DE69233675T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Lumineszenzbestimmungen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von Bindungstests, insbesondere derjenigen Tests, die die Anwesenheit eines interessierenden Analyten über die Messung von Lumineszenz bestimmen, die von einem oder mehreren markierten Komponenten im Testsystem emittiert wird. Genauer betrifft die Erfindung präzise, reproduzierbare, akurate, homogene oder heterogene spezifische Bindungstests mit verbesserter Sensitivität oder Empfindlichkeit, bei denen die Lumineszenzkomponente in der Testzusammensetzung konzentriert ist und auf dem Detektionssystem gesammelt wird, bevor die Elektrochemolumineszenz ausgelöst wird.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Zahlreiche Verfahren und Systeme sind zum Nachweis und zur Quantifizierung von interessierenden Analyten in biochemischen und biologischen Substanzen entwickelt worden. Verfahren und Systeme, die Spurenmengen von Mikroorganismen, Pharmazeutika, Hormonen, Viren, Antikörpern, Nukleinsäuren und anderen Proteinen messen können, sind von großem Wert für Forscher und Kliniker.
  • Ein sehr beträchtlicher Stand der Technik wurde entwickelt, beruhend auf den wohlbekannten Bindungsreaktionen, beispielsweise Antigen-Antikörper-Reaktionen, Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken und von Protein-Liganden-Systemen. Das hohe Maß an Spezifität in vielen biochemischen und biologischen Bindungssystemen hat zu vielen Testverfahren und Systemen geführt, die in der Forschung und der Diagnose von Wert sind. Typischerweise wird das Vorhandensein eines interessierenden Analyten durch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines beobachtbaren "Markers" angezeigt, der an eine oder mehrere der Bindungsmaterialien angeheftet ist. Von besonderem Interesse sind Marker, die über fotochemische, chemische und elektrochemische Hilfsmittel zum Lumineszieren gebracht werden können. "Fotolumineszenz" ist der Vorgang, bei dem in einem Material Lumineszenz induziert wird, wenn es elektromagnetische Strahlung absorbiert. Die Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind Typen der Fotolumineszenz. "Chemolumineszenz"-Prozesse machen die Erzeugung von lumineszenten Spezies durch chemischen Energietransfer notwendig. Die "Elektrochemolumineszenz" erfordert die elektrochemische Erzugung lumineszenter Spezies.
  • Es sind Chemolumineszenz-Testverfahren entwickelt worden, bei denen eine einen interessierenden Analyten enthaltende Probe mit einem Reagenz gemischt wird, das mit einem chemolumineszenten Marker markiert ist. Das reaktive Gemisch wird inkubiert und ein Teil des markierten Reagenz' bindet an den Analyten. Nach dem Inkubieren werden die gebundenen und nicht gebundenen Fraktionen der Mischung getrennt und kann die Konzentration des Markers in einer oder beiden Fraktionen über Chemolumineszenztechniken bestimmt werden. Die Menge der in einem oder beiden Fraktionen bestimmten Chemolumineszenz indiziert die Menge an interessierenden Analyten in der biologischen Probe.
  • Elektrochemolumineszenz-Testverfahren (ECL-Testverfahren) stellen eine Verbesserung der Chemolumineszenzverfahren dar. Sie bieten eine empfindliche und genaue Messung der Anwesenheit und Konzentration eines interessierenden Analyten. Bei diesem Verfahren wird die inkubierte Probe einer voltametrischen Arbeitselektrode zum Triggern der Lumineszenz ausgesetzt. In einer geeigneten chemischen Umgebung wird eine solche Elektrochemolumineszenz durch eine Spannung getriggert, die zu einer vorgegebenen Zeit und in spezieller Weise auf die Arbeitselektrode aufgebracht wird. Das vom Marker produzierte Licht wird gemessen und zeigt die Anwesenheit oder Menge des Analyten an. Für eine genauere Beschreibung solcher ECL-Techniken wird auf die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 86/02734, die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 87/06706 und die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 89/4302 verwiesen.
  • Es ist wünschenswert, Elektrochemolumineszenztests auszuführen, ohne daß die Notwendigkeit eines Trennschritts während des Testverfahrens besteht, und die Signalmodulation bei verschiedenen Konzentrationen an Analyten so zu maximieren, daß eine präzise und empfindliche Messung ausgeführt werden kann. Unter den Verfahren des Standes der Technik für nichttrennende Tests finden sich diejenigen, die in der Testprobe suspendiertes, mikroteilchenförmiges Material verwenden, um eine oder mehrere der Bindungskomponenten des Tests zu binden.
  • Die US-A-4,305,925 betrifft den Nachweis und die Bestimmung von klinisch relevanten Proteinen und Peptiden mittels nephelometrischer und turbidimetrischer Verfahren. Die offenbarten Verfahren involvieren die Bindung des Antigens oder Antikörpers an Latexteilchen, die die Funktion der Lichtstreuung oder Adsorption haben.
  • Die US-A-4,480,042 betrifft Verfahren, welche Teilchenreagenzien verwenden, die aus Teilchen mit Hülle und Kern bestehen. Die Hülle enthält funktionale Gruppen, an die Verbindungen von biologischem Interesse kovalent gebunden werden können; und der hohe Brechungsindex des Kerns führt zu hoher Sensitivität bei Lichtstreuungsmessungen. Das Verfahren beruht auf Agglutinationsreaktionen, die aus der Reaktion zweiwertiger oder bivalenter Antikörper mit mehrwertigen oder multivalenten interessierenden Antigenen resultieren, um Aggregate zu erzeugen, die auf verschiedenen Wegen detektiert und/oder gemessen werden können.
  • Die US-A-4,419,453 betrifft gleichermaßen die Verwendung von Agglutinationstestverfahren mit gefärbtem Latex, die für den Nachweis der Anwesenheit von immunchemischen Stoffen wie Antikörpern und Immunogenen geeignet sind.
  • Ausgehend von diesem Stand der Technik schien es nicht möglich zu sein, ein mikroteilchenförmiges Material in Tests zu verwenden, in denen ein Lumineszenzphänomen gemessen wird. Man würde erwarten, daß die Lumineszenz aus freien chemolumineszenten oder elektrochemolumineszenten Gruppen absorbiert, gestreut oder andere Interferenzwirkungen aus dem mikroteilchenförmigen Material erleiden würde.
  • Im Gegensatz zu dieser Erwartung lehrt die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 90/05301 empfindliche, spezifische Bindungstestverfahren auf Basis eines Lumineszenzphänomens, bei dem ein inertes mikroteilchenförmiges Material spezifisch an eines der Bindungsreagenzien des Testsystems gebunden wird. Der Test kann in einem heterogenen Testformat (ein oder mehrere Trennschritte) durchgeführt werden und kann sehr vorteilhaft in einem homogenen Testformat (ohne Trennung) eingesetzt werden.
  • Die WO 90/05301 betrifft eine Zusammensetzung für einen Test auf Basis einer Bindungsreaktion zur Messung von Lumineszenzphänomenen, wobei die Zusammensetzung eine Vielzahl von suspendieren Teilchen mit einer Oberfläche umfaßt, die eine Komponente der Testmischung binden kann. In einem weiteren Aspekt betrifft sie ein System zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines interessierenden Analyten in einer Probe, welches System die Testverfahren unter Verwendung der Testzusammensetzungen der Erfindungen durchführen kann. Das System umfaßt Mittel zum Induzieren der Lumineszenz im Marker im Testmedium und Mittel zum Messen der Lumineszenz zum Nachweis der Anwesenheit des interessierenden Analyten in der Probe.
  • Es wurde gefunden, daß die Bindung derjenigen Komponente des Testsystems, an die eine Elektrochemolumineszenzgruppe gebunden ist, an ein suspendiertes mikroteilchenförmiges Material die Intensität des Lumineszenzsignals in großem Umfang moduliert, welches von der an die Komponente gebundenen elektrochemolumineszenten Gruppe erzeugt wird, wodurch ein Mittel zum Überwachen der spezifischen Bindungsreaktion des Testsystems bereitgestellt wird. Noch überraschender hat sich gezeigt, daß die suspendierten Teilchen nur geringe oder keine Auswirkung auf die Intensität des Lumineszenzsignals haben, das von der elektrochemolumineszenten Gruppe erzeugt wird, welche an die Komponente des Systems gebunden ist, die nicht an das suspendierte teilchenförmige Material gebunden wird (ungebunden bleibt).
  • Somit betrifft die WO 90/05301 Verfahren zum Nachweis eines interessierenden Analyten in einer Probe, welche Verfahren die Schritte umfassen: (1) Bilden einer Zusammensetzung, umfassend (a) eine Probe, von der vermutet wird, daß sie einen interessierenden Analyten enthält, (b) eine aus der Gruppe gewählte Test-Durchführungssubstanz, die besteht aus (i) einem interessierenden Analyten oder einem Analogon des interessierenden Analyten, (ii) einem Bindungspartner des interessierenden Analyten oder dessen Analogon und (iii) einer reaktiven Komponente, die mit (i) oder (ii) binden kann, wobei eine dieser Substanzen an eine Markerverbindung mit einer chemischen Gruppe gebunden ist, in der Lumineszenz induziert werden kann, und (c) eine Vielzahl von suspendierten Teilchen, die spezifisch mit denn Analyten und/oder einer Substanz definiert in (b) (i), (ii) oder (iii) binden kann, (2) Inkubieren der Zusammensetzung zur Bildung eines Komplexes, der ein Teilchen und die Markerverbindung umfaßt, (3) Induzieren der Lumineszenz in der Markerverbindung und (4) Messen der von der Zusammensetzung emittierten Lumineszenz zum Nachweis der Anwesenheit des interessierenden Analyten in der Probe. Dieselben Verfahren können zur Quantifizierung der Menge des Analyten in einer Probe verwendet werden, indem man die Lumineszenz der Testzusammensetzung mit der Lumineszenz einer Zusammensetzung vergleicht, die eine bekannte Menge des Analyten enthält.
  • Analoga des interessierenden Analyten, die natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein können, sind Verbindungen, die dem Analyten vergleichbare Bindungseigenschaften aufweisen, schließen jedoch Verbindungen von höherer oder geringerer Bindungsfähigkeit ebenso ein. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Bindungspartner sind wohlbekannt. Beispiele sind Antikörper, Enzyme, Nukleinsäuren, Lectine, Cofaktoren und Rezeptoren. Die reaktiven Komponenten, welche den Analyten oder dessen Analogon und/oder seinen Bindungspartner binden können, können ein zweiter Antikörper oder ein Protein, wie Protein A oder Protein G, oder Avidin oder Biotin oder andere Komponenten sein, von denen im Stand der Technik bekannt ist, daß sie Bindungsreaktionen eingehen.
  • Vorteilhafterweise entsteht die Lumineszenz aus Elektrochemolumineszenz (ECL), die durch Exponieren der Markerverbindung, sei es gebunden an spezifische Bindungspartner oder in ungebundenem Zustand, an eine voltametrische Arbeitselektrode induziert wird. Die ECL-reaktive Mischung wird steuerbar zur Emission von Licht getriggert über eine Spannung, die auf die Arbeitselektrode zu einem speziellen Zeitpunkt in spezieller Weise zur Erzeugung von Licht aufgebracht wird. Obwohl die Emission von sichtbarem Licht ein vorteilhaftes Merkmal der Zusammensetzung oder des Systems ist, kann dieses andere Arten von elektromagnetischer Strahlung, wie Infrarot- oder ultraviolettem Licht, Röntgenstrahlen, Mikrowellen usw. emittieren. Die Verwendung der Ausdrücke "Elektrochemolumineszenz", "elektrochemolumineszent", "Lumineszenz", "lumineszent" und "lumineszieren" umfaßt die Emission von Licht und anderen Formen elektromagnetischer Strahlung.
  • Die in der US 89/04919 gelehrten Verfahren gestatten den Nachweis und die Quantifizierung von extrem geringen Mengen eines Analyten in einer Vielzahl von Tests, die in der Forschung und in klinischen Szenarien durchgeführt werden. Die Anforderungen der Forscher und Kliniker machen es jedoch notwendig, die Nachweisgrenzen der über diese Verfahren durchgeführten Tests zu senken, die Empfindlichkeit dieser Tests zu steigern und die Geschwindigkeit, mit der sie durchgeführt werden können, zu erhöhen.
  • Verschiedene Verfahren sind im Stand der Technik zum Vergrößern des Signals aus markierten Spezies durch Aufkonzentrieren bekannt, bevor diese einem Meßschritt unterworfen werden. In der US-A-4,652,333 werden beispielsweise mit fluoreszenten, phosphoreszenten oder atomfluoreszenten Markern markierte Teilchen durch Mikrofiltration aufkonzentriert, bevor ein Meßschritt durchgeführt wird.
  • Es ist ebenso im Stand der Technik bekannt, markierte immunchemische Spezies vor einem Meßschritt aufzukonzentrieren, beispielsweise indem man magnetisch ansprechbare, markierte Teilchen auf die Oberfläche eines Meßgefäßes zieht. In den US-Patenten der Nrn. 4,731,337, 4,777,145 und 4,115,535 werden solche Teilchen beispielsweise auf die Gefäßwandung gezogen und anschließend bestrahlt, um Fluorophore zur Emission . von Licht anzuregen.
  • In der US-A-4,945,045 werden Teilchen auf einer magnetischen Elektrode konzentriert. Eine elektrochemische Reaktion, die von einem markierten chemischen Mediator erleichtert wird, findet an der Elektrode statt. Die immunchemische Bindungsreaktion verändert die Effizienz des Mediators, was bei Bindung zu einem modulierten Signal führt.
  • Diese Verfahren des Standes der Technik sind nicht relevant für die oberflächenselektiven Anregungsprozesse der Erfindung. Ohne sich durch irgendeine spezielle mechanistische Erklärung der Oberflächenanregung, beispielsweise der Elektrochemolumineszenz, binden zu wollen, wird angenommen, daß der Marker auf dem Festphasenkomplex an der Elektrode oxidiert werden muß. Dieses erfordert, daß ein Elektron sich vom Marker zur Elektrode hinab bewegt. Es wird angenommen, daß das Elektron diesen "Sprung" über ein Phänomen, was als Tunneln bekannt ist, macht, bei dem das Elektron durch einen Raum (einen Bereich, in dem seine potentielle Energie sehr hoch ist, beispielsweise die Lösung) hindurchtritt, ohne daß es "über" die Sperre der potentiellen Energie schreiten muß. Es kann die Energiesperre durchtunneln und somit von einem Molekül zu einem anderen oder von einem Molekül zu einer Elektrode ohne weitere Energiezuführ wandern. Dieses Tunnelphänomen kann jedoch nur über sehr kurze Abstände hinweg funktionieren. Die Wahrscheinlichkeit des Tunnelphänomens fällt mit steigender Distanz zwischen den zwei Spezies exponentiell ab. Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens des Tunnelphänomens zwischen zwei Spezies ist relativ hoch, wenn der Abstand unter 2,5 nm beträgt, ist jedoch relativ gering, falls der Abstand größer ist. Der Abstand von 2,5 nm entspricht einer Daumenregel, die vom Fachmann angewandt wird, stellt jedoch keine absolute Grenze dar.
  • Dementsprechend kann nur von denjenigen ECL-Markern innerhalb von 2,5 nm von der Oberfläche der Elektrode erwartet werden, daß diese am ECL-Prozeß teilnehmen. Die Fläche der Teilchen, die sich innerhalb von 2,5 nm von der Oberfläche einer Elektrode befinden, ist typischerweise extrem klein.
  • Dementsprechend würde man nicht erwarten, daß die ECL einer Teilchenoberfläche in signifikantem Maße meßbar wäre. Darüber hinaus muß das Licht, das von dem ECL-Prozeß erzeugt wird, durch das Teilchen hindurchtreten, um zum Fotomultiplier zu gelangen. Da die Teilchen im wesentlichen opak sind (eine konzentrierte Suspension der selben ist schwarz), würde man nicht erwarten, daß selbst für den Fall, daß signifikante Mengen an Licht über die ECL erzeugt werden könnten, das Licht durch das Teilchen durchtritt und vom Fotomultiplier gemessen werden könnte.
  • Aufgaben der Erfindung
  • Es ist daher ein primäres Ziel dieser Erfindung, homogene (ohne Trennung) und heterogene (Trennung) Verfahren, Reagenzien und einen Apparat zur Durchführung der Bindungstests bereitzustellen.
  • Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, spezifische Bindungstests ohne Trennung, Reagenzien und einen Apparat auf Grundlage der Messung von Elektrochemolumineszenz bereitzustellen, die von einer Testzusammensetzung emittiert wird, die ein mikroteilchenförmiges Material enthält.
  • Es ist ein weiteres und verwandtes Ziel, solche Tests, Reagenzien und einen Apparat mit verbesserter Empfindlichkeit, schnellerer Testdauer, größerer Spezifizität, niedrigeren Detektionsgrenzen und größerer Präzision bereitzustellen, als zuvor erreicht worden ist.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Definition von Ausdrücken
  • Der Ausdruck "ECL-Gruppe", "metallhaltige ECL-Gruppe", "Marker", "Markerverbindung" und "Markersubstanz" werden austauschbar verwendet. Es ist im Bereich der Erfindung, daß die "ECL-Gruppe", "metallhaltige ECL-Gruppe", "organometallische", "Metallchelat", "Übergangsmetallchelat", "Seltenerdmetallchelat", "Markerverbindung", "Markersubstanz" und "Marker" genannte Spezies an ein Molekül wie einen Analyten oder ein Analogen desselben, einen Bindungspartner des Analyten oder ein Analogen desselben und weitere Bindungspartner wie die oben genannten Bindungspartner oder eine reaktive Komponente für die Bindung mit dem Analyten, einen Analog derselben oder einen Bindungspartner, wie oben genannt, gebunden ist. Die oben erwähnten Spezies können auch an eine Kombination aus einem oder mehreren Bindungspartnern und/oder einer oder mehreren reaktiven Komponenten gebunden sein. Weiterhin können die oben genannten Spezies auch an einen Analyten oder dessen Analogen, gebunden an einen Bindungspartner, eine reaktive Komponente oder eine Kombination aus einem oder mehreren Bindungspartnern und/oder einer oder mehreren reaktiven Komponenten gebunden sein. Es ist ebenfalls im Bereich der Erfindung, daß eine Vielzahl der oben genannten Spezies direkt oder über andere Moleküle, wie oben angesprochen, an den Analyten oder sein Analogon gebunden ist. Für Abkürzungszwecke werden diese Liganden als Testdurchführungssubstanz bezeichnet.
  • Die Ausdrücke Nachweis und Quantifizierung werden als "Messung" angesprochen, wobei zu verstehen ist, daß die Quantifizierung die Herstellung von Referenzzusammensetzungen und Kalibrierungen erfordern kann.
  • Die Ausdrücke Sammeln und Konzentrierung des Komplexes können austauschbar verwendet werden, um die Aufkonzentrierung des Komplexes in der Testzusammensetzung und die Sammlung des Komplexes beispielsweise an der Elektrodenoberfläche zu beschreiben.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer Zelle zur Durchführung der auf Mikroteilchen beruhenden Tests der Erfindung mit und ohne Trennung.
  • 2 ist ein vereinfachtes Diagramm einer Vorrichtung zum Steuern der Spannung zur Verwendung in der Zelle aus 1.
  • 3 ist eine schematische Darstellung eines PCR-Formats mit direktem Einbau unter Verwendung elektrochemolumineszent markierter Oligonukleotide und Biotin mit elektrochemolumineszent markierten Oligonukleotiden als Primer.
  • 4 ist eine schematische Darstellung eines normalen PCR-Formats unter Verwendung eines biotinylierten Primers, um die Bildung eines biotinylierten PCR-Produkts zu gestatten.
  • 5 ist eine schematische Darstellung eines asymmetrischen PCR-Testformats, welches einzelsträngige, biotinylierte DNS für die spätere Hybridisierung an elektrochemolumineszent markierte Oligonukleotide erzeugt.
  • 6 ist eine Auftragung, welche Spezifitätsuntersuchungen der direkten Inkorporation von elektrochemolumineszent markierten Oligonukleotiden in biotinylierte PCR-Produkte zeigt.
  • 7 ist eine Standardkurve für direkt eingebaute, elektrochemolumineszente Marker und biotinylierte Oligonukleotide in HPV16-PCR-Produkte.
  • 8 ist eine Auftragung, welche einen Punktmutationstest für die Ha-ras-Onkogene zeigt.
  • 9 ist eine Auftragung, welche eine Bewertung der Spezifität für elektrochemolumineszent markierte Sonden unter Verwendung P32-elektrochemolumineszent markierten Sonden für das Aa-ras-Onkogen zeigt.
  • 10 ist eine Auftragung, welche die Bestimmung von relativen Werten eines elektrochemolumineszenten Markers in P32-elektrochemolumineszenten Markern für die Bestimmung von Punktmutation im Ha-ras-Onkogen zeigt.
  • 11 ist eine Standardkurve für den Schnell-Hybridisierungstest für HPV18 ohne Waschen.
  • 12 ist eine schematische Darstellung einer Testzelle, die zur Durchführung von Tests verwendet wird und die Schwerkraft nutzt, um das Absetzen des Komplexes zu verursachen.
  • 13 ist eine Auftragung, welche die Entfernung angibt, die sich der Komplex absetzt, und zwar als Funktion der Zeit unter Einfluß der Schwerkraft, nämlich die Sedimentationsrate von Dynalteilchen (y = –0,28 + 0,48x; Geschwindigkeit = 0,5 mm pro Minute).
  • 14 ist eine Auftragung, welche die Intensität der Elektrochemolumineszenz als Funktion der Zeit in Schwerkraftzellen mit verschiedenen Höhen an Testzusammensetzung über der Elektrode zeigt, das heißt einen Vergleich der Intensitäts-Zeit-Beziehung für zwei Dichtungs- bzw. Probendicken, worin die von offenen Kreisen dargestellten Werte für eine 0,015-Inch-Dichtung und die von schwarzen Kreisen dargestellten Werte für eine 0,075-Inch-Dichtung stehen.
  • 15 ist eine Auftragung, welche die Intensität der Elektrochemolumineszenz in Schwerkraftzellen mit verschiedenen Höhen von Testzusammensetzungen über der Elektrodenoberfläche zeigt, wie sie in einem Test für die Bestimmung von alphafetalem Protein gemessen wurden, das heißt einem Vergleich von Zellen für einen AFP-Test, worin die von offenen Kreisen dargestellten Werte für die 0,015-Inch-Dichtung und die von schwarzen Kreisen dargestellten Werte für eine 0,075-Inch-Dichtung stehen.
  • 16 ist eine schematische Darstellung einer Sedimentationstestzelle, die einen Elektromagneten nutzt, um das Absetzen des Komplexes auf der Elektrodenoberfläche zu veranlassen.
  • 17 ist eine Auftragung, welche die relativen Geschwindigkeiten des Absetzens eines mikroteilchenförmigen Komplexes unter Einfluß eines magnetischen Feldes bzw. der Schwerkraft zeigt, das heißt ein Vergleich von Absetzzeiten von Mikroteilchen zwischen einem durch Magnetfeld induzierten Absetzen und durch Schwerkraft verursachten Absetzen, wobei die Werte für das Magnetfeldabsetzen durch offene Kreise dargestellt sind und die Werte für Schwerkraftabsetzung von schwarzen Kreisen dargestellt werden.
  • 18 ist eine schematische Darstellung einer Sammelzelle, umfassend einen Permanentmagneten.
  • 19 ist eine Auftragung, welche den Anstieg der ECL-Intensität als Funktion der Zeit in Tests zeigt, die mit der Zelle aus 18 durchgeführt wurden, das heißt die Auswirkung der Sammelzeit auf die ECL-Intensität.
  • 20 ist eine schematische Darstellung der Kraftlinien in der Nähe der Elektrodenoberfläche als Funktion der Orientierung des Magneten unter der Elektrodenoberfläche.
  • 21 ist eine schematische Darstellung einer rotierenden Durchflußzelle, worin die Komplexe auf der Oberfläche der Elektrode mittels Zentrifugation abgeschieden werden; das Zentrifugationsverfahren und die Vorrichtung der Erfindung zum Auffangen von Teilchen; die Zentrifugationsdurchflußzelle der Erfindung.
  • 22 ist eine schematische Darstellung einer Fluoreszenzdetektion mit abklingender Welle.
  • 23 und 24 zeigen eine Zelle und eine Vielzahl von Magneten zur Durchführung von Trennungs- oder Nichttrennungs-Testverfahren der Erfindung auf Basis magnetischer Mikroteilchen; die Vielzahl von Magneten des Magnetsystems legen Feldlinien an, die wesentlich parallel zur Ebene der Elektrodenoberfläche liegen.
  • 25 ist eine schematische Zeichnung einer Zelle zur Durchführung der Nichttrennungs- und Trennungstest der Erfindung auf Basis von Mikoteilchen; die Zelle umfaßt eine Arbeitselektrode und eine Vielzahl von Magneten, wie in den 23 und 24.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung mit einem Testreagenz zur Verwendung in einem Test eines Analyten von Interesse auf Grundlage einer Bindungsreaktion und der Messung eines elektrochemolumineszenten Phänomens bereit, umfassend:
    • a) eine Markierungsverbindung, die einen elektrochemolumineszenten Rest enthält, der an einen Bindungspartner des Analyten von Interesse oder eines Analogons des Analyten von Interesse angehängt ist; und
    • b) eine Vielzahl magnetisch reagierender Partikel mit einer Oberfläche, die in der Lage ist, an eine Komponente der Testreagenz-Zusammensetzung zu binden, wobei die Partikel magnetisch reagierende Partikel mit einer Dichte sind, die von 0,5 bis 2 g/ml reicht, und mit einem Durchmesser, der von 0,01 μm bis 10 μm reicht.
  • Eine alternative Ausführungsform der Erfindung stellt ein Kit bereit, das Reagenzien zur Verwendung in einem auf Mikropartikel-basierten Bindungstest für einen Analyten von Interesse enthält, umfassend:
    • a) magnetisch reagierende Partikel mit einer Dichte, die von 0,5 bis 2 g/ml reicht, und mit einem Durchmesser, der von 0,01 μm bis 10 μm reicht; und
    • b) eine Markierungsverbindung, die einen elektrochemolumineszenten Rest enthält, welcher an einen Bindungspartner des Analyten von Interesse und eines Analogons des Analyten von Interesse angehängt ist;
    mit der Maßgabe, daß keine zwei oder mehr Bestandteile des Kits miteinander unter Lagerbedingungen reagieren, wodurch die Funktion der Reagenzien in dem beabsichtigen Test gestört werden könnte.
  • Diese Erfindung stellt weiter die Verwendung einer Zusammensetzung der Erfindung in einem Elektrochemolumineszenz-Bindungstest bereit, wobei diese Partikel magnetisch sind und auf einer Elektrodenoberfläche gesammelt werden.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in einem Test für einen Analyten von Interesse bereit, umfassend:
    • (a) Bilden dieser Zusammensetzung;
    • (b) Einsammeln der Partikel auf einer Elektrodenoberfläche, wobei die Partikel magnetisch sind;
    • (c) Anregen dieses Elektrochemolumineszenz-Rests, um Elektrochemolumineszenz zu emittieren; und
    • (d) Nachweisen der Elektrochemolumineszenz.
  • Der Komplex kann beispielsweise an einer Elektrodenoberfläche gesammelt werden, wo er angeregt wird und zur Elektrochemolumineszenz gebracht wird, wie beispielsweise durch Anlegen einer Spannung an der Elektrode, oder er kann an einer Oberfläche gesammelt werden und danach durch Oberflächenanregung, wie unten beschrieben wird, angeregt werden, um zu fluoreszieren. Die totale interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF) ist als eine oberflächenempfindliche Technik zum Anregen und Nachweisen fluorophorer Markierungen beschrieben worden, und die totale interne Reflexion ist mir RAMAN und der Infrarotabsorption als einer anderen oberflächensensitiven Technik zum Messen des Vorhandenseins einer Markierung verwendet worden. Die Oberflächen-Plasmonresonanz ist eine optische Technik, die nach Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, um Markierungen auf Oberflächen zu messen. Die Erfindung ist daher auf Verfahren zum Anregen von Lumineszenz durch Oberflächenanregungstechniken gerichtet.
  • Während die Erfindung vorzugsweise durchgeführt wird, indem der Komplex in einem Meßbereich gesammelt wird, d.h. auf einer Oberfläche, an der er dazu gebracht werden kann, Lumineszenzsignale abzugeben, umfaßt die Erfindung auch Verfahren, in denen der Komplex außerhalb eines Meßbereichs gesammelt wird und danach Vorrichtungen in diesen Bereich gebracht werden, oder andere Schritte unternommen werden, um die Lumineszenz zu induzieren und zu messen.
  • Das Sammeln des Komplexes kann durch mehrere verschiedene Verfahren durchgeführt werden, einschließlich der schwerkraftabhängigen Ablagerung, Filtration, Zentrifugieren, und der magnetischen Anziehung magnetisch reaktiver Teilchen, die einen Teil des Komplexes bilden. Die verschiedenen Ausführungsformen sind unten in genaueren Details beschrieben.
  • Tests, die auf der Messung der Elektrochemolumineszenz an einer Elektrodenoberfläche basieren, werden vorzugsweise durch Verwendung der Schwerkraft durchgeführt, indem
    • (a) eine Zusammensetzung gebildet wird, die enthält (i) eine Probe (ii) eine Substanz zur Durchführung des Tests, die einen Bestandteil enthält, der an eine Markierungsverbindung gebunden ist, die in der Lage ist, angeregt zu werden, um Elektrochemolumineszenz zu zeigen, und (iii) eine Vielzahl suspendierter Partikel mit einer Dichte, die größer als das Gleichgewicht dieser Zusammensetzung ist und die in der Lage sind, spezifisch an den Analyten und/oder die Substanz zur Durchführung des Tests zu binden;
    • (b) Inkubieren der Zusammensetzung, um einen Komplex zu bilden, der einen Partikel und die Markierungsverbindung einschließt;
    • (c) Einfüllen der Zusammensetzung in eine Testzelle;
    • (d) Einsammeln des Komplexes an der Oberfläche der Elektrode, die unterhalb mindestens eines substantiellen Teils des Volumens dieser Testzelle angebracht ist, indem der Zusammensetzung ermöglicht wird, für eine ausreichende Zeit in der Zelle zu verbleiben, um den Partikeln zu ermöglichen, sich auf der Elektrodenoberfläche durch die Schwerkraft abzulagern;
    • (e) Anregen der Markierungsverbindung in diesem gesammelten Komplex, Lumineszenz zu zeigen, indem eine Spannung an diese Elektrode angelegt wird; und
    • (f) Messen der emittierten Elektrochemolumineszenz an der Elektrodenoberfläche, um das Vorhandensein des Analyten von Interesse der Probe zu messen.
  • Während Chargentests oder Batchtests durchgeführt werden können, können kontinuierliche oder semi-kontinuierliche Tests in Durchflußzellen erfolgen. In einer Durchflußzelle verbleibt die Festphase in der Meßzelle, während die Lösung durch diese hindurchströmt und die Zelle verläßt. Ist die Festphase (beispielsweise Teilchen) dichter als Wasser, das heißt weisen diese eine Dichte größer als diejenige von Wasser auf (über 1,0 g/ml), veranlaßt die Wirkung der Schwerkraft auf die Teilchen deren Fallen auf den Boden der Zelle. Die Zelle kann so konstruiert sein, daß die Teilchen sich auf dem Boden absetzen, während das Fluid durch die Zelle strömt, oder die Zelle kann so konstruiert sein, daß die Hauptmenge der Probe in der Zelle in einem säulenförmigen Kompartment über der Arbeitselektrode eines ECL-Systems enthalten ist. Vor dem Induzieren der ECL muß eine ausreichende Verweilzeit in der Zelle vorgesehen sein, damit die Teilchen sich auf der Oberfläche der Elektrode absetzen können.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann eine Testzusammensetzung, die suspendierte Teilchen mit einer größeren Dichte als derjenigen des Restes der Testzusammensetzung enthält, der Zentrifugation unterworfen werden, um die Teilchen zu einer Meßzone zu entfernen, wo sie anschließend beispielsweise mit einer Elektrode in Kontakt gebracht werden, um die Elektrochemolumineszenz zu induzieren, oder bei der sie direkt während des Zentrifugationsschrittes mit einer Elektrode in Kontakt gebracht werden.
  • Bei dieser Ausführungsform ist die Meßzelle mit Mitteln zum schnellen Rotieren der Probe und dem Probenbehältnis versehen. Zentrifugalkräfte verursachen das Wandern der Teilchen in der Probe nach außen weg von der Rotationsachse des Probenbehältnisses und ein Ansammeln an der äußeren Oberfläche des Probenbehältnisses. Die äußere Oberfläche solcher Probenbehältnisse können die Arbeitselektrode eines ECL-Meßsystemes aufbauen.
  • In einer dritten Ausführungsform können die Teilchen mittels Filtration aus der Testzusammensetzung entfernt werden. Bei dieser Ausführungsform müssen die Teilchen keine größere Dichte als diejenige des Rests der Testzusammensetzung aufweisen. Die Teilchen werden aus der Lösung abgetrennt und konzentriert, indem man die Lösung durch einen Filter beispielsweise mittels Pumpen zieht und die Teilchen auf der Oberfläche des Filters sammelt. Diese Filteroberfläche ist beispielsweise mit einem dünnen Metallfilm beschichtet, der als Arbeitselektrode in einem ECL-Detektionssystem dienen kann.
  • Die suspendierten Teilchen sind magnetisch ansprechbar, das heißt sie können paramagnetisch oder ferromagnetisch sein, und werden in einer Meßzone oder vorzugsweise direkt an der Oberfläche einer Elektrode gesammelt, indem man ein Magnetfeld auf die Teilchen aufbringt. Die Meßzelle ist mit einem Magneten ausgestattet. Das Magnetfeld des Magneten bringt eine Kraft auf die Teilchen auf, wenn sie in der Chargenzelle verweilen oder wenn sie durch eine Durchflußzelle strömen, was die Trennung derselben von der Hauptmenge der Lösung auf die Oberfläche der Zelle verursacht, die sich in nächster Nähe zum Magneten befindet. Wenn der Magnet in geeigneter Orientierung und in nächster Nähe zur Arbeitselektrode eines ECL-Detektionssystems angeordnet ist, konzentrieren sich die Teilchen auf der Oberfläche der Arbeitselektrode auf.
  • Zahlreiche verschiedene heterogene und homogene Formate des Bindungstests können unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren zum Sammeln und Aufkonzentrieren des Komplexes auf der Oberfläche einer Elektrode implementiert werden. Bei einem heterogenen Bindungstest wird der Komplex aus der Zusammensetzung abgetrennt, bevor die Lumineszenz des Marken gemessenen wird. Bei homogenen Tests erfolgt keine Trennung von gebundenem (an die Festphase) und ungebundenem markierten Reagenz.
  • Bei einem heterogenen Test ist das gemessene Signal des Markers, wenn der Komplex auf der Oberfläche der Arbeitselektrode aufkonzentriert ist, viel größer als es in Abwesenheit eines Sammelschrittes wäre. Das Signal des nicht-komplexierten markierten Reagenz bleibt im Gegensatz dazu unverändert. Somit ist trotz der Anwesenheit des unkomplexierten markierten Reagenz in der Meßzelle das Signal des gesammelten Komplexes stärker als in einem Test ohne die Ansammlung des Komplexes. Die Nachweisgrenze für den Bindungstest ist als Folge des Sammelvorgangs wesentlich verbessert.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird in in-situ-Trennschritt in das homogene Bindungstestverfahren aufgenommen. Nachdem die Testzusammensetzung, das heißt die Probe, die Testdurchführungssubstanz und die Teilchen in die Meßzelle gepumpt worden sind und der Komplex auf der Arbeitselektrode gefangen wurde, wird ein zweites Fluid durch die Zelle gepumpt, das frei von Marker oder markiertem Reagenz ist, wodurch eine in-situ-Waschung oder -Trennung des Komplexes von ungebundenen oder nicht gebundenen Komponenten der Testzusammensetzung erfolgt. Dieses Testverfahren ist technisch ein heterogener Bindungstest. Die Möglichkeit, die Trennung innerhalb der Meßzelle durchzuführen, ist jedoch vorteilhaft dahingehend, daß sie keine zusätzliche Trennvorrichtung erfordert und das Verfahren im . allgemeinen wesentlich schneller als externe Trennverfahren ist.
  • Heterogene Bindungstests können unter Verwendung der Erfindung durchgeführt werden, indem man die Komponenten der Testzusammensetzung mischt und für eine bestimmte Zeitspanne miteinander reagieren läßt. Die Testzusammensetzung wird anschließend einem Trennschritt unterworfen, währenddessen die Lösung von den Teilchen abgetrennt wird. Anschließend wird die Elektrochemolumineszenz entweder des Komplexes oder der Lösung gemessen. Die Messung der ECL des Komplexes nach dem Aufkonzentrierungsschritt gestattet die Messung eines Analyten mit besserer Genauigkeit und mit einer niedrigeren Nachweisgrenze als dies ohne Aufkonzentrierung möglich ist.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung wie auch andere Aufgaben und Merkmale derselben werden deutlicher und vollständiger aus der folgenden Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen.
  • Die Erfindung ist in breitem Umfang auf interessierende Analyten anwendbar, die Bindungsreaktionen eingehen können. Diese Reaktionen schließen beispielsweise Antigen-Antikörper-, Ligand-Rezeptor-, DNS- und RNS-Interaktionen sowie andere bekannte Reaktionen ein. Die Erfindung betrifft verschiedene Verfahren und Tests für den qualitativen und quantitativen Nachweis der Anwesenheit solcher interessierenden Analyten in einer Mehrkomponentenprobe.
  • Die Proben
  • Die Probe, die den interessierenden Analyten enthalten kann und in fester Form, als Emulsion, Suspension, Flüssigkeit oder Gas, vorliegen kann, kann abgeleitet werden beispielsweise von Zellen und von Zellen abgeleiteten Produkten, Wasser, Nahrungsmitteln, Blut, Serum, Haar, Schweiß, Urin, Feces (Kot), Gewebe, Speichel, Ölen, organischen Lösungsmitteln oder Luft. Die Probe kann weiter beispielsweise Wasser, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, n-Methylpyrrolidon oder Alkohole oder Mischungen derselben umfassen.
  • Die Analyten
  • Typische interessierende Analyten sind eine ganze Zelle oder ein Oberflächenantigen, subzelluläre Teilchen, ein Virus, ein Prion, ein Viroid, ein Antikörper, ein Antigen, ein Hapten, eine Fettsäure, eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Lipoprotein, ein Polysaccharid, ein Lipopolysaccharid, ein Glycoprotein, ein Peptid, ein Polypeptid, ein Zellmetabolit, ein Hormon, ein pharmazeutisches Mittel, ein synthetisches organisches Molekül, ein organometallisches Molekül, ein Tranquilizer, ein Barbiturat, ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure, ein Zucker, ein Lectin, ein rekombinantes oder abgeleitetes Protein, Biotin, Avidin, Streptavidin oder ein anorganisches Molekül, vorhanden in der Probe. Typischerweise liegt der interessierende Analyt in einer Konzentration von 10–3 Molar oder darunter, beispielsweise so niedrig wie 10–12 Molar oder darunter, vor.
  • Testdurchführungssubstanz
  • Die Testdurchführungssubstanz, die mit der den interessierenden Analyten enthaltenden Probe kombiniert wird, enthält mindestens eine aus der Gruppe ausgewählte Substanz, die besteht aus: (i) zugesetztem interessierendem Analyten oder dessen Analogon, wie oben definiert, (ii) einem Bindungspartner des interessierenden Analyten oder von dessen Analogon und (iii) eine reaktive Komponente, wie oben definiert, die mit (i) oder (ii) binden kann, worin eine der Substanzen an eine Verbindung oder Gruppe gebunden ist, beispielsweise eine ECL-Gruppe, die zur Lumineszenz induziert werden kann. Die markierte Substanz kann eine ganze Zelle oder ein Oberflächenartigen, ein subzelluläres Teilchen, ein Virus, ein Prion, ein Viroid, ein Antikörper, ein Antigen, ein Hapten, ein Lipid, eine Fettsäure, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid, ein Glycoprotein, ein Peptid, ein Polypeptid, ein Zellmetabolit, ein Hormon, ein pharmazeutisches Mittel, ein Tranquilizer, ein Barbiturat, ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure, ein Zucker, ein nichtbiologisches Polymer (vorzugsweise löslich), ein Lectin, ein rekombinantes oder abgeleitetes Protein, ein synthetisches organisches Molekül, ein organometallisches Molekül, ein anorganisches Molekül, Biotin, Avidin oder Streptavidin sein. Bei einer Ausfuhrungsform ist das Reagenz eine elektrochemolumineszente Gruppe, gebunden an einen Antikörper, ein Antigen, eine Nukleinsäure, ein Hapten, eine kurze Nukleotidsequenz, ein Oligomer, einen Liganden, ein Enzym oder Biotin, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G oder Komplexe derselben oder auch andere sekundäre Bindungspartner, die an einem primären Bindungspartner über Proteinwechselwirkungen binden können.
  • Analoga des interessierenden Analyten, die natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein können, sind typischerweise Verbindungen, die dem Analyten vergleichbare Bindungseigenschaften aufweisen, können jedoch ebenso Verbindungen mit höherer oder geringerer Bindungsfähigkeit sein. Die reaktive Komponente, welche den Analyten oder sein Analogon und/oder mit einem Bindungspartner desselben binden kann und über die die ECL-Gruppe an den Analyten gebunden werden kann, ist geeigneterweise ein zweiter Antikörper oder ein Protein wie Protein A oder Protein G oder Avidin oder Biotin oder eine andere Komponente, von der im Stand der Technik bekannt ist, daß sie Bindungsreaktionen eingeht.
  • Die Marker
  • Vorteilhafterweise stellen die ECL-Gruppen Metallchelate dar. Das Metall des Chelats ist geeigneterweise ein solches Metall, daß das Metallchelat unter den elektrochemischen Bedingungen, die auf das fragliche Reaktionssystem aufgebracht werden, luminesziert. Bei dem Metall des Metallchelats handelt es sich beispielsweise um ein Übergangsmetall (wie ein d-Block-Übergangsmetall) oder ein Seltenerdmetall. Bei dem Metall handelt es sich vorzugsweise um Ruthenium, Osmium, Rhenium, Iridium, Rhodium, Platin, Indium, Palladium, Molybdän, Technetium, Kupfer, Chrom oder Wolfram. Besonders bevorzugt sind Ruthenium und Osmium.
  • Die Liganden, die an das Metall in diesen Chelaten gebunden sind, sind üblicherweise heterocyclischer oder organischer Natur und spielen bei der Bestimmung eine Rolle, ob das Metallchelat in einer wäßrigen Umgebung, in einer organischen oder anderen nichtwäßrigen Umgebung löslich ist oder nicht. Die Liganden können mehrzähnig sein und können substituiert sein. Mehrzähnige Liganden schließen aromatische und aliphatische Liganden ein. Geeignete aromatische, mehrzähnige Liganden schließen aromatische heterocyclische Liganden ein. Bevorzugte aromatische heterocyclische Liganden sind stickstoffhaltig wie beispielsweise Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl und Phenathrolyl. Geeignete Substituenten schließen beispielsweise Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl, substituiertes Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxy, Imino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidin, Ureid, schwefelhaltige Gruppen, phosphorhaltige Gruppen und die Carboxylatester des N-Hydroxysuccinimids ein. Das Chelat kann einen oder mehrere einzähnige Liganden aufweisen, von denen eine große Vielzahl im Stand der Technik bekannt ist. Geeignete einzähnige Liganden schließen beispielsweise Kohlenmonoxid, Cyanide, Isocyanide, Halide und aliphatische, aromatische und heterocyclische Phosphine, Amine, Stilbene und Arsine ein.
  • Beispiele geeigneter Chelate sind das bis-[(4,4'-Carbomethoxy)-2,2'-bipyridin]-2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolan-Ruthenium (II); das bis-(2,2'-Bipyridin)-[4-(butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]-Ruthenium (II); das bis-(2,2'-Bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2-bipyridin-4'-yl)buttersäure]-Ruthenium (II); das tris-(2,2'-Bipyridin)-Ruthenium (II); das (2,2'-Bipyridin)-(bis-bis-(1,2-diphenylphosphino)ethylen]-2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-dioxolan-Osmium (II); das bis-(2,2'-Bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin)butylamin]-Ruthenium (II); das bis-(2,2'-Bipyridin)-[1-brom-4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan]-Ruthenium (II); und das bis-(2,2'-Bipyridin)-maleimidohexansäure, 4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamid-Ruthenium (II).
  • Andere ECL-Reste sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 87/06706 und der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 89/04302 beschrieben.
  • Die Funktion der ECL-Gruppen besteht darin, daß sie elektromagnetische Strahlung als Folge der Einführung von elektrochemischer Energie in das Reaktionssystem emittieren. Um dies zu tun, müssen sie zu einem angeregten Energiezustand stimuliert werden können und auch elektromagnetische Strahlung wie ein Lichtphoton beim Absteigen aus dem angeregten Zustand emittieren können. Ohne sich durch eine theoretische Analyse des Mechanismus des Beitrags der ECL-Gruppen zur Elektrochemolumineszenzreaktion binden zu wollen, nehmen wir an, daß diese durch die Einführung von elektrochemischer Energie in das Reaktionssystem oxidiert wird und anschließend durch Wechselwirkung mit einem Reduktionsmittel, welches im System vorhanden ist, in den angeregten Zustand überführt wird. Dieser Zustand ist relativ instabil und das Metallchelat fällt schnell in einen stabileren Zustand zurück. Während es dieses tut, gibt das Chelat elektromagnetische Strahlung wie ein Lichtphoton ab, die detektierbar ist.
  • Die Menge an gemäß der Erfindung inkorporiertem Metallchelat oder anderer metallhaltiger ECL-Gruppen wird von System zu System variieren. Im allgemeinen wird diejenige Menge einer solchen Gruppe verwendet, welche Menge wirksam zur Emission einer detektierbaren und, falls gewünscht, quantifizierbaren Emission elektromagnetischer Energie aus der oben erwähnten Zusammensetzung oder System führt. Die Detektion und/oder Quantifizierung eines interessierenden Analyten erfolgt typischerweise über einen Vergleich der Lumineszenz aus einer einen interessierenden Analyten und eine ECL-Gruppe enthaltenden Probe mit der Lumineszenz, die von einem Kalibrierungsstandard emittiert wird, der mit bekannten Mengen des interessierenden Analyten und der ECL-Gruppe entwickelt wurde. Dieses setzt ein homogenes Format voraus. Im heterogenem Modus wird, wie oben angesprochen, vor der ECL-Analyse eine Trennung durchgeführt.
  • Wie dem Durchschnittsfachmann ersichtlich ist, werden sich die Identität und die Menge der metallhaltigen ECL-Gruppe von einem System zum anderen unterscheiden in Abhängigkeit von den vorliegenden Bedingungen. Die geeignete metallhaltige ECL-Gruppe und eine ausreichende Menge derselben zum Erhalt des gewünschten Ergebnisses läßt sich empirisch vom Durchschnittsfachmann ohne ungebührliches Experimentieren bestimmen, sobald dieser mit der hier gegebenen Lehre ausgestattet wird.
  • Die Teilchen
  • Die Teilchen umfassen mikroteilchenförmiges Material mit einem Durchmesser von 0,01 um, vorzugsweise 0,5 μm bis 10 μm, einer Dichte, die von 0,5 bis 2 g/ml reicht, und einer Oberflächenkomponente, die mit dem Analyten und/oder einem oder mehreren der oben definierten Substanzen binden kann, Beispielsweise kann das mikroteilchenförmige Material quervernetzte Stärke, Dextrane, Cellulose, Proteine, organische Polymere, ein Styrolcopolymer wie ein Styrol/Butadien-Copolymer, ein Acrylnitril/Butadien/Styrol-Copolymer, ein Vinylacetyl/Acrylat-Copolymer oder ein Vinylchlorid/Acrylat-Copolymer, inerte anorganische Teilchen, Chromdioxid, Oxide des Eisens, Silika (Siliziumdioxid), Silikagemische und proteinhaltiges Material oder Mischungen derselben darstellen. Wünschenswerterweise sind die Teilchen im ECL-System suspendiert. Die Teilchen können magnetisch ansprechbare Teilchen sein oder diese umfassen.
  • Testmedien
  • Um ein System zu betreiben, in das eine Elektrode elektrochemische Energie einführt, ist es notwendig, einen Elektrolyten bereitzustellen, in den die Elektrode eingetaucht wird und welcher die ECL-Gruppe enthält. Der Elektrolyt ist eine Phase, durch die eine Ladung mittels Ionen getragen wird. Im allgemeinen ist der Elektrolyt in flüssiger Phase und stellt eine Lösung aus einem oder mehreren Salzen oder anderer Spezies in Wasser, einer organischen Flüssigkeit oder einer Mischung aus organischen Flüssigkeiten oder einer Mischung aus Wasser und einem oder mehreren organischen Flüssigkeiten dar. Andere Formen von Elektrolyten sind jedoch ebenso geeignet in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung. Beispielsweise kann der Elektrolyt eine Dispersion von einer oder mehreren Substanzen in einem Fluid – beispielsweise einer Flüssigkeit, einem Dampf oder einem superkritischen Fluid – oder eine Lösung von einer oder mehreren Substanzen in einem Feststoff, einem Dampf oder einem superkritischen Fluid darstellen.
  • Bei dem Elektrolyten handelt es sich geeigneterweise um eine Lösung eines Salzes in Wasser. Bei dem Salz kann es sich vorzugsweise um ein Natriumsalz oder ein Kaliumsatz handeln, die Einarbeitung anderer Kationen ist jedoch in bestimmten Ausführungsformen ebenso geeignet, solange das Kation nicht mit der elektrochemolumineszenten Wechselwirkungssequenz interferiert. Bei dem Anion des Salzes kann es sich beispielsweise um ein Phosphat handeln, die Verwendung anderer Anionen ist jedoch in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ebenfalls gestattet, wiederum solange das gewählte Anion nicht mit der elektrochemolumineszenten Wechselwirkungssequenz interferiert.
  • Die Zusammensetzung kann außerdem nichtwäßriger Natur sein. Während superkritische Fluide in bestimmten Fällen vorteilhaft verwendet werden können, ist es typischer, einen Elektrolyten zu verwenden, der eine organische Flüssigkeit in einer nichtwäßrigen Zusammensetzung umfaßt. Wie bei einem wäßrigen Elektrolyten ist auch der nichtwäßrige Elektrolyt eine Phase, durch die Ladung mittels Ionen getragen wird. Normalerweise meint dies, daß ein Salz in dem organischen flüssigen Medium gelöst ist. Beispiele geeigneter organischer Flüssigkeiten sind Acetonitril, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Methanol, Ethanol und Mischungen aus zwei oder mehr der oben genannten. Als veranschaulichendes Beispiel können Tetraalkylammoniumsalze wie Tetrabutylammoniumtetrafluorborat, die in organischen Flüssigkeiten löslich sind, mit diesen zur Bildung eines nichtwäßrigen Elektrolyten verwendet werden.
  • Bei dem Elektrolyten handelt es sich in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung um ein gepuffertes System. Phosphatpuffer sind oft von Vorteil. Beispiele sind eine wäßrige Lösung von Natriumphosphat/Natriumchlorid und eine wäßrige Lösung von Natriumphosphat/Natriumfluorid.
  • Andere Testkomponenten
  • Wie in der veröffentlichten PCT-Anmeldung US 89/004859 mit dem Titel Elektrochemolumineszente Reaktionen unter Verwendung eines von einem Amin abgeleiteten Reduktionsmittels beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird, ist es wünschenswert, ein Reduktionsmittel, typischerweise ein Amin oder eine Amingruppe (aus einem größeren Molekül) zu umfassen, das oxidiert werden und sich spontan zersetzen kann, um es in eine stark reduzierende Spezies umzuwandeln. Es wird angenommen, daß das Amin oder die Amingruppe ebenfalls von der in das Reaktionssystem eingeführten elektrochemischen Energie oxidiert wird. Das Amin oder die Amingruppe verliert ein Elektron und wird dann deprotoniert oder lagert sich selbst zu einem starken Reduktionsmittel um. Dieses Mittel wechselwirkt mit der oxidierten metallhaltigen ECL-Gruppe und veranlaßt diese, den angeregten Zustand, wie oben angesprochen, anzunehmen. Um seine Rolle zu erfüllen, weist das Amin oder die Amingruppe vorzugsweise ein Radikal mit Kohlenstoffzentrum und mit einem Elektron auf, das von einem solchen Kohlenstoff abgegeben werden kann, sowie ein α-Kohlenstoffatom, das anschließend als Protonendonor während der Deprotonierung fungieren kann, um das Reduktionsmittel zu bilden. Das von einem Amin abgeleitete Reduktionsmittel stellt den notwendigen Stimulus zur Überführung der metallhaltigen ECL-Gruppe in ihren angeregten Zustand bereit, aus dem nachweisbare elektromagnetische Strahlung emittiert wird.
  • Ein weiter Bereich von Aminen und entsprechenden Amingruppen kann bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Im allgemeinen wird das Amin oder die Amingruppe so gewählt, daß es bzw. sie zum pH des Systems paßt, das elektrochemolumineszent analysiert werden soll. Ein anderer relevanter Faktor besteht darin, daß das Amin oder die Amingruppe mit der Umgebung, in der es bzw. sie während der Analyse funktionieren muß, kompatibel sein muß, das heißt kompatibel mit einer wäßrigen oder nichtwäßrigen Umgebung je nach Lage des Falles. Eine weitere Betrachtung besteht darin, daß das gewählte Amin oder die gewählte Amingruppe ein von einem Amin abgeleitetes Reduktionsmittel unter den vorliegenden Bedingungen bilden sollte, welches stark genug ist, um die oxidierte metallhaltige ECL-Gruppe im System zu reduzieren.
  • Amine (und entsprechende, davon abgeleitete Gruppen), die vorteilhaft in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind aliphatische Amine, wie primäre, sekundäre und tertiäre Alkylamine, deren Alkylgruppen jeweils ein bis drei Kohlenstoffatome aufweisen, sowie auch substituierte aliphatische Amine. Tripropylamin ist ein besonders bevorzugtes Amin, da es zu, vergleichend gesagt, besonders hochintensiver Emission von elektromagnetischer Strahlung fährt, was die Sensitivität bzw. Empfindlichkeit und Genauigkeit des Nachweises und der Quantifizierung der Ausführungsformen, in denen es verwendet wird, fördert. Ebenso geeignet sind Diamine wie Hydrazin und Polymine wie Poly(ethylenimin). Beispiele anderer für die Ausführung der Erfindung geeigneter Amine sind Triethanolamin, Triethylamin, 1,4-Diazabicyclo-(2.2.2)-octan, 1-Piperidinethanol, 1,4-Piperazin-bis-(ethansulfonsäure), Triisopropylamin und Poly(ethylenimin).
  • Typischerweise ist die in der vorliegenden Erfindung verwendete metallhaltige ECL-Gruppe der reaktionsbegrenzende Bestandteil. Dementsprechend ist es ebenfalls typisch, daß das Amin oder die Amingruppe in stöchiometrischem Überschuß bezogen auf dieselbe bereitgestellt wird. Veranschaulichend wird das Amin oder die Amingruppe in einer Konzentration von 50 bis 150 mM verwendet. Für die Verwendung bei einem pH von etwa 7 ist eine Konzentration von 100 mM häufig vorteilhaft. In bestimmten Ausführungsformen wird die obere Grenze der Amin- oder Amingruppen-Konzentration durch die maximale Löslichkeit des Amins oder der Amingruppe in der Umgebung bestimmt, in der es verwendet werden soll, beispielsweise in Wasser. Im allgemeinen wird diejenige Menge an Amin oder Amingruppe verwendet, die ausreicht, die Umwandlung der oxidierten metallhaltigen ECL-Gruppe in ihren angeregten Zustand zu bewirken, so daß Lumineszenz auftritt. Der mit der hier gegebenen Lehre ausgestattete Durchschnittsfachmann kann die Menge an Amin oder Amingruppe, die für das spezielle, zu analysierende System vorteilhafter Weise verwendet werden sollte, empirisch ohne übermäßiges Experimentieren bestimmen.
  • Wie in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 90/05302 beschrieben, werden die Tests der Erfindung wünschenswerter weise in Anwesenheit eines Verstärkers durchgeführt, typischerweise einer Verbindung der Formel
    Figure 00280001
    worin R Wasserstoff oder CnHn2+1, R' CnHn2n, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist. Vorzugsweise kann n von 1 bis 4 sein. Spezifische Beispiele sind im Handel unter dem Namen Triton X-100 erhältliche Substanzen der Formel
    Figure 00280002
    worin x 9 bis 10 ist sowie eine Substanz, die im Handel unter dem Namen Triton N-401 (NPE-40) erhältlich ist, der Formel
    Figure 00280003
    worin x = 40 ist. Der Verstärker wird im allgemeinen in einer ausreichenden Menge verwendet, so daß in seiner Anwesenheit die gewünschte Steigerung der Emission an elektromagnetischer Strahlung auftritt. Typischerweise liegt die Menge bei 0,01 % bis 5,0 %, spezifischer bei 0,1 % bis 1,0 % (Volumen/Volumen).
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete ECL-Gruppe wird zur Emission elektromagnetischer Strahlung induziert, indem man sie in einen angeregten Zustand stimuliert. Dies erfolgt durch Exposition des Systems, in dem sich die ECL-Gruppe befindet, an elektrochemische Energie. Das Potential, bei dem die Oxidation der ECL-Gruppe und der ein starkes Reduktionsmittel bildenden Spezies auftritt, hängt von den genauen chemischen Strukturen derselben sowie von Faktoren wie dem pH des Systems und der Natur der Elektrode, die zum Einführen der elektrochemischen Energie verwendet wird, ab. Es ist dem Durchschnittsfachmann bekannt, wie das optimale Potential und die Emissionswellenlänge eines Elektrochemolumineszenzsystems bestimmt werden. Bestimmte bevorzugte Verfahren der Stimulation des ECL-Systems sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 89/10551 offenbart.
  • Vorrichtung zum Messen der Elektrochemolumineszenz
  • Eine Vorrichtung zur Durchführung der Tests der Erfindung wird in den 1 und 2 beschrieben. 1 offenbart eine vorteilhafte ECL-Vorrichtung, die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht auf die Anwendung in Vorrichtung 10 beschränkt, sondern können ebenso in anderen Arten von ECL-Vorrichtungen angewandt werden, die eine Arbeitselektrode oder eine andere Oberfläche zum Triggern umfassen, um elektrochemische Energie zum Triggern der ECL-Gruppe zur Elektrochemolumineszenz bereitzustellen. Während die Verfahren der Erfindung sowohl im statischen als auch im Durchflußmodus durchgeführt werden können, schließt die Vorrichtung 10 eine Durchflußzelle ein, die bestimmte Vorteile für zahlreiche Probenarten bietet, eingeschlossen Proben für Bindungstests. Weitere Details der Vorrichtung zum Durchführen der ECL-Tests der Erfindung sind in der WO 90/05411 und WO 90/11511 offenbart.
  • Die Vorrichtung 10 umfaßt eine elektrochemische Zelle 12, ein Lichtnachweis/-meßbauteil 14, bei dem es sich vorteilhafterweise um eine Fotomultiplier-Röhre (PMT), eine Fotodiode, ein ladungsgekoppeltes Bauteil, einen fotografischen Film oder Emulsion oder ähnliches handeln kann, sowie eine Pumpe 16, die vorzugsweise eine peristaltische Pumpe ist, um für den Fluidtransport zur, durch und aus der Zelle 12 zu sorgen. Alternativ kann eine Verdränger-Vakuumpumpe verwendet werden. Ein Shutter- oder Blendenmechanismus 18 ist zwischen der Zelle 12 und der PMT 14 vorgesehen und wird steuerbar soweit betrieben, daß er sich nur soweit öffnet, damit die PMT 14 während der ECL-Meßperioden an die Zelle 12 exponiert wird. Der Blendenmechanismus kann beispielsweise während der Reinigung oder des Haltens geschlossen sein. Ebenfalls in der Vorrichtung 10 umfaßt, jedoch in 1 nicht gezeigt, ist ein lichtdichtes Gehäuse, in dem die verschiedenen Komponenten befestigt werden sollen und welches die PMT 14 vor jeglichem äußeren Licht während der ECL-Messungen abschirmen soll.
  • Die Zelle 12 selbst umfaßt einen ersten Befestigungsblock 20, durch den eine Einlaßleitung 22 und eine Auslaßleitung 24 hindurchführen, die vorteilhafterweise aus rostfreiem Stahl bestehen. Der Befestigungsblock 20 weist eine erste äußere Oberfläche 26 und eine zweite innere Oberfläche 28 auf, die eine Seite eines Probenaufnahmevolumens 30 der Zelle 12 definiert, in dem die Zelle 12 die Reinigungs- und/oder Konditionier- und/oder Meßlösungen während der entsprechenden Operationen der Vorrichtung 10 aufnimmt. Die Einlaß- und Auslaßleitungen 22 und 24 führen durch den Befestigungsblock 20 von der äußeren Oberfläche 26 zur inneren Oberfläche 28 und öffnen sich in das Probeaufnahmevolumen 30. Ein zweiter Befestigungsblock 32, der vorteilhafterweise aus rostfreiem Stahl besteht, weist ebenfalls eine erste äußere Oberfläche 34 und eine zweite innere Oberfläche 36 auf. Der zweite Befestigungsblock 32 ist vom ersten Befestigungsblock 20 mit Hilfe eines ringförmigen Abstandshalters 38 getrennt, der vorteilhafterweise aus Teflon oder einem anderen nicht kontaminierbaren Material besteht. Somit definiert die äußere Oberfläche 34 des Befestigungsblocks 32 einen Teil der zweiten Seite des Probeaufnahmevolumens 30. Der Abstandshalter 38 weist einen äußeren Teil 40 und eine zentrale Öffnung 42 auf, deren innere Kante 44 die Seitenwandung des Probenaufnahmevolumens 30 definiert. Der äußere Teil 40 versiegelt die innere Oberfläche 28 des ersten Befestigungsblocks 20 mit der äußeren Oberfläche 34 des zweiten Befestigungsblocks 32, um das Austreten jeglicher Lösung aus dem Probeaufnahmevolumen 30 zwischen den beiden Oberfläche 28 und 34 zu verhindern. Der Befestigungsblock 32 weist weiterhin eine zentrale Öffnung 46 auf, in der ein Fenster 48 versiegelt eingepaßt ist, um den Rest der zweiten Seite des Probeaufnahmevolumens 30 als Fortsetzung der äußeren Oberfläche 34 zu definieren. Das Fenster 48 besteht aus einem Material, das bei der Wellenlänge des von der ECL-Gruppe emittierten Elektrochemolumineszenzlichts im wesentlichen transparent ist. Das Fenster 48 ist daher vorteilhafterweise aus Glas, Plastik, Quarz oder dergleichen gebildet.
  • Die Einlaßleitung 22 trifft an einem ersten Ende 50 desselben auf das Probeaufnahmevolumen 30, in der Nähe des Abstandshalters 38, und die Auslaßleitung 24 schneidet das Probeaufnahmevolumen 38 an einem zweiten Ende 52 desselben, in der Nähe des Abstandshalters 38. Die Kombination aus Einlaßleitung 22, Probeaufnahmevolumen 30 und Auslaßleitung 24 stellt so einen kontinuierlichen Durchstrompfad für den engen, im wesentlichen laminaren Strom einer Lösung zur, durch und aus der Zelle 12 bereit. Die Pfeile A und B zeigen die Strömung in die Einlaßleitung 22 bzw. aus der Auslaßleitung 24 heraus an.
  • Auf der inneren Oberfläche 28 des ersten Befestigungsblocks 20 ist ein Arbeitselektrodensystem 54 befestigt, welches in der veranschaulichten Ausführungsform eine erste und zweite Arbeitselektrode 56 bzw. 58 umfaßt. Bei anderen Ausführungsformen kann eine einzelne Arbeitselektrode vorteilhafterweise bereitgestellt werden oder kann nur die Elektrode 56 eine Arbeitselektrode sein. Die Arbeitselektroden 56, 58 sind die Orte, an denen die elektrochemischen und ECL-Reaktionen von Interesse ablaufen können. Die Arbeitselektroden 56, 58 sind feste voltametrische Elektroden und können daher vorteilhafterweise aus Platin, Gold, Kohlenstoffen oder anderen Materialien aufgebaut sein, die zu diesem Zweck wirksam sind. Drahtverbindungen 60 und 62, die mit den Arbeitselektroden 56 bzw. 58 verbunden sind, führen durch den ersten Befestigungsblock 20 nach außen.
  • Die Verbindungen 60 und 62 werden beide mit einem ersten Arbeitselektrodenterminal 64 einer Spannungssteuerung 66 verbunden, wie in 2 gezeigt. Die Spannungssteuerung 66 arbeitet vorteilhafterweise in der Art eines Potentiostaten, um Spannungssignale an den Arbeitselektroden 56, 58 bereitzustellen und wahlweise während einer ECL-Messung von diesen abfließende Ströme zu messen. Alternativ können die Leitun gen 60 bzw. 62 mit verschiedenen Terminals der Spannungskontrolle 66 für unabhängigen Betrieb verbunden sein.
  • Der Potentiostatbetrieb der Spannungskontrolle 66 wird außerdem über eine Gegenelektrode 68 und wahlweise, jedoch vorteilhafterweise eine Bezugs- oder Referenzelektrode 70 bewirkt. In der veranschaulichten Ausführungsform besteht der Befestigungsblock 32 aus rostfreiem Stahl und die Gegenelektrode 68 besteht aus den exponierten Oberflächen 72, 74 des Befestigungsblockes 32. Die Gegenelektrode 72, 74 und die Arbeitselektroden 56, 58 stellen die Schnittfläche zum Aufbringen der Spannung auf die Lösung im Probeaufnahmevolumen 30 bereit, welche die chemischen Reaktionen energetisiert und die Elektrochemolumineszenz in der Probe triggert und/oder die Energie für Reinigung und Konditionierung der Oberflächen der Zelle 12 bereitstellt. Die Gegenelektrode 72, 74 ist über eine Drahtleitung 76 mit einem zweiten "Gegenelektroden"-Terminal 78 der Spannungssteuerung 66 verbunden.
  • Die Referenzelektrode 70 stellt eine Bezugsspannung bereit, auf die die auf die Arbeitselektroden 56, 58 aufgebrachte Spannung bezogen wird, beispielsweise +1,2 Volt gegenüber der Referenz. Die Referenzelektrode 70 ist vorteilhafterweise in der Auslaßleitung 24 in einer Position 80 angeordnet, die von der Zelle 12 beabstandet ist, und ist über eine Drahtleitung 82 mit einem dritten, "Referenzelektroden"-Terminal 84 der Spannungssteuerung 66 verbunden. Im Drei-Elektroden-Modus muß kein Strom durch die Referenzelektrode 70 fließen. Die Referenzelektrode 70 kann im Drei-Elektroden-Modus des Betriebs eingesetzt werden, um eine vergiftete, bekannte und stabile Spannung bereitzustellen und besteht daher vorteilhafterweise aus Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl) oder stellt eine gesättigte Calomelelektrode (SCE) dar. Die Spannungssteuerung 66 kann in einem Zwei-Elektroden-Modus des Betriebs unter Verwendung nur der Arbeitselektrode 56 und der Elektrode 58 als Gegen-/Referenzelektrode betreibbar sein. In diesem Zwei-Elektroden-Modus des Betriebs ist die Gegen-/Referenzelektrode 58 elektrisch mit den Spannungssteuerungsterminals 78 und 84 auf der Spannungssteuerung 66 verbunden. In diesem Falle arbeitet die Spannungssteuerung 66 im wesentlichen als Batterie. Die Spannungssteuerung 66 stellt Spannungssignale an den Arbeits- und Gegenelektroden 56 und 58 zur Verfügung und mißt wahlweise den durch die jeweiligen Elektroden fließenden Strom. Die Referenzelektrode 70 kann alternativ eine sog. "Quasi-Referenzelektrode" darstellen, die aus Platin, Gold, rostfreiem Stahl oder anderen Materialien besteht, die für eine weniger stabile Spannung sorgen, jedoch eine, die bezüglich der kontaktierten Lösung meßbar ist. Sowohl im Zwei- als auch im Drei-Elektroden-Modus dient die Referenzelektrode 70 bzw. 58 dem Zweck der Bereitstellung einer Referenz, gegen die die auf die Arbeitselektroden 56 aufgebrachte Spannung gemessen wird. Die vergiftete Spannungsreferenz wird gegenwärtig als vorteilhafter betrachtet. Die Spannungssteuerung 66 steuert im Potentiostatbetrieb die verschiedenen Elektroden, indem sie eine bekannte Spannung an der Arbeitselektrode 56, 58 bezogen auf die Referenzelektrode 70 bereitstellt, während sie den Stromfluß zwischen den Arbeitselektroden 56, 58 und der Gegenelektrode 72, 74 mißt. Potentiostaten für diese Zwecke sind wohlbekannt und die Innenstruktur der Spannungssteuerung 66 kann daher jedem der herkömmlichen, im Handel erhältlichen Potentiostaten entsprechen, die die oben genannten Funktionen erfüllen, und stellt dementsprechend per se keinen Teil der Erfindung dar. Tatsächlich kann die Vorrichtung 10 alternativ ohne eine interne Spannungssteuerung 66 konstruiert sein und kann so ausgelegt werden, daß sie an einen externen Potentiostaten angeschlossen wird, der getrennt gesteuert wird, um die erforderlichen Spannungssignale an den Elektroden 56, 58, 72, 74 und 70 bereitzustellen. Diese Spannungssignale, die auf spezifische Weise, wie unten beschrieben, aufgebracht werden, sorgen für wiederholbare Anfangsbedingungen für die Oberflächen der Arbeitselektroden 56, 58 und vorteilhafterweise für die Oberflächen der Zelle 12 insgesamt, ein Merkmal, das signifikant zur verbesserten Präzision bei den ECL-Messungen beiträgt.
  • Die Pumpe 16 ist vorteilhafterweise an der Auslaßleitung 24 angeordnet, um die Lösung aus einem Probenvolumen in Richtung des Pfeiles A in die Einlaßleitung 22 zu "ziehen". Die Lösung wird durch die Einlaßleitung 22, das Probeaufnahmevolumen 30 und die Auslaßleitung 22 an der Referenzelektrode 70 vorbei und hinaus in Richtung des Pfeiles B fließen. Alternativ kann die Pumpe 16 an der Einlaßleitung 22 angeordnet sein, um die Lösung durch die Vorrichtung 10 zu "drücken". Vorteilhafterweise wird derselbe Durchflußweg durch die Einlaßleitung 22, das Probeaufnahmevolumen 30 und die Auslaßleitung 24 für alle Lösungen und Fluide verwendet, die durch die Zelle 12 gelangen, wobei jedes Fluid eine hydrodynamische Reinigung durchführt, indem es das vorhergehende Fluid aus der Zelle 12 drängt. Die Pumpe 16 kann so gesteuert werden, daß sie ihre Wirkung aussetzt, um eine spezielle Lösung für eine beliebige Zeitspanne in der Zelle 12 zu halten.
  • Die Durchflußkonstruktion der Vorrichtung 10 gestattet es, auf die Arbeitselektroden eine variable Spannung aufzubringen oder diese kontinuierlich bei einem Prä-Betriebspotential zu halten, während sie kontinuierlich an eine oder mehrere Lösungen ausgesetzt sind, ohne die Arbeitselektroden 56, 58 (oder die Gegen- und Referenzelektroden 72, 74, 70) an Luft zu exponieren. Das Exponieren an Luft, das den Stromkreis zur Referenzelektrode 70 öffnet, gestattet unbekannte, statistische Spannungsschwankungen, die die Wiederholbarkeit bzw. Reproduzierbarkeit von Oberflächenbedingungen auf den Arbeitselektroden 56, 58 zerstören. Die Durchflußkonstruktion gestattet den schnellen Wechsel bzw. die schnelle Folge von initialisierenden Schritten, in denen das Elektrodensystem 54 gereinigt und konditioniert wird, und Meßschritten, in denen eine oder mehrere Meßwellenformen oder "Sweeps" die ECL triggern bzw. auslösen.
  • Die 23 und 24 zeigen schematisch eine Zelle und Magneten 27/37, die mit einem Magnetsystem ausgestattet ist, welches vorteilhaft Feldlinien aufbringt, die weitgehend parallel zur Ebene der Elektrodenoberfläche 56, 58 sind. Das Magnetsystem besteht aus einer Vielzahl von einzelnen Permanent- oder Elektromagneten, die gestapelt und so orientiert sind, daß sich die Nordpole und Südpole der Magneten 27/37 im Stapel abwechseln. Die einzelnen Magnete der Magnete 27/37 sind durch Luft oder anderes nichtmagnetisch ansprechbares Material getrennt. Die Anordnung, wie sie in den 23 und 24 gezeigt ist, bringt vorteilhafterweise magnetische Kraftlinien in den Bereich über der Arbeitselektrode ein, die nahezu horizontal zur Ebene der Elektrode sind. Dieses induziert eine Orientierung von magnetisch ansprechbaren Teilchen, in der die Teilchen auf der Oberfläche der Elektrode liegen und somit für die elektrochemische Energie, die von der Elektrode bereitgestellt wird, leicht zugänglich sind (siehe 20).
  • Das in den 23 und 24 gezeigte Magnetsystem 27/37 ist außerdem in der Hinsicht vorteilhaft, daß die magnetischen Feldlinien sich nicht über weiten Abstand von der Magnetstruktur erstrecken (siehe 20). Es ist daher nicht wahrscheinlich, daß das Magnetfeld aus einem solchen Magnetsystem ein permanentmagnetisches Verhalten oder ferromagnetische Materialien in der Nähe der Elektrodenvorrichtung induziert oder den Betrieb der Fotomultiplienöhre in der Nähe der Durchflußzelle stark beeinträchtigt. Die in 25 gezeigte Vorrichtung entspricht der in den 1 und 2 gezeigten und ist, wie oben im Hinblick auf die 1 und 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß in 25
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
  • Obwohl ein großer Bereich an Teilchen in den auf Teilchen basierenden Tests der Erfindung verwendet werden kann, haben die Teilchen eine Dichte von 0,5 bis 2 g/ml. Die Auswahl der optimalen Dichte liegt im allgemeinen Fachwissen, die Ablagerungsrate in auf Schwerkraft beruhenden Tests ist ein Kompromiß aus der Geschwindigkeit des Tests und dem Wunsch, eine gleichförmige Schicht des Komplexes auf der Elektronenoberfläche zu generieren.
  • Partikel mit einem breiten Bereich mittlerer Durchmesser können ebenfalls verwendet werden. Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,01 bis 10 μm können verwendet werden.
  • Weite Bereiche der Konzentration der Teilchen in der Testzubereitung können ebenfalls angewandt werden. Beispielsweise kann die Konzentration von 1 bis 10.000 μg/ml bis vorzugsweise von 5 bis 1000 μg/ml reichen. Wünschenswerterweise werden die Dichte der Teilchen, ihre Größe und ihre Konzentration so gewählt, daß sich die Teilchen mit einer Geschwindigkeit von mindestens 0,5 mm/Minute und vorzugsweise mit höherer Geschwindigkeit absetzen.
  • Im Filtermodus der Durchführung der Erfindung weist die Filtriervorrichtung wünschenswerterweise eine Porengröße, gemessen als mittlerer Durchmesser, von grob 0,01 bis 90 % des mittleren Durchmessers der Teilchen und vorzugsweise von 10 bis 90 % dieses Durchmessers auf.
  • Der Stand der Technik hat eine Anzahl magnetischer Teilchen beschrieben, die in den Tests der Erfindung eingesetzt werden können. Beispielsweise beschreiben die US-Patente der Nrn. 4,628,037, 4,695,392, 4,695,393, 4,698,302, 4,554,088, die britische Patentanmeldung GB 2,005,019 A und die EP 0 180 384 eine Vielzahl von magnetischen Teilchen, die erfolgreich angewandt werden können. Die Teilchen können paramagnetisch oder ferromagnetisch sein und können mit verschiedenen Materialien beschichtet sein, an die bindende Verbindungen (Andock-Verbindungen) gekuppelt sind, so daß die magnetischen Teilchen in einem Immunassay genutzt werden können. Wünschenswerterweise zeigen die in der Erfindung verwendeten magnetischen Teilchen eine Suszeptibilität von mindestens 0,001 cgs-Einheiten; wünschenswerterweise beträgt die Suszeptibilität mindestens 0,01 cgs-Einheiten. Die magnetischen Teilchen können einen breiten Bereich von Dichten haben, das heißt von im wesentlichen unterhalb derjenigen von Wasser, 0,01 bis 5 g/ml und vorzugsweise von 0,5 bis 2 g/ml. Die Teilchengröße kann von 0,001 bis 200, wie 0,001 bis 200 oder 0,05 bis 200 μm reichen und beträgt vorzugsweise von 0,01 bis 10 μm. Die Konzentration der Teilchen kann grob von 1 bis 10.000 μg/ml und vorzugsweise von 5 bis 1000 μg/ml betragen.
  • Wünschenswerterweise zeigen die verwendeten magnetischen Teilchen eine niedrige magnetische Resonanz, wie beispielsweise durch die EP 0 180 384 beschrieben, so daß sich die Teilchen nach Entfernen des magnetischen Feldes von der Elektrodenoberfläche entmagnetisieren und aus der Testzelle gespült werden können. Wünschenswerterweise werden die Dichte, die Konzentration und die Teilchengröße der magnetischen Teilchen so gewählt, daß die Absetzzeit mindestens 0,5 mm/Minute und wünschenswerterweise über dieser Geschwindigkeit beträgt. Beim Betrieb der magnetischen Zelle ist es oft wünschenswert, die Magnetvorrichtung vor dem Induzieren der Elektrochemolumineszenz von der Elektrodenoberfläche zu entfernen, um nicht mit dem Betrieb der Fotomultiplienöhre wechselzuwirken.
  • Tests
  • Unter Verwendung der Verfahren der Erfindung können eine Vielzahl von Tests durchgeführt werden.
  • Ein Test wurde, wie in 3 gezeigt, durchgeführt. Aus der Reaktion hervorgehende PCR-Produkte wurden mit Biotin und einem ECL-Marker (tris-(2,2'-Bipyridin)-Ru II, Ru (bpy)3 2+) markiert. Streptavidinkügelchen fingen die bifunktionalisierte DNS über die Bindung von Biotin an Streptavidin ein; an dieses schloß sich ein Waschschritt an. Das an die Kugeln gebundene Produkt wurde anschließend der Analyse zum Nachweis des ECL-Markers unterworfen.
  • Ein Test wurde, wie in 4 gezeigt, durchgeführt. Das biotinylierte PCR-Produkt wurde auf Streptavidinkügelchen gefangen und der nicht-biotinylierte Strang entfernt. Das an die Kugeln gebundene PCR-Produkt wurde anschließend mit einem ECL-markierten Oligonukleotid hybridisiert (Ru (bpy)3 2+). An dieses schloß sich die ECL-Analyse zum Nachweis des Markers an.
  • Ein Test wurde, wie in 5 gezeigt, durchgeführt. Die Hybriden wurden auf Streptavidinkügelchen gefangen. An dieses schloß sich eine ECL-Analyse ohne Waschen an.
  • Ein Test wurde durchgeführt und die Ergebnisse waren wie in 6 gezeigt. Der Test betraf die Anwesenheit von HPV16 und 18 unter Verwendung von DNS-Proben, die aus den Zell-Linien SiHa und HeLa, positiv für beide Virustypen, und von für jeden Virustyp spezifischen Oligonukleotiden durchgeführt wurden. Die Primer 2PV16, 2PV18 wurden biotinyliert, und die Primer 3PV16 und 3PV18 waren ECL-markierte Oligonukleotide. Die Oligonukleotide 2/3PV16 bzw. 2/3PV18 waren spezifisch für HPV16 bzw. HPV18. Die erhaltenen, auf Kugeln gefangenen ECL-Marker wurden unter Verwendung eines in 1 beschriebenen Analysators auf ECL analysiert. Die Ergebnisse wurden für jede Kombination von Probe und Primer als ECL-Zählraten aufgetragen.
  • Ein Test wurde durchgeführt und die Ergebnisse waren wie in 7 gezeigt. Der erhaltene, an Kugeln gebundene ECL-Marker wurde auf ECL unter Verwendung eines in 1 beschriebenen Analysators analysiert. Die Photonenzählraten der ECL-Peaks wurden gegen steigende Konzentrationen der HPV16-DNS, ausgedrückt als Verhältnis der vitalen Kopien zu gesamtzellulären DNS-Kopien, aufgetragen. Bei den in dieser Analyse auf HPV16 verwendeten Primern handelt es sich um 1PV16 (Biotin-Marker) und 2PV16 (ECL-Marker). Die für jede PCR verwendete DNS wurde unter Verwendung von Kalbsthymus-DNS konstant auf 1 μg gehalten.
  • Ein Test wurde durchgeführt und die Ergebnisse waren wie in 8 gezeigt. Die PCR wurde unter Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit nicht markiertem HRP1 (für die Sonden 1T24 und 1CHR) und biotinyliertem HRP1 mit nicht markiertem HRP2 (für die Sonden 2T24 und 2CHR) durchgeführt, wodurch an Kugeln gebundene einzelsträngige Ziele für die Hybridisierung erzeugt wurden. Bei den DNA-Proben handelt es sich um das normale Ha-ras-Gen (Placenta) und das mutante Ha-ras-Gen (NIH3T3-T24). Der Hybridisierung der an die Kügelchen gebundenen DNS mit ECL-markiertem 1T24 (1T24), ECL-markiertem 2T24 (2T24), ECL-markiertem 1CHR (1CHR) und ECL-markiertem 2CHR (2CHR) folgten Waschungen mit TEMAC. Die daraus resultierenden, an Kügelchen gebundenen ECL-Marker wurden auf ECL unter Verwendung eines in 1 beschriebenen Analysators analysiert. Die Ergebnisse wurden als ECL-Zählraten für jede Kombination aus Probe und Sonde aufgetragen.
  • Ein Test wurde durchgeführt und die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Die PCR wurde, wie in 8 beschrieben, durchgeführt, unter alleiniger Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit nicht markiertem HRP1 (für die Sonden 1T24 und 1CHR). Die eingesetzten Sonden waren 1T24 und 1CHR, enthaltend P32 (1T24-P, 1CHR-P) als Kontrolle. Mit 1T24 und 1CHR, enthaltend sowohl P32 und den ECL-Marker, zur Bestimmung der Auswirkungen des ECL-Markers. Die Proben wurden wie zuvor mit TEMAC gewaschen. Das erhaltene, an Kügelchen gebundene P32 wurde nach Zugabe eines Szintillisations-Cocktails in einem Szintillisations-Zählgerät analysiert. Die Ergebnisse wurden als P32-Zählrate pro Sekunde für jede Kombination von Probe und Sonde aufgetragen.
  • Ein Test wurde durchgeführt und die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Der Test wurde, wie in 4 beschrieben, durchgeführt. Bei der Probe handelte es sich um Placenta-DNS und die Amplifikation erfolgte unter Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit nicht markiertem HRP1 (für die Sonden 1T24 und 1CHR). Das erhaltene PCR-Produkt wurde anschließend in Proben aufgeteilt, um ein Probenset zu erhalten, welches verschiedene Mengen an Produkt enthielt. Diese Probensets wurden anschließend entweder mit P32-markierten Sonden (1T24-P32 und 1CHR-P32) oder ECL-markierten Sonden (1T24-ECL und 1CHR-ECL) hybridisiert. Die Ergebnisse jeder Untersuchung wurden anschließend unter Verwendung des mittleren Peaks jedes Markers für die 90 μl Probe normalisiert. Die normalisierten Werte gestatten einen effektiveren Vergleich des Verhältnisses Signal zu Rauschen und den Vergleich des Ansprechens der beiden Verfahren. Die eingefügte Abbildung veranschaulicht das Ansprechen im unteren Bereich der Verdünnungskurve. Die Proben wurden, wie zuvor beschrieben, behandelt (6 und 8).
  • Ein Test wurde durchgeführt und die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Die PCR wurde unter Verwendung von biotinyliertem 2PV18 und nicht markiertem 1PV18 unter Verwendung von HeLa-DNS (400 Kopien pro Zelle) und des in 3 veranschaulichten PCR-Formats durchgeführt. Die erhaltene PCR-Reaktion wurde anschließend mit der spezifischen, ECL-markierten Sonde 3PV18 hybridisiert. Das Hybridisierungsgemisch wurde anschließend zu mit Streptavidin beschichteten Kügelchen hinzugefügt und der daraus erhaltene, an Kügelchen gebundene ECL-Marker wurde direkt unter Verwendung eines ECL-Analysators, wie in 1 beschrieben, auf ECL analysiert. Die Ergebnisse wurden als ECL-Zählraten über der PCR zugesetzten HPV18-Kopien aufgetragen.
  • Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung gegeben.
  • BEISPIELE
  • Instrumente, Materialien und Verfahren
  • (1) Instrumente
  • Eine Durchflußvorrichtung mit drei Elektroden, wie in 1 und 2 beschrieben, wurde eingesetzt.
    Arbeitselektrode: Au-Scheibe, 3 mm Durchmesser
    Gegenelektrode: Au-Scheibe, 3 mm Durchmesser
    Referenzelektrode: Ag/AgCl
    Dichtungsring aus Teflon (0,15'' dick)
    Frontplatte aus Plexiglas
    Einlaßleitung: 0,042'' Innendurchmesser, Polypropylen
    Ansaugraten: variabel von 0,01 bis 5 ml/Minute
    Potentiostat: mikroprozessorgesteuert
    Luminometer, mit Hamamtsu R374 Fotomultiplienöhre (niedrige Verstärkung, rotempfindliche Röhre), Fotomultiplierspannung variabel von 0 bis 1400 Volt. (2) Materialien
    (a) ECL-Marker: Ru(bpy)3 2+
    (b) ECL-Puffer: 112 mM KH2PO4, 88 mM K2HPO4·3H2O, 50 μM NaCl, 6,5 mM NaN3, 0,8 μM Triton X-100, 0,4 mM Tween 20, 100 mM Tripropylamin in H2O
    (c) ECL-Verdünner: 37,5 mM KH2PO4, 109,2 mM K2HPO4·3H2O, 151,7 mM NaCl, 0,65 mM NaN3, 0,43 mM Rinderserumalbumin in H2O
    (d) Ru(bpy)3 2+-NHS: Ru(2,2'-bipyridyl)2(4-[3-(1,3-dioxolan-2-yl)-propyl]-4'-methyl-2,2'-bipyridin)2+
    (e) Dynal-Teilchen: (i) Dynal M-450 Dynakügelchen, 4,5 μm Durchmesser, superparamagnetische Teilchen, 30 mg/ml, erhalten von Dynal, 45 North Station Plaza, Great Neck, NY 11021 (ii) Dynal M-280 Dynakügelchen, 2,8 μm Durchmesser, superparamagnetische Teilchen, 10 mg/ml, erhalten von Dynal, 45 North Station Plaza, Great Neck, NY 11021
  • (3) ECL-Meßzyklus (Drei-Elektroden-Zellbetrieb)
  • Der ECL-Meßzyklus besteht aus drei Stufen: (1) Vorkonditionieren, (2) Messen und (3) Reinigen. Der Vorkonditionierschritt umfaß das Aufbringen einer Spannungsdreieckswelle von 0,0 Volt bis +2,2 Volt auf –1,0 Volt auf +0,6 Volt bei 2,0 Volt/Sekunde. Der Meßschritt umfallt das Ausbringen einer dreieckigen Wellenform von +0,6 Volt auf 2,8 Volt auf +2,0 Volt bei 1,0 Volt/Sekunde. Der Reinigungsschritt umfaßt das Ausbringen einer Spannungsviereckswelle von +0,0 Volt auf +3,0 Volt auf –0,5 Volt auf 0,0 Volt. Alle Spannungen sind auf die Ag/AgCl-Referenzelektrode bezogen.
  • BEISPIEL 1
  • Vorrichtung und Verfahren zum Sammeln von Mikroteilchen mittels Schwerkraft
  • Die Messung erfolgt in einer Zelle, wie sie in 12 gezeigt ist. Es wird Bezug genommen auf 12, die eine Vorrichtung zur Durchführung eines Tests unter Ausnutzung der Schwerkraft zeigt. Die Komponenten der Vorrichtung umfassen ein transparentes Fenster mit der Bezugsnummer 48, einen Dichtungsring mit der Bezugsnummer 222, einen Block 20, der einen Einlaß 22, eine. Arbeitselektrode 56/58, eine Gegenelektrode 72/74 und eine Auslaßöffnung 24 umfaßt. Die Ebene des Zellblocks ist horizontal, das heilst senkrecht zur Richtung des Schwerkraftfeldes der Erde. Markierte Mikroteilchen (Dynal) in einem ECL-Puffer werden mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe zur Zelle gezogen. Die Pumpe wird abgestellt, nachdem die Teilchen die Zelle erreichten. Die Mikroteilchen in der Zellkammer fallen auf die Oberfläche der Arbeitselektrode. Die Geschwindigkeit des Fallens der Mikroteilchen wird bestimmt, so daß sie etwa konstant 0,5 mm/Minute über eine Distanz von 10 mm beträgt, wie in 13 gezeigt. Die Anzahl der Teilchen, die sich absetzen, ist eine Funktion der Zeit und der Fallgeschwindigkeit. Die ECL-Intensität ist proportional der Anzahl der Teilchen, die sich auf der Arbeitselektrode absetzen. Die Anzahl der Teilchen, welche die Oberfläche erreichen, und somit die ECL-Intensität ist durch die Höhe der Probenflüssigkeit über der Arbeitselektrode beschränkt. 14 zeigt die ECL-Intensität als Funktion der Ablagerungszeit für zwei Zellen mit verschiedenen Dichtungsdicken, 0,38 mm (0,015') bzw. 2 mm (0,075''). Beide Zellen weisen ähnliche Absetzgeschwindigkeiten der Mikroteilchen auf, die Zelle mit der dickeren Dichtung ergibt jedoch einen Maximalwert der Ablesung, der um das fünffache größer ist. Die Ergebnisse eines AFP-Tests (Alpha-Fetal-Protein) ist in 15 gezeigt, welche die beiden Zellen vergleicht. Wiederum ergibt die Zelle mit der dickeren Dichtung das fünffache der ECL-Signalintensität.
  • BEISPIEL 2
  • ECL-Vorrichtung und -Verfahren zur Absetzung von Mikroteilchen
  • Magnetisches Sammeln unter Verwendung einer Sedimentationszelle.
  • Eine Zelle zur Ausführung eines Tests unter Anwendung von Magnetkräften, um ein Absetzen von Mikroteilchen zu verursachen, ist in 16 gezeigt. Die Bezugszahl 48 bezeichnet ein transparentes Fenster, die Bezugszahl 122 eine Dichtung, die Bezugszahl 22 den Einlaß in den Zellblock, die Bezugszahl 56/58 die Arbeitselektrode, die Bezugszahl 24 den Probenauslaß, die Bezugszahl 20 den Zellblock selbst und die Bezugszahl 27 einen Elektromagneten.
  • Die Ebene des Zellblocks ist horizontal orientiert. Markierte Mikroteilchen (Dynal) in ECL-Puffer werden mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe in die Zelle gezogen. Die Pumpe wird abgestellt, nachdem die Mikroteilchen die Zelle erreichen. Die Mikroteilchen in der Zellkammer werden mit Hilfe eines Magnetfeldes zur Arbeitselektrode gezogen, das unter Verwendung des Elektromagneten 27 erzeugt wird, der bei 12 Volt und 1,5 Ampere arbeitet. Durch Einsatz des Elektromagneten ist die Absetzgeschwindigkeit der Mikroteilchen wesentlich gegenüber derjenigen gesteigert, die beobachtet wird, wenn die Mikroteilchen ausschließlich aufgrund der Schwerkraft absetzen. Dies ist in 17 gezeigt.
  • BEISPIEL 3
  • ECL-Vorrichtung und -Verfahren zur Absetzung von Mikoteilchen
  • Magnetisches Sammeln unter Verwendung einer Sammelzelle.
  • Ein Test wird in einer Zelle durchgeführt, wie in 18 beschrieben. Unter Bezugnahme auf 18 bezeichnet die Bezugsziffer 48 ein transparentes Fenster, die Bezugsziffer 132 eine Dichtung, die Bezugsziffer 22 einen Einlaß in den Zellblock, die Bezugsziffer 56/58 eine Arbeitselektrode, die Bezugsziffer 20 den Zellblock selbst, die Bezugsziffer 24 den Probenauslaß und die Bezugsziffer 37 einen Permanentmagneten.
  • Die Ebene des Zellblocks ist horizontal orientiert. Markierte Mikroteilchen (Dynal) in ECL-Puffer werden mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe zur elektrochemischen Zelle gezogen. Vor der Einführung der Probe wird der Permanentmagnet 37 unmittelbar unterhalb der Grenzfläche zwischen Arbeitselektrode/Lösung in einem Abstand von 0,035 Inch angeordnet. Wenn die Probe zur Zelle gezogen wird, setzen sich die Mikroteilchen auf einer Fläche über der Arbeitselektrode ab, wie sie von der Fläche des Magneten definiert wird. Die Pumpe wird abgestellt und der Magnet entfernt, nachdem sich die gesamte Probe abgesetzt hat. Je länger die Sammelzeit, desto mehr Teilchen werden abgelagert. Die Erhöhung der Konzentration der Teilchen auf der Arbeitselektrode führt zu erhöhter ECL-Intensität, wie in 19 gezeigt.
  • BEISPIEL 4
  • Verwendung eines Magneten zur Ablagerung von Mikroteilchen
  • Orientierung des Magnetfelds
  • Mikroteilchen 96, 96', die von einem Magneten 27/37 angezogen werden, der ein Permanentmagnet oder ein Elektromagnet sein kann, richten sich mit der Orientierung des Magnetfeldes 98, 98' wie in 20 aus, die Magnetfelder 98 und 98' sowie die erhaltenen Teilchenanordnungen 96 und 96' zeigt, die parallel (A) und senkrecht (B) zur Oberfläche der Arbeitselektrode 56/58 in der Nähe dieser Oberfläche sind.
  • BEISPIEL 5
  • Teilchensammlung und Konzentrierung mittels Filtration
  • Mikroteilchen, die magnetisch ansprechbar sind, nichtmagnetisch ansprechbar sind und einen weiten Bereich von Dichten aufweisen, können vorteilhaft mittels Filtration auf der Oberfläche eines Membranfilters gesammelt werden. Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden die Teilchen durch einen Teil einer Filtermembran gepumpt, die Porengrößen aufweist, die kleiner als der Durchmesser der Teilchen, jedoch vorzugsweise wesentlich kleiner als der Teilchendurchmesser sind, und zwar bei einer ausreichend hohen Oberflächendichte, so daß die Sammlung der Teilchen kein Verstopfen der Poren verursacht. Der Filter ist vorteillhfterweise weitgehend transparent, so daß der Filter nach dem Sammeln der Teilchen auf der Oberfläche einer Arbeitselektrode zum Zweck des Induzierens der ECL von den Teilchen und Messen der Lumineszenz angeordnet werden kann, um die Menge des ECL-Markers auf den Teilchen zu messen.
  • Bei einer anderen Ausführungsform wird der Membranfilter mit Porengrößen, wie oben beschrieben, auf der Oberfläche eines absorbierenden Materials angeheftet oder auf diesem angeordnet, so daß Kapillarkräfte oder "Dochtwirkung" spontan die Mikroteilchen enthaltenden Fluide durch den Membranfilter ziehen, ohne eine Vorrichtung zum Induzieren eines Fluidstromes durch den Filter zu erfordern.
  • Bei der bevorzugten Ausführungsform wird der Membranfilter mit Porengrößen, wie oben beschrieben, mit einem dünnen Film aus Metall oder einem anderen elektrisch leitfähigen Material beschichtet, so daß die Oberfläche der Membran als Arbeitselektrode in einer ECL-Vorrichtung dienen kann. Die leitfähigen Filme lassen sich leicht auf die Oberfläche einer Membran mittels herkömmlich, bei der Herstellung von mikroelektronischen Bauteilen verwendeten Verfahren aufbringen, beispielsweise der thermischen Verdampfung oder dem Sputtern. Eine derartige Filterelektrode läßt sich leicht in einer Durchflußzelle befestigen, so daß der Strömungsweg für das Fluid durch die Filterelektrode führt. Teilchen im Strom werden von der Filterelektrode gefangen und lassen sich leicht in-situ waschen, wodurch ein schnelles und einfaches Mittel zum Durchführen heterogener Tests ohne externe Waschvorrichtung bereitgestellt wird.
  • BEISPIEL 6
  • Teilchensammlung und -konzentrierung mittels eines Zentrifugationsverfahrens
  • Die in 21 gezeigte, rotierende Durchflußzelle stellt ein anderes Mittel zum Fangen des Komplexes auf der Oberfläche der Arbeitselektrode zum Messen der Lumineszenz bereit. Die Testlösung tritt in die Vorrichtung über den Einlaß 261 ein und wird in die Zelle 262 durch die Rotationsdichtung 263 gepumpt, während die Zelle in Rotationsbewegung versetzt wird, wie vom Pfeil R angezeigt. Die dichteren Teilchen des Komplexes werden auf der Oberfläche der Arbeitselektrode 264 konzentriert. Während die Zelle noch rotiert, tritt die Lösung aus der Zelle über den Auslaß 268 aus. Der durch das Zellfenster 267 durchtretende Lichtausstoß wird von der Fotomultiplienöhre 265 gemessen. Der Lichtausstoß wird von der vertikalen Arbeitselektrodenoberfläche(n) 264 durch Brechung an (einer) gebogene(n) Spiegeloberfläche(n) 266 gerichtet, die in der Mitte der Zelle angeordnet sind; die Gegenelektrode(n) 269 ist (sind) ebenso gezeigt. Die Zelle wird anschließend gespült und für den nächsten Zyklus gereinigt. Dies kann bei gestoppter oder rotierender Zelle erfolgen. Die 21 zeigt somit ein Zentrifugalverfahren und eine Zentrifugationsvorrichtung der Erfindung zum Fangen von Teilchen, wie auch eine Zentrifugationsdurchflußzelle der Erfindung.
  • BEISPIEL 7
  • Beschichten von Teilchen mit markiertem, unspezifischen Protein bei mäßiger Oberflächenkonzentration
  • 30 mg (1 ml) von unbeschichteten, magnetisch ansprechbaren Polystyrol-M-450-DYNA-BEADS mit 4,5 μm (DYNAL, Oslo, Norwegen) wurden mittels magnetischer Trennung mit einer 150 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,5, unter Verwendung von 2 ml pro Waschung gewaschen. 150 μg Ru(bpy)3 2+-markierte Mäuse-IgG (Jackson Immunochemicals) in 1 ml phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS) mit 0,05 % Thimerasol wurden zu den Teilchen zugefügt. Man ließ diese Mischung über Nacht bei Raumtemperatur unter Rotation inkubieren. Die Lösung wurde anschließend magnetisch von den Teilchen getrennt und entfernt. Um nichtreagierte Stellen zu blockieren, gab man 1 ml 3% BSA/PBS mit 0,05 % Natriumazid zu den Teilchen hinzu und ließ die erhaltene Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Die Teilchen wurden fünfmal (2 ml pro Waschschritt) gewaschen und anschließend letztlich in 6 ml desselben Puffers zur Lagerung resuspendiert.
  • BEISPIEL 8
  • Elektrochemolumineszenz-Messung (ECL-Messung) unter Verwendung magnetisch ansprechbarer Teilchen
  • Uniforme und nicht-uniforme, polymere und nicht-polymere, magnetisch ansprechbare Teilchen (Dynal, Oslo, Norwegen; Polysciences, Warrington, PA 18976; Cortex Biochem, San Leandro, CA 94577; Aldrich, Milwaukee, WI 53201) wurden mit markierten Proteinen, wie in Beispiel 1 beschrieben, beschichtet. Die beschichteten Teilchen wurden dreimal mit ECL-Puffer gewaschen, bevor 2 ml einer Suspension mit 300 μg/ml hergestellt wurden. Unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe wurden 500 μl der Teilchensuspension in die Durchflußzelle (Beispiel 3) gezogen. Sowie die Teilchen zur Arbeitselektrode strömten, wurden sie mit Hilfe eines Magneten angezogen und auf der Oberfläche der Arbeitselektrode konzentriert. Unter Verwendung der magnetischen Teilchen wurde die Elektrochemolumineszenz mit Hilfe einer Hamamatsu-R374-Fotomultiplierröhre gemessen, die über der Durchflußzelle dort zentriert war, wo die Teilchen sich auf der Arbeitselektrodenoberfläche konzentriert hatten. Tabelle I zeigt ECL-Fotoemissionsmengen, die von den mit markierten Proteinen beschichteten, magnetisch ansprechbaren Teilchen erhalten wurden.
  • Tabelle I ECL-Messungen aus verschiedenen magnetisch ansprechbaren Teilchen
    Figure 00470001
  • BEISPIEL 9
  • Elektrochemolumineszenz-Messung (ECL-Messung) unter Verwendung nicht-magnetischer Teilchen
  • Uniforme und nicht-uniforme, polymere und nicht-polymere, nicht magnetisch ansprechbare Teilchen (Aldrich, Milwaukee, WI 53201; Duke Scientific, Palo Alto, CA 94303) wurden mit markierten Proteinen, wie in Beispiel 7 beschrieben, beschichtet. Die beschichteten Teilchen wurden dreimal mit ECL-Puffer gewaschen, bevor 2 ml einer Suspension mit 300 μg/ml hergestellt wurden. Unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe wurden 500 μl der Teilchensuspension in die Durchflußzelle gezogen. Die beschichteten Teilchen wurden anschließend auf der Arbeitselektrode über eine Gravitationsvorrichtung konzentriert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die nicht magnetische Teilchen verwendende Elektrochemolumineszenz wurde mir einer Hamamatsu-R374-Fotomultiplienöhre gemessen, die über der Durchflußzelle dort zentriert war, wo sich die Teilchen auf der Arbeitselektrodenoberfläche konzentriert hatten. Tabelle II zeigt die von den beschichteten nicht magnetischen Teilchen erhaltenen ECL-Fotoemissionsmengen.
  • Tabelle II ECL-Messung von nicht magnetisch ansprechbaren Teilchen mittels Sammlung über Schwerkraft
    Figure 00480001
  • BEISPIEL 10
  • Herstellung von beschichteten Dynal-Teilchen, auf denen Schaf Anti-Thyroid Stimulierendes Hormon (TSH) physilcalisch adsorbiert ist (REAGENZ I)
  • 1 ml von 4,5 μm unbeschichteten, magnetischen Polystyrolteilchen mit -OH-Resten auf ihrer Oberfläche (DYNAL, DYNABEADS M-450, DYNAL A.S. Oslo, Norwegen) wurde mittels magnetischer Trennung mit einer 150 mM Natriumcarbonat/Bicarbonat-Lösung, pH 9,6, unter Verwendung von 2 ml pro Waschung gewaschen. 0,5 mg affinitätsgereinigte Schaf Anti-TSH, HCG-gereinigte Antikörper (CIBA) in 1 ml der Carbonat/Bicarbonat-Lösung wurden zu den Teilchen zugegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Die Lösung wurde anschließend magnetisch von den Teilchen getrennt und entfernt. Man gab 1 ml 3 BSA/PBS w/ mit 0,05 % Natriumazid hinzu und inkubierte 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren, um nicht reagierte Stellen zu blockieren. Die Teilchen wurden fünfmal gewaschen (2 ml pro Waschung) und dann letztlich in 1 ml desselben Puffers zum Lagern resuspendiert. Die Endkonzentration des Kugelreagenz I betrug 3 Gew.-%.
  • BEISPIEL 11
  • Herstellung eines Ouabain-BSA-Konjugats (REAGENZ II)
  • AKTIVIERUNG DES OUABAINS:
  • 60,4 mg Ouabinoctahydrat (Aldrich, Katalog # 14, 193-3) in 6 ml entionisiertem H2O (di) (in Folie gewickelt) wurde mit 87 mg Natriummetaperiodat (Mallinckrodt, Katalog # 1139) gemischt und die Mischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang unter Rotation inkubiert. Die Reaktion wurde durch Überleiten des Reaktionsgemisches über ein Dowex 1 × 8 – 50 Ionenaustauscherharz (Aldrich, Katalog # 21, 740–9) mir entionisiertem Wasser beendet. 200 μl 1 M Natriumphosphat, pH 7,2, wurde zum Einstellen des pH der Lösung auf 7,0 hinzugegeben.
  • KONJUGIEREN DES AKTIVIERTEN OUABAINS AN BSA:
  • 50 mg des aktivierten Ouabains (4,6 ml) wurden dann tropfenweise zu 108 mg Rinder– serumalbumin BSA, Miles-Fraktion V) in 5 ml 0,15 M PBS, pH 7,8, zugegeben. Dies ist ein Verhältnis von 40:1 (Ouabain:BSA). Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert, gemischt, gefolgt von schneller Zugabe von 30 mg Natriumcyanoborhydrid unter Mischen. Freies Ouabain und überschüssiges Natriumcyanobor hydrid wurden mittels Dialyse bei 4 °C in 0,15 M PBS w/ 0,05 % Natriumazid, 7,8 pH, entfernt. Das Ouabain-BSA-Konjugat als Reagenz II wurde bei 4 °C gelagert.
  • BEISPIEL 12
  • Herstellung von Dynal-Teilchen, beschichtet mit physikalisch adsorbiertem Ouabain-BSA (REAGENZ II)
  • 5 mg 4,5 μm unbeschichtete, magnetische Polystyrolteilchen mit -OH-Resten auf ihrer Oberfläche (DYNAL, DYNABEADS M-450, DYNAL A.S. Oslo, Norwegen) wurden mittels magnetischer Trennung mit einer 150 mM Natriumcarbonat/Bicarbonat-Lösung, pH 9,6, unter Verwendung von 10 ml pro Waschung gewaschen. 3 mg des Ouabain-BSA-Konjugats (Konjugatreagenz II) wurden in 5 ml der Carbonat/Bicarbonat-Lösung zu den Teilchen zugegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert. Die Lösung wurde anschließend magnetisch von den Teilchen getrennt und entfernt. Man gab 5 ml 3 % BSA/PBS w/ 0,05 % Natriumazid hinzu und inkubierte 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rotation zum Blockieren nicht reagierter Stellen. Die Teilchen wurden fünfmal gewaschen (10 ml pro Waschung) und dann letztlich in 1 ml desselben Puffers zur Lagerung resuspendiert. Die Endkonzentration des Kugelreagenz III betrug 3 Gew.-%.
  • BEISPIEL 13
  • Herstellung von mit Ru(bpy)3 2+-markiertem Maus Anti-Dioxin (REAGENZ IV)
  • 1 mg Maus Anti-Digoxin (Cambridge Medical Technologies, Katalog # 200-014 Charge A3574) wurde mit Ru(bpy)3 2+ markiert. Der monoklonale Antikörper (MAb) Anti-Digoxin-Antikörper wurde unter Verwendung eines Centricon-30-Mikrokonzentrators (Amicon) in 0,15 M Kaliumphosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,8, puffergetauscht, wobei das Endvolumen 0,5 ml betrug. Unmittelbar vor der Verwendung wurden 0,5 mg Ru(bpy)3 2+-NHS mit 125 μl wasserfreiem Dimethylsulfoxid (Aldrich) gelöst. Um ein Molverhältnis von 25:1 von Ru(bpy)3 2+ zu Protein auf Basis von Molekulargewichten von 1057 bzw. 150.000 zu erzielen, wurden 0,18 mg Ru(bpy)3 2+-NHS (45 μl) zur Proteinlösung unter Schütteln zugegeben. Das Reaktionsröhrchen wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 Minuten unter Schütteln inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl 1 M Glyzin beendet und 10 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Überleiten über eine Sephadex G – 25 Säule (1 × 20 cm in 0,15 M Kaliumphosphat, 0,15 M NaCl mit 0,05 % Natriumazid, pH 7,2) gereinigt. Die mit Ru(bpy)3 2+-markierten Maus Anti-Digoxin-Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt. Das markierte Protein (Reagenz IV) wies gemäß Bestimmung 12 Marker pro Proteinmolekül auf.
  • BEISPIEL 14
  • Herstellung von mit Ru(bpy)3 2+-markiertem Maus Anti-Thyroid Stimulisierendes Hormon (TSH)
  • (REAGENZ V)
  • 0,5 mg Maus Anti-TSH (CIBA) wurde mit Ru(bpy)3 2+ markiert. Der MAb Anti-TSH-Antikörper wurde einem Pufferaustausch unter Verwendung eines Centricon-30-Mikrokonzentrators (Amicon) in 0,15 M Kaliumphosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,8, unterzogen, wobei das Endvolumen 0,35 ml betrug. Unmittelbar vor der Anwendung wurden 0,5 mg Ru(bpy)3 2+-NHS in 75 μl wasserfreiem Dimethylsulfoxid (Aldrich) gelöst. Um ein Molverhältnis von 50:1 von Ru(bpy)3 2+ als Marker zu Protein zu erzielen, bezogen auf Molekulargewichte von 1057 bzw. 150.000, wurden 0,176 mg Ru(bpy)3 2+-NHS (26,4 μl) zur Proteinlösung unter Schütteln hinzugegeben. Das Reaktionsröhrchen wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 Minuten lang unter Schütteln inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl 1 M Glyzin beendet und 10 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Überleiten über eine Sephadex G – 25 Säule (1 × 20 cm in 0,15 M Kaliumphosphat, 0,15 M NaCl mit 0,05 % Natriumazid, pH 7,2) gereinigt. Die mit Ru(bpy)3 2+-markierten Maus Anti-TSH-Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt. Das markierte Protein (Reagenz V) wies nach Bestimmung 14 Marker pro Protein auf.
  • BEISPIEL 15
  • Einstufiger Trenn-Sandwich-Test auf das Thyroid-stimulierende Hormon (Thyroid Stimulating Hormone) (TSH)
  • 100 μl Serum-Kalibratoren (London Diagnostics TSH LumiTAG Kit), 25 μl Ru(bpy)3 2+-markiertes Maus Anti-TSH (Reagenz V) in ECL-Puffer und 25 μl Schaf Anti-TSH-Dynal-Teilchen (Reagenz n in ECL-Puffer wurden vereinigt und in Polypropylenröhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Anschließend wurden die Teilchen mittels magnetischer Trennung gewaschen und dann in 500 μl ECL-Puffer resuspendiert. Dieses Waschverfahren wurde zwei weitere Male wiederholt. Schließlich wurden die Teilchen in 1 ml ECL-Puffer resuspendiert. Die Elektrochemolumineszenz (ECL) wurde für jede Probe, wie in Beispiel 3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten sind der Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten direkt proportional (steigende Zählraten mit steigenden Konzentrationen an Analyten). Tabelle III zeigt eine repräsentative Testkurve.
  • Tabelle III Einstufiger Trenn-Sandwich-Test: Nachweis von TSH
    Figure 00530001
  • BEISPIEL 16
  • Einstufiger Sandwich-Test ohne Trennung auf das Thyroid-stimulierende Hormon (Thyroid Stimulating Hormone) (TSH)
  • 100 μl Serum-Kalibratoren (London Diagnostics), 25 μl Ru(bpy)3 2+-markiertes Maus Anti-TSH (Reagenz V) in ECL-Puffer und 25 μl Schaf Anti-TSH-Dynal-Teilchen (Reagenz n in ECL-Puffer wurden vereinigt und in Polypropylenröhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Vor dem Ablesen der Ergebnisse wurde 1 ml ECL-Puffer zugegeben. Die Elektrochemolumineszenz (ECL) wurde für jede Probe, wie in Beispiel 3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten sind der Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten direkt proportional (steigende Zählraten mit steigender Konzentration des Analyten). Tabelle IV zeig eine repräsentative Testkurve.
  • Tabelle IV Einstufiger Sandwich-Test ohne Trennung: Nachweis von TSH
    Figure 00540001
  • BEISPIEL 17
  • Zweistufiger kompetitiver Test auf Digoxin mit Trennung
  • 50 μl Serum-Kalibrator (TDx-Test, Abbott Labs, Chicago; II,) und 25 μl mit Ru(bpy)3 2+-markierter Maus Anti-Digoxin (Reagenz In in ECL-Puffer wurden vereinigt und 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Man gab 25 μl Ouabain-BSA-DYNAL-Teilchen (Reagenz III) in ECL-Puffer hinzu und inkubierte weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Mischen. Die Teilchen wurden anschließend mittels magnetischer Trennung gewaschen und dann in 500 μl ECL-Puffer resuspendiert. Dieser Waschvorgang wurde zwei weitere Male wiederholt. Schließlich wurden die Teilchen in 1 ml ECL-Puffer resuspendiert. Die Elektrochemolumineszenz (ECL) wurde für jede Probe, wie in Beispiel 3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten sind der Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten umgekehrt proportional (abneh mende Zählraten mit steigender Konzentration des Analyten). Tabelle V zeigt eine repräsentative Testkurve.
  • Tabelle V Zweistufiger kompetitiver Test mit Trennung: Nachweis von Dioxin
    Figure 00550001
  • BEISPIEL 18
  • Zweistufiger kompetitiver Test auf Digoxin ohne Trennung
  • 50 μl Serum-Kalibrator (TDx-Test, Abbott Labs, Chicago, IL) und 25 μl mit Ru(bpy)3 2+ -markierter Maus Anti-Digoxin (Reagenz IV) in ECL-Puffer wurden vereinigt und 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Man gab 25 μl Ouabain-BSA-DYNAL-Teilchen (Reagenz III) in ECL-Puffer hinzu und inkubierte weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Mischen. Vor dem Ablesen wurden die Teilchen in 1 ml ECL-Puffer resuspendiert. Die Elektrochemolumineszenz (ECL) wurde für jede Probe, wie in Beispiel 3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten sind der Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten umgekehrt proportional (absteigende Zählraten mit steigender Konzentration des Analyten). Tabelle VI zeigt eine repräsentative Testkurve.
  • Zweistufiger kompetitiver Test ohne Trennung: Nachweis von Digoxin Tabelle VI
    Figure 00560001
  • BEISPIEL 19
  • Zweistufiger kompetitiver Test auf Digoxin ohne Trennung unter Anwendung eines Ablesezyklus mit zusätzlichem Waschen vor der letztlichen Reaktion der Probe auf der Elektrode
  • 50 μl Serum-Kalibrator (TDx-Test, Abbott Labs, Chicago, II.) und 25 μl mit Ru(bpy)3 2+ -markierter Maus Anti-Digoxin (Reagenz IV) in ECL-Puffer wurden kombiniert und 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Man gab 25 μl Ouabain-BSA-DYNAL-Teilchen (Reagenz III) in ECL-Puffer hinzu und inkubierte weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Mischen. Vor dem Ablesen wurden die Teilchen in 1 ml ECL-Puffer resuspendiert. Die Elektrochemolumineszenz (ECL) wurde für jede Probe, wie in Beispiel 3 beschrieben, abgelesen. Die ECL-Zählraten sind der Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten umgekehrt proportional (abnehmende Zählraten mit steigender Konzentration des Analyten). Tabelle VII zeigt eine repräsentative Testkurve.
  • Tabelle VII Zweistufiger kompetitiver Test mit Trennung: Nachweis von Digoxin
    Figure 00570001
  • BEISPIEL 20
  • Oligonukleotid-Synthese
  • Die Oligonukleotide wurden auf einem automatischen Oligonukleotid-Synthesegerät von Applied Biosystems unter Verwendung des ß-Cyanoethylphosphoramidits (1) hergestellt. Die Aminomodifikationen am 5'-Ende des Oligonukleotids erfolgte beim letzten Kupplungsschritt und am 3'-Ende unter Verwendung einer modifizierten festen Phase (Glas mit kontrollierten Poren). Clontech (San Diego, CA) stellte die Aminomodifikatoren zur Verfügung. Die erhaltenen, am 5'-Terminus modifizierten Oligonukleotide enthielten alle einen Spacer-Arm von sechs Kohlenstoffatomen an der bezeichneten Aminogruppe (C6, NH2). Die am 3'-Ende modifizierten Oligonukleotide enthielten alle einen Drei-Kohlenstoff-Spacer an der Aminogruppe. Die konstruierten Oligonukleotide, deren Modifikationen und Verwendungen sind unten beschrieben.
  • Die Oligonukleotide für die Untersuchung von HPV wurden gegen die E6-Region, wie zuvor beschrieben (2), gerichtet.
  • Die Oligonukleotid-Sequenzen waren wie folgt:
    Figure 00580001
  • Diese Oligonukleotide ermöglichen die PCR-Erzeugung verschiedener Fragmente; 3PV16 oder 3PV18 mit 2PV 16 oder 2PV18 bilden ein 62 bp-Fragment; 1PV16 mit 2PV16 bilden ein 100 bp-Fragment; 1PV18 mit 2PV18 bildet ein 103 bp-Fragment. Es ist ersichtlich, daß die 3PV16- und 3PV 18-Oligonukleotide ebenfalls als Sonden verwendet werden können, die an die Produkte aus der PCR-Reaktion von 1PV16 mit 2PV16 und 1PV18 mit 2PV18 hybridisieren, wie auch mit dem Strang hybridisieren, der von den Oligonukleotiden 2PV16 und 2PV18 in der PCR erzeugt wird. Bei den Oligonukleotiden für die Tests auf die Ha-ras-Punktmutation handelte es sich um folgende:
    HRP1 5' (C6, NH2) GCGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTG;
    HRP2 5' (C6, NH2) TTCTGGATCAGCTGGATGGTCAGCGCACTC;
  • Diese zwei Oligonukleotid-Primer dirigieren die PCR-Synthese eines 80 bp-Fragments. Die Sequenzen der für diese Untersuchung der Punktmutation verwendeten Sonden waren wie folgt:
    Figure 00580002
  • Neben diesen Sequenzen haben wir außerdem die obigen 1CHR- und 2T24-Sequenzen ohne die 5'-Aminomodifikation jedoch mit einer 3'-Aminogruppe synthetisiert. Diese am 3'-Ende aminomodifizierten Oligonukleotide wurden mit dem ECL-Marker markiert und bei den Hybridisierungen verwendet. Die Stelle einer Mutation/einer Fehlpaarung wird vom Nukleotid insgesamt angezeigt. Die Sonden 1T24 und 1CHR hybridisieren mit dem durch das Oligonukleotid HRP2 in der PCR erzeugten Strang. Die Sonden 2T24 und 2CHR hybridisieren mit dem über das Oligonukleotid HRP1 in der PCR erzeugten Strang.
  • Die Oligonukleotide JK8 und JK8C zum Kuppeln an die Teilchen sind:
    JK8 5' (C6, NH2)GTCCAATCCATCTTGGCTTGTCGAAGTCTGA
    JK8C 5' (C6, NH2)TCAGACTTCGACAACCCAAGATGGATTGGA1C.
  • Diese beiden Sequenzen leiten sich von Aequorin-Sequenzen ab und sind einander komplementär.
    JK7 5'TCAGACTTCGACAA (NH2) CCCAAGATGGATTGGA:
  • Dieses Oligonukleotide wurde unter Verwendung eines Amino-Modifikators von Clontech (San Diego, CA) aminomodifiziert, der Amino-Modifikationen innerhalb der Sequenz gestattet. JK7 wurde unter Verwendung des Ru(bpy)3 2+-Markers markiert. Die Oligonukleotidsonde auf Aequorin-RNS, erzeugt durch in-vitro-Transkription:
    T35 5' (NH2)GATTTTTCCATTGTGGTTGACATCAAGGAA;
  • Dieses Oligonukleotid wurde sowohl mit Biotin als auch dem Ru(bpy)3 2+-Marker markiert. Zum Nachweis von Escherichia-coli-DNS haben wir Oligonukleotide synthetisiert, die spezifisch für den Trp E/D-Bereich des Genoms (3) sind, wie folgt:
    TRP.C03 5' (C6,NH2)GCCACGCAAGCGGGTGAGGAGTTCC(NH2);
    diese Sequenz wurde mit dem Ru(bpy)3 2+-Marker markiert und das
    TRP.C04 5' (C6, NH2)GTCCGAGGCAAATGCCAATAATGG
    wurde mit Biotin, wie im folgenden beschrieben, markiert.
  • BEISPIEL 21
  • Markierung von Oligonukleotiden
  • Alle synthetischen Oligonukleotide wurden mittels Gelfiltration auf einer Biogel-P6-Säule (BioRad Labs) gereinigt, um alle kontaminierenden Aminogruppen zu entfernen. Biotin wurde über die 5'-Aminogruppe des PCR-Primers unter Verwendung von NHS-Biotin (Clontech, San Diego, CA) (4) eingeführt. Das Ru(bpy)3 2+-NHS wurde über die Aminogruppe des modifizierten Oligonukleotids wie folgt eingeführt. Die Oligonukleotide (0,1 μMol) in 100 μl PBS (pH 7,4) wurden mit 5 μMol in DMSO gelöstem Ru(bpy)3 2+-Marker über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln umgesetzt. Die Oligonukleotide wurden aus diesen Markierungsreaktionen mittels Ethanolfällung wiedergewonnen. Jüngste Untersuchungen haben die Möglichkeit belegt, unter Verwendung 0,5 μMol des Ru(bpy)3 2+-Markers effektiv zu markieren (> 80 % ) (Daten nicht gezeigt).
  • Die markierten Oligonukleotide wurden weiter mittels HPLC auf einer Umkehrphasen-Vydac-C-18-Semiprep-Säule mit mobilen Phasen von A) 100 mM Tetraethylammoniumacetat, pH 7,0, und B) 50 % A) und 50 % Acetonitril weiter gereinigt, wobei der Gradient von 20 % bis 40 % B gefahren wurde.
  • Die Sonden 1CHR und 1T24 wurden außerdem mit P32 unter Verwendung der T4-Polynukleotidkinase und Anwendung etablierter Verfahren markiert, wodurch Proben mit einer spezifischen Aktivität von 77.000 cpm/ng erzeugt wurden (5).
  • BEISPIEL 22
  • Herstellung von magnetischen Nukleinsäure-Teilchen
  • Dynal-M-450-Teilchen wurden mit 2-Fluor-1-methylpyridintoluol-4-sulfonat unter Verwendung von Standardverfahren (6) aktiviert. Diese aktivierten Teilchen wurden anschließend mit den Oligonukleotiden JK8 und und JK8C umgesetzt. Zu 100 mg der aktivierten Dynal-Teilchen wurden 33 nMol der Oligonukleotide in 650 μl 0,1 M NaHCO3 zugegeben, gefolgt von Inkubieren für 3 Stunden unter Mischen. Die Teilchen wurden durch Zugabe von Ethanolamin (4 ml, 0,1 M) blockiert. Die gekoppelten Teilchen wurden mit 0,5 mg/ml Einzelstrang-Lachssperma-DNS in ECL-Puffer gemischt, vier- bis fünmal mit ECL-Puffer gewaschen und auf 10 mg/ml in ECL-Puffer resuspendiert, der 100 μg/ml Einzelstrang-Lachssperma-DNS enthielt.
  • BEISPIEL 23
  • Herstellung von magnetischen Streptavidin-Teilchen I
  • Dynal-M-450-Teilchen wurden mit 2-Fluor-1-methylpyridintoluol-4-sulfonat unter Verwendung von Standardverfahren (6) aktiviert. Die aktivierten Teilchen wurden anschließend mit Streptavidin (Sigma Ltd.) umgesetzt. Die aktivieren Teilchen (50 mg) wurden mit 0,1 M NaHCO3 gewaschen, gefolgt von Zugabe des Streptavidins (1,5 mg), und über Nachr reagieren gelassen. Die Teilchen wurden durch Zugabe von Ethanolamin (4 ml, 0,1 M) blockiert. Die gekoppelten Teilchen wurden mit 0,5 mg/ml Einzelstrang-Lachssperma-DNS in ECL-Puffer gemischt, vier- bis fünfmal in ECL-Puffer gewaschen und bei 10 mg/ml in ECL-Puffer resuspendiert, der 100 μg/ml Einzelstrand Lachssperma-DNS enthielt. Die Streptavidin-Teilchen aus Dynal M-280 erwiesen sich ebenfalls als wertvoll, ergaben jedoch mit der gegenwärtigen Testsequenz niedrigere Signale. Für Anwendungen in Immunoassays wurden die Teilchen mit BSA nach der Antigen- oder Antikörper-Kupplung blockiert, unter Verwendung von für die passive Beschichtung verwendeten Puffern.
  • BEISPIEL 24
  • Herstellung von magnetischen Streptavidin-Teilchen II
  • Zu 15 mg BSA (in 2–3 ml BPS) gab man 105 μl Dimethylsulfoxid, enthaltend 50 mg/ml Biotin-x-NHS (Clontech, San Diego, CA. 5002-1) hinzu, gefolgt von Mischen und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 30 μl 1 M Glyzin und Inkubation bei Raumtemperatur 10 Minuten gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Gelfiltrationschromatographie (BioRad, Bio-Gel P6) gereinigt. Dieses Biotin-BSA wurde unter Verwendung einer 0,2 μm Spritze filtriert. 5 mg Biotin-BSA in 10 ml 0,2 M Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, (Carbonat/Bicarbonat)-Puffer wurde zu 300 mg Dynabeads zugegeben, gewaschen mit Carbonat/Bicarbonat (Dynal 14002). Diese Mischung wurde auf einem Vortex-Mischer gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Diese Teilchen wurden magnetisch getrennt, gefolgt von Zugabe von 10 ml ECL-Verdünner und 100 μl tRNS (10 mg/ml). Diese Mischung wurde 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Die Teilchen wurden einmal mit 10 ml ECL-Verdünner gewaschen und in 10 ml ECL-Verdünner und 100 μl tRNS (10 mg/ml) resuspendiert. Diese Mischung wurde gemischt und bei 2 bis 6 °C über Nacht zum Stabilisieren der Proteine auf den Teilchen inkubiert. Die Teilchen wurden magnetisch getrennt und in 10 ml PBS, enthaltend 15 mg Streptavidin (Scripps S1214), suspendiert, gefolgt von Mischen für eine Stunde. Die Teilchen wurden viermal in 10 ml ECL-Verdünner gewaschen, mit 5 Minuten Mischen für jeden Waschschritt. Die Teilchen wurden schließlich in 29,7 ml ECL-Verdünner und 300 μl tRNS (10 mg/ml) auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml Teilchen + 100 μg/ml tRNS resuspendiert.
  • BEISPIEL 25
  • Nachweis immobilisierter DNS auf Teilchen mittels Hybridisierung mit ECL-DNS-Sonden
  • Die Möglichkeit, eine ECL-Nachhybridisierung an Teilchen nachzuweisen, wurde durch die Hybridisierung von an JK8 und JK8C gekoppelten Teilchen (Beispiel 22) mit dem mit Ru(bpy)3 2+-markierten Oligonukleotid JK7 belegt. Einzelne Chargen von Teilchen (300 μg) in ECL-Puffer wurden mit 50 μl ECL-Puffer, enthaltend 12,5, 6,3, 3,01 und 1,5 fMol markiertem JK7, gemischt. Diese Mischungen wurden vier Stunden bei 52 °C hybridisiert, gefolgt von Waschen mit 1 ml ECL-Puffer und Resuspension in 830 μl ECL-Puffer. Diese Proben wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Die Sonde JK7 ist der JK8-Sequenz komplementär und der Sequenz JK8C nicht komplementär.
  • Tabelle VIII
    Figure 00630001
  • Die in Tabelle VIII gezeigten Ergebnisse belegen die Möglichkeit, mittelspezifischer Hybridisierung die Anwesenheit spezifischer Sequenzen mittels ECL nachzuweisen, die direkt auf der Oberfläche von Teilchen immobilisiert sind.
  • BEISPIEL 26
  • RNS-Test auf Basis einer an Kügelchen gebundenen ECL
  • Dynal M450-Teilchen wurden mit einem Antikörper beschichtet, der spezifisch für RNS/DNS-Antikörper ist (7), indem man Standardverfahren folgte (Beispiel 10). Spezifische RNS-Spezies wurden erzeugt unter Verwendung von Plasmiden, die von unserem clonierten Aequorin-Gen abgeleitet waren (8). Kurz gesagt, wurde das Plasmid pA5' mit EcoRI geschnitten, gereinigt und der in-vitro-Transkription unter Verwendung von T3-RNS-Polymerase unterworfen, wodurch T3-RI RNS (negative RNS) erzeugt wurde. Ebenso wurde das Plasmid pA5' mit BamHI geschnitten, gereinigt und der in-vitro-Transkription unter Verwendung der T7-RNS-Polymerase zur Erzeugung der T7-Bam RNS (positive RNS) unterworfen. Diese beiden RNS-Spezies stellen somit zwei komplementäre RNS-Spezies dar. Diese RNS-Spezies wurden gereinigt mittels Extraktion mit einem gleichen Volumen von Phenol:Chloroform (50:50), gefolgt von Chloroform-Extraktion und Präzipitation des Überstandes, unter Verwendung von 2,5 Volumen Ethanol. Die RNS-Menge wurde unter Verwendung der Gelelektrophorese und Spektrophotometrie bestimmt. Diese Verfahren sind gut etabiliert und dem Fachmann bekannt (9). Streptavidin wurde mit dem Ru(bpy)3 2+-Marker unter Verwendung etablierter Verfahren und eines 25:1 Molüberschusses von Ru(bpy)3 2+-Marker über Streptavidin markiert (Beispiel 13). Dieses markierte Streptavidin wurde unter Verwendung einer Iminobiotin-Säule nach etablierten Verfahren (10) gereinigt. Das Streptavidin enthielt schätzungsweise 10 Ru(bpy)3 2+-Marker pro Streptavidintetramer. Dieses markierte Streptavidin wurde anschließend mit biotinyliertem T35 komplexiert, was unter Verwendung eines 1:1-Gemisches an Oligonukleotid zu markiertem Streptavidin erzielt wurde. Spezifisch wurden 20 pMol von jedem in einem Endvolumen von 15 μl ECL-Puffer gemischt und über Nacht bei 4 °C zur Bildung des markierten Streptavidin-Oligonukleotid-Komplexes (SA-T35) inkubiert. Die Proben der positiven und negativen RNS (10 ng) wurden mit 2 μl des SA-T35-Komplexes (einstufiger Test) oder 25 ng des biotinylierten T35 (zweistufiger Test) hybridisiert. Die Proben wurden auf 50 μl ergänzt und 3 Stunden bei 50 °C hybridisiert, gefolgt von Zugabe von 200 μg mit Anti-DNS/R-NS-Antikörper beschichteten Teilchen in 20 μl PBS 0,1 % BSA. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang gemischt, gefolgt von zwei Waschungen in ECL-Puffer. Proben aus der Hybridisierung mit dem SA-T35-Komplex wurden in 530 μl ECL-Puffer resuspendiert und, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Diejenigen Proben aus der Hybridisierung nur mit biotinyliertem T35 wurden anschließend mit 50 pMol des markierten Streptavidins inkubiert und für eine Stunde unter Mischen inkubiert, gefolgt von zwei Waschungen in ECL-Puffer. Proben aus der Hybridisierung wurden in 530 μl ECL-Puffer resuspendiert und, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX dargestellt.
  • Tabelle IX
    Figure 00650001
  • BEISPIEL 27
  • Polymerase Kettenreaktionen (Polymerase Chain Reactions: PCR)
  • Polymerase Kettenreaktionen wurden im wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (11, 12, 13). Reaktionsansätze betrugen typischerweise 100 μl, wenn nicht anders angegeben. Die im asymmetrischen Modus ausgeführte PCR dirigierte den Einbau des Markers Ru(bpy)3 2+ unter Verwendung von 5 pMol des biotinylierten Oligonukleotids und 50 pMol des mit Ru(bpy)3 2+-markierten Oligonukleotids. Wir haben den Test für die Haras-Punktmutation unter identischen Bedingungen, jedoch ohne das mit Ru(bpy)3 2+-markierte Oligonukleotid durchgeführt. Ebenfalls haben wir den HPV-Test asymmetrisch ohne Trennung durchgeführt, jedoch unter Anwendung eines zehnfachen Überschusses des biotinylierten Oligonukleotids, typischerweise 40 pMol. Die Bedingungen des Thermozyklus waren wie folgt, für den HPV18- und 16-Test mit direktem Einbau war das Profil 93 °C 1 Sekunde, 50 °C 1 Sekunde, 60 °C 2 Minuten; für den Ha-ras-Punktmutationstest 93 °C 1 Sekunde, 69 °C 2 Minuten; für den HPV-Test ohne Trennung 93 °C 10 Sekunden, 50 °C 30 Sekunden, 60 °C 2 Minuten. Die Zykluszahlen für diese PCR-Durchläufe lagen bei 30 bis 40, je nach Test und dem erforderlichen Grad an Sensitivität.
  • BEISPIEL 28
  • DNS-SONDENTESTFORMAT I. Nachweis und Ouantifizierung der Human-Papilloma-Virus-(HPV)-PCR-Produkte mittels enzymatischer Inkorporation
  • Im Anschluß an die PCR unter Verwendung des direkten Einbaus des mit Ru(bpy)3 2+-markierten Oligonukleotids wurde das gesamte Reaktionsgemisch (90–100 μl) zu 600 μg an magnetische Teilchen I gekoppeltem Streptavidin gegeben, gefolgt von Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Die Festphase in diesen Proben wurde unter Verwendung magnetischer Gestelle abgetrennt, zweimal mit ECL-Puffer gewaschen, in 530 μl ECL-Puffer resuspendiert und anschließend, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf Elektrochemolumineszenz analysiert. 3 veranschaulicht dieses Testformat. Die Ergebnisse für dieses Testformat wurden mit Proben von Human-Papilloma-Virus gezeigt (2,14). Spezifitätsuntersuchungen des direkten Einbaus bzw. der direkten Inkorporation des mit Ru(bpy)3 2+-markierten Oligonukleotids in biotinylierte PCR-Produkte setzten die eng verwandten Virustypen HPV16 und HPV18 ein. Der Test auf die Anwesenheit von HPV16 und 18 wurde durchgefürt unter Verwendung von DNS-Proben, die für beide Virustypen positiv sind, und von Oligonukleotiden, die für jeden Virustyp spezifisch sind. Die Primer waren wie folgt: 2PV16, 2PV18, biotinyliert, und 3PV16, 3PV18, mit Ru(bpy)3 2+-markierte Oligonukleotide. Die 2/3PV16- und 2/3PV 18-Oligonukleotide waren spezifisch für HPV16 bzw. 18. Die erhaltenen, auf Kügelchen gefangenen Ru(bpy)3 2+-Marker wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf ECL analysiert. Die Ergebnisse wurden als ECL-Zählrate für jede Kombination von Probe und Probe aufgetragen (siehe 6).
  • Um die quantitative Art unseres Testformats zu demonstrieren, wurde eine Standardkurve aus direkt eingebautem Ru(bpy)3 2+-Marker und biotinylierten Oligonukleotiden in die HPV16-PCR-Produkte erzeugt. Die erhaltene, an Kügelchen gebundene Ru(bpy)3 2+-Markierung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf ECL analysiert. Die Photon-Zählraten des ECL-Peaks wurden über steigenden Konzentration der HPV16-DNS aufgetragen, ausgedrückt als Verhältnis viraler Kopien zu gesamtzellulären DNS- Kopien. Die in dieser Analyse auf HPV16 verwendeten Primer waren 1PV16 (Biotin-Marker) und 2PV16 (Ru(bpy)3 2+-Marker). Die für jede PCR verwendete DNS wurde unter Verwendung von Kalbsthymus-DNS bei konstant 1 μg gehalten. Die Ergebnisse für diese Standardkurve sind in 7 gezeigt. Diese Ergebnisse hinsichtlich Spezifität und Quantifizierung demonstriert für dieses Format die Fähigkeit der ECL-Marker, einfache und schnelle Tests auf DNS-Basis zu erzeugen. Ebenfalls belegt wird die Fähigkeit des Markers, sich leicht in Enzymreaktionen einzuschalten, ohne mit dem enzymatischen Prozeß zu interferieren.
  • BEISPIEL 29
  • DNS-SONDENTESTFORMAT II. Nachweis und Bestimmung von Punktmutationen im über die PCR amplifizierten human Ha-ras-Onkogen-Produkt
  • Wir haben die PCR-Reaktionen des Ha-ras-Gens unter Verwendung der Oligonukleotide HRP1 und HRP2 durchgeführt. Unter Verwendung von biotinyliertem HRP1 mit unmarkiertem HRP2 kann das resultierende PCR-Produkt mit den Ru(bpy)3 2+-markierten Sonden 2CHR und 2T24 hybridisieren. Umgekehrt können die unter Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit unmarkiertem HRP1 erhaltenen PCR-Produkte mit den Ru(bpy)3 2+-markierten Sonden 1CHR und 1T24 hybridisieren. Die verwendete DNS war human Placenta-DNS (normal) und Maus-NIH3T3-Zell-DNS, die mit dem mutanten Haras-Gen aus dem Blasenkarzinom T24 transfiziert war (15).
  • Das Testprotokoll war wie folgt: 90 μl PCR-Reaktionsgemisch wurden zu 600 μg an magnetische Teilchen I gekoppeltem Streptavidin zugegeben, gefolgt von Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die feste Phase in diesen Proben wurde unter Verwendung von magnetischen Gestellen abgetrennt, mit 50 mM NaOH und Hypridisierungspuffer (0,9 M NaCL, 50 mM NaPO4, pH 7,7, 5 mM EDTA, 0,1 % (w/v) Ficoll, 0,1 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % (w/v) Rinderserumalbumin) gewaschen und in 10 μg/ml des mit Ru(bpy)3 2+-markierten Oligonukleotids enthaltendem Hybridisierungspuffer resuspendiert. Diese Proben wurden 15 Minuten bei 66°C hybridisiert.
  • Die feste Phase wurde unter Verwendung von magnetischen Gestellen abgetrennt, zweimal mit 0,9 M NaCl, 50 mM NaPO4, pH 7,7, 5 mM EDTA, gewaschen und dann mit 3 M Tetramethylammoniumchlorid, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 0,025 Triton X-100 einmal bei Raumtemperatur und zweimal bei 66 °C für je 20 Minuten gewaschen. Die feste Phase wurde dreimal mit ECL-Puffer gewaschen, in 530 μl ECL-Puffer resuspendiert und die Elektrochemolumineszenz, wie in Beispiel 1 beschrieben, detektiert. 4 veranschaulicht dieses Testformat.
  • Die Tests auf Ha-ras-PCR-Produkte unter Verwendung von P32-markierten Sonden waren denjenigen unter Verwendung von Ru(bpy)3 2+-Markierungen vergleichbar, mit der Ausnahme, daß die feste Phase schließlich in 250 μl ECL-Puffer resuspendiert wurde. Diese suspendierten Proben wurden anschließend in 5 ml Szintillisationsflüssigkeit überführt und auf einem Beckman LS-100C-Flüssigszintillisationszählgerät gezählt.
  • In 8 zeigen wir die Daten für einen Punktmutationstest für das Ha-ras-Onkogen. Die PRC wurde, wie in 4 veranschaulicht, durchgeführt unter Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit unmarkiertem HRP1 (für die Sonden 1T24 und 1CHR) und biotinyliertem HRP1 mit unmarkiertem HRP2 (für die Sonden 2T24 und 2CHR), wodurch an Kügelchen gebundene einzelsträngige Ziele für die Hybridisierung erzeugt wurden. Die DNS-Proben waren das normale (Placenta) Ha-ras-Gen und das mutierte (NIH3T3-T24) Ha-ras-Gen. Die Hybridisierung der an die Kügelchen gebundenen DNS mit Ru(bpy)3 2+-Marker-1T24 (1T24), Ru(bpy)3 2+-Marker-2T24 (2T24), Ru(bpy)3 2+-Marker-1CHR (1CHR) und Ru(bpy)3 2+Marker-2CHR (2CHR) folgten Waschungen mit TEMAC. Der erhaltene, an Kügelchen gebundene Marker Ru(bpy)3 2+ wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben; auf ECL analysiert. Die Ergebnisse wurden als ECL-Zählrate für jede Kombination aus Probe und Sonde aufgetragen. Die Ergebnisse (8) waren wie erwartet, wobei die normalen Sonden gut mit der normalen DNS (siehe die CHR-Sonden) hybridisierten und die mutierten Sonden mit dem mutierten Gen (siehe die T24-Sonden) hybridisierten. Interessant war, daß diese Sonden sich in keinster Weise äquivalent verhielten. Um diese offensichtliche Anomalie zu erkunden, haben wir diese Sonden weiter untersucht, unter Verwendung von P32-markierten Sonden mit und ohne Ru(bpy)3 2+-Marker. Diese Bestimmung der Spezifität der mit Ru(bpy)3 2+-markierten Sonden unter Verwendung von P32-markierten Sonden für das Ha-ras-Onkogen erfolgte wie folgt. Die PCR wurde, wie in 8 beschrieben, unter alleiniger Verwendung von biotinyliertem HRP2 mit nichtmarkiertem HRP1 (für die Sonden 1T24 und 1CHR). Die verwendeten Sonden waren: 1T24 und 1CHR, enthaltend P32 (1T24-P, 1CHR-P) als Kontrollen; mit 1T24 und 1CHR, enthaltend sowohl P32- und Ru(bpy)3 2+-Marker zur Ermittlung des Effekts des Ru(bpy)3 2+-Markers. Die Proben wurden wie zuvor mit TEMAC gewaschen. Das erhaltene, an Kügelchen gebundene P32 wurde nach Zugabe von Szintillisations-Cocktail in einem Szinillations-Zählgerät analysiert. Die Ergebnisse wurden als P32-Zählrate pro Sekunde für jede Kombination aus Probe und Sonde aufgetragen (siehe 9). Diese Ergebnisse belegen, daß die P32-Sonden und die Ru(bpy)3 2+-markierten Sonden äquivalent fungieren und daß die Probleme mit der Sondenspezifität auf den verwendeten spezifischen Sondensequenzen beruhen. Um die Äquivalenz unseres Ru(bpy)3 2+-Markers und P32 weiter zu belegen, haben wir einen Vergleich zwischen diesen markierten Sonden durchgeführt. Die Amplifikation erfolgte, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung placentaler DNS und von biotinyliertem HRP2 mit unmarkiertem HRP1 (für die Sonden 1T24 und 1CHR). Das erhaltene PCR-Produkt wurde anschließend auf Proben aufgeteilt zum Erhalt eines Sets aus Proben, die verschiedene Mengen an Produkt enthielten. Diese Sets von Proben wurden anschließend entweder mit Sonden, markiert mit P32 (1T24-P32 und 1CHR-P32) oder mit dem Ru(bpy)3 2+-Marker (1T24-Ru(bpy)3 2+ und 1CHR-Ru(bpy)3 2+) hybridisiert. Die Ergebnisse aus jeder Untersuchung wurden anschließend unter Verwendung des Mittelwerts eines jeden Markers für die 90 μl-Probe normalisiert. Diese normalisierten Zahlen gestatten einen effektiveren Vergleich des Signals zum Hintergrund bzw. Rauschen und die vergleichbare Antwort der beiden Verfahren. Der Einsatz in 10 veranschaulicht die Antwort im unteren Bereich der Verdünnungskurve. Die Proben wurden, wie zuvor beschrieben, behandelt (8 und 9). Die Ergebnisse in 10 belegten die Äquivalenz der beiden Marker mit Hinweisen für ein besseres Ansprechen unserer Ru(bpy)3 2+-markierten Sonde. Diese Untersuchungen haben die Fähigkeit der mit Ru(bpy)3 2+-markieren Sonden belegt, genauso gut wie P32-markierte Sonden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zu funktionieren, einzelne Basenaustausche in einer Proben-DNS zu unterscheiden. Dieser Beleg zeigt an, daß der Ru(bpy)3 2+-Marker wenig tut, um die Eigenschaften der markierten Sonde in Hybridisierungsreaktionen zu beeinflussen.
  • BEISPIEL 30
  • DNS-SONDENTESTFORMAT III. Nachweis und Quantifizierung von Human-Papilloma-Virus (HPV)-PCR-Produkten in einem Test ohne Trennung
  • Für den Test auf HPV 18 ohne Trennung haben wir eine asymmetrische PCR-Reaktion mit einem Überschuß an biotinyliertem Primer durchgeführt. Diese PCR-Reaktion erzeugt einen Überschuß an biotinylierter, einzelsträngiger DNS, die nun für die direkte Hybridisierung mit den mit Ru(bpy)3 2+-markierten Sonden zur Verfügung steht. Für die Hybridisierung fügten wir 1000 ECL-Zellraten an Oligonukleotid mit Ru(bpy)3 2+-Marker (2 ng) zu, welches spezifisch für das HPV-Gen ist, amplifizierten auf 15 μl der PCR nach Abschluß der Amplifikation, gefolgt von Inkubation für 15 Minuten bei 50 °C. Zu diesem Hybridisierungsgemisch gaben wir 60 μl ECL-Puffer, enthaltend 600 μg von an magnetische Teilchen I gekoppeltem Streptavidin, und inkubierten unter Schütteln bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Das Probenvolumen wurde durch Zugabe von ECL-Puffer auf 530 μl erhöht, gefolgt vom Nachweis der Elektrochemolumineszenz, wie in Beispiel 1 beschrieben. 5 veranschaulicht dieses Testformt. Um diesen Test ohne Trennung zu belegen, haben wir eine Standardkurve für HPV18-DNS durchgeführt. Die PCR wurde unter Verwendung von biotinyliertem 2PV18 und unmarkiertem 1PV18 und von HeLa-DNS durchgeführt (14). Die erhaltene PCR-Reaktion wurde anschließend mit der spezifischen Sonde Ru(bpy)3 2+-Marker-3PV18 hybridisiert. Die Hybridisierungsmischung wurde anschließend zu mit Streptavidin beschichteten Teilchen zugegeben und der erhaltene, an Kügelchen gebundene Ru(bpy)3 2+-Marker wurde direkt auf die ECL, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse wurden als ECL-Zählrate über zur PCR zugefügten HPV18-Kopien aufgetragen, mit einer Kontrolle der ras-Oligonukleotidsonde (siehe 11). Diese Ergebnisse belegen die Fähigkeit, schnelle Tests auf Nukleinsäuresequenzen ohne Trennung auf Basis der Eigenschaften des ECL-Testsystems zu erzeugen.
  • BEISPIEL 31
  • Test auf spezifische genomische DNS-Sequenzen
  • Das hier beschriebene Testformat setzt zwei Oligonukleotide ein, die beide mit demselben DNS-Strang in der Nähe zueinander hybridisieren, wobei eine Sonde das Einfangen gestattet, die andere den Komplex markiert (Sandwich-Hybridisierung). Dieser Test wurde unter Verwendung von E.coli-DNS und für den trp-E/D-Genbereich spezifischen Sonden gezeigt. Die E.coli-DNS wurde Standardprotokollen folgend hergestellt (16). Die Lachssperma-DNS als Kontrolle wurde von Sigma Ltd. bezogen. Zu den DNS-Proben wurden 14 μl Hybridisierungspuffer (10X PBS, 10 mM EDTA und 0,7 % SDS), 2 ng mit Biotin markierter TRP.C04 und 5 ng von mit Ru(bpy)3 2+-markiertem TRP.C-O3 zugegeben. Diese Proben wurden mit Wasser auf 100 μl ergänzt. Die Proben wurden auf 97 °C erwärmt und bei 97 °C 10 Minuten lang inkubiert, auf 50 °C abgekühlt und 2 Stunden hybridisiert. Zu diesen Proben wurden 20 μl mit Streptavidin beschichtete Magnetteilchen II zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur gemischt. Die Teilchen wurden anschließend viermal in ECL-Puffer gewaschen, in 500 μl ECL-Puffer resuspendiert und, wie in Beispiel 3 beschrieben, analysiert. Die positive DNS ist E.coli und die negative DNS ist Lachssperma. Die Ergebnisse sind in Tabelle X gezeigt.
  • Tabelle X
    Figure 00710001
  • Diese Ergebnisse belegen die Fähigkeit des ECL-Testsystems, beim Nachweis eines genomischen Gens in E.coli unter Verwendung eines Sandwich-Hybridisierungs-Testformats auf nicht amplifizierter DNS zu funktionieren. Die mit Streptavidin beschichteten Magnetteilchen I können vergleichbar in der Weise genutzt werden, daß mit Streptavidin beschichtete Magnetteilchen II in diesem Beispiel eingesetzt werden.
  • BEISPIEL 32
  • Teilchenkonzentration auf Abklingwellen-Fluoreszenzdetektoren
  • Die Konzentration eines markierten Komplexes auf einer Detektionsoberfläche kann verwendet werden, um die Empfindlichkeit eines Tests, der Abklingwellendetektoren anwendet, zu erhöhen. Solche Detektoren können entweder (eine) optische Faser(n) oder (einen) planare(n) optische(n) Wellenleiter 300 einsetzen, um Licht 310 von einer Lichtquelle zur fluiden Umgebung zu führen. Das Licht wird durch den Wellenleiter oder die optische Faser über innere Totalreflektion (Total Internal Reflection; TIR) 310' reflektiert, die dann auftritt, wenn ein einfallender Lichtstrahl eine Grenzfläche zwischen einem dielektrischen Medium mit hohem Brechungsindex (n1) und einem mit niedrigerem Brechungsindex (n2) berührt. Ist der Einfallswinkel des Lichtstrahls größer als der kritische Winkel 315, der θ0 ist (der zwischen der senkrechten Linie 300' und dem Lichtpfad 310' gezeigte Winkel), θ0 = sin–1(n2/n1), wird das Licht an der Grenzfläche zu 100 % intern reflektiert. In optischen Wellenleitern und optischen Fasern bewegt sich das Licht mit einem Einfallswinkel, der größer als der kritische Winkel ist und propagiert durch das Medium mittels interner Totalreflektion. 22 zeigt die TIR-Propagation in einem Wellenleiter oder einer optischen Faser.
  • Obwohl der Lichtstrahl bei jeder Wechselwirkung mit der Grenzfläche total reflektiert wird, ist das elektromagnetische Feld außerhalb des Mediums nicht gleich null. Physikalische Bedingungen der Kontinuität über eine Grenzfläche hinweg erfordern, daß das elektromagnetische Feld exponentiell abfällt, wenn es aus der Faser oder dem Wellenleiter in die äußere Umgebung austritt. Dieses Feld wird austretendes oder abklingendes Feld 320 genannt und kann Fluorophore zur Fluoreszenz anregen. Die Abklingrate des austretenden Feldes hängt von der einfallenden Wellenlänge, den Brechungsindizes n1 und n2 sowie dem Einfallswinkel ab. Unter Verwendung eines Quarz-Wellenleiters und sichtbaren Lichtes in einer Wasserumgebung, fällt das austretende Feld 320 innerhalb eines Abstandes von 100 nm von der Grenzfläche zwischen Wellenleiter und Lösung um etwa 90 % ab. In 22 weist das umgebende Medium 330 einen Brechungsindex n2 und die optische(n) Faser(n) oder der bzw. die Wellenleiter 300 einen Brechungsindex n1 auf.
  • Dieselben Prinzipien, die das abklingende Feld für im Wellenleiter oder der optischen Faser propagierendes Licht erzeugen, gestatten, daß das Licht, das bei der Lumineszenz der Fluorophore erzeugt wird, effektiv zurück in das optische Element eingefangen wird. Zusätzlich wird alles Licht, das außerhalb der Abklingzone (320) erzeugt wird, effektiv am Eintritt in das optische Element gehindert. Die Kombination dieser Effekte gestattet den Einsatz von optischen Fasern oder Wellenleitern als effiziente optische Elemente zum Messen der Anwesenheit und Konzentration von Fluorophoren als Markern auf oder in der Nähe ihrer Oberflächen in einer wäßrigen Umgebung. Die hierin durch Bezugnahme aufgenommene US-A-4,447,546 beschreibt ein geeignetes Verfahren und eine Vorrichtung zur Ausführung von Fluoreszenz-Immunoassays, die eine optische Faser zur Anregung und Messung der Fluoreszenz von einem markierten Immunoreagenz in der Abklingzone einsetzen.
  • Die Erfindung kann angewandt werden, um die Empfindlichkeit von Fluoreszenz-Bindungstests unter Verwendung von optischen Fasern oder Wellenleitern zu verbessern. Der Test wird unter Verwendung von mit Fluoreszenz-Gruppen markierten Reagenzien durchgeführt. Nach Inkubation der Teilchen, der Probe und des Reagenz' werden die Teilchen auf der Oberfläche des Wellenleiters oder der optischen Faser konzentriert. Da die Oberfläche der Teilchen größer als die geometrische Fläche des Wellenleiters oder der optischen Faser ist, können mehr Fluorophore in der das optische Element umgebenen Abklingzone gesammelt werden. Somit wird das Lumineszenzsignal von den Teilchen größer sein und kann die Quantifizierung des Analyten empfindlicher sein, was zu verbesserten Nachweisgrenzen führt. DYNAL, DYNABEADS, TEFLON, TRITON und TWEEN sind allesamt eingetragene Handelsmarken.
  • LITERATUR
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Claims (21)

  1. Assayreagenz-Zusammensetzung zur Anwendung in einem Assay für einen interessierenden Analyten, basierend auf einer Bindungsreaktion und der Messung eines elektrochemilumineszenten Phänomens, umfassend: a) eine Markierungsverbindung, enthaltend einen elektrochemilumineszenten Rest, der an einen Bindungspartner des interessierenden Analyten oder eines Analogen des interessierenden Analyten angehängt ist; und b) eine Vielzahl magnetisch reagierender Partikel, die eine Oberfläche aufweisen, die in der Lage ist, an eine Komponente der Assayreagenz-Zusammensetzung zu binden, wobei die Partikel magnetisch reagierende Partikel sind, die eine von 0,5 bis 2 g/ml reichende Dichte und einen von 0,01 μm bis 10 μm reichenden Durchmesser aufweisen.
  2. Zusammensetzung wie in Anspruch 1 dargelegt, wobei die magnetisch reagierenden Partikel superparamagnetische Partikel umfassen.
  3. Kit enthaltend Reagenzien zur Anwendung in einem Mikropartikel-basierten Bindungsassay für einen interessierenden Analyten, umfassend: a) magnetisch reagierende Partikel, die eine von 0,5 bis 2 g/ml reichende Dichte und einen von 0,01 μm bis 10 μm reichenden Durchmesser aufweisen; und b) eine Markierungsverbindung, enthaltend einen elektrochemilumineszenten Rest, i der an einen Bindungspartner des interessierenden Analyten oder eines Analogen des interessierenden Analyten angehängt ist; unter der Voraussetzung, dass jedoch keine zwei oder mehr Komponenten des Kits untereinander unter den Lagerungsbedingungen reagieren, so dass die Funktion der Reagenzien in dem beabsichtigten Assay beeinträchtigt würde.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Partikel auf einer Elektrodenoberfläche gesammelt werden.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 4, wobei die Partikel mit der Markierungsverbindung verbunden sind.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4 oder 5, wobei die Partikel mit Streptavidin beschichtet sind.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5 oder 6, wobei die Zusammensetzung weiter einen Biotin-markierten zweiten Bindungspartner des interessierenden Analyten umfasst.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6 oder 7, wobei die Markierungsverbindung an einen Bindungspartner des interessierenden Analyten angehängt ist und der Bindungspartner ein Antikörper ist.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7 oder 8, wobei die Partikel ein an ihnen angehängtes Bindungsreagenz aufweisen.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9, wobei die Partikel magnetisch reagierende Polystyrol-Partikel sind.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, wobei die Partikel magnetisch reagierende Fe2O3-umfassende Polystyrol-Partikel sind.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 11, wobei die Partikel Dynal M-280 Dynabeads sind.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12, wobei der elektrochemilumineszente Rest ein Metallchelat ist.
  14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das Metallchelat ein Übergangsmetall oder ein Seltenerdmetall umfasst.
  15. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das Metallchelat Ruthenium oder Osmi um umfasst.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12, wobei der elektrochemilumineszente Rest Tris(2,2'-bipyridin)ruthenium(11) ist.
  17. Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16 in einem elektrochemilumineszenten Bindungsassay, wobei die Partikel magnetisch sind und auf einer Elektrodenoberfläche gesammelt werden.
  18. Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16 in einem elektrochemilumineszenten Bindungsassay, wobei die Partikel magnetisch auf einer Elektrodenoberfläche gesammelt werden.
  19. Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder l6 in einem elektrochemilumineszenten Bindungsassay, wobei die Partikel magnetisch auf einer Elektrodenoberfläche gesammelt werden und veranlasst werden, Elektrochemilumineszenz zu emittieren.
  20. Verfahren zur Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16 in einem Assay für einen interessierenden Analyten, umfassend: a) Bilden der Zusammensetzung; b) Sammeln der Partikel auf einer Elektrodenoberfläche, wobei die Partikel magnetisch sind; c) Veranlassen des elektrochemilumineszenten Restes, Elektrochemilumineszenz zu emittieren und d) Detektieren der Elektrochemilumineszenz.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Partikel magnetisch auf der Elektrodenoberfläche gesammelt werden.
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