JP3061416B2 - 改良されたルミネセンス検定の方法と装置 - Google Patents

改良されたルミネセンス検定の方法と装置

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の相互参照 この出願は、1991年２月６日に出願されたMassey等の
同時係属出願通し番号07/652,427の部分継続であり、そ
れは又現在出願放棄されているが電気化学ルミネセンス
検定の表題で1988年11月３日出願の出願通し番号266,88
2の部分継続である。この出願はまた1990年６月18日出
願の出願通し番号539,389の部分継続であり、それは出
願通し番号266,882の継続である。同時にマッセイらが
出願している通し番号07/827,269の「複数の磁石を含む
磁性微粒子ベースのルミネセンス検定の方法と装置」
（CMS摘要書370068−3401）の表題の出願を引用してい
るがこれも出願通し番号07/652,427で部分継続である。
上記の引用出願は総てここでは参照文献に組み入れてあ
る。
発明の分野 この出願は一般的には結合検定を行う方法と装置に関
するものであり、更に具体的には検定システムの１つ以
上の標識を付けた組成が放出するルミネセンスを測定す
ることにより興味のある検体の存在を測定する方法と装
置に関するものである。更に特別にはこの発明はルミネ
センスのある成分が検定組成中に濃縮されていて電気化
学ルミネセンスが引き起こされる前に検出システムに収
集されるように改良した良感度で精密で再現性のある正
確で均一または不均一な特定の結合検定に関するもので
ある。
発明の背景 多数の方法とシステムが、生化学や生物学的物質中に
興味ある検体の検出定量用に開発されている。微量の微
生物、医薬品、ホルモン類、ウイルス、抗体、核酸、そ
の他のタンパク質を測定することのできる方法とシステ
ムは研究者や臨床医にとっては大きな価値がある。
非常に肝要な技術要素が、例えば抗原抗体反応、核酸
異種形成技術、タンパク質配位子システムのような周知
の結合反応を基礎に置いて開発されている。多くの生化
学や生物学的結合システムでの高度な特異性が、研究や
診断に価値のある多くの検定方法とシステムを導き出し
ている。典型的には興味ある検体の存在が、１つ以上の
結合物質に付けた観察できる「標識」の有無によって示
される。特に興味のあるのが光化学、化学、電気化学の
手段により発光する標識である。「光ルミネセンス」
は、物質が電磁放射線を吸収したときに発光を誘導され
るプロセスである。蛍光と燐光は光ルミネセンスの一種
である。「化学ルミネセント」プロセスは、エネルギー
の化学転移によるルミネセント種の生成を伴う。「電気
化学ルミネセンス」は、電気化学的なルミネセント種の
生成を必然的に伴っている。
興味ある検体を含む試料を化学ルミネセント標識で標
識付けした試薬と混合する化学ルミネセント検定技術が
開発されている。反応性混合物は、定温放置され標識付
き反応物が検体と結合する。定温放置後に混合物の結合
部分と非結合部分が分離され、その一方または両方の部
分の標識濃度を化学ルミネセント技術で決定する。一方
または両方の部分で決定した化学ルミネセンスのレベル
は、生物学的試料の検体量を示す。
電気化学ルミネセント（ECL）検定技術は、化学ルミ
ネセント技術の改良である。それは、興味ある検体の存
在と濃度を感度良く精密に測定している。その様な技術
では、ルミネセンス発生の引金にするために定温放置し
た試料を電圧電流計的に作用する電極に触れさせる。適
切な化学環境で、特定時間に特定なやり方で作用電極に
電圧を印加することがその様な電気化学ルミネセンスの
引金となる。その標識により生じた光を測定して検体の
存在または量が表示される。その様なECL技術を充分に
記述するために、PCT公開出願US85/01253（W086/0273
4）、PCT公開出願番号US87/00987、PCT公開出願U.S.88/
03947を引用する。前記出願物の公開は参考文献に組み
入れられている。
検定操作中に分離段階の必要なしに電気化学ルミネセ
ント検定を行い、異なる濃度の検体でシグナル変調を最
大にして精密で良感度の測定が行われるようにすること
が望ましい。非分離検定の先行技術方法には、検定する
１つ以上の結合組成を結合するのに検定試料中に懸濁し
た微粒子物を用いる検定方法がある。
米国特許番号4,305,925は、臨床学的に関連のあるタ
ンパク質とペプチドをネフェロメトリックとタービドメ
トリックの比濁分析法の手段で検出決定することに関す
るものである。公開の方法は、光散乱または光吸収の作
用を行うラテックス粒子に抗原または抗体の結合が関連
している。
米国特許番号4,480,042は、シェル中子（なかご）粒
子から成る粒子試薬を用いた技術に関するものである。
シェルには官能基があってそれに生物学的な興味のある
化合物が共有結合することができ、中子の高屈折率が光
散乱測定の高感度を示すことになる。この技術は、２価
の抗体が興味ある多価の抗原と反応する凝縮反応に基づ
いていて、種々なやり方で検出および／または測定でき
る凝縮物を作り出す。
米国特許番号4,419,453は同様に、抗体や免疫原のよ
うな免疫薬物の存在を検出するのに役立つ着色ラテック
ス凝縮試験法の使用に関するものである。
この先行技術に基づくと、ルミネセント現象を測定す
る検定に微粒子物の使用が可能であるとは思われてはい
なかった。遊離した化学ルミネセントまたは電気化学ル
ミネセント部分からのルミネセンスは吸収、散乱、その
他微粒子物からの干渉を受けると人々は予想したであろ
う。
その予想に反して、米国出願通し番号539,389（PCT公
開出願U.S.89/04919）はルミネセント現象に基づく敏感
で特別な結合検定法を教えているが、そこでは不活性微
粒子物が検定システムの結合反応物の一つに特別に結合
する。その検定は不均一な（１つ以上の分離段階）検定
方式で行われ、均一な（分離のない）検定方式が一番都
合良く使用される。
米国89/04919は、ルミネセント現象測定のための結合
反応に基づいた検定の組成に関するものであり、その組
成には検定混合物の組成に結合できる表面を持った複数
の懸濁粒子が含まれている。別な点では試料中の興味の
ある検体を検出または定量するシステムに向いていて、
そのシステムはその発明の検知組成を用いてその検定法
を行うことができる。このシステムには、検知媒体中の
標識化合物を誘起して発光する手段とそのルミネセンス
を測定して試料中の興味ある検体の存在を検出する手段
が含まれている。
電気化学ルミネセント部分が連結している検定システ
ム成分が懸濁したミクロ微粒子物に結合すると、その成
分に連結した電気化学ルミネセント部分が発するルミネ
セントシグナル強度を大きく変調し、それによって検定
システムの特定結合反応を監視する手段を与えているこ
とが判った。もっと驚くべきことは、懸濁微粒子物に結
合しないで残っているシステム成分に連結した電気化学
ルミネセント部分が発するルミネセントシグナル強度に
この懸濁粒子が極く僅かまたは全く影響を与えないこと
が判った。
それで米国89/04919は試料中の興味ある検体の検出法
に向けられていて、その方法には次の段階が含まれてい
る：即ち （１）次のものを含む組成物の形成： （ａ）興味ある検体を含んでいると思われる試料、 （ｂ）（ｉ）興味ある検体またはその類似物、 （ii）興味ある検体またはその類似物の結合相
手 （iii）上記の（ｉ）または（ii）と結合能力
のある反応性成分 から成るグループから選んだ検定施行物質、ここに該物
質の一つは発光誘導能力のある化学的部分を持った標識
化合物と連結している， （ｃ）検体および／または（ｂ）の（ｉ）、（ii）、
または（iii）で規定した物質と特別な結合能力のある
複数の懸濁粒子； （２）その組成を定温放置して粒子とこの標識化合物を
含む複合体を形成する； （３）標識化合物を発光させる； （４）その組成により放出するルミネセンスを測定して
試料中の興味ある検体の存在を検出する。
これらと同じ方法を用いて、検定組成のルミネセンス
を既知量の検体を含んだ組成のルミネセンスと比較する
ことで試料中の検体量を定量する。
天然物か合成物に拘らず興味ある検体の類似物は検体
に匹敵する結合性を持った化合物であるが、さらにそれ
より大きいか又は小さな結合能力の化合物も含まれる。
本発明に用いるのに適した結合の相手は周知のものであ
る。例えば抗体、酵素、核酸、レクチン、余因子、受容
体である。検体またはその類似物および／またはその結
合相手と結合能力のある反応性化合物は、第二の抗体ま
たはタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇのようなタンパク
質またはアビジンかビチオンのようなものまたは結合反
応に入り込むことが技術的に知られているその他の成分
である。
好都合なことにルミネセンスは、特定の結合相手と結
合したかしないかに拘らず標識化合物が電圧電流計的に
作用する電極に触れて誘起された電気化学ルミネセンス
（ECL）から生じる。このECL反応性混合物は、光を発す
るよう特殊な時間特殊なやり方で或る電圧を作用電極に
印加することで発光の引金を制御する。可視光の放射が
都合良いが、その組成またはシステムは赤外線または紫
外線、Ｘ線、マイクロ波などのような別なタイプの電磁
放射線を放射するかも知れない。「電気化学ルミネセン
ス」「電気化学ルミネセント」「ルミネセンス」「ルミ
ネセント」「発光（ルミネス）」の用語を用いる場合、
光や他の形の電磁放射線の放射を含んでいる。
米国89/04919が教える方法は、研究や臨床で設定して
行った種々の検定で極度に少量の検体を検出定量でき
る。しかし研究者や臨床医の要求から、これらの方法で
行う検定の検出限界を下げこれらの検定の感度を上げ操
作速度を上げることが肝要となっている。
標識の付いた種を測定する段階前にそれを濃縮するこ
とでそれが出すシグナルを増加する種々の方法の技術が
周知となっている。例えば米国特許番号4,652,333では
蛍光、燐光、または原子蛍光の標識が付いた粒子を測定
段階前にミクロろ過で濃縮している。
測定段階前に標識の付いた免疫化学種を、例えば磁気
感応性標識付き粒子を測定容器の表面に引き出すことで
濃縮する技術も周知されている。例えば米国特許番号4,
731,337、4,777,145、4,115,535ではその様な粒子を容
器壁に引き出してから照射して光の蛍光放出を励起して
いる。
米国特許番号4,945,045では粒子を磁性電極上に濃縮
している。標識付き化学媒介物で助長された電極で電気
化学反応が起こる。免疫化学結合が媒介物の効率を変
え、結合が起こるときに変調シグナルが生じる。
これらの先行技術の方法は、この発明の表面選択励起
プロセスとは関連がない。例えば電気化学ルミネセンス
のような表面励起の特別な機構的説明に縛られてはいな
いが、固相複合体上の標識は電極で酸化されるに違いな
いと信じられている。それは電子が標識から電極まで移
動することが要求される。その電子は、例えば溶液のよ
うなポテンシャルエネルギーが非常に高い領域空間をポ
テンシャルエネルギー障害として「飛び越す」ことはし
ないでその中を通過するトンネル現象として周知の「ジ
ャンプ」をすると信じられている。このエネルギー障害
をトンネル通過できてから追加エネルギーを入力しない
で、或る分子から他の分子へまたは或る分子から電極へ
移動する。しかしこのトンネル現象は、非常に短い距離
だけで働くのである。このトンネル現象の可能性は、２
つの種の間の距離が増加するにしたがって指数的に低下
する。２種間で生じるこのトンネル現象の可能性は、も
しその距離が25オングストローム（2.5nm）以下なら相
当高いがその距離が大きいとかなり低くなる。この25オ
ングストロームの距離は熟練技術者が経験的に使っては
いるが絶対的な限度ではない。
従って、電極表面に25オングストロームでのECL標識
はECLプロセスに参与すると期待できる。電極表面の25
オングストローム以内にある粒子面積はおしなべて極度
に小さい。
従って、粒子表面からのECLを顕著な程度に測定でき
るとは期待していない。そのうえ、ECLプロセスで生じ
る光が増倍型光電管にまで到達するには粒子間を通過し
なければならない。その粒子は本来不透明（濃縮懸濁液
は黒色）であるので、たとえかなりの光量がECLで作ら
れたとしても、その光が粒子間を通過して増倍型光電管
で測定されるとは期待していない。
発明の目的 従ってこの発明の主な目的は、結合検定を行うための
均一（非分離）と不均一（分離）方法、試薬、装置を提
供することである。
この発明の他の目的は、微粒子物を含む検定組成から
放出する電気化学ルミネセンスの測定に基づいた非分
離、特定な結合検定、試薬、装置を提供することであ
る。
更に関連する目的は、これまでに到達したもの以上に
改良された感度、早い検定時間、大きな特異性、小さな
検出限度、高い精度を持つような検定、試薬、装置を提
供することである。
発明の説明 用語の定義 「ECL部分」、「金属を含むECL部分」、「標識」、
「標識化合物」、「標識物質」の用語は置き換えて使用
される。「ECL部分」、「金属を含むECL部分」、「有機
金属の」、「金属キレート」、「遷移金属キレート」、
「稀土類金属キレート」、「標識化合物」、「標識物
質」、「標識」と名付けられた種で検体またはその類似
物、検体の結合相手またはその類似物、前記の結合相手
と更に結合する相手、または検体、その類似物または上
記の結合相手と結合する能力のある反応性成分のような
分子と連結するものがこの発明の範囲内にある。上記の
種はまた１つ以上の結合相手および／または１つ以上の
反応性成分の組合せに連結される。それに加えて、前記
の種はまた結合相手、反応性成分、または１つ以上の結
合相手および／または１つ以上の反応性成分の組合せと
結合した検体またはその類似物と連結できる。また複数
の前記の種が直接または前に論じたように他の分子を経
て検体またはその類似物と結合するのもこの発明の範囲
内にある。簡単にするためにこれらの配位子を検定施行
物質と呼ぶ。
検出定量の用語は「測定」と呼び、定量では基準値の
組成と校正を用意する必要があるとされている。
複合体の収集と濃度の用語は、検定組成内の複合体の
濃度と例えば電極表面での複合体の収集とを記述するた
めに置き換えて用いられる。
図面の簡単な説明 図１は、この発明の微粒子に基づく非分離と分離検定
を行うためのセルの概略図である。
図２は、図１のセルと一緒に使う電圧制御装置の簡単
な図形である。
図３は、電気化学ルミネセント標識を付けたオリゴヌ
クレオチドとビオチン電気化学ルミネセント標識を付け
たオリゴヌクレオチドをプライマーとした直接組み込み
PCR方式の概略表示である。
図４は、ビオチニル化PCR生成物を作り出すためにビ
オチニル化プライマーを使った正常PCR方式の概略表示
である。
図５は、電気化学ルミネセント標識付きオリゴヌクレ
オチドに後ほど異種形成するために単一要素ビオチニル
化DNAを作り出す非対称PRC検定方式の概略表示である。
図６は、電気化学ルミネセント標識付きオリゴヌクレ
オチドをビオチニル化PCR生成物に直接組み込む特異性
の研究を示すグラフである。
図７は、HPV16PCR生成物に直接組み込んだ電気化学ル
ミネセント標識とビオチニル化オリゴヌクレオチドの標
準曲線である。
図８は、Ha−ras腫瘍遺伝子のための点突然変異検定
を示すグラフである。
図９は、Ar−ras腫瘍遺伝子のためにP32電気化学ルミ
ネセント標識を付けたプローブを用いて電気化学ルミネ
セント標識を付けたプローブの特異性評価を示すグラフ
である。
図10は、Ha−ras腫瘍遺伝子の点突然変異決定のため
のP32電気化学ルミネセント標識での電気化学ルミネセ
ント標識の相対値測定を示すグラフである。
図11は、HPV18の迅速「洗浄なし」異種形成検定の標
準曲線である。
図12は、複合体を沈降させるのに重力に頼る検定を行
うために用いた検定セルの概略表示である。
図13は、重力の影響を受けた複合体の時間の関数とし
た沈降距離；即ちDynal粒子の沈降速度（ｙ＝−0.28＋
0.48x; 速度＝0.5mm/分）を示すグラフである。
図14は、電極上に異なる検定組成の高さを有する重力
セル中での時間を関数とした電気化学ルミネセンス強度
を示すグラフであり、即ち、２つのガスケット厚さに対
する強度と時間の関係を比較する。ここに白丸で表す値
は0.015インチガスケットのものであり、黒丸で表す値
は0.075インチガスケットのものである。
図15は、アルファ胎児タンパク質測定のための検定で
測った電極表面上の異なる高さの検定組成を有する重力
セル中での電気化学ルミネセンス強度を示すグラフであ
り、即ち、AFP検定のためセルを比較する。ここに白丸
で表す値は0.015インチガスケットのものであり、黒丸
で表す値は0.075インチガスケットのものである。
図16は、複合体を電極表面に沈降させるのに電磁石を
用いる沈降検定セルの概略表示である。
図17は、それぞれ磁場と重力の影響下で沈降する相対
速度を示すグラフであり、即ち、磁場が引き起こす沈降
と重力沈降との間の微粒子沈降時間の比較である。ここ
に磁場沈降の値は白丸で表し重力沈降は黒丸で表してい
る。
図18は、永久磁石を持った収集セルの概略表示であ
る。
図19は、図18のセルで行った検定時間を関数としたEC
L強度の増加を示すグラフであり、即ち、ECL強度におよ
ぼす収集時間の影響である。
図20は、電極表面下の磁石の向きの関数とした電極表
面付近の力線の概略表示である。
図21は、複合体が遠心分離によって電極表面に沈積す
るような回転流セル；粒子を捕獲するための発明の遠心
方法と装置；発明の遠心流セルの概略表示である。
図22は、エバネッセント波蛍光の検出の概要表示であ
る。
図23と24は、この発明の磁性微粒子に基づいた分離ま
たは非分離の検定法を行うためのセルと複数の磁石；電
極表面の面に大体平行した磁線を与える磁石装置の複数
の磁石を示している。
図25は、この発明の微粒子に基づいた非分離と分離の
検定を行うためのセルの概略図面であり、そのセルは図
23、24のような作用電極と複数の磁石を用いている。
発明の簡単な説明 この広範な実施例で、この発明は試料中の興味ある検
体の結合検定を行うための方法である。その段階は次の
ようになる： （ａ）次のものを含む組成物の形成：即ち （ｉ）該試料、 （ii）ルミネセンス発光を引き起こす能力のある標識
化合物に連結した成分を含む検定施行物質、 （iii）検体および／または該検定施行物質と特に結
合する能力のある複数の粒子。
（ｂ）該組成物を定温放置して粒子と該標識化合物を含
む複合体の形成。
（ｃ）該複合体を測定域に収集。
（ｄ）該複合体中の標識化合物を表面選択励起してルミ
ネセンス発光の促進。
（ｅ）試料中の興味ある検体の存在を調べるために放出
ルミネセンスの測定。
複合体は例えば電極表面に収集され、そこで電圧を電
極に加えまたは表面に収集後下記のような表面励起で蛍
光を誘起し複合体は励起されて電気化学ルミネセンスが
誘起される。内部全反射蛍光（TIRF）は蛍光を出し易い
標識を励起し検出する表面感度の良い技術として説明さ
れていて、内部全反射はラマンと赤外吸収と共に標識の
存在を測定する別な表面感度の良い技術として用いられ
ている。表面プラズモン共鳴は、この発明の方法によっ
て表面の標識測定のために用いられる光学技術である。
この発明は従って、表面励起技術によりルミネセンスを
励起する方法に向けられている。
この発明は測定域即ち、ルミネセンス発光を引き起こ
す表面に複合体を収集することで都合良く行われるが、
この発明はまた複合体を測定域外に収集した後にその測
定域に持って行く手段をとるか他の段階をとってルミネ
センスを誘起して測定する方法も含んでいる。
複合体の収集は重力沈降、ろ過、遠心力分離、および
複合体の一部を形成する磁気感応性粒子の磁気吸引など
を含む若干の色々な方法で行われる。若干の実施例を以
下更に詳細にわたって説明する。
電極表面の電気化学ルミネセンス測定に基づく検定
が、重力を使って次のように都合良く行われている：即
ち （ａ）次のものを含む組成物の形成：即ち （ｉ）該試料、 （ii）ルミネセンス発光を誘起する能力のある標識化
合物に連結した成分を含む検定施行物質、 （iii）該組成物の残りよりも大きな密度を持ち検体
および／または該検定施行物質と特に結合する能力のあ
る複数の粒子。
（ｂ）該組成を定温放置して粒子と該標識化合物を含む
複合体の形成。
（ｃ）該組成を検定セルに収集。
（ｄ）該組成を該セル内に充分な時間滞留させることで
重力により該電極表面上に粒子が沈降するようにして、
該検定セル容積の少なくとも相当部分の下に位置した電
極表面で該複合体を収集。
（ｅ）該電極に電圧を加えることで該収集複合体中の標
識化合物のルミネセンスを誘起。
（ｆ）試料中に興味のある検体が存在するのを調べるた
めに電極表面に発生したルミネセンスの測定。
バッチ検定が行われるが、連続または半連続検定をフ
ローセル内で行うことができる。フローセルの場合に
は、溶液が流れ通過する間に測定セル内には固相が残
る。もしその固相（例えば粒子）が水よりも濃い、即ち
水より大きな密度（＞1.0g/mL）なら、粒子にかかる重
力が粒子をセル底に沈降させる。液体がセル内を流れて
通過する間に粒子が底に沈降するようにセルは作られて
いるか、ECL装置の作用電極上のカラム状仕切り内のセ
ルに試料の大部分が入ってしまうようにセルは作られて
いる。粒子がECLを誘起する前に電極表面上に沈降する
ようにセル内の充分な滞留時間が与えられなければなら
ない。
この発明の他の実施例では、検定組成とバランスする
以上に大きな密度を持った懸濁粒子を含む検定組成を遠
心力分離にかけて、粒子が測定域に移りそこで続いて粒
子が例えば電気化学ルミネセンスを誘起するように電極
と接触させるか遠心力分離段階で電極と直接接触させ
る。
この実施例では、測定セルが試料と試料封入物を迅速
に回転する手段を備えている。遠心力が試料中の粒子を
試料封入物の回転軸から外向きに動かして試料封入物の
外面に集める。この様な試料封入物の外面はECL測定装
置の作用電極を構成している。
第３の実施例では、粒子が検定組成からろ過によって
取り出される。この実施例では粒子が検定組成バランス
以上の大きな密度を持っている必要はない。この発明で
粒子を溶液から分離し、例えばろ紙面上の粒子をポンプ
で引いて収集など、ろ紙を通して溶液を引き抜いて濃縮
する。このろ紙面は例えば、ECL検出装置内の作用電極
として働くように金属薄膜で覆う。
好適な実施例では、懸濁粒子は例えば常磁性または強
磁性の磁気感応性であり粒子に磁場を印加して測定域ま
たはできれば直接電極表面に集める。測定セルには磁石
が付いている。磁石の磁場は、粒子がバッチセル内に滞
留している時または粒子がフローセルを通過している時
に力を加えて溶液のかさから磁石に極めて近接している
セル表面に粒子を分離する。もし磁石が適切な向きでEC
L検出装置の作用電極に近接して置かれているならば、
粒子は作用電極の表面に濃縮される。
複合体を電極表面に集め濃縮するために上記の方法を
用いて、結合検定の若干異なる不均一と均一方式が実施
される。不均一結合検定では、標識からのルミネセンス
測定前にその組成から複合体は取り出される。均一検定
では、結合した（固相と）標識付き試薬と結合していな
い標識付き試薬の分離は行われない。
不均一検定では、複合体が作用電極の表面上で濃縮さ
れると標識からのシグナルを測定すると、収集段階のな
い場合よりもずっと大きくなる。それに反して、複合し
ていない標識付きの試薬からのシグナルは変わりがな
い。それ故、測定セル内に複合していない標識付きの試
薬が存在していても、収集した複合体からのシグナルは
複合体の収集がない検定におけるよりも大きくなる。結
合検定の検出限界は、収集操作の結果としてずっと改良
される。
この発明の好適な実施例で、均一結合検定操作では現
場での分離段階が含まれている。例えば試料、検定施行
物質、粒子のような検定組成が測定セル内にポンプで集
められ複合体が作用電極上に取り込れた後に、現場洗浄
または複合体を検定組成の結合していない成分から分離
しながら第二の液体を標識試薬または標識付き試薬のな
いセルを通ってポンプで引き込む。この検定操作は技術
的には不均一結合検定である。しかし測定セルの内側で
の分離能力は、分離装置を追加する必要がなく外側分離
法よりもずっと早く操作できる点で有利である。
不均一結合検定はこの発明を利用して検定組成の成分
を混合しそれを既定の時間だけ反応させて行われる。検
定組成は次に溶液を粒子から分離する分離段階に入る。
次に電気化学ルミネセンスを複合体か溶液から測定す
る。濃縮段階で濃縮しないで行うのより良い精度と低い
検出限度で検体の測定ができるようになった後に、複合
体からのECLを測定する。
発明の詳細な説明 この発明は、他の目的やその特長も同じように、次の
ような好適な実施例の説明をすることで更にはっきり十
分理解される。
この発明は、結合反応に入れる能力のある興味ある検
体に広範にわたって適用できる。これらの反応には、例
えば抗原抗体、配位子受容体、DNAとRNAの相互作用、そ
の他の周知の反応が含まれる。この発明は、多種類成分
の試料内の興味ある検体の存在を定性的および定量的に
検出する色々の方法と検定に関するものである。
試料 固体、エマルジョン、懸濁液、液体、またはガス状で
あるかも知れない興味ある検体を含んでいる試料は、例
えば細胞と細胞を作った生成物、水、食物、血液、血
清、毛髪、汗、尿、ふん便、組織、唾液、油、有機溶剤
または空気から得られる。試料は更に例えば水、アセト
ニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルフォルムア
ミド、ｎ−メチル−ピロリドンまたはアルコール類また
はそれらの混合物から成り立っている。
検体 興味ある典型的な検体は、試料中に存在する細胞全体
または表面抗原、準細胞粒子、ウイルス、プリオン、ウ
イロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、タン
パク質、リポタンパク質、多糖類、リポ多糖類、グリコ
タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、細胞代謝産物、
ホルモン、薬剤、合成有機分子、有機金属分子、鎮静
剤、バルビツール塩、アルカロイド、ステロイド、ビタ
ミン、アミノ酸、糖、レクチン、再結合または派生タン
パク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ま
たは無機分子。典型的に、興味のある検体は10−３モル
以下の濃度で存在し例えば10−12モル以下の低さまでに
なる。
検定施行物質 興味のある検体を含んだ試料と組合せた検定施行物質
は、次のものから成るグループから選んだ少なくとも１
つの物質を含んでいる：即ち （ｉ）上記のような付加した興味のある検体またはその
類似物、 （ii）興味ある検体の結合相手またはその類似物、 （iii）（ｉ）または（ii）と結合能力のある上記の反
応性成分。
ここに該物質の１つを化合物または部分（例えばルミ
ネセンス発光を誘起する能力のあるECL部分）に連結す
る。標識付けの物質は細胞全体または表面抗原、準細胞
粒子、ウイルス、プリオン、ウイロイド、抗体、抗原、
ハプテン、脂質、脂肪酸、核酸、多糖類、タンパク質、
リポタンパク質、リポ多糖類、グリコタンパク質、ペプ
チド、ポリペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬剤、
鎮静剤、バルビツール塩、アルカロイド、ステロイド、
ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的ポリマー（できれ
ば可溶性）、レクチン、再結合または派生タンパク質、
合成有機分子、有機金属分子、無機分子、ビオチン、ア
ビジン、ストレプトアビジン。或る実施例では、その試
薬は抗体、抗原、核酸、ハプテン、小ヌクレオチド連
鎖、オリゴマー、配位子、酵素、またはビオチン、アビ
ジン、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質
Ｇ、またはその複合体、または一次結合の相手にタンパ
ク質相互作用により結合する能力があるその他の二次結
合の相手などと共役した電気化学ルミネセンス性の部分
である。
興味のある検体の類似物は、天然物であれ合成物であ
れ典型的にはその検体に匹敵する結合性を持った化合物
であるが、また結合能力が高いか低い化合物であっても
よい。検体またはその類似物および／またはその結合相
手と結合する能力がありそれによってECL部分が検体と
連結できるような反応性化合物は、第二抗体またはタン
パク質Ａやタンパク質Ｇのようなタンパク質、またはア
ビジン、またはビオチンまたは結合反応に入ることが技
術的に周知されているその他の化合物が適当である。
標識 ECL部分が金属キレートであるのが都合が良い。この
キレートの金属は、問題の反応システムに課せられた電
気化学的条件下でルミネセンス発光をする金属キレート
となるような金属が適している。そのような金属キレー
トの金属は、例えば遷移金属（ｄ−ブロック遷移金属の
ような）または稀土類金属である。その金属はルテニウ
ム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白
金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウ
ム、銅、クロムまたタングステンが好ましい。特に好ま
しいのはルテニウムとオスミウムである。
このようなキレートの金属に連結する配位子は、普通
は複素環式（ヘテロサイクリック）または有機の特性で
あり金属キレートが水溶液環境または有機かその他の非
水溶液環境に可溶性であるかどうかを決める役割を演じ
ている。この配位子は多歯状（polydentate）であり置
換できる。多歯状配位子には芳香族と脂肪族の配位子が
含まれる。適当な芳香族の多歯状配位子には芳香族複素
環式配位子が含まれる。好ましい芳香族複素環式配位子
は、例えばビピリジル、ビピラジル、ターピリジル、フ
ェナントロリルのような窒素含有のものである。適当な
置換物には、例えばアルキル、置換アルキル、アリー
ル、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、カル
ボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボキシアミ
ド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシ
カルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジニ
ウム、ウレイド、硫黄含有基、燐含有基、Ｎヒドロキシ
琥珀酸イミドのカルボキシレートエステルが含まれる。
キレートは１つ以上の単一歯状配位子を持ち、その広範
な種類が技術的に周知されている。適当な単一歯状配位
子には、例えば一酸化炭素、シアナイド、イソシアナイ
ド、ハライド、脂肪族、芳香族、多素環式ホスフィン、
アミン、スチルベン、アルシンが含まれる。
適当なキレートの例としては、ビス［（４、４′−カ
ルボメトキシ）−2,2′−ビピリジン］２−［３−（４
−メチル−2,2′−ビピリジン−４−イル）プロピル］
−1,3−ジオキソランルテニウム（II）；ビス（2,2′ビ
ピリジン）［４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル
−2,2′−ビピリジン］ルテニウム（II）；ビス（2,2′
−ビピリジン）［４−（４′−メチル−2,2′−ビピリ
ジン４′−イル）−酪酸］ルテニウム（II）；トリス
（2,2′ビピリジン）ルテニウム（II）；（2,2′−ビピ
リジン）［ビス−ビス（1,2−ジフェニルフォスフィ
ノ）エチレン］２−［３−（４−メチル−2,2′−ビピ
リジン−４′−イル）プロピル］−1,3−ジオキソラン
オスミウム（II）；ビス（2,2′−ビピリジン）［４−
（４′−メチル−2,2′−ビピリジン）−ブチルアミ
ン］ルテニウム（II）；ビス（2,2′−ビピリジン）
［１−ブロモ−４（４′−メチル−2,2′−ビピリジン
−４−イル）ブタン］ルテニウム（II）；ビス（2,2′
−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−2,
2′−ビピリジン−４′−ブチルアミドルテニウム（I
I）。その他のECL部分は、参考文献としてここに組み入
れたPCT公開出願US87/00987とPCT公開出願83/0394に記
述がある。
ECL部分の作用は、電気化学的エネルギーを反応系に
導入した結果として電磁放射線を放出することである。
こうなるにはECL部分が励起エネルギー状態に刺激を受
ける能力があり、また励起状態から落ちる際に光のフォ
トンのような電磁放射線を放出する能力もなければなら
ない。電気化学ルミネセント反応にECL部分が関与して
いるメカニズムの理論的解析に縛られたくはないが、電
気化学エネルギーを反応系に導入することで酸化され次
いで系内の還元体との相互作用によって励起状態に変わ
るものと我々は考えている。この状態は比較的不安定で
あり金属キレートはすぐにもっと安定な状態に低下す
る。その間にキレートは光のフォトンのような検出可能
な電磁放射線を放出する。
この発明によって組み込まれた金属キレートやその他
の金属を含有するECL部分の量は、系によって変わる。
一般的には、その様な部分の使用量は検出可能な放出を
得るのに効果的な量とするが、前記の組成や系からの電
磁エネルギーの放出が定量できることが望ましい。興味
のある検体検出および／または定量は、普通には興味の
ある検体やECL部分を含んだ試料からのルミネセンスを
既知量の興味ある検体やECL部分で調製した校正標準物
からの放出ルミネセンスに対して比較することで行われ
る。これは均一方式を考えている。不均一方式では前に
述べたようにECL分析に先だって分離を行う。
或る普通の技術技能で評価できるのであるが、金属含
有のECL部分の確認と定量は、普通行われる条件にも依
存するが系の種類によって変わる。適当な金属含有ECL
部分と好ましい結果を得るのに十分なその量は、過度な
実験などをしなくてもここでの教訓を一度身につければ
普通の技術技能で経験的に決められる。
粒子 粒子としては0.05μｍ〜200μｍ、好ましくは0.1μｍ
〜100μｍ、最も好ましくは0.5μｍ〜10μｍのように0.
001μｍ〜200μｍ直径の微粒子物と、検体および／また
は前に規定した１つ以上の他物質に結合する能力のある
表面成分から成り立つものが都合がよい。例えば、この
微粒子物は架橋澱粉、デキストラン、セルロース、タン
パク質、有機ポリマー、スチレン／ブタジエンコポリマ
ー、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレンコポリマ
ーのようなスチレンコポリマー、ビニルアセチルアクリ
レートコポリマーまたは塩化ビニル／アクリレートコポ
リマー、不活性無機粒子、二酸化クロム、鉄、シリカ、
シリカ混合の酸化物、タンパク物質、またはそれらの混
合物。粒子はECL系に懸濁しているのが望ましい。粒子
には磁気感応性粒子が含められるか含めてもよい。
検定媒体 電極が電気化学エネルギーを導入するシステムを操作
するためには、電極を浸漬するためのECL部分を含む電
解質が提供されなければならない。この電解質は、電荷
がイオンで運ばれるような相である。一般的にこの電解
質は液体相であり、１つ以上の塩またはその他の種を
水、有機液または有機液混合物、または水と１つ以上の
有機液の混合物に溶かした溶液である。しかしその他の
形の電解質もこの発明の或る実施例では使用できる。例
えば電解質は流体（例えば液体、蒸気、または超臨界の
流体）中に１つ以上の物質が分散したものまたは固体、
蒸気または超臨界流体中の１つ以上の物質が溶解した溶
液でもよい。
この電解質は、塩の水溶液が適当である。その塩はナ
トリウム塩またはカルシウム塩が好ましいが、他の陽イ
オンとの組合せもその陽イオンが一連の電気化学ルミネ
セント相互作用に干渉しない限り或る実施例では適切で
ある。その塩の陰イオンは例えば燐酸塩であるが、その
他の陰イオンの使用もこの発明での或る実施例では許さ
れるが、再度言うがその選んだ陰イオンが一連の電気化
学ルミネセント相互作用に干渉しない限りである。
その組成も非水溶液である。超臨界流体は或る場合に
は好都合に取り上げられるが、非水組成の有機液体より
成る電解質を利用するのが更に代表的である。水溶液電
解質のように非水溶液電解質も電荷がイオンで運ばれる
相である。通常、これは塩が有機液体の媒体に溶解して
いることを意味する。適当な有機液体を例示するとアセ
トニトリル、ジメチルスルフォキシド（DMSO）、ジメチ
ルフォルムアミド（DMF）、メタノール、エタノール、
および前記の２つ以上の混合物。実例として、テトラブ
チルアンモニウムテトラフルオロボレートのようなテト
ラアルキルアンモニウム塩類は有機液体に可溶でありそ
れらと共に非水溶液電解質を作るのに使われる。
電解質はこの発明の或る実施例では緩衝系となる。燐
酸塩緩衝液がしばしば好都合である。例としては燐酸ナ
トリウム／塩化ナトリウムの溶液と燐酸ナトリウム／弗
化ナトリウムの水溶液。
その他の検定成分 PCT公開の出願U.S.89/04859、表題「アミン誘導還元
体を利用した電気化学ルミネセント反応」で述べている
ように、引用して組み入れてあるその開示では、代表的
にはアミンまたはアミン部分（巨大分子の）還元体を添
加するとそれが酸化され自発的に分解して非常に還元性
のある種に転化するので望ましいとしている。アミンま
たはアミン部分はまた反応系に導入した電気化学エネル
ギーによって酸化されると信じられている。アミンまた
はアミン部分は電子を消失して釣合が失われるかそれ自
体の再配置が行われて強度の還元剤になる。この還元剤
は酸化された金属含有ECL部分と反応し合って上記のよ
うな励起状態になると思われる。この役割を行うために
はアミンまたはアミン部分が電子を与えるような炭素を
中央にしたラジカルと、還元体形成のためには釣合を失
った際にプロトンを与える役割を果たすアルファ炭素を
有していることが望ましい。アミン誘導の還元体は、金
属含有ECL部分を励起状態に変えそれにより検出可能な
電磁放射線が放出されるよう必要な刺激を与えるのであ
る。
広範囲にわたるアミンと相当するアミン部分がこの発
明を実行するのに利用できる。一般的にアミンまたはア
ミン部分は、電気化学ルミネセンスで分析する系のpHに
適合するように選ばれる。その他の関連ファクターはア
ミンまたはアミン部分が、分析中に機能するような環境
（即ち、水溶液または非水溶液の環境の場合であって
も）に適合しなければならない。更に、選ばれたアミン
またはアミン部分が普通に行われている条件下で系内の
酸化された金属含有ECL部分を還元できるほど充分な強
度を示すアミン誘導の還元体を形成しなければならない
点を考慮する。
アミン類（およびそれから誘導された相応する部分）
でこの発明に好都合に利用されているものは、一次、二
次、三次アルキルアミンのような脂肪族アミン類、それ
ぞれ１〜３の炭素原子を有するアルキル基、ならびに置
換脂肪族アミン類である。トリプロピルアミンは、比較
的な話であるが、特別強度の電磁放射線を放出させて、
これを使った実施例では検出定量の感度と精度を上げて
いる。また、ヒドラジンのようなジアミン類とポリエチ
レンイミンのようなポリイミン類が好適である。この発
明を行うのに好適な他のアミン類の例は、トリエタノー
ルアミン、トリエチルアミン、1,4−ジアザビシクロ−
（2.2.2）−オクタン、１−ピペリジンエタノール、1,4
−ピペラジンビス−（エタンスルホン酸）、トリイソプ
ロピルアミンおよびポリエチレンイミン。
本発明で利用される金属含有ECL部分の代表的なもの
は反応を制限する構成要素である。従って、アミンまた
はアミン部分はそれに対して化学量論的に過剰に与えら
れる。実例として、アミンまたはアミン部分は50〜150m
Mの濃度で用いられる。約７のpHで利用するには、100mM
濃度が好都合である。或る実施例では、アミンまたはア
ミン部分の上限濃度は使用する環境（例えば水）でのア
ミンまたはアミン部分の最大溶解性で決められている。
一般にアミンまたはアミン部分は、酸化された金属含有
ECL部分が励起状態へ転移してルミネセンスを発するの
に充分影響を与える量を使用する。普通の技術技能はこ
こでの教えを身につけることで、分析する特殊な系に好
都合に使用されるアミンまたはアミン部分の量を過度な
実験なしに経験的に決めることができる。
PCT公開出願US89/04915の表題「増強した電気化学ル
ミネセント反応」の内容は引用に組み入れられている
が、そこで述べられているように、この発明の検定は増
強剤の存在下で行うのが望ましい。その増強剤の代表的
な化合物の化学式は： ここに R:水素またはCnH2n+1、Ｒ′:CnH2n、Ｘ＝０〜70、ｎ＝
１〜20（好ましくは１〜４）。特定の例としてはトリン
トンＸ−100の名称の市販品がある。その化学式は： ここにＸ＝９〜10 トリントンＸ−401の名称の市販品、化学式は： ここにＸ＝40。
増強剤は一般には充分な量を使用してそれで電磁放射
線の望ましい放出増加が起こるようにする。代表的な量
は0.01％〜5.0％、更に好ましいのは0.1％〜1.0％v/v。
この発明により用いるECL部分は、励起状態に刺激し
て電磁放射線を放射するように導かれる。そこではECL
部分を組み込んだ系を電気化学エネルギーに曝すことで
行われる。ECL部分と強還元体を形成する種の酸化を起
こすポテンシャルは、その正確な化学構造ならびに系の
pHや電気化学エネルギーを導き出すために使用される電
極の特性のようなファクターに依存している。最適のポ
テンシャルと電気化学ルミネセント系の放射波長の決め
方は、普通の技術技能でも周知されている。ECL系を刺
激強調する或る好ましい方法は、PCT公開出願US89/0181
4で開示されているが、その内容はここに引用して組み
入れてある。
電気化学ルミネセンスの測定装置 この発明の検定を行う装置を図１、２で説明する。図
１は具合のよいECL装置を開示しているが本発明の方法
は図10の適用に限られないで、ECL部分の電気化学ルミ
ネセンスの引金となる電気化学エネルギーを与える作用
電極またはその他の引金となる表面を含んだ別なタイプ
のECL装置がむしろ採用されることがある。この発明の
方法は静的または流動様式で行うことができるが、装置
10には結合検定試料を含む多くのタイプの試料にはっき
りした利点を与えるフローセルが含まれている。この発
明のECL検定を行う装置の更に詳細が公開のPCT出願US89
/04854とUS90/01370で開示されている。
装置10には電気化学セル12、増倍型光電管（PMT）が
有利であるが光検出／測定機器14、光ダイオード、電荷
結合機器、写真フィルムまたはエマルジョンなど、セル
12との流体輸送をするためにはぜん動ポンプが有利であ
るがポンプ16が含まれる。代替案として容積式ポンプが
使用できる。シャッター機構18がセル12とPMT14との間
にあり、ECL測定期間中にPMT14をセル12に曝すときにだ
け開けるように制御して運転される。このシャッター機
構は例えばメンテナンス中は閉じられる。また装置10に
含まれているが図１に説明がないのは光遮蔽ハウジング
であり、種々の構成部品をその内に装備しECL測定中に
外部の光をPMT14から遮断する意図がある。
セル12自体には第１装備ブロック20がありステンレス
鋼で具合良く作られていて、入口管22と出口管24が通っ
ている。装備ブロック20には第１の外面26と第２の内面
28がありセル12の試料保持容積30の一方の側を決めてい
て、そこでセル12は装置10の運転中に溶液の洗浄および
／または状態調節および／または測定を保持する。入口
管22と出口管24は外面26から内面28に装備ブロック20を
通過して試料保持容積30に口を開けている。第２装備ブ
ロック32もステンレス鋼で具合い良く作られていて、第
１の外面34と第２の内面36がある。第２の装備ブロック
32は第１の装備ブロック20とはテフロンまたはその他の
汚染されない物質で具合いよくできた環状スペーサー38
で分離されている。それで装備ブロック32の外面34は試
料保持容積30の第２側面部分を規定する。スペーサー38
には外側部分40と中央口径42があり、その内端44は試料
保持容積30の側壁を規定する。外側部分40は、第２装備
ブロック32の外面34に対して第１装備ブロック20の内面
28を目張りして、２つの面28、34の間の試料保持容積30
から溶液が出るのを防いでいる。装備ブロック32には更
に中央口径があり、それには窓48がシール固定されてい
て試料保持容積30の第２の側の残りを外面34の続きとし
て規定している。窓48は、ECL部分から放出する電気化
学ルミネセンス光の波長に全く透明な物質で作られる。
窓48は、従ってガラス、プラスチック、石英などで具合
いよく作られている。
入口管22はその第１の末端50がスペーサー38の近くで
試料保持容積30と交差し、出口管24はその第２末端52が
スペーサー38の近くで試料保持容積30と交差する。入口
管22、試料保持容積30、出口管24の組合せで、セル12に
出入りする溶液が狭く全く層流のために連続した流路が
提供される。矢印Ａ、Ｂはそれぞれ入口22と出口管24に
入るのと出る流れを表す。
第１装備ブロック20の内面28に装備されたのは作用電
極システム54であり、それは説明した実施例では第１と
第２の作用電極56、58を含めている。他の実施例では、
１つの作用電極が具合いよく与えられるか電極56だけが
作用電極となる。作用電極56、58は興味の電気化学反応
とECL反応が起こる所である。作用電極56、58は固体の
電圧電流型電極であり従って白金、金、炭素またはこの
目的に効果のあるその他材料で具合いよく作られてい
る。作用電極56、58にそれぞれ接続されたワイヤーコネ
クター60、62は第１装備ブロック20を通過して出てい
る。
コネクター60、62は図２で説明した電圧制御器66の第
１「作用電極」端子64に両方が接続されている。電圧制
御器66は、電圧シグナルを作用電極56、58に供給しECL
測定中に流れ出る電流を随時測定するのにポテンシオス
タットのやり方で具合いよく運転される。それとは別
に、コネクター60、62は個々の運転用に電圧制御器66の
端子を分けて接続してもよい。
電圧制御器66のポテンシオスタットとしての運転は、
対向電極68とまた随時具合いよく照合電極70によって更
に影響を与えられる。説明した実施例で、装備ブロック
32はステンレス鋼で作られ、対向電極68は装備ブロック
32の露出面72、74である。対向電極72、74と作用電極5
6、58は、試料保持容積30内の溶液にポテンシャルを印
加する接合点を与え、それが化学反応のエネルギーを与
えて試料の電気化学ルミネセンスの引金となり、及び／
またはセル12の表面を浄化し状態調節するエネルギーを
提供する。対向電極72、74はワイヤーコネクター76で電
圧制御器66の第２「対向電極」の端子78に接続される。
る。
照合電極70は基準電圧を与え、これに対して作用電極
56、58で加えられた電圧が照合され、例えば基準に対し
て＋1.2ボルトとなる。照合電極70は、セル12から間隔
のある位置80に出口管24が具合いよく配置されワイヤー
コネクター82で電圧制御器66の第３「照合電極」の端子
84に接続される。この３電極様式では、電流は照合電極
70を通っては流れない。照合電極70は、３電極様式運転
では釣り合いのとれた既知の安定電圧を提供するのに使
われ、従ってそれは銀／塩化銀（Ag/AgCl）で具合いよ
く作られるか飽和カロメル電極（SCE）である。電圧制
御器66は、２電極様式運転では作用電極56と電極58だけ
を対向／照合電極として使って運転できる。この２電極
様式運転では、対向／照合電極58が電圧制御器66の電圧
制御端子78、84に電気的に接続される。この場合、電圧
制御器66は本質的にはバッテリーとして運転する。電圧
制御器66は、電圧シグナルを作用電極56と対向電極58に
供給しそれぞれの電極を通して流れる電流を随時測定す
る。照合電極70は、白金、金、ステンレス鋼またはその
他の材料で作るいわゆる「準照合」電極とも言われ、安
定性が少ないが接触した溶液に関して測定可能になる電
圧を与える。２電極と３電極様式の両方の様式では照合
電極70または58が標準を与える目的に使われ、それに対
して作用電極56に加えられた電圧が測定される。釣合の
とれた電圧標準が目下のところより好都合だと考えられ
ている。ポテンシオスタット運転で電圧制御器66は、照
合電極70に関して作用電極56、58に既知電圧を与え一方
作用電極56、58と対向電極72、74の間に流れる電流を測
定することで種々の電極を制御する。この目的にはポテ
ンシオスタットが周知されていて、従って、電圧制御器
66の内部構造は従来の市販品のどのポテンシトスタット
にも対応し上記の機能を作り出すのでそれ自体は本発明
の一部を形成はしていない。確かに、装置10はあるいは
また内部電圧制御器66なしで作られ、必要な電圧シグナ
ルを電極56、58、72、74、70に与えるために別々に制御
される外部ポテンシオスタットと接続して適合されるこ
とがある。下記するような特定のやり方で加えられるこ
れらの電圧シグナルは、作用電極56、58の表面と都合よ
く全体としてセル12の表面に反復できる初期条件を与
え、その特性はECL測定の精度改良にかなり貢献する。
ポンプ16は、溶液を試料容積から入口管22へ矢印Ａの
方向に「引っ張る」ために都合のよい出口管24のところ
に位置する。溶液は入口管22、試料保持容積30、出口管
24を経て照合電極70を通過して矢印Ｂの方向に流れ出
る。その代わりに、ポンプ16を入口管22のところに位置
して溶液を装置10を経て「押し出す」こともある。都合
よく入口管22、試料保持容積30、出口管24を経るこの同
じ流路が全溶液と流体に用いられ、それはセル12を通過
してその際各流体は前の残っていた流体をセル12の外に
押し出しながら水力学的洗浄活動を行う。ポンプ16の運
転を止めて、セル12中の特殊な溶液を或る時間保持する
ように制御することもできる。
装置10の流れが通過する構造では、作用電極に変動電
圧を印加することあるいは作用電極56、58（または対向
電極72、74と照合電極70）を大気に曝すことなしに１つ
以上の溶液に連続して曝されながら予め運転できるポテ
ンシャルに絶えず保持することができる。大気に曝され
ると、照合電極70への回路が開かれて未知の乱れた電圧
の変動が起こって作用電極56、58の表面条件の再現性が
なくなる。この流れ通過の構造では、電極システム54を
浄化し状態調節をする初期段階と１つ以上のECLトリガ
ーの波形または掃引の測定段階の間での急速な交替が可
能である。
図23と24はセルとマグネットシステムを装備した磁石
27/37の概略を表していて、このマグネットシステムは
電極表面56、58の面に大体平行な磁場線を都合よく印加
する。マグネットシステムは複数のそれぞれの永久磁石
または電磁石から成り立っていて、それらは磁石27/37
の北極と南極を交替に積み重ね配向してある。磁石27/3
7のそれぞれの磁石は空間または磁気に感応しない材料
で分けられている。その配置は図23と24に示すように、
電極面に殆ど水平になるように磁力線を作用電極の上の
領域に都合よく並べる。これが磁気感応性粒子を配向さ
せて粒子が電極表面上に並び電極が供給した電気化学エ
ネルギーに容易にアクセスできるようになる（図20参
照）。
図23と24に示すマグネットシステム27/37は、磁場線
が磁石構造から長い距離伸びていないことが都合よい
（図20参照）。その様なマグネットシステムからの磁場
は、従って永久磁石の挙動または強磁性体を電極装置の
近くに引き起こす恐れがなく、フローセル装置に近い増
倍型光電管の運転に厳しい影響を与えない。図25に描か
れた装置は図１と２に表した通りであり、また図１と２
に関しての上記の説明の通りであるが、図25を除いて、
水平に向けられた電極56または電極56、58の下に垂直に
位置したのは図23と24に示すように北と南に配向した複
数の磁石27/37である。
この発明はまた試薬の組成にも向けられている。大ま
かには試薬組成はこの発明の検定システム成分のどれか
になるであろう。即ち、（ａ）電解質、（ｂ）ECL部分
含有の標識化合物、（ｃ）磁気感応性粒子を含む粒子、
（ｄ）興味の検体または興味の検体の類似物、（ｅ）興
味の検体の結合相手またはその類似物、（ｆ）（ｄ）と
（ｅ）との反応能力のある反応性成分、（ｇ）還元体、
または（ｂ）電気化学ルミネセンス反応の増強剤。試薬
は使用上の都合により互いに組み合わされる。即ち、意
図した検定での成分機能が損なわれる程成分が保管中に
互いに反応しないならば、２成分、３成分、および多数
成分の混合物が調製される。望ましいのは、試薬が２成
分または多数成分の混合物であってそれには粒子および
１つ以上の他の成分が含まれていることである。
この発明はまたキットにも目を向けている。そのキッ
トには上記のような１つ以上の成分（ａ）〜（ｈ）を入
れた容器があるか、そのキットにはこれらの成分の混合
物から成る上記のような１つ以上の試薬組成を入れた容
器があり、全てがこの発明の検定法とシステムに使われ
る。
発明の好適な実施例の説明 この発明の粒子での検定には広範囲の粒子が採用され
るが、一般的には粒子は密度1.0〜5.0g/mL（1.1〜2g/mL
が好ましい）を持つ。最適な密度を選ぶことはこの技術
技能の範囲内であり、重力駆動の検定での沈降速度は検
定のスピードと複合体を電極表面上に一様な層に作り上
げたい要望との間で妥協することになる。
広範囲の平均直径を持った粒子も採用される。例えば
0.05〜200μｍのような好ましくは0.01〜10μｍと0.001
〜200μｍ範囲内の平均直径の粒子は使用できる。
検定組成での粒子の広範な濃度も採用される。例え
ば、濃度は１〜10,000μg/mL、好ましくは５〜1000μg/
mLの範囲に限られる。望ましくは粒子密度、そのサイ
ズ、その濃度は粒子が少なくとも0.5mm/分の速度（好ま
しくはもっと早い速度）で沈降するように選ばれる。
この発明を行うろ過様式で、ろ過手段は平均直径で測
ったポアサイズとして粒子の平均直径の大体0.01〜90
％、好ましくは10〜90％、が望ましい。
先行技術はこの発明の検定で使用できる多数の磁性粒
子を述べている。例えば米国特許No.4,628,037、4,695,
392、4,695,393、4,698,302、4,554,088、英国特許出願
GB2,005,019AとEP0,180,384。これらの全てがここに引
用されて組み込まれているが、うまく使用できた多数の
磁性粒子を記述している。粒子は常磁性体か強磁性体で
あり、磁性粒子が免疫検定に使うことができるように結
合化合物がつながる種々の材料で粒子は被覆されてい
る。望ましくはこの発明で使用される磁性粒子は少なく
とも0.001cgs単位の磁化率、好ましくは少なくとも0.01
cgs単位の磁化率を持っている。磁性粒子は広範囲の密
度を持つ。即ち、水の密度より十分小さい0.01〜5g/m
L、好ましくは0.5〜2g/mL。粒子サイズは、例えば0.001
〜200または0.05〜200μｍ、好ましくは0.01〜10μｍの
範囲となる。粒子濃度は大まかに１〜10,000μg/mL、好
ましくは５〜1000μg/mLの範囲となる。
使用する磁性粒子は例えばEP0,180,384で述べたよう
に低い磁気共鳴を持っているのが望ましい。従ってこの
磁性粒子から磁場が取り除かれた後に粒子を消磁して検
定セルから掃き出す。磁性粒子の密度、濃度と粒子サイ
ズは沈降時間が少なくとも0.5mm/分、好ましくはそれ以
上の速度、になるように選ばれる。磁性セルの運転で
は、倍増型光電管の運転に干渉しないために電気化学ル
ミネセンスを誘起する前に電極表面から磁化手段を取り
除くことが望ましい。
検定 この発明の方法を用いて種々の検定が行われる。
或る検定が行われたのを図３に示す。反応で生じたPC
R生成物をビオチンとECL標識（トリス（2,2′ビピリジ
ン）ルテニウム、ルテニウム（bpy）3 2+）で標識付けし
た。ストレプトアビジンのビーズがビオチンとストレプ
トアビジン結合を経て２官能化されたDNAを捕らえた後
それを洗浄した。次に、ビーズに結合した生成物をECL
標識検出の分析にかけた。
或る検定が行われたのを図４に示す。ビオチニル化し
たPCR生成物をストレプトアビジンのビーズ上で捕らえ
ビオチニル化していない要素を取り除いた。ビーズに結
合したPCR生成物を次にECL標識（ルテニウム（bp
y）3 2+）付けしたオリゴヌクレオチドで異種形成した。
これをECL分析して標識を検出した。
或る検定が行われたのを図５に示す。異種形成したも
のをストレプトアビジンのビーズ上で捕らえた。これを
洗浄しないでECL分析した。
或る検定を行いその結果を図６に示す。HPV16と18の
存在検定を、両ウイルス型に陽性の細胞系統SiHaとHeLa
と両ウイルス型に特殊なオリゴヌクレオチドから分離し
たDNA試料を用いて行った。プライマーの2PV16と2PV18
はビオチニル化され、3PV16と3PV18はECL標識付けオリ
ゴヌクレオチドであった。2/3PV16と2/3PV18オリゴヌク
レオチドはHPV16とHPV18にそれぞれ特定のものであっ
た。生じたビーズに捕らえられたECL標識を、図１に記
した分析器を用いてECL分析した。その結果を、各試料
プライマーの組合せに対するECL計数としてプロットし
た。
或る検定を行いその結果を図７に示す。生じたビーズ
に結合したECL標識を図１に記した分析器を用いてECL分
析した。ECLピークのフォトン計数をHPV16DNA濃度の増
加に対してプロットし、全セルラーDNAコピーに対する
ウイルスコピーの比率として表示した。このHPV16の分
析に使用したプライマーは1PV16（ビオチン標識）と2PV
16（ECL標識）であった。各PCRに用いたDNAは子牛胸腺D
NAを用いて一定の１μｇに保持した。
或る検定を行いその結果を図８に示す。標識のないHR
P1とビオチニル化したHRP2（プローブ1T24と1CHRに）お
よび標識のないHRP2とビオチニル化したHRP1（プローブ
2T24と2CHRに）を用いてPCRを行い、ビーズに結合した
単一要素の異種形成用のターゲットを作った。DNA試料
は、正規（胎盤）Ha−ras遺伝子と突然変種（NH3T3−T2
4）Ha−ras遺伝子であった。ECL標識の1T24（1T24）、E
CL標識の2T24（2T24）、ECL標識の1CHR（1CHR）、ECL標
識の2CHR（2CHR）とビーズに結合のDNAの異種形成に続
いてTMAC洗浄した。生成したビーズ結合のECL標識を図
１に記した分析器を用いてECL分析した。結果を各試料
プローブの組合せに対するECL計数としてプロットし
た。
或る検定を行いその結果を図９に示す。標識のないHR
P1とビオチニル化だけしたHRP2を用いて（プローブ1T24
と1CHRに）図８に記したようにPCRが行われた。使用し
たプローブは：標準物としてP32（1T24−Ｐ、1CHR−
Ｐ）含有の1T24と1CHRであった。P32とECL標識の両方を
含有する1T24と1CHRでECL標識の効果を決定する。以前
の様にTEMACで試料を洗浄した。生成したビーズ結合のP
32をシンチレーション計数管内でシンチレーションカク
テルを加えて分析した。その結果を、各試料プローブの
組合せに対するP32計数／秒としてプロットした。
或る検定を行いその結果を図10に示す。検定は図４に
記したように行った。試料は胎盤DNAであり、増幅は標
識のないHRP1（プローブ1T24と1CHRに）とビオチニル化
したHRP2を用いて行った。生成したPCR物を次に異なっ
た量の生成物を含む一連の試料となるように試料作りを
した。これら一連の試料を次にP32で標識付けしたプロ
ーブ（1T24−P32と1CHR−P32）またはECL標識で標識付
けしたプローブ（1T24−ECLと1CHR−ECL）のどちらかと
異種形成した。次にそれぞれの実験結果を、90μＬの試
料に対する各標識からの平均ピーク値を用いて標準化し
た。これらの標準化した数値はバックグランドに対する
シグナルの更に効果的な比較となり、この２つの方法の
比較応答を示す。挿入した数値は希釈曲線の低レベルで
の応答を表している。試料は以前に述べたように取り扱
った（図６と図８）。
或る検定を行いその結果を図11に示す。ビオチニル化
した2PV18と標識のない1PV18を用い、HeLaDNA（セル当
り400コピー）を用い、図３で説明したPCR方式を用いて
PCRを行った。
生成PCR反応物を次に特定のプローブECL標識の3PV18
で異種形成した。異種形成した混合物を次にストレプト
アビジン被覆ビーズに添加して生成したビーズ結合のEC
L標識を図１に記したECL分析器を用いて直接ECL分析を
した。その結果を、PCRに添加したHPV18コピーに対する
ECL計数にプロットした。
次に、制限のない例を説明図で示すがこの発明を制限
するものと見なすべきではなく、この発明の精神または
範囲から外れることなしに、その多くの明らかな変更が
可能である。
例 計装、材料、方法 （１）計装 図１と２に記した３電極を採用した流れ通過の装置を
用いた。
作用電極： 金ディスク、3mm直径 対向電極： 金ディスク、3mm直径 照合電極： 銀／塩化銀 テフロンガスケット（0.15インチ厚さ） プレキシガラスの面板 入口管＝0.042インチ内径ポリプロピレン 吸引速度： 可動、0.01〜5mL/分 ポテンシオスタット： マイクロプロセサーで制御 浜松R374PMT（低利得で赤色に良感度の管）使用のル
ミノメーター;PMT電圧は０〜1400V可動 （２）材料 （ａ）ECL標識： ルテニウム（bpy）3 2+ （ｂ）ECL緩衝液:112mM KH2PO4、88mM;K2HPO4・3H
2O、50μＭ NaCl、6.5mM NaN3、0.8μＭトリトンＸ−
1000、0.4mMツイーン20、100mM;トリプロピルアミン水
溶液 （ｃ）ECL希薄液:37.5mM KH2PO4、109.2mM;K2HPO4・
3H2O、151.7mM NaCl、0.65mM NaN3、0.43mM 牛血清
アルブミン水溶液 （ｄ）ルテニウム（bpy）3 2+NHS:ルテニウム（2,2′
−ビピリジル）２（４−［３−（1,3−ジオキソラン−
２−イル）プロピル］−４′−メチル−2,2′−ビピリ
ジン）2+ （ｅ）Dynal粒子： （ｉ）DynalM−450Dynaビーズ、4.5μｍ直径、超常
磁性粒子、30mg/mL、ニューヨーク州11021、グレートネ
ック、ノースステーションプラザ45、Dynal社から求め
る。
（ii）DynalM−280Dynaビーズ、2.8μｍ直径、超常
磁性粒子、10mg/mL、ニューヨーク州11021、グレートネ
ック、ノースステーションプラザ45、Dynal社から求め
る。
（３）ECL測定サイクル（３電極セル運転） ECL測定サイクルは３段階から成り立つ： （１）予備状態調節、（２）測定、（３）洗浄。
予備状態調節の段階では0.0ボルト〜＋2.2ボルト〜−
1.0ボルト〜＋0.6ボルトの電圧三角波を2.0ボルト／秒
で印加する。測定段階では三角波形を＋0.6ボルトから
＋2.8ボルト、＋2.0ボルトに1.0ボルト／秒で印加す
る。洗浄段階では電圧矩形波を＋0.0ボルトから＋3.0ボ
ルト、−0.5ボルト、0.0ボルトに印加する。全電圧は銀
／塩化銀照合電極に対するものである。
例1.重力による微粒子収集の装置と方法 測定は図12に示すようにセル内で行う。重力を用いて
検定を行うための装置記載の図12を参照のこと。装置の
構成部分には参照数字48で示した透明窓、参照数字222
で示したガスケット、入口22、作用電極56/58、対向電
極72/74、出口24を含めたブロック20がある。セルブロ
ックの面は水平で、即ち地球の重力場の方向に垂直であ
る。ECL緩衝液中の標識付き微粒子（Dynal）は、ぜん動
ポンプの手段でセルに引かれる。粒子がセルに到達した
後にポンプを停止する。セル室内の微粒子は作用電極の
表面上に沈降する。微粒子の沈降速度は図13に示すよう
に10mmの距離にわたって大体一定の0.5mm/分に決められ
る。沈降粒子の数は時間と沈降速度の関数である。ECL
強度は作用電極上に沈降する微粒数に比例する。その表
面に到達する粒子数、従ってECL強度は、作用電極上の
流体試料の高さによって制限される。図14は、それぞれ
0.015と0.075インチの異なるガスケット厚さの２つのセ
ルにつての沈積時間の関数としてECL強度を示す。セル
は両方とも同様な微粒子の沈積速度を持つが厚いガスケ
ットのセルは５倍は大きい最大の読みを示す。AFP（ア
ルファ胎児タンパク質）検定の結果を２つのセルで比較
して図15に示す。またもや厚いガスケットのセルでは５
倍のECLシグナル強度が生じる。
例2.微粒子沈積のECL装置と方法 沈積セルを用いた磁気収集。
微粒子を沈降させるのに磁力を用いて検定を行うため
のセルを図16に示す。参照番号48は透明窓、参照番号12
2はガスケット、参照番号22はセルブロックの入口、参
照番号56/58は作用電極、参照番号24は試料出口、参照
番号20はセルブロック自体、参照番号27は電磁石を言
う。
セルブロックの面は水平を向いている。ECL緩衝液中
の標識付きの微粒子（Dynal）をぜん動ポンプでセルま
で引き上げる。微粒子がセルに到達したらポンプを停止
する。セル室内の微粒子は、12ボルト、1.5アンペヤー
で操作した電磁石27を用いて生じた磁場の手段で作用電
極まで引き上げる。電磁石の応用によって微粒子の沈積
速度は、単に重力によって微粒子を沈降させる場合に観
察されるものより大きく増加している。それを図17に示
す。
例3.微粒子を沈積するECL装置と方法 収集セルを用いた磁気収集 図18に示すようにセル内で検定が行われる。図18を参
照すると、参照番号48は透明窓、参照番号132はガスケ
ット、参照番号22はセルブロックの入口、参照番号56/5
8は作用電極、参照番号20はセルブロック自体、参照番
号24は試料出口、参照番号37は永久磁石を言う。
セルブロックの面は水平に向けられる。ECL緩衝液中
の標識付きの微粒子（Dynal）をぜん動ポンプで電気化
学セルまで引き上げる。試料を入れる前に、永久磁石37
を作用電極／溶液界面のすぐ下の0.035インチの距離に
置く。試料がセルに引き上げられたら微粒子が作用電極
上の磁石の区域で決められた区域に沈積する。全試料が
沈積した後ポンプを停止し磁石を取り除く。収集時間が
長くなるほど多くの粒子が沈積する。図19に示すように
作用電極上の粒子濃度が増加するとECL強度が増す。
例4.微粒子沈積のための磁石の使用 磁場の向き 磁石27/37が永久磁石であれ電磁石であれ、それに引
かれた微粒子96、96′は図20のように磁場98、98′の向
きに並ぶ。ここに図は磁場98と98′、生成した粒子配置
96と96′が作用電極56/58の面の近くでそれに平行
（Ａ）と垂直（Ｂ）していることを描いている。
例5.ろ過による粒子の収集と濃縮 磁気感応性、非磁気感応性、また広範囲にわたる密度
の微粒子はろ過によって薄膜フィルターの面上に具合よ
く集められる。この発明の或る実施例では、孔サイズが
粒子直径より小さい、好ましくは実質的に粒子直径より
小さく十分大きな表面密度で粒子が集まっても孔が詰ま
らないようなフィルター膜部分を通して粒子をポンプで
引く。フィルターは具合いよく大体透明なので、粒子か
らECLを誘起し粒子のECL標識量を測定するためにルミネ
センスを測る目的で粒子収集後のフィルターを作用電極
の表面上に置くことができる。
別な実施例では、上記の孔サイズの膜フィルターを吸
収剤の表面に付着させるかその上に置いて毛細管または
「ウイッキング」が微粒子を含有する流体を膜フィルタ
ーを通して自発的に引っ張るようにすると、フィルター
を通過する流体の流れを引き起こす装置は必要がない。
好適な実施例では、上記のような孔サイズを持った膜
フィルターは薄い金属フィルムまたはその他の電導性材
料で被覆されているので、その膜面はECL装置の作用電
極として使用できる。マイクロエレクトロニック機器の
製作で普通使われている方法、例えば熱蒸着またはスパ
ッタリングによって、電導性フィルムは容易に膜面に付
けられる。その様なフィルター電極は容易にフローセル
に装備できるので流体の流路はフィルター電極を通るこ
とになる。流れの中の粒子はフィルター電極で捕まえら
れ、不均一検定を行うための迅速で簡単な手段を準備す
れば外部の洗浄装置なしでもその場で容易に洗浄でき
る。
例6.遠心法による粒子の収集と濃縮 図21に示す回転フローセルは、ルミネセンス測定のた
めの作用電極表面で複合体を捕まえる別な方法を提供す
る。検定溶液は入口261を経てその装置に入り、それは
矢印Ｒで示したような回転運動をセルに与えながら回転
シール263を通してセル262にポンプで引かれる。複合体
の濃い粒子が作用電極264の表面に濃縮される。セルが
まだ回転している間に、溶液は出口268を経てセルから
出る。セルの窓267を通過する光出力は増倍型光電管265
で測定される。光出力は、垂直な作用電極264から出て
セル中央に置かれた曲面鏡266で反射するように向けら
れる；対向電極269も示す。セルはそこで次のサイクル
のためにフラッシュ洗浄される。これはセルが停止して
も回転していても行える。そこで図21は粒子を捕まえる
ためのこの発明の遠心法と装置、ならびにこの発明の遠
心フローセルを示す。
例7.中程度の表面濃度に標識を付けた不特定タンパク質
での粒子被覆 30mg（1mL）の4.5μｍ径の非被覆の磁気感応性ポリス
チレンＭ−450DYNABEADS（Dynal社、ノルウェー、オス
ロ）を150mMの燐酸塩緩衝pH7.5溶液での磁気分離により
2mL/洗浄の割合で洗浄した。1mLの燐酸塩緩衝塩水（PB
S）と0.05％のシメラゾル中に150μｇのルテニウム（bp
y）3 2+標識の付いたマウスIgG（ジャクソン免疫化学会
社）を含む溶液を粒子に添加した。この混合物は一晩室
温で回転しながら定温放置した。次にその溶液を粒子か
ら磁気的に分離し取り除いた。未反応箇所を塞ぐために
1mLの３％BSA/PBSと0.05％のアジ化ナトリウムを粒子に
加えて、生成した溶液を２時間室温で放置した。粒子を
５回（2mL/洗浄の割合）洗浄し、次に最後であるが保管
するため6mLの同じ緩衝液で再び懸濁した。
例8.磁気感応性粒子を用いた電気化学ルミネセント（EC
L）測定 均一と不均一、高分子量と非高分子量、磁気感応性粒
子（Dynal社、ノルウェー、オスロ；ポリサイアンス
社、ワーリントン、ペンシルバニア州18976;コルテック
スバイオ化学社、サンレアンドロ、カルフォルニヤ州94
577;アルドリッチ社、ミルウオーキー、ビスコンシン州
53201）を、例７で述べたように標識付きタンパク質で
被覆した。被覆した粒子を2mLの300μg/mL懸濁液を作る
前にECL緩衝液で３回洗浄した。ぜん動ポンプを使っ
て、500μＬの粒子懸濁液をフローセルに吸引した（例
３）。粒子は作用電極に流れて、磁石で作用電極の表面
上に引っ張られ濃縮された。粒子が濃縮された作用電極
の面上にあるフローセルの上の中央に置かれている浜松
R374増倍型光電管を使って磁性粒子の電気化学ルミネセ
ンスを測定した。標識の付いたタンパク質で被覆した磁
気感応性粒子から得られたECL光放出レベルを表Ｉに示
す。
例9.非磁性粒子を用いた電気化学ルミネセンス（ECL）
の測定 均一と不均一、高分子量と非高分子量、非磁気感応性
粒子（アルドリッチ社、ミルウオーキー、ビスコンシン
州53201;デューク科学社、パロアルト、カルフォルニヤ
州94303）を、例７で述べたように標識付きタンパク質
で被覆した。被覆した粒子を2mLの300μg/mL懸濁液を作
る前にECL緩衝液で３回洗浄した。ぜん動ポンプを使っ
て、500μＬの粒子懸濁液をフローセルに吸引した。次
に被覆した粒子を例１に述べた重力の手段で作用電極上
に濃縮した。粒子が濃縮された作用電極の面上にあるフ
ローセルの上の中央に置かれている浜松R374増倍型光電
管で非磁性粒子の電気化学ルミネセンスを測定した。被
覆した非磁性粒子から得られたECL光放出レベルを表II
に示す。
例10.物理吸着した羊の抗甲状腺刺激ホルモン（TSH）を
被覆したDynal粒子の調製（試薬Ｉ） 1mLの4.5μｍの被覆のない磁性ポリスチレン粒子で表
面にヒドロキシル基の残査があるもの（DYNAL、DYNABEA
DS Ｍ−450、Dynal社、ノルウェー、オスロ）を150mL
の炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムpH9.6溶液を使っ
て2mL/洗浄の割合で磁気分離で洗浄した。0.5mLの親和
性の純化羊抗TSH、HCG除去の抗体（CIBA）を1mLの炭酸
ナトリウム／重炭酸ナトリウム溶液に溶かした溶液を粒
子に添加した。この混合物を一晩撹はんしながら室温で
定温放置した。次のその溶液を粒子から磁気分離して取
り除いた。1mLの３％BSA/PBSw/0.05％のアジ化ナトリウ
ムを加え未反応箇所を防ぐために撹はんしながら室温で
２時間定温放置した。粒子を５回（2mL/洗浄の割合）洗
浄してから最後に保管するために1mLの同じ緩衝液に再
び懸濁した。ビーズ試薬Ｉの最終濃度は３重量％であっ
た。
例11.ウアベイン−BSA共役物の調製（試薬II）ウアベイ
ンの活性化： 60.4mgのウアベインオクタヒドレート（アルドリッチ
社、カタログ番号14,193−３）を6mLの脱イオン（di）
水（箔包装）に入れ87mgのメタ過よう素酸ソーダ（モー
ルインクロッド社、カタログ番号113 ９）と混合しそ
の混合物を回転しながら室温で２時間定温放置した。反
応物をドウエックス1X8−50イオン交換樹脂（アルドリ
ッチ社、カタログ番号21,740−９）と脱イオン水の中を
通して反応を止めた。200μＬの1M燐酸ソーダpH7.2を加
えて溶液のpHを7.0に調節した。
活性化したウアベインと牛血清アルブミン（BSA）の共
役物： 50mgの活性化したウアベイン（4.6mL）を次に5mL0.15
MのPBSpH7.8中に108mg含まれた牛血清アルブミン（BS
A）に滴下して添加する（マイルスフラクションＶ）。
これは40:1（ウアベイン:BSA）の比率となる。この反応
物を混ぜながら室温で２時間定温放置した後30mgのシア
ノボロハイドライドソーダを撹はんしながら急激に添加
した。遊離したウアベインと過剰のシアノボロハイドラ
イドソーダを0.15MPBSw/0.05％アゾ化ソーダpH7.8中で
４℃で透析して取り除いた。このウアベイン−BSAの共
役試薬IIを４℃で保管した。
例12.物理吸着したウアベイン−BSA被覆のDynal粒子の
調製（試薬III） 5mgの4.5μｍの被覆のない磁性ポリスチレン粒子で表
面にヒドロキシル基の残査があるもの（DYNAL、DYNABEA
DS Ｍ−450、Dynal社、ノルウェー、オスロ）を150mL
の炭酸ナトリウ／重炭酸ナトリウムpH9.6溶液を使って1
0mL/洗浄の割合で磁気分離で洗浄した。3mgのウアベイ
ン−BSA共役物（共役試験II）を5mLの炭酸／重炭酸塩溶
液に溶かしたものを粒子に添加した。この混合物を一晩
回転しながら室温で定温放置した。次にその溶液を粒子
から磁気分離し取り除いた。5mLの３％BSA/PBSw/0.05％
のアジ化ナトリウムを加え未反応箇所を防ぐため回転し
ながら室温で２時間定温放置した。粒子を５回（10ml/
洗浄の割合）洗浄してから最後に保管するために1mLの
同じ緩衝液に再び懸濁した。ビーズ試薬IIIの最終濃度
は３重量％であった。
例13.ルテニウム（bpy）3 2+標識の付いたマウス抗ジゴ
キシンの調製（試薬IV） 1mgのマウス抗ジゴキシン（ケンブリッジ医学技術
社、カタログ番号200−14、ロットA3575）にルテニウム
（bpy）3 2+で標識を付けた。単クローン抗体（MAb）抗
ジゴキシン抗体をセントリコン30のミクロ濃縮器（アミ
コン社）を使って0.15M燐酸カリ緩衝液と交換して最終
の容積0.5mLの0.15M塩化ナトリウムpH溶液とした。使用
直前に、0.5mgのルテニウム（bpy）3 2+NHSを125μＬの
無水ジメチルスルホキシド（アルドリッチ社）で溶解し
た。ルテニウム（bpy）3 2+:分子量がそれぞれ1057と15
0,000のタンパク質のモル比が25:1になるように、0.15m
gのルテニウム（bpy）3 2+−NHS（45μＬ）を振とうしな
がらタンパク質に加えた。反応管を室温の暗所で30分振
とうしながら定温放置した。25μＬの1Mグリシンを添加
して反応を止め、10分間定温放置した。反応混合物をセ
パデックスＧ−25カラム（1X20cm、0.15M燐酸カリ、0.1
5M塩化ナトリウムを0.05％アジ化ナトリウムpH7.5溶液
に）を通して精製した。ルテニウム（bpy）３＋＋標識
を付けたマウス抗ジゴキシン部分を集めて貯めた。標識
の付いたタンパク質（試薬IV）は、タンパク質の分子当
り12標識を持つことが測定された。
例14.ルテニウム（bpy）3 2+標識付きマウス抗甲状腺刺
激ホルモン（TSH）の調製（試薬Ｖ） 0.5mgのマウス抗TSH（CIBA）をルテニウム（bpy）3 2+
で標識を付けた。MAb抗TSH抗体をセントリコン30マイク
ロ濃縮器（アミコン社）を使って0.15M燐酸カリ緩衝液
に交換して最終容積が0.35mLの0.15M塩化ソーダpH7.8溶
液にした。使用直前に、0.5mgのルテニウム（bpy）3 2+N
HSを75μＬの無水ジメチルスルホキシド（アルドリッチ
社）で溶解した。ルテニウム（bpy）3 2+:分子量がそれ
ぞれ1057と150,000のタンパク質のモル比が50:1になる
ように、0.176mgのルテニウム（bpy）3 2+−NHS（26.4μ
Ｌ）を振とうしながらタンパク質に加えた。反応管を室
温の暗所で30分振とうしながら定温放置した。25μＬの
1Mグリシンを添加して反応を止め、10分間定温放置し
た。反応混合物をセパデックスＧ−25カラム（1x20cm、
0.15M燐酸カリ、0.15M塩化ナトリウムを0.05％アジ化ナ
トリウムpH7.2溶液に）を通して精製した。ルテニウム
（bpy）3 2+標識を付けたマウス抗TSH部分を集めて貯め
た。標識の付いたタンパク質（試薬Ｖ）は、タンパク質
の分子当り14標識を持つことが測定された。
例15.甲状腺刺激ホルモン（TSH）を１段階で分離するサ
ンドイッチ検定 100μＬの血清試験検定液（ロンドン診断用TSHルミTA
Gキット）、ECL緩衝液中の25μＬのルテニウム（bpy）3
2+標識を付けたマウス抗TSH（試薬Ｖ）、ECL緩衝液中の
25μＬ羊抗TSH−Dynal粒子（試薬Ｉ）を組合せポリプロ
ピレン管中で15分間室温で混ぜながら定温放置した。次
に粒子を磁気分離で洗浄してから500μＬのECL緩衝液に
懸濁した。この洗浄操作を２回追加して繰り返した。最
後に、粒子を1mLのECL緩衝液に再度懸濁した。各試料の
電気化学ルミネセンス（ECL）を例３に述べたように読
み取った。ECL計数は、試料中に存在する検体濃度に正
比例する（検体濃度が増すと計数が増加する）。表III
に代表的な検定値を示す。
例16.甲状腺刺激ホルモン（TSH）の１段階非分離サンド
イッチ検定 100μＬの血清試験検定液（ロンドン診断用TSHルミTA
Gキット）、ECL緩衝液中の25μＬのルテニウム（bpy）3
2+標識を付けたマウス抗TSH（試薬Ｖ）、ECL緩衝液中の
25μＬ羊抗TSH−Dynal粒子（試薬Ｉ）を組合せポリプロ
ピレン管中で15分間室温で混ぜながら定温放置した。次
に粒子を磁気分離で洗浄してから500μＬのECL緩衝液に
懸濁した。結果を読み取る前に、1mLのECL緩衝液を加え
た。各試料の電気化学ルミネセンス（ECL）は例３に述
べたように読み取った。ECL計数は、試料中に存在する
検体濃度に正比例する（検体濃度が増すと計数が増加す
る）。表IVに代表的な検定値を示す。
例17.ジゴキシンの２段階分離競合検定 50μＬの血清試験検定液（TDx検定、アボット研究
所、イリノイ州、シカゴ）とECL緩衝液中の25μＬのル
テニウム（bpy）3 2+標識を付けたマウス抗ジゴキシン
（試薬IV）を組合せてポリプロピレン管中で20分間室温
で混ぜながら定温放置した。ECL緩衝液中の25μＬのウ
アベイン−BSA−Dynal粒子（試薬III）を加え混ぜなが
ら更に20分室温で定温放置した。次に、粒子を磁気分離
で洗浄してから500μＬのECL緩衝液に再び懸濁した。こ
の洗浄は２回追加して繰り返した。
最後に、粒子を1mLのECL緩衝液に再懸濁した。各試料
の電気化学ルミネセンス（ECL）は例３に述べたように
読み取った。ECL計数は、試料中に存在する検体濃度に
反比例する（検体濃度が増すと計数が減る）。表Ｖに代
表的な検定値を示す。
例18.ジゴキシンの２段階非分離競合検定 50μＬの血清試験検定液（TDx検定、アボット研究
所、イリノイ州、シカゴ）とECL緩衝液中の25μＬのル
テニウム（bpy）3 2+標識を付けたマウス抗ジゴキシン
（試薬IV）を組合せて20分間室温で混ぜながら定温放置
した。ECL緩衝液中の25μＬのウアベイン−BSA−Dynal
粒子（試薬III）を加え混ぜながら更に20分室温で定温
放置した。読み取る前に、粒子を1mLのECL緩衝液に再懸
濁した。各試料の電気化学ルミネセンス（ECL）は例３
に述べたように読み取った。ECL計数は、試料中に存在
する検体濃度に反比例する（検体濃度が増すと計数が減
少する）。表VIに代表的な検定値を示す。
例19.電極上に最終反応試料を追加洗浄しサイクル毎に
読み取る方式のジゴキシンの２段階非分離競合検定 50μＬの血清試験検定液（TDx検定、アボット研究
所、イリノイ州、シカゴ）とECL緩衝液中の25μＬのル
テニウム（bpy）3 2+標識を付けたマウス抗ジゴキシン
（試薬IV）を組合せ20分間室温で混ぜながら定温放置し
た。ECL緩衝液中の25μＬのウアベイン−BSA−Dynal粒
子（試薬III）を加え混ぜながら更に20分室温で定温放
置した。読み取る前に、粒子を1mLのECL緩衝液に再懸濁
した。各試料の電気化学ルミネセンス（ECL）を例３に
述べたように読み取った。ECL計数は、試料中に存在す
る検体濃度に反比例する（検体濃度が増すと計数が減少
する）。表VIIに代表的な検定値を示す。
例20.オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドはβシアノエチルフォスフォルア
ミダイト（１）を用いて応用バイオシステム自動オリゴ
ヌクレオチド合成器で作る。５′末端のオリゴヌクレオ
チドアミノ変性は最後のカプリング段階で起こり、３′
末端には変性した固相（制御ポアガラス）を用いる。ク
ローン技術社（カリフォルニヤ州、サンディエゴ）がア
ミノ変性剤を供給している。その結果生じた５′変性オ
リゴヌクレオチドは総て６炭素間隔の腕が指定のアミノ
基に付いている（C6、NH2）。３′変性オリゴヌクレオ
チドは総て３炭素間隔の腕がアミノ基に付いている。構
成されたオリゴヌクレオチド、その変性と利用を下記す
る。
HPV研究のためのオリゴヌクレオチドは前記のようにE
6の領域に向けらた（２）。
オイゴヌクレオチドの順列は次のようであった： これらのオリゴヌクレオチドは、種々の断片のPCR発
生を可能にしている:3PV16または3PV18がそれぞれ2PV16
または2PV18と62bp断片を形成;1PV16が2PV16と100bp断
片を形成;1PV18が2PV18と103bp断片を形成。また3PV16
と3PV18のオリゴヌクレオチドは1PV16と2PV16および1PV
18と2PV18のPCR反応から生成物を異種形成するプロー
ブ、更にPCR内でオリゴヌクレオチド2PV16と2PV18によ
って作った要素（ストランド）を異種形成するプローブ
として使用できることが評価される。Ha−ras点突然変
異検定のためのオリゴヌクレオチドは次のようであっ
た： これらの２つのオリゴヌクレオチドプライマー80bp断
片の合成を目指している。この点突然変異研究のための
プローブ順列は次のようであった： これらの順列とは別に、我々は上記の1CHRと2T24順列
を５′アミノ変性でなく３′アミノ基で合成した。これ
らの３′アミノ変性オリゴヌクレオチドはECL標識で標
識を付けられ異種形成に用いられた。突然変異／不整合
の箇所は肉太のヌクレオチドで表示する。プローブ1T24
と1CHRは、PCR内でオリゴヌクレオチドHRP2によって作
られた要素と異種形成する。プローブの2T24と1CHRをPC
R内でオリゴヌクレオチドHRP1で作られた要素（ストラ
ンド）に異種形成する。粒子に結合するオリゴヌクレオ
チドJK8とJK8Cは： これらの２つの順列はエクオリン順列から導かれ、それ
は互いに補足し合っている。
このオリゴヌクレオチドは、順列内のアミノ変性を可
能にするクローン技術社（カルフォルニヤ州サンディエ
ゴ）のアミノ変性剤を用いてアミノ変性した。JK7はル
テニウム（bpy）3 2+標識を用いて標識付けをした。試験
管内での転写により作られたエクオリンRNAのオリゴヌ
クレオチドプローブ： このオリゴをビオチンとルテニウム（bpy）3 2+標識の両
方で標識付けした。大腸菌DNAの検出のために、我々は
ゲノムのTrpE/D領域に特有なオリゴヌクレオチド（３）
を次のように合成した： この順列はルテニウム（bpy）3 2+標識で標識付けした。
は下記のようにビオチンで標識付けした。
例21.オリゴヌクレオチドの標識付け 合成オリゴヌクレオチドは総て、バイオゲルP6（バイ
オ研究所）カラム上のゲルろ過によって不純物のアミノ
基を除去するために精製した。NHS−ビオチン（クロー
ン技術社、カルフォルニヤ州サンディエゴ）を用いてビ
オチンがPCRプライマーの５′アミノ基を経て導入した
（４）。変性オリゴヌクレオチドのアミノ基を経てルテ
ニウム（bpy）3 2+−NHSが次のように導入した。100μＬ
のPBS（pH7.4）中のオリゴヌクレオチド（0.1μモル）
をDMSOに溶解した５μモルのルテニウム（bpy）3 2+標識
と一晩暗所で室温で反応した。オリゴヌクレオチドはこ
れらの標識付けの反応からエタノール沈澱法で回収され
た。最近の研究は、0.5μモルのルテニウム（bpy）3 2+
標識を用いて効果的に標識付けすることができることを
実証している（データは示されない）。
標識を付けたオリゴヌクレオチドを、Ａ）100mMの酢
酸テトラエチルアンモニウムpH7.0と7B）50％のＡ）と5
0％のアセトニトリルの移動相がある逆相VydacC−18セ
ミプレプカラム上でＢの20％から40％の勾配を作ってHP
LCにより更に精製した。
プローブ1CHRと1T24もまた、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用い確立された方法を用いて比活性が77,000cpm/
ngのプローブを作ってP32で標識を付けた（５）。
例22.核酸磁性粒子の調製 DynalM450粒子を標準手順を用いて２フルオロ−１−
メチルピリジニウムトルエン４スルフォネートで活性化
した（６）。この活性化した粒子を次に、オリゴヌクレ
オチドJK8とJK8Cで反応した。100mgの活性Dynal粒子に6
50μＬの0.1M重炭酸ナトリウム中に33nモルのオリゴヌ
クレオチドのある溶液を添加した後、混ぜながら３時間
定温放置した。粒子はエタノールアミン（4mL,0.1M）を
添加して遮断した。結合した粒子は0.5mg/mLの単一要素
の鮭精液DNAのECL緩衝液と混ぜて４〜５回ECL緩衝液に
洗い込み、100μg/mLの単一要素の鮭精液DNAを含んだ10
mg/mLのECL緩衝液で再懸濁した。
例23. DynalM450粒子を標準手順を用いて２−フルオロ−１
−メチルピリジニウムトルエン４スルフォネートで活性
化した（６）。この活性粒子を次にストレプトアビジン
（シグマ社）で反応した。活性粒子（50mg）を0.1Mの重
炭酸ナトリウムで洗浄後、ストレプトアビジン（1.5m
g）を添加して一晩反応した。粒子はエタノールアミン
（4mL,0.1M）を添加して遮断した。結合した粒子は0.5m
g/mLの単一要素の鮭精液DNAのECL緩衝液と混ぜて４〜５
回ECL緩衝液に洗い込み、100μg/mLの単一要素の鮭精液
DNAを含んだ10mg/mLのECL緩衝液で再懸濁した。DynalM
−280からのストレプトアビジン粒子も価値あることを
示したが、目下の検定次第では低いシグナルしか出さな
い。免疫検定に適用するために、不動態被覆に用いた緩
衝液を使って抗原または抗体と結合した後に粒子をBSA
で遮断した。
例24.ストレプトアビジン磁性粒子の調製II 15mgのBSA（２〜3mLのPBS中）に、50mg/mLのビオチン
−ｘ−NHS（クローン技術社、カルフォルニヤ州サンデ
ィエゴ、5002−１）含有の105μＬのジメチルスルフォ
キシドを添加した後、混合し室温で30分間定温放置し
た。30μｌの1Mリシンを添加して反応を停止し室温で10
分間定温放置した。反応混合物をゲルろ過クロマトグラ
フ法（バイオラド社、バイゲルP6）で精製した。この10
mLの0.2M炭酸／重炭酸ソーダ緩衝剤pH9.6（炭酸塩／重
炭酸塩）緩衝液中のビオチン−BSAを、300mgの炭酸塩／
重炭酸塩で洗浄したDynabead（Dynal14002）に添加し
た。この混合物を渦巻き撹はんをしてから混ぜながら一
晩室温で定温放置した。この粒子を磁気分離した後、10
mLのECL希釈液と100μＬのtRNA（10mg/mL）を添加し
た。この混合物を３〜４時間室温で混ぜながら定温放置
した。この粒子を１回10mLのECL希釈液で洗浄し10mLのE
CL希釈液と100μＬのtRNA（10mg/mL）に再懸濁した。こ
の混合物を混ぜ２〜６℃で一晩定温放置して粒子上のタ
ンパク質を安定化した。粒子は磁気分離し15mgのストレ
プトアビジン（スクリップス社、S1214）含有の10mLのP
BSに懸濁した後、１時間混合した。粒子を10mL ECL希釈
液で洗浄毎に５分間撹はんしながら４回洗浄した。粒子
を最後に29.7mLのECL希釈液と300μＬのtRNA（10mg/m
L）中で再懸濁し最終の濃度を10mg/mLの粒子と100μg/m
LのtRNAとした。
例25.ECL・DNAプローブと異種形成によって粒子上に固
定したDNAの検出 粒子を異種形成した後のECL検出能力が、ルテニウム
（bpy）3 2+標識のオリゴヌクレオチドJK7とJK8とJK8C
（例22）に結合した粒子の異種形成によって実証され
た。ECL緩衝液中のそれぞれのロットの粒子（300μｇ）
を50μＬの12.5、6.3、3.01、1.5fモルの標識付きのJK7
含有の50μL ECL緩衝液と混合した。これらの混合物を
４時間52℃で異種形成した後、1mLのECL緩衝液で洗浄し
830μＬのECL緩衝液に再懸濁した。これらの試料を例１
に記したように分析した。プローブJK7はJK8順列と補足
し合うがJK8C順列とは補足し合わない。
表VIIIに示す結果は、ECLによって粒子表面上に直接
固定された特定順列の存在を特別な異種形成により検出
できることを実証している。
例26.ビーズ結合のECLに基づくRNA検定 DynalM450粒子を、標準手順に従ってRNA/DNA抗体特定
の抗体（７）で被覆した（例10）。我々のクローン化し
たエクオリン遺伝子から導いたプラスミドを用いて特定
のRNA種を作成した（８）。簡単には、プラスミドpA5′
は大腸菌（EcoR I）で切断し、精製し、T3RNAポリメラ
ーゼを用いて現場転写を受けT3−RIRNA（負のRNA）を生
じた。また、プラスミドpA5′はBamH Iで切断し、精製
し、T7RNAポリメラーゼを用いてインビトロ転写を受けT
7−BamRNA（正のRNA）を生じた。これらの２つのRNA種
は従って２つの補足的なRNA種を表している。これらのR
NA種は同量のフェノール：クロロフォルム（50:50）で
抽出して精製した後、クロロフォルム抽出して2.5容積
のエタノールを用いて上澄液を沈澱した。RNAの量は、
ゲル電気泳動と分光分析を用いて測定した。これらの方
法は確立されていてそれらの技術技能は周知されている
（９）。確立された方法を用い25:1モル過剰のルテニウ
ム（bpy）3 2+標識をストレプトアビジン上に用いて、ス
トレプトアビジンにルテニウム（bpy）3 2+標識を付けた
（例13）。この標識付きのストレプトアビジンを、確立
された方法にしたがってイミノビオチンカラムを用いて
精製した（10）。このストレプトアビジンは、ストレプ
トアビジンテトラマー当り10個のルテニウム（bpy）3 2+
標識を含むと見積られた。この標識付きのストレプトア
ビジンは次に、ビオチニル化T35と複合したが、これは
オリゴヌクレオチド：標識付きストレプトアビジン（1:
1）の混合を用いて達成した。特に、20pモルのそれぞれ
のものを最終容積が15μＬのECL緩衝液に混合し、一晩
４℃で定温放置して標識付きストレプトアビジン−オリ
ゴヌクレオチド（SA−T35）複合体を形成した。正と負
のRNA試料（10ng）は異種形成して２μＬのSA−T35複合
体（１段階検定）または25ngのビオチニル化T35（２段
階検定）となった。試料を50μＬに調合し３時間50℃で
異種形成した後、20μＬのPBS（0.1％BSA）中に200μｇ
の抗DNA/RNA抗体で被覆の粒子を添加した。この混合物
を室温で１時間混合した後、ECL緩衝液で２回洗浄し
た。SA−T35複合体と異種形成の試料を530μＬのECL緩
衝液中に再懸濁し例１に記したように分析した。
ビオチニル化T35のみとの異種形成からの試料を50pモ
ルの標識付きのストレプトアビジンと１時間撹はんしな
がら定温放置し、その後ECL緩衝液で２回洗浄した。異
種形成からの試料を530μＬのECL緩衝液に再懸濁し例１
に記したように分析した。その結果を表IXに表わした。
例27.ポリメラーゼの連鎖反応 ポリメラーゼの連鎖反応は大体記述したように行われ
た（11,12,13）。特記しない限り100μＬの反応が代表
的である。PCRは、5pモルのビオチニル化オリゴヌクレ
オチドと50pモルのルテニウム（bpy）3 2+標識付きオリ
ゴヌクレオチドを用いてルテニウム（bpy）3 2+標識の組
み込みを目指す非対称の様式で行われた。我々はHa−ra
s点突然変異の検定を同じ条件下、但しルテニウム（bp
y）3 2+標識付きオリゴヌクレオチドなしで行った。ま
た、我々は非対称、非分離、但し10倍過剰のビオチニル
化オリゴヌクレオチド（典型的には40pモル）を使ったH
PV検定を行った。熱的サイクル条件は次のようであっ
た：直接組み込みのHPV18と16検定の場合には、その輪
郭は93℃で１秒、50℃で１秒、60℃で２分;Ha−rasの点
突然変異検定の場合には、93℃で１秒、69℃で２分；非
分離HPV検定の場合には、93℃で10秒、50℃で30秒、60
℃で２分。これらのPCR運転のサイクル数は、検定と要
求される感度に依存して30〜40回であった。
例28.DNA−プローブ検定方式I.酵素的組み込みによるヒ
ト乳頭腫ウイルスPCR生成物の検出と定量 ルテニウム（bpy）3 2+標識のオリゴヌクレオチドの直
接組み込みを用いたPCRに従って、全反応混合物（90〜1
0μＬ）を600μｇのストレプトアビジン結合の磁性粒子
Ｉに添加した後、20分間室温で振とうしながら定温放置
した。これらの試料中の固相は磁気ラックを用いて分離
し、２回ECL緩衝液で洗浄し、530μＬのECL緩衝液で再
懸濁し次に例１で述べたように電気化学ルミネセンスを
分析した。図３はこの検定方式を説明する。この検定方
式の結果をヒト乳頭腫ウイルス試料で説明した（2,1
4）。ルテニウム（bpy）3 2+標識のオリゴヌクレオチド
をビオチニル化PCR生成物に直接組み込む特異性の研究
は、密接に関係するウイルス型HPV16とHPV18を利用し
た。HPV16と18の存在の検定は、両ウイルス型に正のDNA
試料と両ウイルス型に負のオリゴヌクレオチドを用いて
行った。そのプライマーは次のように、2PV16と2PV18は
ビオチニル化であり3PV16と3PV18はルテニウム（bpy）3
2+標識のオリゴヌクレオチドであった。2/3PV16と2/3PV
18オリゴヌクレオチドは、それぞれHPV16と18に特定さ
れた。生成のビーズに捕らえられたルテニウム（bpy）3
2+標識を、例１に記したようにECL分析した。その結果
は各試料プライマー組合せでのECL計数としてプロット
した（図６参照）。
我々の検定方式の定量的特性を実証するために、HPV1
6PCR生成物に直接組み込んだルテニウム（bpy）3 2+標識
とビオチニル化オリゴヌクレオチドの標準曲線を作成し
た。生成したビーズ結合のルテニウム（bpy）3 2+標識を
例１に記したようにECL分析した。ECLフォトン計数は、
増加するHPV16DNA濃度に対してプロットし、ウイルスコ
ピー：全セルラーDNAコピー比率として表した。このHPV
16分析に用いたプライマーは、1PV16（ビオチン標識）
と2PV16（ルテニウム（bpy）3 2+標識）であった。各PCR
に用いたDNAは、子牛胸腺DNAを用いて一定の１μｇに保
持した。この標準曲線の結果を図７に示す。この方式の
特異性と定量の結果は、これらECL標識が簡単で迅速なD
NAに基づく検定を形成する能力のあることを実証してい
る。また、この標識が酵素化プロセスでは干渉しないで
酵素反応で容易に干渉することを実証している。
例29.DNA−プローブ検定方式II.ヒトHa−ras腫瘍遺伝子
PCR増幅生成物の点突然変異の検出と決定 我々はオリゴHRP1とHRP2をつかってHa−ras遺伝子のP
CR反応を行った。標識のないHRP2とビオチニル化したHR
P1を用いて生じたPCR生成物はルテニウム（bpy）3 2+標
識プローブの2CHRと2T24に異種形成する。反対に、標識
のないHRP1とビオチニル化したHRP2を用いて生じたPCR
生成物はルテニウム（bpy）3 2+標識プローブの1CHRと1T
24に異種形成する。使用のDNAはヒト胎盤（正常）と膀
胱癌腫T24からの突然変異Ha−ras遺伝子で伝染されたマ
ウスNIH3T3セルDNAであった（15）。
検定手順規定は次のようである:90μＬのPCR反応混合
物を600μｇのストレプトアビジン結合の磁性粒子Ｉに
添加した後、室温で30分間定温放置した。これら試料中
の固相を磁気ラックを使って分離し50mMの苛性ソーダで
洗浄し、異種形成緩衝液（0.9M塩化ナトリウム、50mM燐
酸ナトリウム、pH7.7、5mM EDTA、0.1％w/v甲状腺刺激
アルブミン）で洗浄し10μg/mLのルテニウム（bpy）3 2+
標識のオリゴヌクレオチド含有の異種形成緩衝液で再懸
濁した。これらの試料を15分間66℃で異種形成した。
固相を磁気ラックを使って分離し２回0.9M塩化ナトリ
ウム、50mM燐酸ナトリウム、pH7.7、5mM EDTAで洗浄し3
Mのテトラメチルアンモニウム塩化物、50mMのトリス塩
酸、pH8.0、2mMのEDTA、0.025％トリトンＸ−100で室温
で１回、66℃で２回、それぞれ20分間洗浄した。固相を
ECL緩衝液で３回洗浄し530μＬのECL緩衝液に再懸濁し
て例１に述べたように電気化学ルミネセンスを検出し
た。図４はこの検出方式を説明している。
P32標識付きのプローブを使ったHa−rasPCR生成物の
検定は、固相を最後に250μＬのECL緩衝液に再懸濁する
以外はルテニウム（bpy）3 2+標識使用のものと同様であ
った。これらの懸濁試料を次に、5mLのシンチレーショ
ン流体に移しベクマンLS−100Cの液体シンチレーション
計数管上で計数した。
図８にHa−ras腫瘍遺伝子の点突然変異検定から得た
我々のデータを示す。PCRは、標識なしのHRP1とビオチ
ニル化したHRP2を使い（プローブ1T24と1CHRの場合）、
また標識なしのHRP2とビオチニル化したHRP1を使い（プ
ローブ2T24と2CHRの場合）検定を行い、異種形成にはビ
ーズ結合の単一要素の目標を作成した。DNA試料は、正
常（胎盤）Ha−ras遺伝子と突然変異（NIH3T3−T24）Ha
−ras遺伝子であった。ルテニウム（bpy）3 2+標識の1T2
4（1T24）、ルテニウム（bpy）3 2+標識の2T24（2T2
4）、ルテニウム（bpy）3 2+標識の1CHR（1CHR）、ルテ
ニウム（bpy）3 2+標識の2CHR（2CHR）とビーズ結合のDN
Aの異種形成に続いてTEMAC洗浄をした。生成のビーズ結
合のルテニウム（bpy）3 2+標識は例１に記したようにEC
L分析した。結果は各試料プローブの組合せについてのE
CL計数としてプロットした。その結果（図８）は、正常
DNAにうまく異種形成している正常プローブ（CHRプロー
ブ参照）と突然変異遺伝子に異種形成している突然変異
プローブ（T24プローブ参照）では予想通りであった。
これらのプローブが総て等しく行われなかったのは興味
がある。この外見上の異常性を調べるのに、我々はルテ
ニウム（bpy）3 2+標識のあるのとないP32標識付きのプ
ローブを使って更にこれらのプローブを研究した。Ha−
ras腫瘍遺伝子についてP32標識付きのプローブを使った
ルテニウム（bpy）3 2+標識付きのプローブの特異性評価
を次のように実施した。即ちPCRは図８に記すように標
識のないHRP1とビオチニル化したHRP2だけを使って（1T
24と1CHRの場合）行った。使用したプローブは:P32含有
の1T24と1CHR（1T24−Ｐ、1CHR−Ｐ）を標準として;P32
とルテニウム（bpy）3 2+標識の両方を含有する1T24と1C
HRでルテニウム（bpy）3 2+標識の効果を決める。試料を
前と同様にTEMACで洗浄した。生成したビーズ結合のP32
は、シンチレーション計数管内でシンチレーションカク
テルを添加して分析した。その結果は、各試料プローブ
の組合せについてP32計数／秒としてプロットした（図
９参照）。この結果は、P32プローブとルテニウム（bp
y）3 2+標識を付けたプローブは同じように機能しプロー
ブの特異性の問題は使用した特定のプローブ順列による
ことを実証した。
更に、我々が行ったこれらの標識を付けたプローブ間
の比較は、我々のルテニウム（bpy）3 2+標識とP32が同
等であることを実証している。胎盤DNAを使い、標識の
ないHRP1とビオチニル化HRP2を使い（プローブ1T24と1C
HRの場合）前記のようにして増幅を行った。生成のPCR
生成物を次に、異なる量の生成物を含有する一連の試料
を与えるように試料採取した。次に、これら一連の試料
をP32で標識付けしたプローブ（1T24−P32と1CHR−P3
2）またはルテニウム（bpy）3 2+標識を付けたプローブ
（IT24−Ru（bpy）3 2+とICHR−Ru（bpy）3 2+）のどちら
かと異種形成した。次に、各研究の結果を、90μＬの試
料について各標識の平均値を用いて標準化した。これら
の標準化した数字は、バックグラウンドに対するシグナ
ルの効果的な比較となりこの２方法の比較応答となる。
図10に挿入のものは、希釈曲線の低レベルでの応答を示
す。試料は前記したように取り扱った（図８と図９）。
図10の結果は、我々のルテニウム（bpy）3 2+標識を付け
たプローブから良い応答を示す２つの標識の同等性が実
証される。これらの研究は、ルテニウム（bpy）3 2+標識
を付けたプローブが試料DNA中の単一ベース変化を区別
する能力の点でP32標識を付けたプローブと同様に機能
する能力のあることを実証している。この証拠は、ルテ
ニウム（bpy）3 2+標識が異種形成反応で標識を付けたプ
ローブの性質に殆ど影響しないことを示している。
例30.DNAプローブの検定方式III.非分離検定でのヒト乳
頭腫ウイルスPCR生成物の検出と定量 HPV18の非分離検定で、我々は過剰のビオチニル化し
たプライマーと非対称PCR反応を行った。このPCR反応
は、ルテニウム（bpy）3 2+標識のプローブによって直接
異種形成にすぐ利用できる過剰のビオチニル化した単一
要素DNAを作り出す。異種形成のために、我々はHPV遺伝
子に特有な1000ECL計数のルテニウム（bpy）3 2+標識を
付けたオリゴヌクレオチド（約2ng）を添加して15μＬ
のPCRに増幅し、その増幅が完了後に15分間50℃で定温
放置した。この異種形成混合物に600μｇのストレプト
アビジン結合の磁性粒子Ｉ含有の60μＬのECL緩衝液を
添加し撹はんしながら室温で15分間定温放置した。試料
容積はECL緩衝液を加えて530μＬに増加した後、例１に
記したように電気化学ルミネセンスを検出した。図５は
この検出方式を説明している。この非分離検定を実証す
るため、我々はHPV18DNAの標準曲線を使った。HeLaDNA
を使いビオチニル化2PV18と標識のない1PV18を使ってPC
Rを行った（14）。次に、生じたPCR反応物を特定プロー
ブのルテニウム（bpy）3 2+標識を付けた3PV18と異種形
成した。次に、異種形成混合物をストレプトアビジン被
覆粒子に添加し生成したビーズ結合のルテニウム（bp
y）3 2+標識を例１に述べたような直接ECL分析した。そ
の結果を、ラス・オリゴヌクレオチドプローブの標準で
PCRに添加したHPV18コピーに対するECL計数としてプロ
ットした（図11参照）。これらの結果は、ECL検定シス
テムの性質に基づいて核酸順列の迅速非分離検定を作り
出す能力を実証している。
例31.特定ゲノムDNA順列の検定 ここに述べる検定方式は、２つのオリゴヌクレオチド
を利用する。その両方が同じDNA要素を互いに隣合わせ
るように異種形成し、一方のプローブは捕獲でき、他の
プローブは複合体を標識付ける（サンドイッチ異種形
成）。この検定は大腸菌DNAとtrpE/D遺伝子領域に特定
にプローブを用いて実証された。大腸菌DNAは次のよう
な標準手順規定に従って調製された（16）。鮭精液制御
DNAはシグマ社から購入した。DNA試料に14μＬの異種形
成緩衝液（10xPBS、10mMのMEDTA、0.7％SDS）、2ngのビ
オチン標識付きTRP・CO4と5ngのルテニウム（bpy）3 2+
標識のTRP・CO3を添加した。これらの試料を水で100μ
Ｌに調製した。試料を97℃に加熱し97℃で10分間定温放
置し、50℃に冷却してから２時間異種形成した。我々は
これらの試料に20μＬのストレプトアビジン被覆の磁性
粒子IIを添加し２時間室温で混合した。次に、粒子をEC
L緩衝液で４回洗浄し500μＬのECL緩衝液に再懸濁し、
例３に述べたように分析した。正のDNAは大腸菌であり
負のDNAは鮭の精液である。結果を表Ｘに示す。
これらの結果は、増幅なしのDNAにサンドイッチ異種
形成検定方式を用いて大腸菌のゲノム遺伝子検出に機能
するECL検定システムの能力を実証した。ストレプトア
ビジン被覆の磁性粒子Ｉは、ストレプトアビジン被覆の
磁性粒子IIがこの例に使われている様式と同様に使うこ
とができる。
例32.エバネッセント波蛍光検出器上の粒子濃度 検出面上の標識付き複合体の濃度は、エバネッセント
波検出器を用いた検定の感度増加に利用できる。その様
な検出器は、光ファイバーか平面光学導波管300のどち
らかを使って光310を光源から流体環境の所まで導いて
くるのに使われる。光は導波管か光ファイバーを経て、
入射光線が高い屈折率（n1）とより低い屈折率（n2）の
誘電体媒体間の界面に当たるときに生じる内部全反射
（TIR）310′で反射される。光線の入射角度が臨界角度
（θ０）（垂直線300′と光路310′の間の角度）315よ
り大きいときには、θ０＝sin−１（n2/n1）となり光は
その界面で100％内部に反射する。光学導波管と光ファ
イバー内を光はこの臨界角度より大きな入射角度で進
み、媒体内を内部全反射して伝播する。図22は、導波管
または光ファイバー内のTIR伝播を記載している。
光束は界面で互いに作用し合って全反射するが、その
電磁場は媒体外ではゼロではない。界面をよぎる物理的
連続の必要条件は、光が光ファイバーまたは導波管の外
側の外部環境に貫通すると電磁場は指数的に減衰するこ
とを要求する。この場をエバネッセント場320と呼び蛍
光体を励起して蛍光を発する能力がある。エバネッセン
ト場の減衰速度は入射波長、屈折率n1とn2、入射角度に
依存する。石英導波管と水環境内の可視線を使うと、エ
バネッセント場320は、導波管／溶液界面から100nmの距
離内で約90％減衰する。図22では、周囲の媒体330が屈
折率n2と光ファイバーまたは導波管300、屈折率n1を持
っている。
導波管または光ファイバー内を伝播する光のエバネッ
セント場を作るのと同じ原理で、蛍光体が光学要素に効
率的に捕獲されて輝くときに発する光が認められる。そ
れに加えて、エバネッセント地帯（320）外に形成され
たどんな光も、光学要素への侵入を効率的に拒否され
る。これらの効果の組合せは、光ファイバーまたは導波
管が水の環境でその表面上または近くの蛍光体標識の存
在または濃度を測定するための効率的な光学要素として
使用されることを認めている。ここに引用されている米
国特許No.4,447,546は、標識付きの免疫反応体からのエ
バネッセント地帯の蛍光を励起し測定するのに光ファイ
バーを採用し蛍光免疫検定を行うのに適した方法と装置
を記述している。
この発明は、光ファイバーまたは導波管を使って蛍光
に結び付いた検定の感度を改良するのに適用できる。こ
の検定は、蛍光部分で標識を付けた試薬を使って行って
いる。粒子、試料と試薬を定温放置した後に、粒子を導
波管または光ファイバーの表面に濃縮した。粒子の表面
積は導波管または光ファイバーの幾何学的面積より大き
いので、光学要素を取り巻くエバネッセント地帯にもっ
と多くの蛍光体を収集できる。従って、粒子からのルミ
ネセントシグナルは大きくなり検体の定量がもっと感度
良く、検出限界が改良されることになる。
このようにこの発明の好適な実施例が詳細に述べられ
たが、添記のクレームで規定されるこの発明は、多くの
明らかな変更が本発明の精神または範囲から外れること
なしに可能であり上記の説明で明らかにした特殊な詳細
に限られるものではないことを理解してもらいたい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ８２７，２７０ (32)優先日 平成４年２月３日(1992．2．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 シャー，ハレシュ，ピー. アメリカ合衆国20878 メリーランド州 ゲイサースバーグ，ノーウィッチ コー ト 21 (72)発明者 ケンテン，ジョン，エィチ. アメリカ合衆国20879 メリーランド州 ゲイサースバーグ，ウインドジャマー ウエイ 1921 (72)発明者 グッドマン，ジャック，イー. アメリカ合衆国22201 バージニア州ア ーリントン，サード ストリート ノー ス 3011 (72)発明者 ロウク，ジョージ，イー. アメリカ合衆国20882 メリーランド州 レイトンズビル，モブリィ ファーム ドライブ 21706 (72)発明者 ブラックバーン，ゲイリー，エフ. アメリカ合衆国20882 メリーランド州 ゲイサースバーグ，ローリング フォー ク ウエイ 23627 (72)発明者 マッセイ，リチャード，ジェイ. アメリカ合衆国20852 メリーランド州 ロックビル，バレリアン コート ５ (56)参考文献 特表 平１−500688（ＪＰ，Ａ) 特表 昭64−500059（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／3533（ＷＯ，Ａ１) 国際公開90／5296（ＷＯ，Ａ１) 国際公開90／5301（ＷＯ，Ａ１) 欧州公開170446（ＥＰ，Ａ１)

Claims (57)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】電極面での電気化学ルミネセンス測定に基
    づいて試料中に存在する興味ある検体の結合検定を行う
    ための次の段階から成る方法： （ａ）次の組成物の形成： （ｉ）該試料 （ii）ルミネセンスを誘導できる標識化合物に連結した
    成分を含有する検定施行物質、および （iii）検体および／または該検定施行物質と特異的に
    結合できる複数の粒子； （ｂ）粒子と該標識化合物を含有する複合体を形成する
    該組成物の定温放置； （ｃ）該複合体の収集； （ｄ）該収集した複合体の電極面との接触を惹起し該電
    極への電圧印加により該複合体中の標識化合物の発光を
    誘導；および （ｅ）試料中の興味ある検体の存在を測定するため電極
    面で放出するルミネセンスの測定。
  2. 【請求項２】電極面での電気化学ルミネセンス測定に基
    づいて試料中に存在する興味ある検体の結合検定を行う
    ため次の段階から成る方法： （ａ）次の組成物の形成： （ｉ）該試料 （ii）ルミネセンスを誘起することのできる標識化合物
    に連結した成分を含有する検定施行物質、および （iii）該組成物の残りよりも大きな密度を有し検体お
    よび／または該検定施行物質と特に結合できる複数の懸
    濁粒子； （ｂ）粒子と該標識化合物を含有する複合体を形成する
    該組成物の定温放置； （ｃ）該組成を検定セルに導入； （ｄ）重力によって電極面上に粒子が沈降するよう該組
    成が該検定セル中で充分な時間滞留することを認めて該
    セル容積の少なくとも主要部分の下にある該電極面に該
    組成を収集； （ｅ）該電極に電圧を印加により該収集複合体中の標識
    化合物に発光を誘導；および （ｆ）試料中の興味ある検体の存在を測定するため電極
    面で放出のルミネセンスの測定。
  3. 【請求項３】該電極面上に該粒子が沈降するように組成
    物が該検定セル中で充分な時間滞留するのを許されるバ
    ッチプロセスを行う特許請求の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】該電極面上に該粒子の少なくとも一部が沈
    降するよう該組成が該検定セル中を充分な低速度で通過
    するフロープロセスを行う特許請求の範囲第２項記載の
    方法。
  5. 【請求項５】該粒子が0.1〜5g/mLの密度を持つ特許請求
    の範囲第２項記載の検定方法。
  6. 【請求項６】該粒子が0.5〜2g/mLの密度を持つ特許請求
    の範囲第５項記載の検定方法。
  7. 【請求項７】該粒子の平均直径で測ったサイズが0.01〜
    100μｍにおよぶ特許請求の範囲第２項記載の検定方
    法。
  8. 【請求項８】粒子サイズが0.01〜10μｍにおよぶ特許請
    求の範囲第７項記載の検定方法。
  9. 【請求項９】該組成中の粒子濃度が１〜10,000μg/mLで
    ある特許請求の範囲第２項記載の検定方法。
  10. 【請求項１０】該粒子濃度が５〜1000μg/mLの範囲にあ
    る特許請求の範囲第９項記載の検定方法。
  11. 【請求項１１】沈降速度を少なくとも0.5mm/分にするよ
    うな該組成中の該粒子の密度、サイズおよび濃度である
    特許請求の範囲第２項記載の検定方法。
  12. 【請求項１２】該電極面の少なくとも主要部分が電気化
    学ルミネセンスを誘起する以前に該複合体の単層で被覆
    されている特許請求の範囲第２項記載の検定方法。
  13. 【請求項１３】電極面での電気化学ルミネセンス測定に
    基づいて試料中に存在する興味ある検体の結合検定を行
    うため次の段階から成る方法： （ａ）次のものを含む組成物の形成： （ｉ）該試料 （ii）ルミネセンスを誘導できる標識化合物に連結した
    成分を含有する検定施行物質、および （iii）該組成の残りよりも大きな密度を有し検体およ
    び／または該検定施行物質と特に結合できる複数の懸濁
    粒子； （ｂ）粒子と該標識化合物を含有する複合体を形成する
    該組成物の定温放置； （ｃ）遠心力法による該組成物の収集； （ｄ）該収集複合体の電極面接触を引き起こし該電極に
    電圧を印加することで該複合体内の標識化合物にルミネ
    センスを誘導；および （ｅ）試料中の興味ある検体の存在を測定するため電極
    面で放出のルミネセンスの測定。
  14. 【請求項１４】該遠心力段階で電極面上に該複合体を収
    集する特許請求の範囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】該粒子が0.1〜5g/mLの密度を持つ特許請
    求の範囲第13項記載の検定方法。
  16. 【請求項１６】該粒子が0.5〜2g/mLの密度を持つ特許請
    求の範囲第15項記載の検定方法。
  17. 【請求項１７】該試料が遠心分離されている間にルミネ
    センスを測る特許請求の範囲第13項記載の検定方法。
  18. 【請求項１８】電極面での電気化学ルミネセンス測定に
    基づいて試料中に存在する興味ある検体の結合検定を行
    うために次の段階から成る方法： （ａ）次のものを含む組成物の形成： （ｉ）該試料 （ii）電気化学ルミネセンスを誘導できる標識化合物に
    連結した成分を含有する検定施行物質、および （iii）検体および／または該検定施行物質と特に結合
    できる複数の懸濁粒子； （ｂ）粒子と該標識化合物を含有する複合体を形成する
    該組成の定温放置； （ｃ）ろ過法による該組成の収集； （ｄ）該収集複合体の電極面との接触を引き起こし該電
    極に電圧を印加することで該複合体内の標識化合物にル
    ミネセンスを誘導；および （ｅ）試料中の興味ある検体の存在を測定するため電極
    面で放出のルミネセンスの測定。
  19. 【請求項１９】該ろ過段階で該電極面上に該複合体を収
    集する特許請求の範囲第18項記載の方法。
  20. 【請求項２０】該粒子の平均直径で測ったサイズが0.00
    1〜100μｍにおよぶ特許請求の範囲第18項記載の検定方
    法。
  21. 【請求項２１】該粒子サイズが0.01〜10μｍにおよぶ特
    許請求の範囲第20項記載の検定方法。
  22. 【請求項２２】該ろ過法が多孔質な金属電極面上で行わ
    れ、平均直径で測った該孔サイズが該粒子の平均直径の
    10〜90％である特許請求の範囲第18項記載の方法。
  23. 【請求項２３】電極面での電気化学ルミネセンス測定に
    基づいて試料中に存在する興味ある検体の結合検定を行
    うために次の段階から成り立つ方法： （ａ）次のものを含む組成物の形成： （ｉ）該試料 （ii）ルミネセンスを誘導できる標識化合物に連結した
    成分を含む検定施行物質、および （iii）検体および／または該検定施行物質と特に結合
    できる磁気感応性の複数の懸濁粒子； （ｂ）粒子と該標識化合物を含有する複合体を形成する
    該組成物の定温放置； （ｃ）該粒子に磁場を印加して該複合体を収集； （ｄ）該収集複合体の電極面との接触を引き起こし該電
    極に電圧を印加することで該複合体内の標識化合物にル
    ミネセンスを誘導；および （ｅ）試料中の興味ある検体の存在を測定するのに電極
    面で放出のルミネセンスの測定。
  24. 【請求項２４】該電場の付加が該電極面での該複合体の
    収集を引き起こす特許請求の範囲第13項記載の方法。
  25. 【請求項２５】電極面での電気化学ルミネセンス測定に
    基づいて試料中に存在する興味ある検体の結合検定を行
    うために次の段階から成り立つ方法： （ａ）次のものを含む組成物の形成： （ｉ）該試料 （ii）電気化学ルミネセンスを誘導できる標識化合物に
    連結した成分を含む検定施行物質、および （iii）検体および／または該検定施行物質と特に結合
    できる磁気感応性の複数の懸濁粒子； （ｂ）粒子と該標識化合物を含有する複合体を形成する
    該組成物の定温放置； （ｃ）該組成物を検定セルに導入； （ｄ）該粒子に磁場を付加することで電極面に該複合体
    を収集； （ｅ）該電極に電圧を印加することで該収集の複合体内
    の標識化合物にルミネセンスを誘導；および （ｆ）試料中の興味ある検体の存在を測定するための電
    極面で放出のルミネセンスの測定。
  26. 【請求項２６】該磁場が該電極面上に該粒子の沈降を引
    き起こすよう該組成物を該セル内に充分な時間滞留させ
    るバッチプロセスを行う特許請求の範囲第25項記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】該磁場が該電極面上に該粒子の沈降を引
    き起こすよう充分な低速度で該組成物流を該セル内通過
    させるフロープロセスを行う特許請求の範囲第25項記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】該粒子が少なくとも0.001cgs単位の磁化
    率を持つ特許請求の範囲第25項記載の検定方法。
  29. 【請求項２９】磁化率が少なくとも0.01cgs単位である
    特許請求の範囲第28項記載の方法。
  30. 【請求項３０】該粒子が0.5〜2g/mLの密度を持つ特許請
    求の範囲第25項記載の検定方法。
  31. 【請求項３１】該粒子の密度が0.5〜2g/mLである特許請
    求の範囲第30項記載の方法。
  32. 【請求項３２】該粒子の平均直径で測ったサイズが0.00
    1〜100μｍである特許請求の範囲第25項記載の検定方
    法。
  33. 【請求項３３】該粒子サイズが0.01〜10μｍでありその
    粒子が低共鳴である特許請求の範囲第25項記載の検定方
    法。
  34. 【請求項３４】該組成物中の粒子濃度が１〜10,000μg/
    mLである特許請求の範囲第25項記載の検定方法。
  35. 【請求項３５】該粒子濃度が５〜1000μg/mLである特許
    請求の範囲第34項記載の検定方法。
  36. 【請求項３６】該粒子の沈降速度を少なくとも0.5mm/分
    にするような該組成物中の該粒子の磁化率、密度、サイ
    ズおよび濃度である特許請求の範囲第25項記載の検定方
    法。
  37. 【請求項３７】該電極面の少なくとも主要部分が電気化
    学ルミネセンスを誘起する以前に該複合体の単層で被覆
    されている特許請求の範囲第25項記載の検定方法。
  38. 【請求項３８】該磁場の力線が該電極面の領域で該電極
    面と実質的に平行である特許請求の範囲第25項記載の方
    法。
  39. 【請求項３９】該複合体の収集以後とルミネセンスの誘
    起以前に電場を撤回する特許請求の範囲第25項記載の方
    法。
  40. 【請求項４０】試料中の興味ある検体の検出又は定量の
    ための結合検定を行うための次の段階からなる方法： （ａ）複数の粒子を提供すること； （ｂ）電気化学ルミネセンスが起こるように誘導するこ
    とができる領域に該粒子を捕集すること； （ｃ）電気化学ルミネセンス化合物に直接的に又は間接
    的に結合している該粒子を、電気化学ルミネセンスを誘
    導するのに充分な条件に付し；及び （ｄ）放出されたルミネセンスを検出又は定量するこ
    と； であって、粒子を電気化学ルミネセンス条件に付す時
    に、粒子が該粒子と検定施行物質とから形成される複合
    体の一部であったか若しくは一部であり、該検定施行物
    質は該電気化学ルミネセンス化合物に結合し、以下の
    （１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも一つ
    の化合物を含んでおり： （１）追加された興味ある検体又は該検体のアナログ、 （２）該検体の結合相手又は該アナログの結合相手、及
    び （３）上記（１）又は（２）と結合することのできる成
    分； 該検定施行物質はさらに、粒子を電気化学ルミネセンス
    条件に付すに先立って若しくは付す時に、該試料又は該
    興味ある検体に暴露されているものである上記方法。
  41. 【請求項４１】該検定は競合的結合検定である請求項40
    記載の方法。
  42. 【請求項４２】該複合体は該捕集領域での捕集に先立っ
    て形成される請求項40記載の方法。
  43. 【請求項４３】該捕集は重力沈降、ろ過、遠心分離又は
    磁力を含む請求項40記載の方法。
  44. 【請求項４４】該捕集は磁場を用いることにより遂行さ
    れる請求項40記載の方法。
  45. 【請求項４５】該捕集は一つ又は二つ以上の磁石を用い
    ることにより遂行される請求項40記載の方法。
  46. 【請求項４６】該電気化学ルミネセンスの誘導は表面選
    択的励起によって遂行される請求項40記載の方法。
  47. 【請求項４７】該組成物は還元剤を含む請求項40記載の
    方法。
  48. 【請求項４８】試料中の興味ある検体の検出又は定量の
    ための結合検定を行うための次の段階からなる方法： （ａ）複数の粒子を提供すること、但し該粒子と該興味
    ある検体は異なるものである； （ｂ）電気化学ルミネセンスが起こるように誘導するこ
    とができる領域に該粒子を捕集すること； （ｃ）電気化学ルミネセンス化合物に直接的に又は間接
    的に結合している該粒子を、電気化学ルミネセンスを誘
    導するのに充分な条件に付し；及び （ｄ）放出されたルミネセンスを検出又は定量するこ
    と； であって、粒子を電気化学ルミネセンス条件に付す時
    に、粒子が該粒子と検定施行物質とから形成される複合
    体の一部であったか若しくは一部であり、該検定施行物
    質は該電気化学ルミネセンス化合物に結合し、以下の
    （１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも一つ
    の化合物を含んでおり： （１）追加された興味ある検体又は該検体のアナログ、 （２）該検体の結合相手又は該アナログの結合相手、及
    び （３）上記（１）又は（２）と結合することのできる成
    分； 該検定施行物質はさらに、粒子を電気化学ルミネセンス
    条件に付すに先立って若しくは付す時に、該試料又は該
    興味ある検体に暴露されているものである上記方法。
  49. 【請求項４９】該検定は競合的結合検定である請求項48
    記載の方法。
  50. 【請求項５０】該複合体は該捕集領域での粒子の捕集に
    先立って形成される請求項48記載の方法。
  51. 【請求項５１】該検定施行物質は該電気化学ルミネセン
    ス化合物に直接的に結合している請求項48記載の方法。
  52. 【請求項５２】該電気化学ルミネセンス化合物は電気化
    学ルミネセンス標識である請求項48記載の方法。
  53. 【請求項５３】該捕集は重力沈降、ろ過、遠心分離又は
    磁力を含む請求項48記載の方法。
  54. 【請求項５４】該捕集は磁場を用いることにより遂行さ
    れる請求項48記載の方法。
  55. 【請求項５５】該捕集は一つ又は二つ以上の磁石を用い
    ることにより遂行される請求項48記載の方法。
  56. 【請求項５６】該電気化学ルミネセンスの誘導は表面選
    択的励起によって遂行される請求項48記載の方法。
  57. 【請求項５７】該組成物は還元剤をさらに含む請求項48
    記載の方法。
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