパクの結合部分から解離することによ
り、液中に速やかに拡散するものである。従って、強酸
条件をもたらすには、公知の強酸性化合物、例えば、塩
酸、硫酸、硝酸等のいずれか又は適宜混合液を用いて、
上記拡散作用が得られる程度のｐＨを適宜選択すればよ
い。具体的には０．１規定（Ｎ）の硝酸を含有する溶液
を反応後の支持体に接触させると、数秒程度で充分量の
アクリジニウムエステル化合物を解離して略飽和傾向と
なる。かかる強酸条件の有効ｐＨは、３以下、好ましく
は２以下である。本発明において、アクリジニウムエス
テル化合物の種類としては、種々のアクリジニウムエス
テル誘導体であっても強酸下条件でエステル結合が切れ
る訳であるから、特に限定されない。

【００２０】一方、かかる強酸条件は、上述したように
発光反応を一時的に保留状態にできるから、アルカリ性
物質の添加時機に応じて所望のタイミングで発光反応を
開始させることが可能である。但し、発光反応を測定す
るに当たり、アルカリ性物質を添加してから発光が生じ
るまでの時間は極めて短時間であるので、光遮断された
暗環境下でアルカリ性物質の添加操作を行うのが好まし
い。分析時間を短縮する上で好ましいタイミングは、充
分量のアクリジニウムエステル化合物が液中に解離して
拡散した直後であるから、実験により種々反応条件に最
適な時間を設定すればよい。０．１規定の硝酸液による
解離反応においては、数秒後にアルカリ性物質を添加す
ればよい。

【００２１】

【実施例】以下、本発明の一実施例を図１〜図３に基づ
いて説明する。図１は本発明の一実施例の要部を示して
おり、図中の符号１は化学発光を利用した生体関連物質
の免疫測定装置（以下、測定装置と称する）である。こ
の測定装置１には発光反応部２が備えられており、この
発光反応部２においては、光検出手段としての光電子倍
増管（以下、ＰＭＴと称する）３が本体４に差込まれて
いる。本体４は密閉された箱状のもので、本体４の中に
は壁５によって仕切られた測光セル収容室６とＰＭＴ収
容室７とが形成されている。壁５には第１の窓８が形成
されており、この窓８には開閉自在な第１のシャッタ９
が取付けられている。

【００２２】ＰＭＴ３は、本体４の外に配置されたソケ
ット１０に装着されており、ＰＭＴホルダ１１によって
覆われている。さらに、ＰＭＴ３はその受光側を窓８に
向けている。ソケット１０からは信号線ケ−ブル１２が
導出されており、ＰＭＴ３は信号線ケ−ブル１２を介し
て信号処理装置１３に接続されている。また、ソケット
１０からは高圧電源ケ−ブル１４も導出されており、Ｐ
ＭＴ３は高圧電源１５に接続されている。そして、ＰＭ
Ｔ３には高圧電源１５から高電圧（例えば−1000Ｖ) が
印加されるとともに、ＰＭＴ３は入射した光の強度に応
じたパルス信号を信号処理装置１３へ出力する。信号処
理装置１３はパルスカウンティング機能や演算機能等を
有している。

【００２３】測光セル収容室６にはセルホルダ１６が設
けられており、このセルホルダ１６には試料容器として
の測光セル１７が自在に着脱される。測光セル１７は分
析対象となる試薬や試料を収容するためのものである。
また、セルホルダ１６には、測光セル１７の有無を検知
するための測光セルセンサ１８が備えられている。さら
に、セルホルダ１６には、測光セル１７内の磁性粒子を
集磁するための電磁石１９が内蔵されている。

【００２４】測光セル収容室５には、第１及び第２の分
注プロ−ブ２０、２１（第１及び第２の試薬添加手段）
と、攪拌棒２２とが備えられている。両分注プロ−ブ２
０、２１は、分注駆動源２３、２４や第１及び第２の試
薬容器２５、２６に接続されており、測光セル１７に所
定の試薬を分注する。分注駆動源２３、２４や第１及び
第２の試薬容器２５、２６は本体４の外に配置されてい
る。ここで、分注駆動源２３、２４としてシリンジ等の
一般的な機器を利用することが可能である。

【００２５】また、攪拌棒２２は、本体４の外に配置さ
れた昇降回転機構部２７に連結されている。そして、攪
拌棒２２は、測光セル１７がセルホルダ１６に着脱され
る際には、作業の障害にならないよう上昇し、測光セル
１７内の試薬と試料の混合液を攪拌する際には、下降し
て測光セル１７に進入する。

【００２６】本体４には、測光セル収容室６に面して開
口した第２の窓２８が設けられており、この第２の窓２
８には開閉自在な第２のシャッタ２９が取付けられてい
る。第２の窓２８は、測光セル１７を測光セル収容室６
に出入れするために利用される。また、第２のシャッタ
２９は、外乱光が測光セル収容室６に侵入することを防
止する。

【００２７】この第２のシャッタ２５及び前記第１のシ
ャッタ９には開閉センサ３０、３１が付設されており、
これらの開閉センサ３０、３１によって各シャッタ９、
２９の開閉状態が検出される。

【００２８】つぎに、上述の測定装置１により行われる
測光方法を説明する。ここでは、免疫反応の結果生じた
免疫複合体と未反応の抗原或いは抗体との分離を、抗原
或いは抗体の一方を磁性粒子（不溶性物質、応磁化物
質、ビ−ズ）に固相して、磁性粒子上で免疫複合体（特
異親和性結合複合物）を形成させる免疫反応システムを
例に挙げて説明する。

【００２９】本実施例では、化学発光の発光基質とし
て、瞬間的な発光現象を引起こすアクリジニウムエステ
ル化合物（被発光誘発物質）を使用する。また、化学発
光に到るまでの一連の免疫反応は、測光セル１７内で既
に行われ、且つ、Ｂ／Ｆ分離も終了しているとする。

【００３０】まず、第２のシャッタ２９を開け、Ｂ／Ｆ
分離後の測光セル１７を測光セルホルダ１６に装着す
る。そして、第２のシャッタ２９を閉じ、外乱光を遮
る。このとき、セルホルダ１６の電磁石１９はＯＦＦ状
態にあり、攪拌棒２２は上昇している。また、第１のシ
ャッタ９は閉じており、高圧電源１５はＯＦＦ状態にあ
る。第１及び第２のシャッタ９、２９が閉じていること
が確認され、且つ、測光セル１７がセルホルダ１６に装
着されていることが確認された後、第１の分注プロ−ブ
２０から第１試薬としての過酸化水素溶液が、測光セル
１７に所定量加えられる。

【００３１】この溶液は過酸化水素の安定を保つために
酸性に調整されてるが、この液性のために、磁性粒子上
に免疫複合体を介して結合しているアクリジニウムエス
テル化合物のエステル結合が解離され、アリジニウム化
合物が過酸化水素溶液の上清液に拡散される。この反応
を促進するために、攪拌棒２２が、測光セル１７内の磁
性粒子と過酸化水素溶液を攪拌する。

【００３２】つぎに、第１のシャッタ９が開かれ、ＰＭ
Ｔ３の高圧電源１５がＯＮされる。ＰＭＴ３の出力が安
定するまで、約10〜30秒間このまま放置する。この間、
電磁石１９をＯＮし、測光セル内の磁性粒子に磁力を作
用さて、磁性粒子を測光セル１７の底部に集磁する。

【００３３】この後、再度測光セル１７がセルホルダ１
６によって保持されていることを確認し、第２の分注プ
ロ−ブ２１から測光セル１７へ、第２試薬としてのアル
カリ溶液を所定量加える。このアルカリ溶液の添加によ
り、測光セル１７中の上清液に拡散したアクリジニウム
化合物が瞬間的に発光する。したがって、アルカリ溶液
の分注に連動してＰＭＴ３による測光動作を開始させ
る。

【００３４】微弱光を測光する場合、ＰＭＴ３の出力は
パルス出力となる。そのため、パルスをカウントする時
間を予め決め、その時間内のパルス数をカウントし、微
弱光の光量を算出する。この方法はフォトンカウンティ
ング法と呼ばれる測光方式であるが、本実施例において
は、この方式を採用することが可能である。

【００３５】本実施例のようにアクリジニウム化合物を
利用した場合、約10秒間程度の測光によって全発光量を
計測することができる。測光動作終了後、第１のシャッ
タ９が閉じられ、高圧電源１５がＯＦＦされる。測光に
先立って電磁石１９はＯＦＦされている。電磁石１９の
磁力が雑音源になることを防止するためである。さら
に、第１のシャッタ９が閉じられていること、及び、高
圧電源１５がＯＦＦされていることが確認された後、第
２のシャッタ２４が閉じられ、測光セル１７が取出され
る。

【００３６】そして、上述の動作が繰返され、複数の試
料について発光免疫測定が行われる。上述のような測定
装置１においては、磁性粒子が電磁石１９により集磁さ
れて測光セル１７の底に沈降し、上清液中の磁性粒子が
アクリジニウム化合物から分離され、上清液が均一体と
なる。したがって、磁性粒子の表面での反射を防止する
ことができる。さらに、消光（クエンチング）を防止す
るために反射の少い微粒子を用いる必要がない。この結
果、微弱な化学発光を正確に検出でき、測定精度を向上
することが可能になる。

【００３７】以下に、具体的な実験例と結果を示す。１．実験例まず、β２−ミクログロブリン（β２−ＭＧ）に対する
抗体（三菱化成）を粒径4.5 μｍの磁性粒子（DYNABEAD
S,DYNA1 社）に４×１０⁸ 個／ｍｌ固相化した磁性試薬
（粒子濃度ｗ／ｖ％）１０μｌを、マイクロプレ−ト
（ヌンク社、平底）の各ウエルにて各種濃度のβ２−Ｍ
Ｇを含むＰＢＳ溶液（pH 7.4) １０μｌと夫々室温で５
分間反応させた。次に、ウエルの側部に磁石を１５秒間
当てることにより、反応後の磁性粒子をウエルの一方の
内壁に集め、緩衝液にて２回洗浄することにより、第１
回目のＢ／Ｆ分離を行った。次いで、同様にして、アク
リジニウム誘導体−Ｉ（同仁化学）を標識した抗イムノ
グロブリン抗体１００μｌを注入して室温で５分間反応
させた後に洗浄を行った。約０．６％過酸化水素溶液を
含む０．１Ｎ硝酸溶液（Ａ）と、過酸化水素溶液を含ま
ない同硝酸液（Ｂ）とを５０μｌずつ別個のウエルに分
注した。マイクロプレ−トを暗箱（図１中の測光セル収
容室６）内に移して遮光状態とし、Ａ液を加えたウエル
とＢ液を加えたウエルの夫々に対して、０．２５Ｎ水酸
化ナトリウム液を各５０μｌずつ添加して発光反応させ
ると共に、発光反応が開始してから１秒、２秒および３
秒後の発光によるフォトン数を、ユニバ−サルカウンタ
（浜松ホトニクス）によりカウントして積算値を求め
た。 (i) 第１免疫反応マイクロプレ−トのウエルに反応用緩衝液１００μｌを
加えた後、よく攪拌した磁性粒子浮遊液１０μｌ、検量
線用標準液１０μｌを加え室温で５分間反応させた。

【００３８】なお、攪拌条件を揃えるために試薬等の添
加時のみ検液の吸排を数回繰返すのみとし、反応中は攪
拌なしとした。 (ii)Ｂ／Ｆ分離免疫反応終了後、ランタネット系磁石１個をマイクロプ
レ−トウエルの側部に約１５秒間押しあてることで磁性
粒子をウエル内の一方の内壁に集めた後検液をマイクロ
ピペットで除去した。

【００３９】その後、洗浄液２５０μｌを磁性粒子を分
散させるように注入し直ちに磁石を約１５秒間押しあて
磁性粒子をウエルの内壁に集め洗浄液をマイクロピペッ
トで除去した。

【００４０】この操作をその後２回繰返すことでＢ／Ｆ
分離とした。 (iii) 第２免疫反応Ｂ／Ｆ分離後のウエルに標識抗体１００μｌを加え、検
液の吸排による攪拌を行った後室温で５分間反応させ
た。 (iv)Ｂ／Ｆ分離 (ii)項と同様に２５０μｌの洗浄液で３回洗浄すること
でＢ／Ｆ分離とした。 (v) 発光反応発光試薬Ａ液５０μｌを加え磁性粒子を均一に分散させ
たウエルをフォトカウンティング用の暗箱にセットし、
そのウエル中に試薬を分注するよう設定された分注ユニ
ット（ＲＤ）により発光試薬Ｂ液５０μｌを添加した。 (vi)発光量の計測ユニバ−サルカウンタ（浜松ホトニクス製）により印加
電圧：１２５０Ｖ、ゲ−ト時間：１０ミリ秒、デ−タ
数：５１２の条件で (v)項のＲＤと同期して測定をおこ
なった。なお、測定結果は発光の開始時点より３秒間の
積算値として表した。２．測定結果３秒間のカウントの積算値を以下の表１及び図４に示
す。

【００４１】

【表１】

【００４２】

【表２】

【００４３】これらの結果より、０ng/ml 標準液でのカ
ウント数が若干大きいことが気になるが、１００ng/ml
の標準液までの検量線は反応時間１０分で直線性を示す
ことが確認された。

【００４４】２００ng/ml の標準液が期待されたカウン
ト数よりも低値にでていることにより、この標準液を２
００ng/ml の標準液で倍々希釈して希釈系列を作成しそ
の直線性の検討を行った結果を前掲の表２及び図５に示
した。先の検討よりは改善されているがやはり２００ng
/ml が低値に測定されていることが判明した。このこと
より今回の測定条件では２００ng/ml 程度の検体では抗
原過剰な状態となっていることが考えられる。

【００４５】また、補足資料として、図６に各標準液で
の発光現象の経時変化を示す。このグラフは１０ミリ秒
毎に１ミリ秒あたりのカウント数を示したものである。
発光現象まで約１秒を費やしているが、これは試薬Ｂ液
を分注しているＲＤが起動から実際の試薬の分注まで約
１秒を要していることを示すものである。

【００４６】発光現象の経時変化と今までの測定結果よ
り本試薬の測定は発光試薬Ｂ液分注から約１秒間のフォ
トカウントの積算値で測定できることが明らかとなっ
た。３．追加検討発光物質であるＡＥは試薬Ａ液添加で磁性粒子表面より
解離し溶液中に溶解するものと考えられるため、試薬Ａ
液添加後磁性粒子を均一に分散した場合（ケ−ス１）
と、磁性粒子を強制的に底面に集めた場合（ケ−ス２）
とではどちらが発光量の計測に有利かについて検討し
た。検討結果を以下の表３に示す。

【００４７】

【表３】

【００４８】検討の結果、磁性粒子を底面に集めた方が
測定カウント数は１０％程度多くなることが判明した。
また、再現性については明確な結果は得られなかった
が、やはり磁性粒子を底面に集めた方が若干良好である
ように思われた。

【００４９】なお、本発明は、要旨を逸脱しない範囲で
種々に変形することが可能である。例えば、本実施例で
は電磁石１９が本体４の中に配置されており、磁性粒子
の集磁が本体４の中で行われるが、本発明はこれに限定
されるものではなく、集磁の操作を本体４の外で行って
もよい。つまり、電磁石１９はＰＭＴ３への雑音源とな
るため、ＰＭＴ３と電磁石１９との距離をできる限り離
したり、両者の間に電磁シ−ルドを設けたりすることが
望ましい。したがって、電磁石１９を本体４の外へ配置
して、集磁が本体４の外で行うことにより、雑音をより
低減することができる。

【００５０】この場合、第１の分注プロ−ブ２０も本体
４の外に配置し、過酸化水素溶液の添加から、その後の
攪拌、及び、磁性粒子の集磁までの作業を本体４の外で
行うとともに、アルカリ溶液の添加操作から後の操作だ
けを本体４の中で行うことが考えられる。

【００５１】また、本実施例では電磁石１９が備えられ
ているが、例えば磁性粒子を重力或いはその他の力を利
用して測光セル１７の壁面に集めることができれば、電
磁石１９は不要になる。

【００５２】さらに、例えば図７に示すように測光セル
４１に曲面部分を形成して攪拌部４２を設けてもよい。
つまり、攪拌部４２は垂直な側面４３に連続しており、
試薬は側面４３に沿って分注される。そして、試薬は、
第１の分注プロ−ブ２０または第２の分注プロ−ブ２１
によって、適宜の角度方向から分注される。このとき、
試薬は、セル４１の側面４３に沿って注入される。注入
後の試薬は、側面４３から曲面４４を経て最終的に底部
４５に到達することにより、既に収容されているＢ／Ｆ
分離後の固相粒子を効率よく巻き込んで接触の機会を増
やすので、攪拌棒２２を用いることなく、充分な攪拌効
果が得られる。このことは、特に図１のような遮蔽構造
内での部品点数を減らす点で非常に好ましい。また、振
動による攪拌と異なり、測光セル４１の位置決め構造も
簡単になるから測光装置全体が小型化する。

【００５３】

【発明の効果】以上説明したように請求項１の発明は、
不溶性物質を用いて得られた特異親和性結合複合物に、
Ｂ／Ｆ分離の後に第１試薬を添加して不溶性物質に結合
した被発光誘発物質を解離させ、被発光誘発物質に第２
試薬を添加し被発光誘発物質を化学発光させて光量を検
出する光学的免疫測定方法において、被発光誘発物質を
解離させたのち、浮遊状態にある不溶性物質を非浮遊状
態とし、不溶性物質と被発光誘発物質とを分離して被発
光誘発物質を化学発光させる。

【００５４】また、請求項３の発明は、不溶性物質を用
いて得られた特異親和性結合複合物に、Ｂ／Ｆ分離の後
に第１試薬を添加して不溶性物質に結合した被発光誘発
物質を解離させ、被発光誘発物質に第２試薬を添加し被
発光誘発物質を化学発光させて光量を検出する免疫測定
装置において、被発光誘発物質と解離して浮遊状態にあ
る不溶性物質を非浮遊状態とし、不溶性物質と被発光誘
発物質とを分離する不溶性物質分離手段を設けた。そし
て、これらの発明によれば、発光光量を正確に検出する
ことができ、測定精度を向上できるという効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例の要部を示す構成図。

【図２】発光反応部を示す断面図。

【図３】本発明の一実施例の免疫測定方法を示すフロ−
チャ−ト。

【図４】実験結果を示すグラフ。

【図５】実験結果を示すグラフ。

【図６】実験結果を示すグラフ。

【図７】測光セルの変形例を示すもので、（ａ）は正面
図、（ｂ）は側面図。

【符号の説明】

１…免疫測定装置、３…光電子倍増管、１３…信号処理
装置、１７…測光セル、１９…電磁石（不溶性物質分離
手段、集磁手段）、２２…攪拌棒、２５…過酸化水素溶
液（第１試薬）、２６…アルカリ溶液（第２試薬）。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】不溶性物質を用いて得られた特異親和性
結合複合物に、Ｂ／Ｆ分離の後に第１試薬を添加して上
記不溶性物質に結合した被発光誘発物質を解離させ、上
記被発光誘発物質に第２試薬を添加し上記被発光誘発物
質を化学発光させて光量を検出する光学的免疫測定方法
において、上記被発光誘発物質を解離させたのち、浮遊
状態にある上記不溶性物質を非浮遊状態とし、上記不溶
性物質と上記被発光誘発物質とを分離して上記被発光誘
発物質を化学発光させることを特徴とする光学的免疫測
定方法。
【請求項２】上記不溶性物質が磁力によって非浮遊状
態とされることを特徴とする前記請求項１記載の光学的
免疫測定方法。
【請求項３】不溶性物質を用いて得られた特異親和性
結合複合物に、Ｂ／Ｆ分離の後に第１試薬を添加して上
記不溶性物質に結合した被発光誘発物質を解離させ、上
記被発光誘発物質に第２試薬を添加し上記被発光誘発物
質を化学発光させて光量を検出する免疫測定装置におい
て、上記被発光誘発物質と解離して浮遊状態にある上記
不溶性物質を非浮遊状態とし、上記不溶性物質と上記被
発光誘発物質とを分離する不溶性物質分離手段を設けた
ことを特徴とする免疫測定装置。
【請求項４】上記不溶性物質が応磁化物質であり、上
記不溶性物質分離手段が上記不溶性物質を磁力を利用し
て非浮遊化する集磁手段であることを特徴とする前記請
求項３記載の免疫測定装置。