JPH07508340A - 粒子濃縮と化学発光検出を利用する改良発光検定のための方法ならびに装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 粒子濃縮と化学発光検出を利用する改良発光検定のための方法ならびに装置本願 は同時出願中の１９９１年２月６８ｉこ出願されたＭａｓＳｅＹ等の特許出願連 続筒０７／６５２，４２７号と一部継続するものであり、そして後者は１９９０ 年６月１８１１ｉこ出願された特許出願第０７１５３９，３８９号と一部継続し 、更にｉ＆昔は現在では放棄された電気化学発光検定法と題する１９８８年１１ 月３日出願の特許出願連続筒０７／２６６．８８２号の継続であり、更にこの特 許出願は同時出願中の１９９０年６Ｊ１］８ＥＩｌこ出願された特許出願連続筒 ０７１５３９゜３８９号の一部継続であり、そして後者は現在では放棄された電 気化学発光検定法と題する１９８８年１１月３日出願の特許出願連続筒０７／２ ６６．８８２号の継続である。この特許出願明細書の主題事項は参照により本明 細書中に取り人本願は一般的には結合検定を行なうだめの方法および装置に関し 、更に詳しく言えは、検定系の一つ以上の標識された成分により放出される発光 を測定することにより対象とする被検物質の存在を測定する方法および装置に関 するものである。更に詳しく言えば、本発明は電気化学発光を起こさせる前に、 発光成分を検定組成物中に濃縮し、収集するという、精密で再現性のある正確な 均質または不均質な特異的結合検定法に関する。

発明の背景 生化学的および生物学的物質中に対象とする被検物質の検出と定量のための多数 の方法ならびに装置か開発されて来た。痕跡量の微生物、医薬品、ホルモン、ウ ィルス、抗体、核酸および他のタンパク質を測定することのできる方法および装 置は研究者および臨床医にとって非常に貴重である。

よく知られた結合反応、例えは抗原−抗体反応、核酸ノ＼イブリｙド形成技術、 およびタンパク質−配位子系に基ついた非常に実質のある技術の実体か開発され て来た。多くの生化学的および生物学的結合系における高度の特異性は、研究と 診断に価値の高い多くの検定法および装置へと導いた。典型的な場合では、１種 以上の結合物質に付けられた観察しうる「標識」の有無により対象となる被検物 質の存在か示される。光化学的、化学的および電気化学的手段により発光させる ことのできる標識か特に関心をもたれている。「ホトルミネセンスノは物質か電 磁放射線を吸収するとき発光をひき起こす過程である。蛍光とりん光はホトルミ ネセンスのタイプである。「化学発光」の過程は化学的エネルギー移動により発 光種の生成を必然的に伴う。「電気化学発光」は電気化学的に発光種を生成する 必要かある。

対象とする被検物質を含む試料を化学発光性標識で標識した反応体と混合する化 学発光検定技術か開発された。反応性混合物をインキュベーションすると、標識 された反応体の若干部分は被検物質に結合する。インキュベーション後、混合物 の結合部分と非結合部分とに分ける。いずれかの部分または両方の部分の中の標 識の濃度は化学発光技術により定量できる。一方または両方のフラクションに測 定された化学発光の強度はその生物学的試料中の対象とする被検物質の量を示す 。

インキュベーションした試料は発光を誘発するためにポルタンメトリー作用電極 に暴露することかできる。適切な化学的環境においては、ある特別な時間と特別 な方法で作用電極に加えられた電圧によりこのような電気化学発光がひき起こさ れる。標識により発生した光を測定すると、これは被検物質の存在あるいは量を 示す。このような電気化学発光技術の更に詳しい説明をめるには、ＰＣＴ公開出 願第ＵＳ　８５１０１２５３号（Ｗ０８６１０２７３４）明細書、ＰＣＴ公開出 願第ＵＳ　８７１００９８７号明細書、およびＰＣＴ公開出願第ＵＳ　８８１０ ３９４７号明細書か参考になる。上記出願の開示は参照により取り入れである。

検定手順の間に分離工程を必要とすることなく化学発光検定を実施しうろことお よび被検物質の様々な濃度において精密かつ高感度な測定をなしつるように信号 変調を最大にすることか望ましい。

先行技術による分離検定法には、米国特許第４．１４１，６８７号および欧州特 許出願第０．０３０，０８７号明細書に記載のような方法かあり、これらは導管 中で粒子を磁気的に分離した後粒子を別個のチャンバーに移して標識の分析に供 する方法に関する。

先行技術による非分離検定法には、検定試料中に懸濁させた微粒子状物質を用い て検定試料の１種以上の結合性成分を捕捉する方法である。

米国特許第４．３０５，９２５号明細書は、ネフエロ分析法および比濁分析法を 用いて臨床的に関係のあるタンパク質およびペプチドを検出し定量する方法に関 する。開示された方法は、光散乱または吸着の機能を果たすラテックス粒子に抗 原あるいは抗体を固定するものである。

米国特許第４，４８０，０４２号明細書は、殻−核粒子からなる粒状試薬を使用 する技術に関する。その殻は生物学的興味のある化合物を共存結合させることの できる官能基を含み、そして核部の高い屈折率は光散乱測定に対して高感度をも たらす。この技術は、２価抗体を対象とする多価抗原とから集合体を生ずる反応 の結果起こる凝集現象に基づくもので、この集合体は種々の方法で検出しそして （または）測定することができる。

同様に、米国特許第４，４１９，４５３号明細書は、抗体および免疫原といった 免疫化学物質の存在を検知するために役立つ着色ラテックス凝集試験法の使用に 関する。

この先行技術に基づくと、発光現象を測定する検定法に微粒子状物質を使用する ことか可能であるとは思われないであろう。誰もか遊離の化学発光部分から生し た発光か吸収され、散乱され、あるいは他の仕方で微粒子状物質による妨害を受 ける筈であろうと予想する。

この予想とは反対に、米国特許願連続第２６６．８８２号明細書（ＰＣＴ公開出 願ＵＳ第８９１０４９１９号明細書）は、検定系の結合性反応体の一つに不活性 な微粒子状物質を特異的に結合させた、発光現象に基づく感度の良い特異的結合 検定法を教示している。この検定法は不均質な（一つ以上の分離工程を含む）検 定形態て実行できるか、均質な（非分１１ｉ１）検定形態て用いる方か最も有利 であるかも知れない。

特許出願第ＵＳ８９１０４９１９号明細書は、発光現象の測定のための結合反応 に基づく検定法に供する組成物に関し、前記組成物は検定混合物の一成分に結合 しつる表面をもつ多数の懸濁粒子を含んでいる。別の面でこの特許願は、試料中 の対象とする被検物質を検出あるいは定量するための方式に向けられており、こ の方式はその発明に係る検定組成物を使用して検定法を行なうことかできるもの である。この方式は検定媒質中の標識化合物に発光を誘発させる手段およびその 発光を測定して試料中の対象とする被検物質の存在を検知する手段を含んでいる 。

このように、特許出願第ＵＳ　８９１０４９１９号明細書は試料中の対象とする 被検物質の検出法に関するもので、その方法は（１）（イ）対象とする被検物質 を含むことか予想される試料、（ロ）（ｉ）対象とする被検物質あるいは対象と する被検物質の類縁体、（ｉｉ）対象とする被検物質あるいはその前記類縁体の 結合相手、および（ｉｉｉＸｉ）または（ｉ　ｉ）と結合することのできる反応 性成分（前記物質の一つは発光を誘発しつる化学部分を存する標識化合物に結合 される）からなる群から選はれる検定実行物質、および（）Ｘ）被検物質および （または）（ロ）の（ｉ）、　（ｉｌ）、または（ｉｉｉ）で定義された物質と 特異的に結合することのできる多数の懸濁した粒子からなる組成物をつくり、（ ２）該組成物をインキュベーションして粒子および前記標識化合物を含む複合体 をつくり、（３）標識化合物を発光させるよう誘発し、そして（４）組成物によ り誘発された発光を測定して試料中の対象とする被検物質の存在を検知する、と いう諸工程を含む。これらの同じ方法を用いて検定組成物の発光を、既知量の被 検物質を含む組成物の発光と比較することにより、試料中の被検物質の量を定量 できる。

対象とする被検物質の類縁体は、天然のこともあれば合成物質のこともあり、被 検物質に匹敵する結合性を存する化合物であるか、もっと高い結合能力あるいは 低い結合能力をもつ化合物も包含する。本発明への使用に適した結合相手は公知 である。例は抗体、酵素、核酸、レクチン、補因子および受容体である。被検物 質またはその類縁体とおよび（または）その結合相手と結合することのできる反 応性成分は第二の抗体のこともあれば、あるいはタンパク質、例えばプロティン ＡまたはプロティンＧのこともあり、あるいはアビジンまたはビオチンまたは結 合反応に入ることのできるこの分野で公知の他の成分のこともある。

発光は標識化合物（特異的な結合の相手と結合していようか結合していまいか） をポルタンメトリー作用電極に暴露することによりひき起こされた電気化学発光 （ＥＣＬ）から生ずるのか有利である。ＥＣＬ反応混合物は、光を発生させるた めに特別な時間と特別な仕方で作用電極に加えられる電圧により、調節下に発光 を誘発させる。可視光線の放出は有利な特徴であるか、本組成物あるいは方式は 他の型の電磁放射線、例えば赤外または紫外光線、Ｘ−線、マイクロウェーブな とを放出てきる。「電気化学発光」、　「電気化学発光性のＪ、「発光Ｊ、［発 光性の」、および「発光する」という用語の使用は光および他の形の電磁放射線 の放出を包含する。

米国特許出願第８９１０４９１９号明細書に教示された方法は、研究および臨床 の環境の中で実行される種々の検定において、極端に少量の被検物質の検出およ び定量を可能にしている。しかし、研究者および臨床医の要求は、これら検定法 の感度を増加させるためにそして検定法を実行しつる速さを増すために、これら の方法によって実行される検定の検出限界を下げることを緊急の問題としている のである。

標識された化学種からの信号を測定段階にかける前に、それを濃縮することによ り増強する種々の方法かこの分野で知られている。例えば、米国特許第４，６５ ２．３３３号明細書によると、蛍光、りん光あるいは原子蛍光標識で標識された 粒子を、測定段階の実行前にミクロ濾過により濃縮している。

また、例えば磁気応答性の標識粒子を測定容器の表面に吸い出すことにより、標 識された免疫化学種を測定段階に先立ち濃縮することもこの分野で公知である。

例えば、米国特許第４，７３１，３３７号、第４．７７７．１４５号、および第 ４．１１５，５３５号明細書によると、このような粒子を容器壁に引き寄せ、次 に照射してフルオロホア発光を励起する。

米国特許第４，９４５，０４５号明細書によると、粒子を磁性電極上に濃縮して いる。標識された化学的媒介物質により促進された電極て電気化学的反応か起こ る。免疫化学的結合反応か媒介物質の効果を変化させる結果結合か起こるときに 変調信号を生ずる。

発明の目的 従って、本発明の主たる目的は、結合検定法を行なうための均質（非分離）およ び不均質（分離）法、試薬および装置を提供することにある。

本発明の更に一つの目的は、微粒子状物質を含む検定組成物から放出される電気 化学発光の測定に基づく、非分離、特異的結合検定法、試薬および装置を提供す ることにある。

更に一つの関連した目的は、従来達成されたものよりも感度が向上し、検定時間 か速く、感度か高く、検出限界か低く、そして正確さが大きい検定法、試薬、お よび装置を提供することにある。

化学発光は分子の高エネルギー励起状態を発生させる原因となるエネルギーか、 活発な化学反応から導かれる発光反応として定義される。このように化学発光反 応は化学エネルギーから電磁放射線（紫外線、可視光線、または赤外線）への直 接変換である。励起状態の分子がその基底状態のエネルギー準位に戻るとき発光 か起こり、特定波長の光子を放出し、そしてこの波長はその分子および基底状態 と比較したその励起状態のエネルギーに特徴的なものである。

多くの化学反応によりエネルギーか発生し、このような反応は発熱反応と呼ばれ る。大抵の場合、そのエネルギーは熱として現われ、分子における振動、回転、 および並進のエネルギーを誘発する。化学発光反応において、このエネルギーの 少なくとも一部は高エネルギー励起状態の生成に使われる。これは一般に２分子 の極めて活発な迅速な反応を要求し、分子の一方は光を放出することかてきる・ 量Ｈνは電磁放出線の光子を表わす。ｈはブランク定数であり、νは放出された 光の振動数である。

若干の化学発光反応においては、励起状態の分子Ｃ０の電子エネルギーは別の分 子に移動し、 Ｃ”＋Ｅ−４Ｃ十Ｅ” 次に後者は電磁放出線の光子を放出することによってその基底状態まで減衰する 。

化学発光の検出を用いる特異的結合検定法、例えは免疫検定は、結合する相手の 一つに付いた標識として反応体の一方を使用している。このような検定法におい て、反応体は一般に標識および誘発物質と呼ばれ、次式に従って反応する。

標識十誘発物質→標識８＋副生成物 標識６→副生成物十ｈν 特異的結合検定法に使用されて来た化学発光は識の例にはアクリノニウムエステ ル、ルミノール、イソルミナール、シュウ酸エステル、ジオキセタン、およびル シフェリンか含まれる。多くの場合、この誘発物質分子は過酸化水素のような酸 化剤であり、標識を高エネルギー反応で酸化することかでき、そして標識の励起 状磐を発生させることかできる。

時には化学発光過程の効率を増加させる手段として、促進物質分子を化学発光反 応に使用する。このような分子は一般に反応の反応速度を遅くし、光放出の量子 収率を増加させる。

化学発光結合検定法には酵素を標識として使用するものも実証されている。これ らの場合、酵素は誘発物質溶液の存在下で化学発光反応を触媒する。−例は、過 酸化水素と水酸化物イオンの存在下で、ルミノールの化学発光反応を触媒するた めの酵素セイヨーワサビ　ペルオキシダーゼの使用である。

用語「化学発光性部分」、「標識」、「標識化合物」、および「標識物質」は互 換性をもって使用している。「化学発光性部分」、　「標識化合物」、　「標識 物質」、および「標識」と呼ふ化学種を、被検物質またはその類縁体、被検物質 またはその類縁体の結合相手、ならびに」−記のこのような結合相手のそれ以外 の結合相手、あるいは被検物質、その類縁体あるいは上記の結合相手と結合する ことのできる反応性成分といった分子に結合させることは本発明の範囲内にある 。上記化学種は１種板」−の結合相手および（または）ＩＦ’Ｊ以」二の反応性 成分のコンビネーションにも結合させることかできる。更にまた、上記種は結合 相手に固定された被検物質またはその類縁体、反応性成分、あるいは１種以上の 結合相手および（または）１種以上の反応性成分のコンビネーションに結合させ ることもてきる。多数の上記ｐ１について被検物質またはその類縁体に直接、あ るいは前述したような他の分子を介して結合させることも本発明の範囲内にある 。簡潔のため、これら配位子を検定実行物質と呼ぶ。

検出および定量という用語は［測定ｊを指すか、定量は標準組成物の調製および 校正を必要とすることかあるのは当然である。

複合体の収集および濃縮という用語は、検定組成物中の複合体の濃縮および、例 えば、フローセル表面での複合体の収集を記述するため互換性をもって使用する ことかある。

発光は標識化合物を、それか特異的な結合相手に結合されていようかいまいが、 標識か発光するように前記標識を誘発しうる誘発物質へ暴露することにより誘導 された化学発光から起こるのかを利である。誘発物質は標識か酸化されて発光す るように前記標識を酸化しつる酸化剤であるのがよい。化学発光性の反応性混合 物は、特別な時間と特別な仕方で発光するよう調節下に誘発して光を発生させる 。

可視光線の放出か有利な特徴であるか、本組成物あるいは方式は他の型の電磁放 射線、例えは赤外線または紫外線、Ｘ−線、マイクロウェーブなどを発すること もある。「化学発光ｊおよび「化学発光性」という用語の使用は光および他の形 の電磁放射線の放出を含む。

図面の簡単な説明 図１は本発明に係る微粒子を基本とする非分離および分離検定法を実行するため の永久磁石を含むセルの概略図である。

図２は、化学発光性の標識をしたオリゴヌクレオチドおよびプライマーとしてビ オチン化学発光性の標識をしたオリゴヌクレオチドを使用する直接導入ＰＣＲ形 悪の概略表示である。

図３は、ビオチニル化したＰＣＲおよびＰＲＯＤＵＣＴを生成させるためビオチ ニル化プライマーを使用する標準ＰＣＲ構成の概略表示である。

図４は、化学発光性の標識をしたオリゴヌクレオチドへ後からハイブリッド形成 するための一本鎖ビオチニル化ＤＮＡを発生させる非対称ＰＲＣ検定形態の概略 表示である。

図５は、複合体を収集域表面に沈降させるために電磁石を使用する沈降検定セル の概略表示である。

図６は、収集域表面下の磁石の配向の相関として収集域付近の力線の概略表示で ある。

図７は、複合体を遠心により収集域に沈着させる回転フローセルの概略表示であ る。

図８は、本発明に係る微粒子を基本とする非分離および分離検定法を実行するた めの永久磁石を含むセルのもう一つの概略図である。

図９は、図８のセルと共に使用するための電圧調節装置の簡略図である。

図１０は、複合体を沈降させるために重力に頼る検定法を行なうのに使用する検 定セルの概略表示である。

発明の詳細な説明 その最も幅広い具体例を示すと、本発明は試料中に存在する対象とする被検物質 の結合検定法を実行する方法にある。以下の工程か含まれる・（イ）（＋）前記 試料、 （１１）誘発されたとき化学発光しうる標識化合物に結合された成分を含む検定 実行物質、および （ｉｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合すること のできる複数の粒子 を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキユベーシヨンして粒子および前記標識化合物を含む複 合体をつくり、 （ハ）前記複合体を収集域に集め、 （ニ）前記標識か発光するように前記標識を誘発することのできる誘発物質を前 記収集域中に導入し、そして （ホ）放出された発光を測定して試料中の対象とする被検物質の存在を測定する 。

なるへくこの誘発物質は、標識か酸化されそして化学発光するように標識を酸化 しうる酸化剤であるのかよい。また粒子は磁気的応答性かあり、複合体を磁気的 に収集域に集めるのかよい。

もう一つの具体例を示すと、検定実行物質あるいは粒子は、標識を酸化しうる酸 化剤に前駆物質を変換する酵素を含み、そして誘発物質かその前駆物質である。

本発明は複合体を測定域に、即ちそれか発光を起こしうる表面上に集めることに より実施されるか、本発明はまた複合体を測定域に集め、その後発光を誘発しか つそれを測定する手段を核酸に講しるかまたは他の工程を設ける方法も包含する 。

複合体の収集は、種々の幾つかの方法、例えば自然沈降、濾過、遠心、および複 合体の一部を形成する磁気応答性粒子の磁性吸引、により行なうことができる。

幾つかの具体例を下に更に詳しく説明する。

バッチ式検定法を実行できるか、連続式あるいは半連続式検定法もフローセルて 実行できる。フローセルにおいては、固体相か測定セル内に留まる一方、溶液は セルの出口を通って流れる。もし固体相（例えば、粒子）が水より重い、即ち水 の密度より大きい密度（１，０ｇ／ｍｌより大）をもつなら、粒子にかかる重力 は粒子をセルの底部に降下させることになる。セルは粒子か底に沈降し、流体は セルを通って流れるように構成することができ、あるいはセルは収集域の上の円 柱形の区分のセル内に試料の大部分か含まれるように構成することもできる。化 学発光を誘発する前に粒子を収集域に沈降させるためには、セル内に十分な滞留 時間を設けねばならない。

本発明のもう一つの具体例においては、懸濁粒子（検定組成物の残りの部分より 大きい密度をもつ）を含む検定組成物を遠心にかけて粒子を測定域に移し、ここ てその後粒子を例えは誘発物質と接触させて化学発光をひき起こさせる。

この具体例においては、試料および試料封入容器を迅速に回転させる手段を測定 セルに設ける。試料中の粒子は遠心力により試料封入容器の回転軸から外側に向 かって動き、試料封入容器の外面に集められる。

第三の具体例を示すと、粒子を検定組成物から濾過により除くことかできる。

この具体例によると、粒子は検定組成物の粒子以外の部分より大きい密度を有す る必要かない。溶液を濾過器に通して吸引する、例えばポンプ送りする、ことに より粒子を溶液から分離し、濾過器の表面上に粒子を集めることにより濃縮する 。

特に適当な一具体例をあげると、懸濁粒子は磁気応答性であり、例えばそれらは 常磁性あるいは強磁性であり、粒子に対して磁場をかけることにより測定域に集 められる。測定セルは磁石を具えている。粒子かバッチセル内に留まるとき、あ るいはフローセル中を粒子か流れるとき、磁石の磁場で粒子に力かかかり、粒子 は溶液の大部分から分離して磁石に最も接近したセルの表面上に行く。

前記の方法を用いて複合体を収集し、濃縮することにより、結合検定法に対して 幾つかの異なる不均質および均質の形態を実行することができる。不均質結合検 定においては、標識からの発光の測定前に複合体を組成物から分離する。均質検 定においては、結合（固体相へ）および非結合標識試薬の分離を行なわない。

・　均質検定法において、複合体を収集域に濃縮する場合、標識からの測定され る信号は、濃縮工程か存在しない場合よりはるかに大きい。複合体を形成してい ない標識された試薬からの信号は反対に変化しない。このため、測定セル中に複 合体未形成の標識された試薬か存在するにも拘らず、収集された複合体からの信 号は複合体を収集しない検定法におけるよりも強い。この収集手順の結果として 、結合検定法に対する検出限界かはるかに改善される。

本発明の特に適当な具体例を示すと、均質結合検定手順の中に原位置分離工程か 含まれる。検定組成物、即ち試料、検定実行物質および粒子を測定セル中にポン プ送りし、複合体を収集域に集めた後、標識あるいは標識された試薬を含まない 第二の液体をセル中にポンプ送りすることによって、検定組成物の未結合成分か ら複合体を原位置洗浄あるいは分離することかてきる。この検定手順は技術的に は不均質結合検定法である。しかし、測定セル内での分離実行能力は、追加分離 装置を必要とせず、かつこの手順の方か一般に外部分離法よりもはるかに早いと いう点て有利である。

不均質結合検定は、本発明方法を用いることにより、検定組成物の成分を混合し 、それらを所定の時間反応させることにより行なわれる。次に検定組成物を粒子 に暴露する。次に複合体または溶液いずれかからの化学発光を測定する。濃縮工 程後の複合体からの化学発光を測定すると、濃縮せずに可能とされるよりも高い 正確さと低検出限界をもって被検物質を測定できる。

もう一つの具体例をあげると、本発明は試料中に存在する対象とする被検物質の 結合検定を実行する方法にある。それには次の工程か含まれる（イ）（１）前記 試料、 （１１）誘発されたとき化学発光しつる標識化合物に結合された成分を含む検定 実行物質、および （ｉｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合すること のできる複数の粒子 を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキュベーションして粒子および前記の標識された成分を 含む複合体を形成せしめ、 （ハ）前記複合体を電極表面に集め、 （ニ）標識化合物を誘発物質と接触させることによりその発光を誘発し、前記誘 発物質は電気化学エネルギーの導入時に、例えば電極に電圧を印加することによ り、前駆物質分子を変換させることにより原位置で形成させ、そして（ホ）放出 された発光を測定して試料中の対象とする被検物質の存在を測定する。

複合体を、例えは電極表面に集め、この表面で、例えは標識が酸化されて化学発 光するように標識を酸化することのてきる酸化剤を収集域中に導入すること（こ より、励起させ、化学発光を誘発することができる。本発明によると、この酸化 剤は前駆物質分子の変換によりその場で形成される。試料を含む組成物は前駆物 質分子を含むこともてき、あるいは前駆物質分子を、インキュベーションの前後 いずれかで、しかし磁気的収集の前に、あるいはインキュベーションした複合体 を磁気的に集めた後で、導入することかできる。

このようにして、本発明は試料中に存在する対象被検物質の結合検定を実行する 方法に関し、そして拳法は、 （イ）（ｉ）前記試料、 （■）酸化時に化学発光しうる標識化合物へ結合された成分を含む検定実行物質 、 （山）被検物質および（または）前記検定物質と特異的に結合することのできる 複数の被覆磁性粒子、および （ｉｖ）前記標識を酸化しうる酸化剤へ電気化学的に変換されうる分子を含む組 成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキュベーションして粒子と前記標識化合物を含む複合体 をつくり、 （ハ）前記複合体を電極表面に磁気的に集め、（ニ）前記標識か酸化され、発光 するように前記電極に電圧を加えることにより前記分子を前記酸化剤に変換し、 そして（ホ）放出された発光を測定して試料中の対象被検物質の存在を測定する という諸工程を含む。

更に本発明は試料中に存在する対象被検物質の結合検定法を実行する方法に関す るものであり、そして拳法は、 （イ）（＋）前記試料、 （１１）酸化時に化学発光しうる標識化合物へ結合された成分を含む検定実行物 質、および （ｉｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合すること のできる複数の被覆磁性粒子 を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物へ、前記標識を酸化しつる酸化剤に電気化学的に変換されうる 分子を導入し、 （ハ）前記組成物をインキュベーションして粒子と前記標識化合物を含む複合体 をつくり、 （ニ）前記複合体を′ＦＬｉ表面に磁気的に収集し、（ホ）前記標識か酸化され て発光するように、前記電極に電圧を加えることにより前記分子を前記酸化剤に 変換し、そして（へ）放出された発光を測定して試料中の対象とする被検物質の 存在を測定する という諸工程を含む。

本発明はまた試料中に存在する対象被検物質の結合検定法を実行する方法に関す るものであり、そして拳法は、 （イ）　（ｉ）　ｔｍ記試料、 （■）酸化時に化学発光しうる標識化合物へ結合された成分を含む検定実行物質 、および ＜１ｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合すること のできる複数の被覆磁性粒子 を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキュベーションして粒子と前記標識化合物を含む複合体 をつくり、 （ハ）前記組成物へ、前記標識を酸化しうる酸化剤に電気化学的に変換されうる 分子を導入し、 （ニ）前記複合体を電極表面に磁気的に集め、（ホ）前記標識か酸化されて発光 するように、前記電極に電圧を加えることにより前記分子を前記酸化剤へ変換し 、そして（へ）放出された発光を測定して試料中の対象とする被検物質の存在を 測定する という諸工程を含む。

本発明はなお更に試料中に存在する対象被検物質の結合検定法を実行する方法に も関するものであり、そして拳法は （イ）（１）前記試料、 （１１）酸化時に化学発光しつる標識化合物に結合された成分を含む検定実行物 質、および （■）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合することので きる複数の被覆磁性粒子 を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキュベーションして粒子と前記標識化合物を含む複合体 をつくり、 （ハ）前記複合体を電極表面に磁気的に集め、（ニ）前記組成物へ、前記標識を 醇化しつる酸化剤へ電気化学的に変換されうる分子を導入し、 （ホ）前記標識か酸化されて発光するように、前記電極に電圧を加えることによ り前記分子を前記酸化剤へ変換し、そして（へ）放出された発光を測定して試料 中の対象とする被検物質の存在を測定する という諸工程を含む。

特に適当な一具体例においては、懸濁粒子か磁気応答性であり、例えばそれらか 常磁性のこともあれば強磁性のこともあり、そして測定域に、あるいはなるへく は直接電極表面に、粒子に対して磁場をかけることによって収集する。測定セル は磁石を具えている。粒子かバッチセル中に留まっているとき、あるいはそれら かフローセル中を流れているとき、磁石の磁場から粒子に力かかかると、粒子は 溶液の大部分から分離して磁石に最も接近したセルの表面に行く。もし磁石か適 当な配向で、化学発光検出系の作用電極に接近して置かれると、粒子は作用電極 の表面に集中するであろう。

発明の詳細な説明 本発明ならびに他の目的およびその特徴は、幾つかの特に適当な具体例について の次の説明から一層明瞭に詳しく理解されるであろう。

本発明は結合反応に入りうる対象被検物質に一般に適用しつる。これらの反応は 、例えば抗原−抗体、配位子受容体、ＤＮＡとＲＮＡの相互作用、および他の公 知の反応を包含する。本発明は多成分試料中の対象とするこのような被検物質の 存在を定性的および定量的に検出するための種々の方法および検定法に関する。

試料 対象とする被検物質を含みうる試料は固体、乳濁系、懸濁系、液体、あるいは気 体の形にあるかもしれず、例えは細胞および細胞由来の生成物、水、食品、血液 、血清、毛髪、汗、尿、便、組織、唾液、７１１１類、打機溶媒あるいは空気か ら誘導されることもある。試料は、更に例えば、水、アセ１−二トリル、ジメチ ルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−ピロリドンまたはアルコ ール類またはその混合物をよむこともある。

被検物質 対象とする興り的な被検物質は全細胞または表面抗原、細胞上粒子、ウィルス、 ブリオン、ウィロイド、抗体、抗原、ハブテン、脂肪酸、核酸、タンパク質、リ ポタンパク質、多糖類、リボ多糖類、糖タンパク質、ペプチド、ポリペブチ１− １細胞代謝物、ホルモン、薬理作用物質、合成有機分子、有機金属分子、トラン キライザー、バルビッール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ 酸、糖、レクチン、組み換えあるいは誘導タンパク質、ビオチン、アビノン、ス トレプトアビジン、あるいは試料中に存在する無機分子である。典型的には、対 象とする被検物質は１０１モル以下、例えば１ｏ−０モル以下といった少量で存 在する。

検定実行物質 対象とする被検物質を含む試料と合わせる検定実行物質は（ｉ）前に定義された 対象とする添加された被検物質またはその類縁体、（ｉ　ｉ）対象とする被検物 質またはその前記類縁体の結合相手、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉ　ｉ） と結合することのできる、前に定義された反応性成分（前記物質の一つは化合物 あるいは部分、例えば発光するように誘発されうる化学発光性部分、に結合され る）からなる群から選はれる少なくとも１種の物質を含む。標識された物質は全 細胞または表面抗原、細胞上粒子、ウィルス、プリオン、ウィロイド、抗体、抗 原、ノ１ブテン、脂質、脂肪酸、核酸、多糖類、タンパク質、リポタンパク質、 リボ多糖類、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、細胞代謝物、ホルモン、 薬理作用物質、トランキライザー、バルビッール酸塩、アルカロイド、ステロイ ド、ビタミン、アミノ酸１、糖、非生物学的重合体（なるへくは可溶性）、レク チン、組み換えまたは誘導タンパク質、合成有機分子、有機金属分子、無機分子 、ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンのいずれでもよい。−具体例を あげると、試薬は抗体、抗原、核酸、ハブテン、小ヌクレオチＩ一連続体、オリ ゴマー、配位子、酵素、またはビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロ ティンＡ、プロティンＧ、あるいはその複合体、あるいはタンパク質相互作用を 通して主要結合相手に結合しつる他の二次的結合相手に接合した化学発光性部分 である。

対象とする被検物質の類縁体は天然物でも合成物でもよく、典型的には被検物質 に匹敵する結合性をもつ化合物であるが、これらはまたもつと高い、あるいはも っと低い結合能力をもつ化合物のこともありうる。被検物質またはその類縁体と 、および（または）その結合相手と結合することのできる、そして化学発光性部 分を被検物質につなぐことのできる反応性成分は第二の抗体またはタンパク質、 例えはプロティンＡまたはプロティンＧ、あるいはアビジンまたはビオチン、あ るいはこの分野で結合反応に入ることか判っている他の成分か適当である。

化学発光性部分の機能は、反応系中に誘発物質、とりわけ酸化剤を導入する結果 として電磁放射線を発することである。これを行なうためには、これらは励起さ れたエネルギー状態まて誘発されることかできなけれはならず、そしてまたこの 励起状聾から下降するときに光の光子のような電磁放射線を放出することかでき なければならない。

誘発物質は、電気化学的エネルギーの導入時に、例えは電極に電圧波形を印加す ることにより、前駆物質、例えば水、を酸化剤、例えば過酸化あるＩ、ｓは超酸 化水素、に変換することによりその場で形成される。第二の例として、前駆物質 としての酸素分子は電気化学的に還元されて過酸化水素、即ち誘発物質、を生ず る。

本発明方法に従い添加される化学発光性部分の量は系ごとに変化するであろう。

一般に、利用されるこのような部分の量は、上記組成物あるいは系から検出可能 な、また望むならは定量可能な電磁エネルギーの放出を起こすのに有効な量であ る。対象とする被検物質の検出および（または）定量は、典型的には対象とする 被検物質と化学発光性部分とを含む試料から生じた発光を、既知量の対象とする 被検物質と化学発光性部分とを用いてつくり出された校正標準により放出された 発光と比較することによりなされる。これは均質形態をとることになる。不均質 様式においては、化学発光分析の前に前記のような分離を行なう。

当業者にとって明らかなように、化学発光性部分の実体と量は一般に行なわれる 条件によって糸色に変化するであろう。適切な化学発光性部分、および望む結果 を得るための十分な量は、一旦本発明の教示を授けられたならば、不当な実験を 実施しなくとも当業者により実験的に決定できる。

梓ヱ 粒子は０．０５μｍから２００　μｍ、なるへくはＯ，１μｍから１００μｍ、 最も好ましくは０５μｍから１０μｍの直径と、被検物質および（または）前記 の小バラグラフ（ロ）（１）、（ロ）（ｉｉ）、あるいは（ロ）　（ｉｉｉ）に 定義された他の物質の１種以上に結合することのできる表面成分とを有する微粒 子状物質からなるのか有利である。例えば、この微粒子状物質は架橋されたデン プン、デキストラン、セルロース、タンパク質、有機重合体、スチレン共重合体 、例えばスチレン／ブタノエン共重合体、アクリロニトリル／ブタノエン／スチ レン共重合体、ヒニルアセチルアクリレート共重合体、あるいは塩化ビニル／ア クリレート共重合体、不活性無機粒子、二酸化クロム、鉄の酸化物、シリカ、シ リカ混合物、およびタンパク質性物質、あるいはこれらの混合物でよし）。望ま しく（よ、これら粒子を化学発光性の系に懸濁させるのかよい。

電気化学発光の測定装置 本発明に係る検定法を実施するための装置を図１で説明する。図１は有利な化学 発光装置を開示しているか、本発明方法は装置ＩＯによる適用に限らず、むしろ 標識された成分を収集するための手段を含む池の型の化学発光装置でも使用でき る。本発明方法は静的様式またはフロースル一様式のいずれかで実施できるが、 装置１０はフロースルーセルを含む。これは結合検定試料を含めて多くの型の試 料に対し明確な利点を具えている。本発明化学発光検定法を実施するための装置 についてのこれ以上の詳細は、一般に誼渡された公開ＰＣＴ米国特許出願第８９ １０４８５４号および第９０１０１３７０号明細書に開示されている。

装置１０は測定セル１２、光検知／測定装置１４（これは光電子増倍管（ＰＭＴ ）であるのか有利である）、光ダイオード、電荷転送素子、写真フィルムあるい は乳剤なと、およびポンプ１６を含み、後者のポンプはセル１２へ、セル１２を 経て、またセル１２からの流体輸送に備えて螺動ポンプか有利である。他方、容 量形ポンプも使用できる。ンヤッター機構１８がセル１２とＰＭＴＩ４との間に 設けられ、化学発光側定期の間にＰＭＴ１４をセル１２に露出する時においての み調節下に開くよう操作される。例えば、このツヤツタ−機構は保守点検中は閉 ざすことかある。また図１には示されていないか、種々の成分を装着するため、 そして化学発光測定中に外部の光からＰＭＴ１４をしやへいするために意図され た遮光ハウジングか装置ＩＯに含まれる。

セル１２自身は第一のマウンティング　ブロック２０を含み、これを送入管２２ と排出管２４（プレキシグラスから構成するのが有利）とが貫通している。マウ ンティング　ブロック２０はセル１２の試料保持容積３０の一側面を決める第一 の外面２６と第二の内面２８を存し、セル１２はこの容積３０に清掃および（ま たは）整調および（または）測定用の溶液を、装置■０のそれぞれ対応する操作 の間に保持している。送入管およびｔＪＦ出管２２．２４は、外面２６から内面 ２８へとマウンティング　ブロック２０を通り抜け、試料保持容積３０の中に開 口する。第二のマウンティング　ブロック３２は化学発光部分により放出された 化学発光性の光の波長において実質的に透明である材料から構成するのが有利で ある。それ故、マウンティング　ブロック３２はガラス、プラスチック、石英な どから形づくるのか有利であり、第一の外面３４と第二の内面３６を存する。第 二のマウンティング　ブロック３２は第一のマウンティング　ブロックから、な るべくはテフロンまたは他の非汚染性材料から、つくられた環状スペーサー３８ により隔てられている。このように、マウンティング　ブロック３ｏの外面３４ は試料保持容積３０の第二の側面を決めることになる。スペーサー３８は外側の 部分４０と中央の開き４２をもち、その内部のヘリ４４は試料保持容積３ｏの側 壁を決める。外側の部分４０は、第一のマウンティング　ブロック２ｏの内面２ ８を第二のマウンティング　ブロック３２の外面３４に対して密閉しており、二 つの面２８，３４の間の試料保持容積３ｏがらいがなる溶液も出て行がないよう に防いている。

送入管２２は、スペーサー３８に隣接するその最初の端５ｏのところで、試料保 持容１１３０と交差し、ｊＪｌ出管２４は、スペーサー３８に隣接するその二番 目の端５２のところで、試料保持容積３ｏと交差する。送入管２２、試料保持容 積３０、および排出管２４は一緒になってセル１２への、セル１２中の、そして セル１２からの溶液の流れかせまい実質的に層流となるための途切れない流路を 与えている。

ポンプ１６は、溶液を矢印Ａの方向で試料だめから送入管２２の中へ「引き入れ る」よう排出管２４のところに配置するのが有利である。溶液は送入管２２、試 料保持容積３ｏ、そして排出管２４を通って流れ、矢印Ｂの方向で出て行く。

他方、ポンプ１６を送入管２２に配置して溶液を装置１ｏを通って「押し出す」 こともてきる。送入管２２、試料保持容積３ｏ、およびＪＪｔ出管２４を通るこ の同じ流路を、セル１２を通過するあらゆる溶液および流体に対して使用するこ とにより、各流体かその前の流体をセル１２がら押し出すように流体力学的清掃 作用を果すとを利である。ポンプ１６はセル１２に特定の溶液をある時間保持す るためその動作を停止するよう制御できる。

本発明検定法を実施するためのもう一つの装置を図８と図９で説明する。図８は 有利な化学発光装置を開示しているか、本発明方法は、装置ｌＯでの適用に限ら ず、むしろ前駆物質を誘発物質へと変換する電気化学的エネルギーを得るための 作用電極あるいは他の誘発作用をする面と、標識された成分を収集するための手 段を含む、他の型の化学発光装置で用いることもてきる。本発明方法は静的様式 でもフロースル一様式でも実施できるか、装置１０はフロースルーセルを含み、 そしてこのものは結合検定試料を含めて多くの型の試料に対し明確な利点を与え る。本発明に係る化学発光検定法を実施するための装置のこれ以上の詳細は、一 般に１渡された公開ＰＣＴ特許出願ＵＳ　８９１０４８５４号および米国特許出 願第９０１０１３７０号明細書に開示されている。

装置１０は電気化学的セル１２、光検出／測定装置１４（これは光電子増倍管（ ＰＭＴ）であるのか有利である）、光ダイオード、電荷転送素子、写真フィルム あるいは乳剤なとおよびポンプ１６を含む。ポンプ１６は流体をセル１２へ、セ ル１２中を、そしてセル１２から輸送するために螺動ポンプであるのが有利であ る。別法として容量形ポンプも使用できる。シャッター機構１８かセル１２とＰ ＭＴｌ　４との間に設けられ、化学全光測定期の間ＰＭＴ１４をセルＩ２に露出 する場合にのみ、開くよう調節下に操作される。このシャッター機構は、例えば 保守作業中は閉ざすことかある。図１には示していないか、装置ｌＯにはまたそ れに種々な成分を装着し、また化学発光の測定中にＰＭＴＩ　４を外部の光から しゃへいするために意図された遮光ハウジングも含まれている。

セル１２それ自身は第一のマウンティング　ブロック２ｏを含み、これを送入管 ２２と排出管２４とか通り抜けている。これらの管はプレキシグラスから構成す るのか有利である。マウンティング　ブロック２ｏはセル１２の試料保持容積３ ０の一方の側面を決める第一の外面２６と第二の内面２８を有し、そしてセル１ ２はこの容積３０に清掃および（または）整調および（または）測定用の溶液を 、装置ｌＯのそれぞれの対応する操作中保持する。送中管および排出管２２゜２ ４は外面２６から内面２８へとマウンティング　ブロック２ｏを貫通していて、 試料保持容積３０の中に開口する。第二のマウンティング　ブロック３２は、化 学発光部分により放出された化学発光性の光の波長において実質的に透明な材料 から構成するのか有利である。それ故に、マウンティング　ブロック３２はガラ ス、プラスチック、石英なとから形づくるのか有利であり、そして第一の外面３ ４と第二の内面３６を存する。第二のマウンティング　ブロック３２は第一のマ ウンティング　ブロック２０から、なるべくはテフロンまたは他の非汚染性材料 からつくられた環状スペーサー３８により隔てられている。このように、マウン ティング　ブロック３０の外面３４は試料保持容積３０の第二の側面を決めるこ とになる。スペーサー３８は外側の部分４０と中央の開き４２を有し、その内部 のへり４４は試料保持容積３０の側壁を決める。外側の部分４ｏは、第一のマウ ンティング　ブロック２０の内面２８を第二のマウンティング　ブロック３２の 外面３４に対して密閉しており、これら二つの面２８．３４の間の試料保持容積 ３０から如何なる溶液も通り抜けられないよう防いている。

送入管２２は、スペーサー３８に隣接するその最初の端５ｏのところで試料保持 容積３０と交差し、排出管２４はスペーサー３８にｗ４接するその二番目の端５ ２のところて試料保持容積３０と交差する。送入管２２、試料保持容積３ｏ、お よび排出管２４は一緒になってセル１２への、セル１２中の、そしてセル１２が らの溶液の流れか、せまい実質的に層流となるための連続した流路を与えている 。

第一のマウンティング　ブロック２０の内面２８に作用電極系５４が装着され、 ここに例示された具体例においては、作用電極５８を含む。池の具体例において は、２個以上の作用ＫｆｉＥか有利に設けられている。作用電極５８は対象とす る電気化学的反応と化学発光反応が起こりうる場所である。作用電極５８は中空 でないポルタンメトリー電極であり、それ故に白金、金、炭素またはこの目的に 対して効果的な他の材料から有利に構成することができる。作用電極５８につな げられた針金のコネクター６２は第一のマウンティング　ブロック２ｏを通って 出て行く。

コネクター６２は図２に示された電圧制ｉａ’ｔ＋器６６の第一の「作用電極Ｊ 端子６４に接続されている。電圧制御器６６はポテンシオスタットのように都合 よく働いて作用電極５８へ電圧１３号を供給し、また任意に化学発光の測定中は そこがらの電流を測るよう働く。

電圧制御器６６のポテンシオスタット動作は、対ＱＴ極５６および、これは任意 ではあるか有利な、参照電極７ｏを通して更にイテなゎれる。対電極５６および 作用電極５８は試料保持容積３０内の溶液に対して電位を印加する界面を与え、 そしてこの容積３０は化学反応にエネルギーを与え、かつ試料中の前駆物質から 誘発物質への電気化学的変換をひき起こし、そして（または）セル１２の表面を 清掃し整調するためのエネルギーを提供する。対電極５６は電圧制御器６６の第 二のＦ対電極」端子７８に針金コネクター６０によりつなげられる。

参照ｔｆ４７０は作用電極５８によってかけられる電圧を指示する標準電圧を与 える（例えば、基準に対して＋１．２ポルト）。参照電極７０はセル１２から間 隔をとった位置８０のところて排出管２４に置くのか有利であり、そして針金コ ネクター８２を経て電圧制御器６６の第三の「参照電極」端子８４に接続される 。

この三つの電極方式においては、参照ＴＬｉ７０を通って電流が流れない。参照 電極７０は三電極動作方式で使用することにより均衡のとれた既知の安定した電 圧が得られ、それ故に銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣＩ）から有利に構成されるが、 あるいは飽和カロメル電極（ＳＣＥ）である。電圧制御器６６は、対／参照電極 として作用電極５８および電極５６たけを使用する二電極動作方式で操作できる 。この二に極動作方式においては、対／参照ＴＬ極５６は電圧制御器６６の電圧 制御端子７８と８４に電気的に接続される。この場合、電圧υ制御器６６は本質 的に電池として働く。電圧制御器６６は電圧信号を作用電極および対電極５８と ５６に供給し、そしてそれぞれの電極を通って流れる電流を任意に測定する。参 照電極７ｏは白金、金、ステンレス鋼または池の材料からつ（られた別称いわゆ る「準参照」電極でもあり、そしてこの電極は比較的不安定な電圧を供給するか 、それてもなお接触している溶液に関しては測定可能なものである。二電極方式 と三電極方式の両方とも参照電極７０または５６は、作用ｔｔ’１Ｊｉ５８にか けられたどちらの電圧を測るのかに対して標準を与えるという目的を果す。均衡 をとった電圧標準は現在一層有利と考えられている。電圧制御器６６はそのポテ ンシオスタット動作中、参照電極７０に関して作用電極５８に既知電圧を供給す ると同時に作用電極５Ｂと対電極５６との間の電流を測ることによって種々な電 極を制御する。この目的に対するポテンシオスタットは公知てあり、それ故に電 圧制御器６６の内部構造は、上記の機能をもたらす従来からの市販ボテンンヨス タットのいずれかに相当するので、それ自身本発明の一部をなさない。事実、装 置１０は、別法として、内部電圧制御器６６を含まずに組立てることができ、そ して電極５６．５８．７２．７４および７０へ必要な電圧信号を供給するために 別個に制御される外部ポテンショスタットへ接続するように適合させることかで きる。下記の特別な仕方で適用されるこれら電圧信号は、作用電極５８の表面に 対して、また有利には全体としてセル１２の表面に対して反復しうる初期条件を 提供する。これは化学発光測定における精度の向上に有意に貢献する特徴である 。

ポンプ１６は溶液を試料ためから矢印Ａの方向て送入管２２中に「引き入れる」 ように排出管２４に配置するのか有利である。溶液は送入管２２、試料保持容積 ３０および排出管２４を通って流れ、参照電極７０を通過し、そして矢印Ｂの方 向に出て行く。別法として、ポンプ１６は装置１０を通って溶液を「押し出すＪ ように送入管２２に配置することもできる。送入管２２、試料保持容積３０およ びｔＪ［出前２４を通るこの同じ流路を、セル１２を通過するあらゆる溶液およ び流体に対して使用することにより、各流体かその前の流体をセル１２から押し 出すように流体力学的清掃作用を果たすと有利である。ポンプＩ６はある特定の 溶液をセル１２内にある時１１ＪＩ保つためその動作を中止するよう制御できる 。

装置ｌＯのこのフロースルー構成は作用電極に可変電圧か印加されるように、あ るいは動作前の電位に連続的に保持されるようにてきる一方、作用電極５８（あ るいは対電極および参照電極５６．７０）を空気にさらすことなく１種以上の溶 液に連続的に暴露することかできる。空気に対する露出は、回路を参照電極７０ に開放することであり、不明の乱雑な電圧変動を許し、これか作用電極５８に対 する表面状態の再現性を破壊する。このフロースルー構成は、電極系５４を清掃 し、調子を整える開始段階と一つ以上の測定波形あるいは掃引か化学発光を誘発 する測定段階との間の迅速な交替を可能にする。

検定媒質 標識か酸化されそして発光するように、前駆物質分子を酸化剤へ変換するために 、電極か電気化学的エネルギーを導入するという方式を働かせるには、電極を浸 しかつ前駆物質分子を含む電解液を供給する必要かある。この電解液は電荷がイ オンにより運ばれる相である。一般に、電解液は液相の状態にあり、水、有機液 体または有機液体混合物、あるいは水と１種板」二の有機液体との混合物の中に １種以上の塩あるいは他の化学種を含む溶液である。しかし、本発明の幾つかの 具体例においては、池の形式の電解相も有用である。例えば、電解相は流体、例 えば液体、蒸気、超臨界液体、中の１種以上の物質の分散系のこともあり、ある いは固体、蒸気または超臨界流体中に１種以上の物質を含む溶液のこともある。

電解液は塩の水溶液か適当である。なるべくこの塩はナトリウム塩かカリウム塩 かよいか、ある具体例においては、陽イオンか化学発光性相互作用の進行を妨害 しない限り、他の陽イオンの添加も適している。塩の陰イオンは例えばリン酸塩 でよいか、本発明の幾つかの具体例においては池の陰イオンの使用も許される。

繰り返し述へるが、これは選ばれた陰イオンが化学発光性相互作用の進行を妨害 しない限りにおいてである。

組成物は井水性のこともある。ある場合には超臨界流体を有利に使用できるか、 非水性組成物中に有機液体を含む電解液を利用するのかより一般的である。水性 電解液と同様、非水性電解液も電荷かイオンにより運ばれる相である。通常、こ れは塩を有機液体媒質に溶かすことを意味する。適当な有機液体の例は、アセト ニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　、ジメチルホルムアミド（ＤＭ Ｆ）、メタノール、エタノール、および上記化合物の１種以上の混合物である。

有機液体中に可溶なテトラアルキルアンモニウム塩、例えばテトラブチルアンモ ニウム　テトラフルオロボレートを上記有機液体と併用して非水性電解液をつく るのか代表的な例である。

電解液は本発明のある具体例においては緩衝系である。リン酸塩緩衝剤かしばし ば有利である。例はリン酸す）−リウム／塩化ナトリウム水溶液、およびリン酸 ナトリウム／フッ化ナトリウム水溶液である。

本発明の他の諸点 本発明はまた試薬ｎ■成物にも向けられている。広く言って、試薬組成物は本発 明検定法の成分、即ち（イ）電解液、（ロ）化学発光性部分を含む標識化合物、 （ハ）磁気応答性粒子を含めて粒子、（ニ）対象とする被験物質あるいは対象と する被験物質の類縁体、（ホ）対象とする被験物質またはその類縁体の結合相手 、（へ）（ニ）または（ホ）と反応することのできる反応性成分、（ト）誘発物 質の前駆体分子、または（チ）化学発光反応促進物質のいずれかである。これら 試薬は使用の便利さから相互に合わせることかできる。即ち、２成分、３成分、 およびもっと多成分の混合物を調製できるか、たたし意図した検定法におけるそ れらの機能をそこなう程に貯蔵中圧に反応しない限りにおいてである。望ましく は、これら試薬は粒子ならびに１種以上の他の成分を含む２成分あるいは多成分 混合物とする。

本発明はまたキットにも向けられている。このキットは前述した成分（イ）から （チ）の１種以上を含む容器を包含するか、あるいはこのキットは本発明に係る 検定法ならびに装置にすべて使Ｉ［するための成分の混合物からなる前記の１種 以上試薬組成物を含存する容器を含みうる。

本発明の特に適当な具体例の説明 本発明に係る粒子を基本とした検定法には広範囲の粒子を使用できるか、一般に これら粒子は１．　Ｏから５．０ｇ／ｍｌの密度をもち、そしてなるへくは１． 　１から２ｇ／ｍｌの密度をもつことか好ましい。最適密度の選択は技術の熟練 にかかっているか、重力で働く検定法においては沈降速度か検定の速さと収集域 における複合体の均一層をつくり出す願望とのｌｉｌの交換条件となる。

広範囲の平均直径を有する粒子も使用できる。０．００１から１００μｍの平均 直径を有する粒子を使用でき、そしてなるへく粒子は０，０１から１０μｍの平 均直径をもつことか好ましい。

検定組成物中広Ｗｌ囲の粒子濃度も使用できる。例えば、この潤度は１〜１０゜ ０００μｇ／ｍｌから、なるへくは５〜１０００μｇ／ｍｌまてにわたりうる。

粒子の密度、それらの粒径および濃度は、粒子か少なくとも０．５１Ｔｌ′ｌＩ ／分の速度で、なるへくはもっと早い速度で沈降するように選ぶことか望ましい 。

本発明方法を実行する濾過方式において、この濾過装置は、平均直径として測定 したとき、粒子の平均直径の概して０．０１〜９０９６から、なるへくはこの直 径の１０９６〜９０９６の細孔寸法を有することか望ましい。

この技術分野は本発明検定法に使用できる幾つかの磁性粒子を記述している。

例えば、米国特許第４，６２８，０３７号、第４，６９５，３９２号、第４．６ ９５．３９３号、第４，６９８．３０２号、箔４，５５４，０８８号明細書、英 国特許出願ＣＢ？Ｂ２，００５，０＋９Ａ号明細書および欧州特許第０．１８０ ゜３８４号明細書は順調に使用できる種々の磁性粒子を記載している。これら粒 子は常磁性のこともあるいは強磁性のこともあり、そしてこれら磁性粒子を免疫 検定に使用できるように、結合性化合物をカップリングする種々の材料で被覆す ることもある。本発明方法に使用する磁性粒子は少なくとも０．００１ｃｇｓｍ 位の磁化率を有することか望ましく、そして磁化率か少なくとも０．０１ＣｇＳ 単位であるのか望ましい。磁性粒子は広範囲の密度、即ち水の密度よりかなり低 い密度、００１から５ｇ／ｎ＋Ｉまで、そしてなるへくは０．５から２ｇ／ｍｌ 、ををしうる。

粒径は０．００１から１００μｍに及び、なるへくは０．Ｏｌから１０μｍがよ い。粒子濃度は概して１から１０，０００μｇ／ｍｌにわたりうるか、なるべく は５からｌ　ＯＯＯｕｇ／＋ｒ＋１かよい。

使用される磁性粒子は、電極面から磁場を除いた後に粒子か消磁し、検定セルか ら一掃できるように、例えは欧州特許第０．１８０，３８４号明細書に記載の通 り、低い残留磁気を有することか望ましい。磁性粒子の密度、濃度および粒径は 、沈降時間か少なくとも０．５ｍｍ／分、望ましくはこの速度以上となるように 選ぶことか望ましい。

塊！半 本発明方法を使用することにより種々の検定を実行できる。

図２に示したように検定を実行した。反応から生じた生成物をビオチンおよび化 学発光性標識て標識した。ストレプトアビジンビーズはビオチンストレプトアヒ ノン結合を経て二官能基化されたＮＤＡをとらえ、これに続いて洗浄をした。

次にビーズに結合された生成物を、化学発光性標識を検出する分析に付した。

図３に示したように検定を実行した。ビオチニル化されたＰＣＲ生成物をストレ プトアビジンビーズ上にとらえ、未ビオチニル化鎖を除去した。次に、ビーズに 固定されたＰＣＲ生成物を化学発光性標識化オリゴヌクレオチドでハイブリット 形成させた。これに続いて化学発光分析を行ない標識を検出した。

図４に示したように検定を行なった。ハイブリットはストレプ）−アビジンビー ズ上にとらえた。これに続いて、洗浄することなく化学発光分析に付した。

例１〜例Ｊ】 （１）装置組み立て 図１で説明したフロースルー装置を用いた。

テフロン　ガスケット（厚さ０．１５’）プレキシグラス　フェースプレート 送入管；内径０．０４２“ポリプロピレン吸引速度＝０．０＋から５　ｍｌ／分 の可変ハママツＲ３７４ＰＭＴ（低ゲイン、赤感受性増倍管）を使用したルミノ メータ−；ＰＭＴ電圧、Ｏ−＋４００Ｖ可変沈降セルを使用する磁気収集 磁力を用いて微粒子を沈降させる検定法を行なうためのセルを図５に示す。参照 番号２１は透明な窓を示し、参照番号２２はガスケットを、参照番号２３はセル ブロックの入口を、参照番号２５は試料出口を、参照番号２６はセルブロック自 身を、そして参照番号２７は電磁石を示す。セルブロックの面は水平に向いてい る。緩衝液中に入れた標識化微粒子（Ｄｙｎａｌ）を螺動ポンプによりセルへ引 いた。

微粒子かセルに達した後ポンプを止めた。セルチャンバー中の微粒子を、１２ポ ルト１．　５アンペアで働かせた電磁石２７を用いて発生させた磁場を用いて収 集域へ吸引した。電磁石の適用により、微粒子の沈着速度は、微粒子かもっばら 重力によって沈降するときに観察された速度よりも著しく増加した。

収集セルを使用する磁気収集 図１で説明したセルで検定を実施する。図１に関して、参照番号３２は透明な窓 を示し、参照番号３８はガスケットを示し、参照番号２２はセルブロック人口を 示し、参照番号２０はセルブロック自身を示し、参照番号２４は試料出口を示し 、そして参照番号３７は永久磁石を示す。

セルブロックの面は水平方向をとる。緩衝液中に入れた標識化微粒子（Ｄｙｎａ ｌ）を、螺動ポンプＩｆによりセルへ吸引する。試料導入に先立ち、永久磁石３ ７を収集域のすぐ下の０．０３５インチの距離に配置した。試料をセルに吸引し つつあるとき、微粒子は磁石の領域によって限定される収集域に集まる。ポンプ を止める。収集時間か長い程、より多くの粒子か集められる。

磁場の配向 永久磁石であろうと、電磁石であろうと磁石に吸引される微粒子は磁場の方向に 整列する。図６は磁場および生した粒子の配列を描いたもので、セルブロック８ および４の頂部表面に対し核部と接近してそれぞれ平行（Ａ）および垂直（Ｂ） の配列を示す。当業者は収集域における粒子の配向かその後の誘発物質との接触 の効率に影響を及はすことを認識するであろう。

広範囲の密度を有する磁気応答性、非磁気応答性の微粒子は膜フィルターの表面 に濾葉するのか有利である。本発明の一具体例においては、粒子を濾過膜の部分 に通してポンプ送りする。前記膜は粒子直径より小さいか、なるべくは粒子直径 より実質的に小さい細孔寸法をもち、そして粒子の収集によって細孔の目詰りを 起こさないよう十分に高い表面密度てポンプ送りする。次に集められた粒子は、 粒子からの化学発光を誘発しそしてこの発光を測定して粒子上の化学発光装置の 量を測るという目的のため、濾過器を通して誘発物質溶液をポンプ送りすること により誘発物質に暴露される。

もう一つの具体例においては、前記の細孔寸法をもつ膜フィルターを吸収材料の 表面に付けるか置いて、毛細管作用あるいは「吸上作用」か微粒子を含む流体を 膜フィルターを通して自然に吸引するようにする。このようにすると濾過器を通 して流体の流れを起こさせる装置を必要としない。

特に適当な一具体例においては、前述した細孔寸法を有する膜フィルターを金属 あるいは他の電気伝導性材料の薄膜で被覆し、膜面か化学発光装置における作用 電極として働きつるようにする。この伝導性フィルムは、超小型電子装置の加工 に常用される方法、例えは熱蒸発あるいはスパッタリング、により膜の表面に容 易に適用される。

このようなフィルターは、流体のための流路がフィルターを通るようにフローセ ルに容易に装着される。流れの中の粒子はフィルターによって捕捉され、その場 で容易に洗浄されるので、外部の洗浄装置を必要とすることなく不均質検定法を 実行するための迅速かつ簡単な手段か提供される。

図７に示された回転フローセルは、発光をθり定するために複合体を収集するも う一つの手段を提供する。セルに回転運動を与えながら、回転ンール６３を通し て検定溶液６１をセル６２にポンプ送りする。複合体のより重い粒子は収集域に 濃縮される。セルかなお回転しつつあるうちに溶液はセルから出て行く。セル窓 ６７を通過する光の出力を光電子増（き管６５により測定する。この光の出力は 収集域から注かれ、セル中心に位置した曲面鏡６６で反射し去る。次にセルを洗 浄し、きれいにして次の測定サイクルに備える。これはセルを停止させてもある いは回転させなからでも成し遂げられる。

３０ｍｇ（１ｍｉ）の４．５８ｍ未被覆磁気応答性ポリスチレンＭ−４５０ＤＹ ＮＡＢＥＡＤＳ　（ＤＹＮＡＬ、オス口、ノルウェー）を、１５０ｒｒＮのリン 酸塩緩衝溶液（ｐＨ７，５）を用いて磁気分離により洗浄する（２ｍｌ／洗浄を 使用）。この粒子へ０．０５９６のチメラゾールを含む１ｍｌのリン酸塩緩衝食 塩水（ＰＢＳ）中アクリジニウムエステルー標識抗体化０而ｏｎ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｉｃｓ　ＬｕｍａＴａｇ　ＴＳＨ標識抗体）１５０μｇを加える。この混合 物を室温でかきまぜながら一晩インキュベーションする。溶液を次に粒子から磁 気的に分離し、流体を除く。未反応部位を封鎖するため、粒子へアジ化ナトリウ ム０．０５％を含む３％ＢＳＡ／ＰＢＳＩｍ１を加え、得られた溶液を室温で２ 時間インキユヘーションする。粒子を５回洗浄しく２ｍｌ／洗浄）、次に保存の ため同じ緩衝液６ｍｌに最終的に再浮遊させる。

例６記載のようにして、磁気応答性粒子（Ｄｙｎａｌ　、オス口、ノルウェー） を標識化タンパク質て被覆する。被覆粒子をリン酸塩緩衝液で３回洗浄した後、 ０゜ＩＮ　ＨＮＯｚおよび０．５％過過酸氷水素中３０μ／ｍｌの懸濁液２ｍｌ とする。螺動ポンプを用いて、この粒子懸濁液５００μｍをフローセル中に吸引 する（例２）。

粒子かセル中を流れるとき、これらは磁石により吸引され、収集域中に濃縮され る。粒子を磁気的に集めた後、０．　２５Ｎ　ＮａＯＨ１０，５％過酸化水素の 溶液をセル中に吸引する一方、粒子が収集域に濃縮されたフロセル上に中心をも つノ１ママツＲ３７４光電子増信管を使用して化学発光を測定する。

例８ 物理的に吸着された羊抗甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）被覆Ｄｙｎａ１粒子の調 製表面に−ＯＨ残基を有する４、５μｍ未被覆磁性ポリスチレン粒子（ＤＹＮＡ Ｌ、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ　Ｍ−４５０，ＤＹＮＡＬ　Ａ、Ｓ、オスロム　ノルウ ニ　）１ｍｌを、１５０ｄｌ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９， ６）を用いて磁気分離により洗浄する（２ｍｌ／洗浄を使用）。炭酸塩／重炭酸 溶液１ｍｌ中０．　５ｍｇの精製モノクローン抗ＴＳＨ抗体（カタログ間、５０ ６４０３１゜Ｖｅｎｔｒｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、ボートラ ンド、メイン州）を粒子へ加える。この混合物をかきませながら室温で一晩イン キユヘーションする。次に溶液を粒子から磁気的に分離し、除去する。アシ化す ｌ・リウム０．０５％を含む３％ＢＳＡ／ＰＢＳ　１ｍｌを加え、室温でかきま せながら２時間インキユヘーションして未反応部位を封鎖する。粒子を５回（２ ｍｌ／回）洗浄し、次に最終的に貯蔵のため同し緩衝液１ｍｌ中に靜濁させる。

最終濃度は３重量％である。

例９ 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する一段階分離すントイッチ検定法血ｌＩ？ キャリブレータ−化ｏｎｄｏｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｊｉｃｓ　ＴＳＨＬｕｍ１　Ｔ ＡＧ　Ｋｉｔ）　１００　μｌ、リン酸塩緩衝液中Ｌｕｍａ　Ｔａｇ　ＴＳ）ｌ アクリジニウムエステル−標準抗体化ｏｎｄｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　２ ５　μ！！およびリン酸塩緩衝液中杭−ＴＳＨ−ＤＹＮＡＬ粒子（例８）２５μ ｌを合わせ、ポリプロピレン管中で混合しつつ室温で１５分間インキユヘーソヨ ンする。次に粒子を磁気分離により洗浄し、次にｐ）１４．ｔｏ閘炭酸塩／重炭 酸塩緩衝液５００μβ中に再静濁させる。この洗浄手順を更に２回繰り返した。

粒子をフローセル中に吸引しく例２）、磁気的に収集し、化学発光反応を誘発す る溶液（０，５％過酸化水素、０．　２５Ｎ　ＮａＯＨ）をフローセルを通して 流す。各試料に対する化学発光を例２記載のように測定する。化学発光の強さは 試料中に存在する被検物質の濃度に直接比例する（被検物質の濃度が増加するに つれて強度を増す）。

例１Ｏ 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する一段階非分離すンドイッチ検定法血清ギ ヤリプレーター化ｏｎｄｏｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＴＳＩ（Ｌｕｍ１　Ｔ ＡＧ　Ｋｉｔ）　ｌ　ＯＯμｌ、リン酸塩緩衝液中Ｌｕｍａ　ＴａｇＴＳＨアク リジニウムエステル−標識抗体化ｏｎｄｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　２５　 μｌおよびリン酸塩緩衝液中杭−ＴＳＨ−ＤＹＮＡＬ粒子（例つ２５μｌを合わ せ、ポリプロピレン管の中で混合しつつ室温で１５分間インキュベーションする 。結果を読む前に、ｐＨ４，１００ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液１ｍｌを加える 。粒子をフローセル中に吸引しく例２）、磁気的に収集し、化学発光反応を誘発 する溶液（０，５％過酸化水素、０゜２５　Ｎ　Ｎａ０ｔ（）をフローセル中に 通す。例２に記載のように各試料に対する化学発光を読む。化学発光の強さは試 料中に存在する被検物質の濃度に直接比例する（被検物質濃度か増加するにつれ て強度を増す）。

例１ｊ 誘発物質を発生する酵素を使用する化学発光ＴＳＨ免疫検定固体相として磁気応 答性微粒子を、また標識としてアクリジニウムエステルを使用することにより、 例２に記載の装置を用いてＴＳＨ免疫検定を実行することかできる。酵素、グル コースオキシダーゼを用いて誘発物質の前駆物質（グルコース）を誘発物質（過 酸化水素）に変換する。酵素グルコースオキソダーゼはグルコースからグルコン 酸と過酸化水素への酸化を触媒する。アクリジニウムエステルは過酸化水素の存 在下で励起状態に酸化される。酸化された励起生成物がその後基底状態に戻ると 、その結果光か放出され、これか定量される。特異的抗体と酵素グルコースオキ シダーゼの両方で被覆された磁性微粒子を使用することかできる。この粒子は例 ８と同様に、ただし抗体と酵素（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の両方を０． 　５ｍｇずつ被覆のだめの粒子へ加える。別法として、各試薬（抗体あるいは酵 素）で被覆された別々の粒子を混合して検定に使用することもできる（例８記載 のようにして別々に調製する）。

グルコースオキシダーゼ Ｄ−グルコース　Ｄ−グルコン酸刊１２０２アクリジニウムエステル＋Ｈ２０， 光（４２８ｎｍ）ＴＳＨ免疫検定はこの分野で公知の二部位サンドイッチ検定法 に基づいている。

例８記載のようにして、モノクローン抗−ＴＳＨ抗体を被覆した微粒子を調製す る。酵素グルコースオキシダーゼを被覆した磁性微粒子は、抗体被覆磁性微粒子 と同し方法により調製する。アクリジニウムエステルで標識されたポリクローン 抗ＴＳＨ抗体およびＴＳＨ標準はＬｏｎｄｏ口Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから得ら れる。酵素基質溶液はＤ−グルコース（Ｉ　ＯＯｍｇ／ｍｌ）を含む１００蘭リ ン酸カリウム緩衝液からなる。試験系列（１２Ｘ７５ｍｍポリプロピレン）を据 え付け、標準および検定すべき試料に従って標識する。各試験管へ標準あるいは 試料あるいは対照１００μＥ、アクリジニウムエステル−標識抗体１００μ！お よび抗ＴＳＨ抗体と酵素被覆微粒子との混合物１００μｌを加える。管を混合し つつ室温で１５分インキユヘーションする。インキュヘーンヨン後、ｐＨ４，１ ００ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液１ｍｌを加える。粒子をフローセル（例２）中 に吸引し、磁気的に収集し、グルコース基質溶液をフローセル中に通す。例２に 記載のように各試料に対する化学発光を読む。化学発光の強度は試料中に存在す る被検物質の濃度に直接比例する（被検物質の濃度か増加するにつれて強度を増 す）。

図８および図９て説明した３個の電極を用いるフロースルー装置を使用する。

作用電極・・・Ａｕ円板、直径３ｍ 対電極・・Ａｕ円板、直径３ｍ 参照電極・・・Ａｇ／ＡｇＣｌ テフロンガスケツｌ−（厚さ０１５“）プレキシグラス　フェースプレート 送入管＝内径０．０４２“ポリプロピレン吸引速度＝００１から５ｍ１／分、可 変ポテンシオスタット−制御されたマイクロプロセッサ−ルミノメータ−、ハマ マッＲ３７４ＰＭＴ（低ゲイン、赤感受性管）。

ＰＭＴ電圧０−１４００Ｖ可変 この測定法は図１Ｏに示したセルで行なう。図１Ｏを参照すると、本図は重力を 用いて検定を行なう装置を描いたものである。装置の成分は参照番号１１により 示される透明な窓、参照番号Ｉ２により示されるガスケット、入口１３、作用電 極１４、対電極１５および出口１６を含むブロックを包含する。セルブロックの 面は水平である。即ち、地球の重力の場の方向に対して垂直である。緩衝液中の 標識化された微粒子（Ｄｙｎａｌ）を螺動ポンプを用いてセルへ引き入れる。粒 子がセルに達した後にポンプを止める。セルチャンバー内の微粒子は作用電極面 上に降下する。微粒子の降下速度は１０ｍｍの距離にわたり０．　５ｍｍ／分て ほぼ一定であることか測定された。沈降する粒子の数は時間と降下速度の関数で ある。化学発光の強度は作用電極上に沈降する粒子の数に比例する。面に達する 粒子の数、従って化学発光の強度、は作用電極上の流体試料の高さにより制限さ れる。

収集セルを使用する磁気収集 図８で説明したセルで検定を行なう。図８を参照すると、参照番号３２は透明な 窓を示し、参照番号３８はガスケットを、参照番号２２はセルブロックへの入口 を、参照番号５８は作用電極を、参照番号３５はセルブロック自身を、参照番号 ２４は試料出口を、そして参、照番号３７は永久磁石を指す。

セルブロックの面は水平方向をとる。化学発光緩衝液中の標識された微粒子（Ｄ ｙｎａｌ）は螺動ポンプにより電気化学的セルへ引かれる。試料の導入に先立ち 、永久磁石３４を作用電極／溶液界面の直下に０．０３５インチの距離で配置す る。

試料かセルへ引かれるにつれて、微粒子は磁石の領域によって決まる収集域に集 まる、例えば作用電極上の領域に沈着する。全試料か沈着した後に、ポンプを止 め、磁石を取り去る。収集時間か長い程より多くの粒子か沈着する。作用電極上 の粒子濃度を増加させると化学発光強度か増す。

したタンパク質て被覆する。被覆粒子をリン酸塩緩衝液で３回洗浄後、ｐＨ４の １００蘭炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中３０μｇ／ｍＩの懸濁液２ｍｌをつくる。螺 動ポンプを使用してこの粒子懸濁液５００μｌをフローセル中に引き入れる。粒 子か作用電極へ流れるにつれてそれらは磁石により作用電極上に吸引され、濃縮 される。

粒子か磁気で集められた後、０．　２５Ｎ　ＮａＯＨの溶液をセルに通す。次の 三つの方法のうちのいずれかによって前駆物質分子から誘発物質分子への変換に より化学発光が発生する （１）　作用電極て水（前駆物質）か酸化されて過酸化水素および他の酸化性化 学種（誘発物質）を生成するように、電位波形を電気化学的電極にかける。過酸 化水素または池の酸化性化学種かアクリジニウムエステル標識の化学発光反応を ひき起こす。

（２）　溶液中に溶けた酸素（Ｉｊ７駆物質）か還元されて次式：％式％ に従って過酸化水素（誘発物質）を生成するように電位波形を電気化学的電極に かける。この電気化学的反応は、飽和カロメル電極に関しておよそ一〇、４Ｖを 作用ＫｆＥにかけたとき起こる。過酸化水素はアクリジニウムエステル標識の化 学発光反応をひき起こす。

（３）　水の酸化的電気分解により酸素か作用電極に生成するように電位波形を 電気化学的電極にかける。次に水の電気分解により生じた酸素（前駆物質）か還 元されて過酸化水素（誘発物質）を生ずるように電気化学的電極へ波形をかける 。過酸化水素はアクリジニウムエステル標識の化学発光反応をひき起こす。

粒子か作用電極上の収集域に濃縮したフローセル上に中心を置くハママソＲ３７ ４光電子増倍管を使用して化学発光を測定する。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、５ ０Ｇ、６Ａ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、　１０

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中に存在する対象被検物質の結合検定を実行する方法において、（イ） （ｉ）前記試料、 （ｉｉ）誘発時に化学発光することのできる標識化合物に結合した成分を含む検 定実行物質、および （ｉｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合すること のできる複数の粒子 を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキュベーションして粒子および前記標識成分を含む複合 体を形成せしめ、 （ハ）前記複合体を収集域に集め、 （ニ）標識が発光するように前記標識を誘発することのできる誘発物質を前記収 集域中に導入し、そして （ホ）放出された発光を測定して試料中の対象とする被検物質の存在を測定する 諸工程からなる上記方法。
2. ２．誘発物質は標識を酸化しうる酸化剤である、請求項１記載の方法。
3. ３．粒子は磁気応答性であり、複合体は収集域中に磁気的に集められる、請求項 １記載の方法。
4. ４．酸化剤は過酸化水素または超酸化物である、請求項２記載の方法。
5. ５．検定実行物質は標識を酸化することのできる酸化剤へ前駆物質を変換するた めの酵素を更に含み、誘発物質がその前駆物質である、請求項１記載の方法。
6. ６．酵素はグルコースオキシダーゼであり、前駆物質はグルコースであり、酸化 剤は過酸化水素である、請求項５記載の方法。
7. ７．粒子は標識を酸化しうる酸化剤へ前駆物質を変換するための酵素を更に含み 、そして誘発物質がその前駆物質である、請求項１記載の方法。
8. ８．酵素はグルコースオキシダーゼであり、前駆物質はグルコースであり、酸化 剤は過酸化水素である、請求項７記載の方法。
9. ９．粒子を収集できる十分な時間組成物をセル内に留めておくバッチ法として行 なわれる、請求項１記載の方法。
10. １０．粒子の少なくとも一部分を収集できるように十分低速度で組成物をセル中 に流す流動法として行なわれる、請求項１記載の方法。
11. １１．粒子は０．１から５ｇ／ｍｌの密度を有する、請求項７記載の検定法。
12. １２．粒子は０．５から２ｇ／ｍｌの密度を有する、請求項１１記載の検定法。
13. １３．平均直径として測定したとき、粒子の粒径は０．００１から１００μｍに 及ぶ、請求項７記載の検定法。
14. １４．粒子の粒径は０．０１から１０μｍに及ぶ、請求項１３記載の検定法。
15. １５．組成物中の粒子の濃度は１から１０，０００μｇ／ｍｌである、請求項７ 記載の検定法。
16. １６．粒子の濃度は５から１０００μｇ／ｍｌの範囲にある、請求項１５記載の 検定法。
17. １７．粒子は少なくとも０．００１ｃｇｓ単位の磁化率を有する、請求項７記載 の検定法。
18. １８．磁化率は少なくとも０．０１ｃｇｓ単位である、請求項１７記載の方法。
19. １９．組成物中の粒子の磁化率、密度、粒径および濃度は粒子の沈降速度が少な くとも０．５ｍｍ／分となるように選ぶ、請求項７記載の検定法。
20. ２０．化学発光の測定に基づき、試料中に存在する対象被検物質の結合検定を実 行するための装置において、 （イ）垂直な円柱形の域を有し、そして入口および出口を有し、セルおよび前記 円柱形の域の大体の体積より下に位置した磁場を発生させるための手段を更に含 む試料含有体積を限定するセル、および（ロ）収集域で発生した化学発光を測定 する手段からなる上記装置。
21. ２１．磁場を発生させるための手段は、北−南配向で非磁性材料により分離され た複数の磁石を含む、請求項２０記載の装置。
22. ２２．試料中の対象被検物質の結合検定を実行する方法において、（イ）（ｉ） 前記試料、 （ｉｉ）誘発時に化学発光しうる標識化合物に結合した成分を含む検定実行物質 、および （ｉｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合すること のできる複数の粒子 を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキュベーションして粒子および標識成分を含む複合体を つくり、 （ハ）前記複合体を電極表面に集め、 （ニ）標識を誘発物質と接触させることによりその発光を誘発し、前記誘発物質 は電気化学的エネルギーの導入時に前駆物質分子の変換によりその場で形成され るようにし、そして （ホ）放出された発光を測定して試料中の対象被検物質の存在を測定する諸工程 からなる上記方法。
23. ２３．誘発物質は標識を酸化しうる酸化剤である、請求項２２記載の方法。
24. ２４．粒子は磁気的に応答性がありそして複合体は電極表面に磁気的に集められ る、請求項２２記載の方法。
25. ２５．複合体を電極表面に集めるために使用される磁場は、放出された発光を測 定する前に実質的に消散させる、請求項２２記載の方法。
26. ２６．分子は水であり、酸化剤は過酸化水素または超酸化物である。請求項２２ 記載の方法。
27. ２７．分子は酸素であり、酸化剤は過酸化水素である、請求項２２記載の方法。
28. ２８．試料中に存在する対象被検物質の結合検定を実行する方法において、（イ ）（ｉ）前記試料、 （ｉｉ）酸化時に化学発光しうる標識化合物に結合した成分を含む検定実行物質 、 （ｉｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合すること のできる複数の被覆された磁性粒子、および（ｉｖ）標識を酸化しうる酸化剤へ 電気化学的に変換されうる分子を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキュベーションして粒子および前記標識化合物を含む複 合体をつくり、 （ハ）前記複合体を電極表面に磁気的に集め、（ニ）前記標識が酸化されて発光 するように、前記電極に電圧をかけることにより前記分子を前記酸化剤へ変換し 、そして（ホ）放出された発光を測定して試料中の対象被検物質の存在を測定す る諸工程からなる上記方法。
29. ２９．試料中に存在する対象被検物質の結合検定を実行する方法において、（イ ）（ｉ）前記試料、 （ｉｉ）酸化時に化学発光しうる標識化合物に結合した成分を含む検定実行物質 、および （ｉｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合すること のできる複数の被覆された磁性粒子を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物へ、前記標識を酸化することのできる酸化剤に電気化学的に変 換されうる分子を導入し、 （ハ）前記組成物をインキュベーションして粒子と前記標識化合物を含む複合体 をつくり、 （ニ）前記複合体を電極表面に磁気的に集め、（ホ）前記標識が酸化されて発光 するように、前記電極に電圧をかけることにより前記分子を前記酸化剤に変換し 、そして（へ）放出された発光を測定して試料中の対象被検物質の存在を測定す る諸工程からなる上記方法。
30. ３０．試料中に存在する対象被検物質の結合検定を実行する方法において、（イ ）（ｉ）前記試料、 （ｉｉ）酸化時に化学発光しうる標識化合物に結合した成分を含む検定実行物質 、および （ｉｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合しうる複 数の被覆された磁性粒子 を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキュベーションして粒子と前記標識化合物を含む複合体 をつくり、 （ハ）前記組成物へ、前記標識を酸化しうる酸化剤へ電気化学的に変換すること のできる分子を導入し、 （ニ）前記複合体を電極表面に磁気的に集め、（ホ）前記標識が酸化されて発光 するように、前記電極に電圧をかけることにより前記分子を前記酸化剤へ変換し 、そして、（へ）放出された発光を測定して試料中の対象とする被検物質の存在 を測定する 諸工程からなる上記方法。
31. ３１．試料中に存在する対象被検物質の結合検定を実行する方法において、（イ ）（ｉ）前記試料、 （ｉｉ）酸化時に化学発光しうる標識化合物に結合した成分を含む検定実行物質 、および （ｉｉｉ）被検物質および（または）前記検定実行物質と特異的に結合すること のできる複数の被覆された磁性粒子を含む組成物をつくり、 （ロ）前記組成物をインキュベーションして粒子と前記標識化合物を含む複合体 をつくり、 （ハ）前記複合体を電極表面に磁気的に集め、（ニ）前記組成物へ、前記標識を 酸化しうる酸化剤に電気化学的に変換することのできる分子を導入し、 （ホ）前記標識が酸化されて発光するように、前記電極に電圧をかけることによ り前記分子を前記酸化剤に変換し、そして（へ）放出された発光を測定して試料 中の対象とする被検物質の存在を測定する 諸工程からなる上記方法。
32. ３２．粒子を収集できる十分な時間組成物をセル内に留めておくバッチ法で行な われる、請求項２２記載の方法。
33. ３３．粒子の少なくとも一部分を収集できるように十分低速度で組成物をセル中 に流す流動法として行なわれる、請求項２２記載の方法。
34. ３４．粒子は０．１から５ｇ／ｍｌの密度を有する、請求項２２記載の検定法。
35. ３５．粒子は０．５から２ｇ／ｍｌの密度を有する、請求項３４記載の検定法。
36. ３６．平均直径として測定したとき粒子の粒径は０．００１から１００μｍにわ たる、請求項２２記載の検定法。
37. ３７．粒子の粒径は０．０１から１０μｍにわたる、請求項３６記載の検定法。
38. ３８．組成物中の粒子の濃度は１から１０，０００μｇ／ｍｌである、請求項２ ２記載の検定法。
39. ３９．粒子の濃度は５から１０００μｇ／ｍｌの範囲にある、請求項３８記載の 検定法。
40. ４０．粒子は少なくとも０，００１ｃｇｓ単位の磁化率を有する、請求項２２記 載の方法。
41. ４１．磁化率は少なくとも０．０１ｃｇｓ単位である、請求項４０記載の方法。
42. ４２．組成物中の粒子の磁化率、密度、粒径および濃度は、粒子の沈降速度が少 なくとも０．５ｍｍ／分となるように選ぶ、請求項２２記載の検定法。
43. ４３．化学発光の測定に基づき、試料中に存在する対象被検物質の結合検定を実 行するための装置において、 （イ）入口および出口を具えた垂直な円柱形の域を有し、そして磁場を発生させ るための手段およびセルと円柱形の域の大体の体積より下に位置した電極を更に 含む試料含有体積を限定するセル、および（ロ）前記電極に電圧を印加するため の手段、および（ハ）収集域で発生した化学発光を測定するための手段からなる 上記装置。
44. ４４．磁場を発生させるための手段は、北−南配向で非磁性材料により分離され た複数の磁石を含む、請求項４３記載の装置。