JPH11148901A - 改良されたルミネセンス検定のための装置 - Google Patents

改良されたルミネセンス検定のための装置

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JPH11148901A JP10200865A JP20086598A JPH11148901A JP H11148901 A JPH11148901 A JP H11148901A JP 10200865 A JP10200865 A JP 10200865A JP 20086598 A JP20086598 A JP 20086598A JP H11148901 A JPH11148901 A JP H11148901A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 興味ある電極での電気化学ルミネセンス測定
に基づいて試料中に存在する興味ある検体の結合検定を
行うための方法、装置、試薬、およびキットを提供す
る。この装置は電極の近接域で磁場を発生する磁石を含
んでいる。 【解決手段】 電極面での粒子に結合した標識の電気化
学ルミネセンス測定に基づいて試料中に存在する興味あ
る検体の結合検定を行うために次のものから成り立つ装
置： （ａ）試料を規定し、容積を含み、入口と出口手段を有
するセル、電極、および電極に近接した該粒子を捕集す
るための捕集手段； （ｂ）該電極に電圧を印加する手段；および （ｃ）該電極で発生する電気化学ルミネセンスを測定す
る手段。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願の相互参照】この出願は、１９９１年２月６
日に出願されたＭａｓｓｅｙ等の同時係属出願通し番号
０７／６５２，４２７の部分継続であり、それは又現在
出願放棄されているが電気化学ルミネセンス検定の表題
で１９８８年１１月３日出願の出願通し番号２６６，８
８２の部分継続である。この出願はまた１９９０年６月
１８日出願の出願通し番号５３９，３８９の部分継続で
あり、それは出願通し番号２６６，８８２の継続であ
る。同時にマッセイらが出願している通し番号０７／８
２７，２６９の「複数の磁石を含む磁性微粒子ベースの
ルミネセンス検定の方法と装置」（ＣＭＳ摘要書３７０
０６８−３４０１）の表題の出願を引用しているがこれ
も出願通し番号０７／６５２，４２７で部分継続であ
る。上記の引用出願は総てここでは参照文献に組み入れ
てある。
【０００２】
【発明が属する技術分野】この出願は一般的には結合検
定を行う方法と装置に関するものであり、更に具体的に
は検定システムの１つ以上の標識を付けた組成が放出す
るルミネセンスを測定することにより興味のある検体の
存在を測定する方法と装置に関するものである。更に特
別にはこの発明はルミネセンスのある成分が検定組成中
に濃縮されていて電気化学ルミネセンスが引き起こされ
る前に検出システムに収集されるように改良した良感度
で精密で再現性のある正確で均一または不均一な特定の
結合検定に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】多数の方法とシステムが、生化学や生物
学的物質中の興味ある検体の検出定量用に開発されてい
る。微量の微生物、医薬品、ホルモン類、ウイルス、抗
体、核酸、その他のタンパク質を測定することのできる
方法とシステムは研究者や臨床医にとっては大きな価値
がある。非常に肝要な技術要素が、例えば抗原抗体反
応、核酸異種形成技術、タンパク質配位子システムのよ
うな周知の結合反応を基礎に置いて開発されている。多
くの生化学や生物学的結合システムでの高度な特異性
が、研究や診断に価値のある多くの検定方法とシステム
を導き出している。典型的には興味ある検体の存在が、
１つ以上の結合物質に付けた観察できる「標識」の有無
によって示される。特に興味のあるのが光化学、化学、
電気化学の手段により発光する標識である。「光ルミネ
センス」は、物質が電磁放射線を吸収したときに発光を
誘導されるプロセスである。蛍光と燐光は光ルミネセン
スの一種である。「化学ルミネセント」プロセスは、エ
ネルギーの化学転移によるルミネセント種の生成を伴
う。「電気化学ルミネセンス」は、電気化学的なルミネ
セント種の生成を必然的に伴っている。興味ある検体を
含む試料を化学ルミネセント標識で標識付けした試薬と
混合する化学ルミネセント検定技術が開発されている。
反応性混合物は、定温放置され標識付き反応物が検体と
結合する。定温放置後に混合物の結合部分と非結合部分
が分離され、その一方または両方の部分の標識濃度を化
学ルミネセント技術で決定する。一方または両方の部分
で決定した化学ルミネセンスのレベルは、生物学的試料
の検体量を示す。
【０００４】電気化学ルミネセント（ＥＣＬ）検定技術
は、化学ルミネセント技術の改良である。それは、興味
ある検体の存在と濃度を感度良く精密に測定している。
その様な技術では、ルミネセンス発生の引金にするため
に定温放置した試料を電圧電流計的に作用する電極に触
れさせる。適切な化学環境で、特定時間に特定なやり方
で作用電極に電圧を印加することがその様な電気化学ル
ミネセンスの引金となる。その標識により生じた光を測
定して検体の存在または量が表示される。その様なＥＣ
Ｌ技術を充分に記述するために、ＰＣＴ公開出願ＵＳ８
５／０１２５３（Ｗ０８６／０２７３４）、ＰＣＴ公開
出願番号ＵＳ８７／００９８７、ＰＣＴ公開出願Ｕ．
Ｓ．８８／０３９４７を引用する。前記出願物の公開は
参考文献に組み入れられている。検定操作中に分離段階
の必要なしに電気化学ルミネセント検定を行い、異なる
濃度の検体でシグナル変調を最大にして精密で良感度の
測定が行われるようにすることが望ましい。非分離検定
の先行技術方法には、検定する１つ以上の結合組成を結
合するのに検定試料中に懸濁した微粒子物を用いる検定
方法がある。米国特許番号４，３０５，９２５は、臨床
学的に関連のあるタンパク質とペプチドをネフェロメト
リックとタービドメトリックの比濁分析法の手段で検出
決定することに関するものである。公開の方法は、光散
乱または光吸収の作用を行うラテックス粒子に抗原また
は抗体の結合が関連している。米国特許番号４，４８
０，０４２は、シェル中子（なかご）粒子から成る粒子
試薬を用いた技術に関するものである。シェルには官能
基があってそれに生物学的な興味のある化合物が共有結
合することができ、中子の高屈折率が光散乱測定の高感
度を示すことになる。この技術は、２価の抗体が興味あ
る多価の抗原と反応する凝縮反応に基づいていて、種々
なやり方で検出および／または測定できる凝縮物を作り
出す。
【０００５】米国特許番号４，４１９，４５３は同様
に、抗体や免疫原のような免疫薬物の存在を検出するの
に役立つ着色ラテックス凝縮試験法の使用に関するもの
である。この先行技術に基づくと、ルミネセント現象を
測定する検定に微粒子物の使用が可能であるとは思われ
てはいなかった。遊離した化学ルミネセントまたは電気
化学ルミネセント部分からのルミネセンスは吸収、散
乱、その他微粒子物からの干渉を受けると人々は予想し
たであろう。その予想に反して、米国出願通し番号５３
９，３８９（ＰＣＴ公開出願Ｕ．Ｓ．８９／０４９１
９）はルミネセント現象に基づく敏感で特別な結合検定
法を教えているが、そこでは不活性微粒子物が検定シス
テムの結合反応物の一つに特別に結合する。その検定は
不均一な（１つ以上の分離段階）検定方式で行われ、均
一な（分離のない）検定方式が一番都合良く使用され
る。米国８９／０４９１９は、ルミネセント現象測定の
ための結合反応に基づいた検定の組成に関するものであ
り、その組成には検定混合物の組成に結合できる表面を
持った複数の懸濁粒子が含まれている。別な点では試料
中の興味のある検体を検出または定量するシステムに向
いていて、そのシステムはその発明の検知組成を用いて
その検定法を行うことができる。このシステムには、検
知媒体中の標識化合物を誘起して発光する手段とそのル
ミネセンスを測定して試料中の興味ある検体の存在を検
出する手段が含まれている。
【０００６】電気化学ルミネセント部分が連結している
検定システム成分が懸濁したミクロ微粒子物に結合する
と、その成分に連結した電気化学ルミネセント部分が発
するルミネセントシグナル強度を大きく変調し、それに
よって検定システムの特定結合反応を監視する手段を与
えていることが判った。もっと驚くべきことは、懸濁微
粒子物に結合しないで残っているシステム成分に連結し
た電気化学ルミネセント部分が発するルミネセントシグ
ナル強度にこの懸濁粒子が極く僅かまたは全く影響を与
えないことが判った。
【０００７】それで米国８９／０４９１９は試料中の興
味ある検体の検出法に向けられていて、その方法には次
の段階が含まれている：即ち （１）次のものを含む組成物の形成： （ａ）興味ある検体を含んでいると思われる試料、
（ｂ）（ｉ）興味ある検体またはその類似物、（ii）興
味ある検体またはその類似物の結合相手（iii)上記の
（ｉ）または（ii）と結合能力のある反応性成分から成
るグループから選んだ検定施行物質、ここに該物質の一
つは発光誘導能力のある化学的部分を持った標識化合物
と連結している，（ｃ）検体および／または（ｂ）の
（ｉ）、（ii）、または（iii)で規定した物質と特別な
結合能力のある複数の懸濁粒子； （２）その組成を定温放置して粒子とこの標識化合物を
含む複合体を形成する； （３）標識化合物を発光させる； （４）その組成により放出するルミネセンスを測定して
試料中の興味ある検体の存在を検出する。これらと同じ
方法を用いて、検定組成のルミネセンスを既知量の検体
を含んだ組成のルミネセンスと比較することで試料中の
検体量を定量する。
【０００８】天然物か合成物に拘らず興味ある検体の類
似物は検体に匹敵する結合性を持った化合物であるが、
さらにそれより大きいか又は小さな結合能力の化合物も
含まれる。本発明に用いるのに適した結合の相手は周知
のものである。例えば抗体、酵素、核酸、レクチン、余
因子、受容体である。検体またはその類似物および／ま
たはその結合相手と結合能力のある反応性化合物は、第
二の抗体またはタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇのよう
なタンパク質またはアビジンかビオチンのようなものま
たは結合反応に入り込むことが技術的に知られているそ
の他の成分である。好都合なことにルミネセンスは、特
定の結合相手と結合したかしないかに拘らず標識化合物
が電圧電流計的に作用する電極に触れて誘起された電気
化学ルミネセンス（ＥＣＬ）から生じる。このＥＣＬ反
応性混合物は、光を発するよう特殊な時間特殊なやり方
で或る電圧を作用電極に印加することで発光の引金を制
御する。可視光の放射が都合良いが、その組成またはシ
ステムは赤外線または紫外線、Ｘ線、マイクロ波などの
ような別なタイプの電磁放射線を放射するかも知れな
い。「電気化学ルミネセンス」「電気化学ルミネセン
ト」「ルミネセンス」「ルミネセント」「発光（ルミネ
ス）」の用語を用いる場合、光や他の形の電磁放射線の
放射を含んでいる。米国８９／０４９１９が教える方法
は、研究や臨床で設定して行った種々の検定で極度に少
量の検体を検出定量できる。しかし研究者や臨床医の要
求から、これらの方法で行う検定の検出限界を下げこれ
らの検定の感度を上げ操作速度を上げることが肝要とな
っている。標識の付いた種を測定する段階前にそれを濃
縮することでそれが出すシグナルを増加する種々の方法
の技術が周知となっている。例えば米国特許番号４，６
５２，３３３では蛍光、燐光、または原子蛍光の標識が
付いた粒子を測定段階前にミクロろ過で濃縮している。
【０００９】測定段階前に標識の付いた免疫化学種を、
例えば磁気感応性標識付き粒子を測定容器の表面に引き
出すことで濃縮する技術も周知されている。例えば米国
特許番号４，７３１，３３７、４，７７７，１４５、
４，１１５，５３５ではその様な粒子を容器壁に引き出
してから照射して光の蛍光放出を励起している。米国特
許番号４，９４５，０４５では粒子を磁性電極上に濃縮
している。標識付き化学媒介物で助長された電極で電気
化学反応が起こる。免疫化学結合が媒介物の効率を変
え、結合が起こるときに変調シグナルが生じる。これら
の先行技術の方法は、この発明の表面選択励起プロセス
とは関連がない。例えば電気化学ルミネセンスのような
表面励起の特別な機構的説明に縛られてはいないが、固
相複合体上の標識は電極で酸化されるに違いないと信じ
られている。それは電子が標識から電極まで移動するこ
とが要求される。その電子は、例えば溶液のようなポテ
ンシャルエネルギーが非常に高い領域空間をポテンシャ
ルエネルギー障害として「飛び越す」ことはしないでそ
の中を通過するトンネル現象として周知の「ジャンプ」
をすると信じられている。このエネルギー障害をトンネ
ル通過できてから追加エネルギーを入力しないで、或る
分子から他の分子へまたは或る分子から電極へ移動す
る。しかしこのトンネル現象は、非常に短い距離だけで
働くのである。このトンネル現象の可能性は、２つの種
の間の距離が増加するにしたがって指数的に低下する。
２種間で生じるこのトンネル現象の可能性は、もしその
距離が２５オングストローム（2.５nm）以下なら相当高
いがその距離が大きいとかなり低くなる。この２５オン
グストロームの距離は熟練技術者が経験的に使ってはい
るが絶対的な限度ではない。
【００１０】従って、電極表面に２５オングストローム
でのＥＣＬ標識はＥＣＬプロセスに参与すると期待でき
る。電極表面の２５オングストローム以内にある粒子面
積はおしなべて極度に小さい。従って、粒子表面からの
ＥＣＬを顕著な程度に測定できるとは期待していない。
そのうえ、ＥＣＬプロセスで生じる光が増倍型光電管に
まで到達するには粒子間を通過しなければならない。そ
の粒子は本来不透明（濃縮懸濁液は黒色）であるので、
たとえかなりの光量がＥＣＬで作られたとしても、その
光が粒子間を通過して増倍型光電管で測定されるとは期
待していない。
【００１１】
【発明が解決すべき課題】従ってこの発明の主な目的
は、結合検定を行うための均一（非分離）と不均一（分
離）方法、試薬、装置を提供することである。この発明
の他の目的は、微粒子物を含む検定組成から放出する電
気化学ルミネセンスの測定に基づいた非分離、特定な結
合検定、試薬、装置を提供することである。更に関連す
る目的は、これまでに到達したもの以上に改良された感
度、早い検定時間、大きな特異性、小さな検出限度、高
い精度を持つような検定、試薬、装置を提供することで
ある。
【００１２】発明の説明 用語の定義 「ＥＣＬ部分」、「金属を含むＥＣＬ部分」、「標
識」、「標識化合物」、「標識物質」の用語は置き換え
て使用される。「ＥＣＬ部分」、「金属を含むＥＣＬ部
分」、「有機金属の」、「金属キレート」、「遷移金属
キレート」、「稀土類金属キレート」、「標識化合
物」、「標識物質」、「標識」と名付けられた種で検体
またはその類似物、検体の結合相手またはその類似物、
前記の結合相手と更に結合する相手、または検体、その
類似物または上記の結合相手と結合する能力のある反応
性成分のような分子と連結するものがこの発明の範囲内
にある。上記の種はまた１つ以上の結合相手および／ま
たは１つ以上の反応性成分の組合せに連結される。それ
に加えて、前記の種はまた結合相手、反応性成分、また
は１つ以上の結合相手および／または１つ以上の反応性
成分の組合せと結合した検体またはその類似物と連結で
きる。また複数の前記の種が直接または前に論じたよう
に他の分子を経て検体またはその類似物と結合するのも
この発明の範囲内にある。簡単にするためにこれらの配
位子を検定施行物質と呼ぶ。検出定量の用語は「測定」
と呼び、定量では基準値の組成と校正を用意する必要が
あるとされている。複合体の収集と濃度の用語は、検定
組成内の複合体の濃度と例えば電極表面での複合体の収
集とを記述するために置き換えて用いられる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】この広範な実施例で、こ
の発明は試料中の興味ある検体の結合検定を行うための
方法である。その段階は次のようになる： （ａ）次のものを含む組成物の形成：即ち（ｉ）該試
料、（ii）ルミネセンス発光を引き起こす能力のある標
識化合物に連結した成分を含む検定施行物質、（iii)検
体および／または該検定施行物質と特に結合する能力の
ある複数の粒子。 （ｂ）該組成物を定温放置して粒子と該標識化合物を含
む複合体の形成。 （ｃ）該複合体を測定域に収集。 （ｄ）該複合体中の標識化合物を表面選択励起してルミ
ネセンス発光の促進。 （ｅ）試料中の興味ある検体の存在を調べるために放出
ルミネセンスの測定。
【００１４】複合体は例えば電極表面に収集され、そこ
で電圧を電極に加えまたは表面に収集後下記のような表
面励起で蛍光を誘起し複合体は励起されて電気化学ルミ
ネセンスが誘起される。内部全反射蛍光（ＴＩＲＦ）は
蛍光を出し易い標識を励起し検出する表面感度の良い技
術として説明されていて、内部全反射はラマンと赤外吸
収と共に標識の存在を測定する別な表面感度の良い技術
として用いられている。表面プラズモン共鳴は、この発
明の方法によって表面の標識測定のために用いられる光
学技術である。この発明は従って、表面励起技術により
ルミネセンスを励起する方法に向けられている。この発
明は測定域即ち、ルミネセンス発光を引き起こす表面に
複合体を収集することで都合良く行われるが、この発明
はまた複合体を測定域外に収集した後にその測定域に持
って行く手段をとるか他の段階をとってルミネセンスを
誘起して測定する方法も含んでいる。複合体の収集は重
力沈降、ろ過、遠心力分離、および複合体の一部を形成
する磁気感応性粒子の磁気吸引などを含む若干の色々な
方法で行われる。若干の実施例を以下更に詳細にわたっ
て説明する。
【００１５】電極表面の電気化学ルミネセンス測定に基
づく検定が、重力を使って次のように都合良く行われて
いる：即ち （ａ）次のものを含む組成物の形成：即ち（ｉ）該試
料、（ii）ルミネセンス発光を誘起する能力のある標識
化合物に連結した成分を含む検定施行物質、（iii)該組
成物の残りよりも大きな密度を持ち検体および／または
該検定施行物質と特に結合する能力のある複数の粒子。 （ｂ）該組成を定温放置して粒子と該標識化合物を含む
複合体の形成。 （ｃ）該組成を検定セルに収集。 （ｄ）該組成を該セル内に充分な時間滞留させることで
重力により該電極表面上に粒子が沈降するようにして、
該検定セル容積の少なくとも相当部分の下に位置した電
極表面で該複合体を収集。 （ｅ）該電極に電圧を加えることで該収集複合体中の標
識化合物のルミネセンスを誘起。 （ｆ）試料中に興味のある検体が存在するのを調べるた
めに電極表面に発生したルミネセンスの測定。 バッチ検定が行われるが、連続または半連続検定をフロ
ーセル内で行うことができる。フローセルの場合には、
溶液が流れ通過する間に測定セル内には固相が残る。も
しその固相（例えば粒子）が水よりも濃い、即ち水より
大きな密度（＞1.０g ／mL）なら、粒子にかかる重力が
粒子をセル底に沈降させる。液体がセル内を流れて通過
する間に粒子が底に沈降するようにセルは作られている
か、ＥＣＬ装置の作用電極上のカラム状仕切り内のセル
に試料の大部分が入ってしまうようにセルは作られてい
る。粒子がＥＣＬを誘起する前に電極表面上に沈降する
ようにセル内の充分な滞留時間が与えられなければなら
ない。
【００１６】この発明の他の実施例では、検定組成とバ
ランスする以上に大きな密度を持った懸濁粒子を含む検
定組成を遠心力分離にかけて、粒子が測定域に移りそこ
で続いて粒子が例えば電気化学ルミネセンスを誘起する
ように電極と接触させるか遠心力分離段階で電極と直接
接触させる。この実施例では、測定セルが試料と試料封
入物を迅速に回転する手段を備えている。遠心力が試料
中の粒子を試料封入物の回転軸から外向きに動かして試
料封入物の外面に集める。この様な試料封入物の外面は
ＥＣＬ測定装置の作用電極を構成している。第３の実施
例では、粒子が検定組成からろ過によって取り出され
る。この実施例では粒子が検定組成バランス以上の大き
な密度を持っている必要はない。この発明で粒子を溶液
から分離し、例えばろ紙面上の粒子をポンプで引いて収
集など、ろ紙を通して溶液を引き抜いて濃縮する。この
ろ紙面は例えば、ＥＣＬ検出装置内の作用電極として働
くように金属薄膜で覆う。好適な実施例では、懸濁粒子
は例えば常磁性または強磁性の磁気感応性であり粒子に
磁場を印加して測定域またはできれば直接電極表面に集
める。測定セルには磁石が付いている。磁石の磁場は、
粒子がバッチセル内に滞留している時または粒子がフロ
ーセルを通過している時に力を加えて溶液のかさから磁
石に極めて近接しているセル表面に粒子を分離する。も
し磁石が適切な向きでＥＣＬ検出装置の作用電極に近接
して置かれているならば、粒子は作用電極の表面に濃縮
される。
【００１７】複合体を電極表面に集め濃縮するために上
記の方法を用いて、結合検定の若干異なる不均一と均一
方式が実施される。不均一結合検定では、標識からのル
ミネセンス測定前にその組成から複合体は取り出され
る。均一検定では、結合した（固相と）標識付き試薬と
結合していない標識付き試薬の分離は行われない。不均
一検定では、複合体が作用電極の表面上で濃縮されると
標識からのシグナルを測定すると、収集段階のない場合
よりもずっと大きくなる。それに反して、複合していな
い標識付きの試薬からのシグナルは変わりがない。それ
故、測定セル内に複合していない標識付きの試薬が存在
していても、収集した複合体からのシグナルは複合体の
収集がない検定におけるよりも大きくなる。結合検定の
検出限界は、収集操作の結果としてずっと改良される。
この発明の好適な実施例で、均一結合検定操作では現場
での分離段階が含まれている。例えば試料、検定施行物
質、粒子のような検定組成が測定セル内にポンプで集め
られ複合体が作用電極上に取り込まれた後に、現場洗浄
または複合体を検定組成の結合していない成分から分離
しながら第二の液体を標識試薬または標識付き試薬のな
いセルを通ってポンプで引き込む。この検定操作は技術
的には不均一結合検定である。しかし測定セルの内側で
の分離能力は、分離装置を追加する必要がなく外側分離
法よりもずっと早く操作できる点で有利である。不均一
結合検定はこの発明を利用して検定組成の成分を混合し
それを既定の時間だけ反応させて行われる。検定組成は
次に溶液を粒子から分離する分離段階に入る。次に電気
化学ルミネセンスを複合体か溶液から測定する。濃縮段
階で濃縮しないで行うのより良い精度と低い検出限度で
検体の測定ができるようになった後に、複合体からのＥ
ＣＬを測定する。
【００１８】
【発明の実施の態様】この発明は、他の目的やその特長
も同じように、次のような好適な実施例の説明をするこ
とで更にはっきり十分理解される。この発明は、結合反
応に入れる能力のある興味ある検体に広範にわたって適
用できる。これらの反応には、例えば抗原抗体、配位子
受容体、ＤＮＡとＲＮＡの相互作用、その他の周知の反
応が含まれる。この発明は、多種類成分の試料内の興味
ある検体の存在を定性的および定量的に検出する色々の
方法と検定に関するものである。
【００１９】試料 固体、エマルジョン、懸濁液、液体、またはガス状であ
るかも知れない興味ある検体を含んでいる試料は、例え
ば細胞と細胞を作った生成物、水、食物、血液、血清、
毛髪、汗、尿、ふん便、組織、唾液、油、有機溶剤また
は空気から得られる。試料は更に例えば水、アセトニト
リル、ジメチルスルホキシド、ジメチルフォルムアミ
ド、ｎ−メチル−ピロリドンまたはアルコール類または
それらの混合物から成り立っている。 検体 興味ある典型的な検体は、試料中に存在する細胞全体ま
たは表面抗原、準細胞粒子、ウイルス、プリオン、ウイ
ロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸、タンパ
ク質、リポタンパク質、多糖類、リポ多糖類、グリコタ
ンパク質、ペプチド、ポリペプチド、細胞代謝産物、ホ
ルモン、薬剤、合成有機分子、有機金属分子、鎮静剤、
バルビツール塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸、糖、レクチン、再結合または派生タンパ
ク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、また
は無機分子。典型的に、興味のある検体は１０-3モル以
下の濃度で存在し例えば１０-12 モル以下の低さまでに
なる。
【００２０】検定施行物質 興味のある検体を含んだ試料と組合せた検定施行物質
は、次のものから成るグループから選んだ少なくとも１
つの物質を含んでいる：即ち（ｉ）上記のような付加し
た興味のある検体またはその類似物、（ii）興味ある検
体の結合相手またはその類似物、（iii)（ｉ）または
（ii）と結合能力のある上記の反応性成分。ここに該物
質の１つを化合物または部分（例えばルミネセンス発光
を誘起する能力のあるＥＣＬ部分）に連結する。標識付
けの物質は細胞全体または表面抗原、準細胞粒子、ウイ
ルス、プリオン、ウイロイド、抗体、抗原、ハプテン、
脂質、脂肪酸、核酸、多糖類、タンパク質、リポタンパ
ク質、リポ多糖類、グリコタンパク質、ペプチド、ポリ
ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬剤、鎮静剤、バ
ルビツール塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、
アミノ酸、糖、非生物学的ポリマー（できれば可溶
性）、レクチン、再結合または派生タンパク質、合成有
機分子、有機金属分子、無機分子、ビオチン、アビジ
ン、ストレプトアビジン。或る実施例では、その試薬は
抗体、抗原、核酸、ハプテン、小ヌクレオチド連鎖、オ
リゴマー、配位子、酵素、またはビオチン、アビジン、
ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ま
たはその複合体、または一次結合の相手にタンパク質相
互作用により結合する能力があるその他の二次結合の相
手などと共役した電気化学ルミネセンス性の部分であ
る。興味のある検体の類似物は、天然物であれ合成物で
あれ典型的にはその検体に匹敵する結合性を持った化合
物であるが、また結合能力が高いか低い化合物であって
もよい。検体またはその類似物および／またはその結合
相手と結合する能力がありそれによってＥＣＬ部分が検
体と連結できるような反応性化合物は、第二抗体または
タンパク質Ａやタンパク質Ｇのようなタンパク質、また
はアビジン、またはビオチンまたは結合反応に入ること
が技術的に周知されているその他の化合物が適当であ
る。
【００２１】標識 ＥＣＬ部分が金属キレートであるのが都合が良い。この
キレートの金属は、問題の反応システムに課せられた電
気化学的条件下でルミネセンス発光をする金属キレート
となるような金属が適している。そのような金属キレー
トの金属は、例えば遷移金属（ｄ−ブロック遷移金属の
ような）または稀土類金属である。その金属はルテニウ
ム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白
金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウ
ム、銅、クロムまたはタングステンが好ましい。特に好
ましいのはルテニウムとオスミウムである。このような
キレートの金属に連結する配位子は、普通は複素環式
（ヘテロサイクリック）または有機の特性であり金属キ
レートが水溶液環境または有機かその他の非水溶液環境
に可溶性であるかどうかを決める役割を演じている。こ
の配位子は多歯状（polydentate)であり置換できる。多
歯状配位子には芳香族と脂肪族の配位子が含まれる。適
当な芳香族の多歯状配位子には芳香族複素環式配位子が
含まれる。好ましい芳香族複素環式配位子は、例えばビ
ピリジル、ビピラジル、ターピリジル、フェナントロリ
ルのような窒素含有のものである。適当な置換物には、
例えばアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリー
ル、アラルキル、置換アラルキル、カルボキシレート、
カルボキシアルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、ア
ミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、ア
ミノカルボニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイ
ド、硫黄含有基、燐含有基、Ｎヒドロキシ琥珀酸イミド
のカルボキシレートエステルが含まれる。キレートは１
つ以上の単一歯状配位子を持ち、その広範な種類が技術
的に周知されている。適当な単一歯状配位子には、例え
ば一酸化炭素、シアナイド、イソシアナイド、ハライ
ド、脂肪族、芳香族、多素環式ホスフィン、アミン、ス
チルベン、アルシンが含まれる。
【００２２】適当なキレートの例としては、ビス
［（４、４’−カルボメトキシ）−２，２’−ビピリジ
ン］２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−
４−イル）プロピル］−１，３−ジオキソランルテニウ
ム（II）；ビス（２，２’ビピリジン）［４−（ブタン
−１−アル）−４’−メチル−２，２’−ビピリジン］
ルテニウム（II）；ビス（２，２’−ビピリジン）［４
−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン４’−イル）
−酪酸］ルテニウム（II）；トリス（２，２’ビピリジ
ン）ルテニウム（II）；（２，２’−ビピリジン）［ビ
ス−ビス（１，２−ジフェニルフォスフィノ）エチレ
ン］２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−
４’−イル）プロピル］−１，３−ジオキソランオスミ
ウム（II）；ビス（２，２’−ビピリジン）［４−
（４’−メチル−２，２’−ビピリジン）−ブチルアミ
ン］ルテニウム（II) ；ビス（２，２’−ビピリジン）
［１−ブロモ−４（４’−メチル−２，２’−ビピリジ
ン−４−イル）ブタン］ルテニウム（II）；ビス（２，
２’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル
−２，２’−ビピリジン−４’−ブチルアミドルテニウ
ム（II）。その他のＥＣＬ部分は、参考文献としてここ
に組み入れたＰＣＴ公開出願ＵＳ８７／００９８７とＰ
ＣＴ公開出願８３／０３９４に記述がある。
【００２３】ＥＣＬ部分の作用は、電気化学的エネルギ
ーを反応系に導入した結果として電磁放射線を放出する
ことである。こうなるにはＥＣＬ部分が励起エネルギー
状態に刺激を受ける能力があり、また励起状態から落ち
る際に光のフォトンのような電磁放射線を放出する能力
もなければならない。電気化学ルミネセント反応にＥＣ
Ｌ部分が関与しているメカニズムの理論的解析に縛られ
たくはないが、電気化学エネルギーを反応系に導入する
ことで酸化され次いで系内の還元体との相互作用によっ
て励起状態に変わるものと我々は考えている。この状態
は比較的不安定であり金属キレートはすぐにもっと安定
な状態に低下する。その間にキレートは光のフォトンの
ような検出可能な電磁放射線を放出する。この発明によ
って組み込まれた金属キレートやその他の金属を含有す
るＥＣＬ部分の量は、系によって変わる。一般的には、
その様な部分の使用量は検出可能な放出を得るのに効果
的な量とするが、前記の組成や系からの電磁エネルギー
の放出が定量できることが望ましい。興味のある検体検
出および／または定量は、普通には興味のある検体やＥ
ＣＬ部分を含んだ試料からのルミネセンスを既知量の興
味ある検体やＥＣＬ部分で調製した校正標準物からの放
出ルミネセンスに対して比較することで行われる。これ
は均一方式を考えている。不均一方式では前に述べたよ
うにＥＣＬ分析に先だって分離を行う。或る普通の技術
技能で評価できるのであるが、金属含有のＥＣＬ部分の
確認と定量は、普通行われる条件にも依存するが系の種
類によって変わる。適当な金属含有ＥＣＬ部分と好まし
い結果を得るのに十分なその量は、過度な実験などをし
なくてもここでの教訓を一度身につければ普通の技術技
能で経験的に決められる。
【００２４】粒子 粒子としては0.０５μm 〜２００μm 、好ましくは 0.
１μm 〜１００μm 、最も好ましくは0.５μm 〜１０μ
m のように0.００１μm 〜２００μm 直径の微粒子物
と、検体および／または前に規定した１つ以上の他物質
に結合する能力のある表面成分から成り立つものが都合
がよい。例えば、この微粒子物は架橋澱粉、デキストラ
ン、セルロース、タンパク質、有機ポリマー、スチレン
／ブタジエンコポリマー、アクリロニトリル／ブタジエ
ン／スチレンコポリマーのようなスチレンコポリマー、
ビニルアセチルアクリレートコポリマーまたは塩化ビニ
ル／アクリレートコポリマー、不活性無機粒子、二酸化
クロム、鉄、シリカ、シリカ混合の酸化物、タンパク物
質、またはそれらの混合物。粒子はＥＣＬ系に懸濁して
いるのが望ましい。粒子には磁気感応性粒子が含められ
るか含めてもよい。
【００２５】検定媒体 電極が電気化学エネルギーを導入するシステムを操作す
るためには、電極を浸漬するためのＥＣＬ部分を含む電
解質が提供されなければならない。この電解質は、電荷
がイオンで運ばれるような相である。一般的にこの電解
質は液体相であり、１つ以上の塩またはその他の種を
水、有機液または有機液混合物、または水と１つ以上の
有機液の混合物に溶かした溶液である。しかしその他の
形の電解質もこの発明の或る実施例では使用できる。例
えば電解質は流体（例えば液体、蒸気、または超臨界の
流体）中に１つ以上の物質が分散したものまたは固体、
蒸気または超臨界流体中の１つ以上の物質が溶解した溶
液でもよい。この電解質は、塩の水溶液が適当である。
その塩はナトリウム塩またはカルシウム塩が好ましい
が、他の陽イオンとの組合せもその陽イオンが一連の電
気化学ルミネセント相互作用に干渉しない限り或る実施
例では適切である。その塩の陰イオンは例えば燐酸塩で
あるが、その他の陰イオンの使用もこの発明での或る実
施例では許されるが、再度言うがその選んだ陰イオンが
一連の電気化学ルミネセント相互作用に干渉しない限り
である。
【００２６】その組成も非水溶液である。超臨界流体は
或る場合には好都合に取り上げられるが、非水組成の有
機液体より成る電解質を利用するのが更に代表的であ
る。水溶液電解質のように非水溶液電解質も電荷がイオ
ンで運ばれる相である。通常、これは塩が有機液体の媒
体に溶解していることを意味する。適当な有機液体を例
示するとアセトニトリル、ジメチルスルフォキシド（Ｄ
ＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）、メタノ
ール、エタノール、および前記の２つ以上の混合物。実
例として、テトラブチルアンモニウムテトラフルオロボ
レートのようなテトラアルキルアンモニウム塩類は有機
液体に可溶でありそれらと共に非水溶液電解質を作るの
に使われる。電解質はこの発明の或る実施例では緩衝系
となる。燐酸塩緩衝液がしばしば好都合である。例とし
ては燐酸ナトリウム／塩化ナトリウムの溶液と燐酸ナト
リウム／弗化ナトリウムの水溶液。
【００２７】その他の検定成分 ＰＣＴ公開の出願Ｕ．Ｓ．８９／０４８５９、表題「ア
ミン誘導還元体を利用した電気化学ルミネセント反応」
で述べているように、引用して組み入れてあるその開示
では、代表的にはアミンまたはアミン部分（巨大分子
の）還元体を添加するとそれが酸化され自発的に分解し
て非常に還元性のある種に転化するので望ましいとして
いる。アミンまたはアミン部分はまた反応系に導入した
電気化学エネルギーによって酸化されると信じられてい
る。アミンまたはアミン部分は電子を消失して釣合が失
われるかそれ自体の再配置が行われて強度の還元剤にな
る。この還元剤は酸化された金属含有ＥＣＬ部分と反応
し合って上記のような励起状態になると思われる。この
役割を行うためにはアミンまたはアミン部分が電子を与
えるような炭素を中央にしたラジカルと、還元体形成の
ためには釣合を失った際にプロトンを与える役割を果た
すアルファ炭素を有していることが望ましい。アミン誘
導の還元体は、金属含有ＥＣＬ部分を励起状態に変えそ
れにより検出可能な電磁放射線が放出されるよう必要な
刺激を与えるのである。広範囲にわたるアミンと相当す
るアミン部分がこの発明を実行するのに利用できる。一
般的にアミンまたはアミン部分は、電気化学ルミネセン
スで分析する系のpHに適合するように選ばれる。その他
の関連ファクターはアミンまたはアミン部分が、分析中
に機能するような環境（即ち、水溶液または非水溶液の
環境の場合であっても）に適合しなければならない。更
に、選ばれたアミンまたはアミン部分が普通に行われて
いる条件下で系内の酸化された金属含有ＥＣＬ部分を還
元できるほど充分な強度を示すアミン誘導の還元体を形
成しなければならない点を考慮する。
【００２８】アミン類（およびそれから誘導された相応
する部分）でこの発明に好都合に利用されているもの
は、一次、二次、三次アルキルアミンのような脂肪族ア
ミン類、それぞれ１〜３の炭素原子を有するアルキル
基、ならびに置換脂肪族アミン類である。トリプロピル
アミンは、比較的な話であるが、特別強度の電磁放射線
を放出させて、これを使った実施例では検出定量の感度
と精度を上げている。また、ヒドラジンのようなジアミ
ン類とポリエチレンイミンのようなポリイミン類が好適
である。この発明を行うのに好適な他のアミン類の例
は、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、１，４
−ジアザビシクロ−（２．２．２）−オクタン、１−ピ
ペリジンエタノール、１，４−ピペラジンビス−（エタ
ンスルホン酸）、トリイソプロピルアミンおよびポリエ
チレンイミン。本発明で利用される金属含有ＥＣＬ部分
の代表的なものは反応を制限する構成要素である。従っ
て、アミンまたはアミン部分はそれに対して化学量論的
に過剰に与えられる。実例として、アミンまたはアミン
部分は５０〜１５０mMの濃度で用いられる。約７のpHで
利用するには、１００mM濃度が好都合である。或る実施
例では、アミンまたはアミン部分の上限濃度は使用する
環境（例えば水）でのアミンまたはアミン部分の最大溶
解性で決められている。一般にアミンまたはアミン部分
は、酸化された金属含有ＥＣＬ部分が励起状態へ転移し
てルミネセンスを発するのに充分影響を与える量を使用
する。普通の技術技能はここでの教えを身につけること
で、分析する特殊な系に好都合に使用されるアミンまた
はアミン部分の量を過度な実験なしに経験的に決めるこ
とができる。
【００２９】ＰＣＴ公開出願ＵＳ８９／０４９１５の表
題「増強した電気化学ルミネセント反応」の内容は引用
に組み入れられているが、そこで述べられているよう
に、この発明の検定は増強剤の存在下で行うのが望まし
い。その増強剤の代表的な化合物の化学式は：
【化１】 ここに Ｒ：水素またはＣn Ｈ2n+1、Ｒ’：Ｃn Ｈ2n、 Ｘ＝０〜７０、ｎ＝１〜２０（好ましくは１〜４）。特
定の例としてはトリントンＸ−１００の名称の市販品が
ある。その化学式は：
【化２】 ここにＸ＝９〜１０ トリントンＸ−４０１の名称の市販品、化学式は：
【化３】 ここにＸ＝４０。増強剤は一般には充分な量を使用して
それで電磁放射線の望ましい放出増加が起こるようにす
る。代表的な量は0.０１％〜5.０％、更に好ましいのは
0.１％〜1.０％ｖ／ｖ。
【００３０】この発明により用いるＥＣＬ部分は、励起
状態に刺激して電磁放射線を放射するように導かれる。
そこではＥＣＬ部分を組み込んだ系を電気化学エネルギ
ーに曝すことで行われる。ＥＣＬ部分と強還元体を形成
する種の酸化を起こすポテンシャルは、その正確な化学
構造ならびに系のpHや電気化学エネルギーを導き出すた
めに使用される電極の特性のようなファクターに依存し
ている。最適のポテンシャルと電気化学ルミネセント系
の放射波長の決め方は、普通の技術技能でも周知されて
いる。ＥＣＬ系を刺激強調する或る好ましい方法は、Ｐ
ＣＴ公開出願ＵＳ８９／０１８１４で開示されている
が、その内容はここに引用して組み入れてある。
【００３１】電気化学ルミネセンスの測定装置 この発明の検定を行う装置を図１、２で説明する。図１
は具合のよいＥＣＬ装置を開示しているが本発明の方法
は図１０の適用に限られないで、ＥＣＬ部分の電気化学
ルミネセンスの引金となる電気化学エネルギーを与える
作用電極またはその他の引金となる表面を含んだ別なタ
イプのＥＣＬ装置がむしろ採用されることがある。この
発明の方法は静的または流動様式で行うことができる
が、装置１０には結合検定試料を含む多くのタイプの試
料にはっきりした利点を与えるフローセルが含まれてい
る。この発明のＥＣＬ検定を行う装置の更に詳細が公開
のＰＣＴ出願ＵＳ８９／０４８５４とＵＳ９０／０１３
７０で開示されている。装置１０には電気化学セル１
２、増倍型光電管（ＰＭＴ）が有利であるが光検出／測
定機器１４、光ダイオード、電荷結合機器、写真フィル
ムまたはエマルジョンなど、セル１２との流体輸送をす
るためにはぜん動ポンプが有利であるがポンプ１６が含
まれる。代替案として容積式ポンプが使用できる。シャ
ッター機構１８がセル１２とＰＭＴ１４との間にあり、
ＥＣＬ測定期間中にＰＭＴ１４をセル１２に曝すときに
だけ開けるように制御して運転される。このシャッター
機構は例えばメンテナンス中は閉じられる。また装置１
０に含まれているが図１に説明がないのは光遮蔽ハウジ
ングであり、種々の構成部品をその内に装備しＥＣＬ測
定中に外部の光をＰＭＴ１４から遮断する意図がある。
【００３２】セル１２自体には第１装備ブロック２０が
ありステンレス鋼で具合良く作られていて、入口管２２
と出口管２４が通っている。装備ブロック２０には第１
の外面２６と第２の内面２８がありセル１２の試料保持
容積３０の一方の側を決めていて、そこでセル１２は装
置１０の運転中に溶液の洗浄および／または状態調節お
よび／または測定を保持する。入口管２２と出口管２４
は外面２６から内面２８に装備ブロック２０を通過して
試料保持容積３０に口を開けている。第２装備ブロック
３２もステンレス鋼で具合い良く作られていて、第１の
外面３４と第２の内面３６がある。第２の装備ブロック
３２は第１の装備ブロック２０とはテフロンまたはその
他の汚染されない物質で具合いよくできた環状スペーサ
ー３８で分離されている。それで装備ブロック３２の外
面３４は試料保持容積３０の第２側面部分を規定する。
スペーサー３８には外側部分４０と中央口径４２があ
り、その内端４４は試料保持容積３０の側壁を規定す
る。外側部分４０は、第２装備ブロック３２の外面３４
に対して第１装備ブロック２０の内面２８を目張りし
て、２つの面２８、３４の間の試料保持容積３０から溶
液が出るのを防いでいる。装備ブロック３２には更に中
央口径があり、それには窓４８がシール固定されていて
試料保持容積３０の第２の側の残りを外面３４の続きと
して規定している。窓４８は、ＥＣＬ部分から放出する
電気化学ルミネセンス光の波長に全く透明な物質で作ら
れる。窓４８は、従ってガラス、プラスチック、石英な
どで具合いよく作られている。入口管２２はその第１の
末端５０がスペーサー３８の近くで試料保持容積３０と
交差し、出口管２４はその第２末端５２がスペーサー３
８の近くで試料保持容積３０と交差する。入口管２２、
試料保持容積３０、出口管２４の組合せで、セル１２に
出入りする溶液が狭く全く層流のために連続した流路が
提供される。矢印Ａ、Ｂはそれぞれ入口管２２と出口管
２４に入るのと出る流れを表す。
【００３３】第１装備ブロック２０の内面２８に装備さ
れたのは作用電極システム５４であり、それは説明した
実施例では第１と第２の作用電極５６、５８を含めてい
る。他の実施例では、１つの作用電極が具合いよく与え
られるか電極５６だけが作用電極となる。作用電極５
６、５８は興味の電気化学反応とＥＣＬ反応が起こる所
である。作用電極５６、５８は固体の電圧電流型電極で
あり従って白金、金、炭素またはこの目的に効果のある
その他材料で具合いよく作られている。作用電極５６、
５８にそれぞれ接続されたワイヤーコネクター６０、６
２は第１装備ブロック２０を通過して出ている。コネク
ター６０、６２は図２で説明した電圧制御器６６の第１
「作用電極」端子６４に両方が接続されている。電圧制
御器６６は、電圧シグナルを作用電極５６、５８に供給
しＥＣＬ測定中に流れ出る電流を随時測定するのにポテ
ンシオスタットのやり方で具合いよく運転される。それ
とは別に、コネクター６０、６２は個々の運転用に電圧
制御器６６の端子を分けて接続してもよい。電圧制御器
６６のポテンシオスタットとしての運転は、対向電極６
８とまた随時具合いよく照合電極７０によって更に影響
を与えられる。説明した実施例で、装備ブロック３２は
ステンレス鋼で作られ、対向電極６８は装備ブロック３
２の露出面７２、７４である。対向電極７２、７４と作
用電極５６、５８は、試料保持容積３０内の溶液にポテ
ンシャルを印加する接合点を与え、それが化学反応のエ
ネルギーを与えて試料の電気化学ルミネセンスの引金と
なり、及び／またはセル１２の表面を浄化し状態調節す
るエネルギーを提供する。対向電極７２、７４はワイヤ
ーコネクター７６で電圧制御器６６の第２「対向電極」
の端子７８に接続される。
【００３４】照合電極７０は基準電圧を与え、これに対
して作用電極５６、５８で加えられた電圧が照合され、
例えば基準に対して＋1.２ボルトとなる。照合電極７０
は、セル１２から間隔のある位置８０に出口管２４が具
合いよく配置されワイヤーコネクター８２で電圧制御器
６６の第３「照合電極」の端子８４に接続される。この
３電極様式では、電流は照合電極７０を通っては流れな
い。照合電極７０は、３電極様式運転では釣り合いのと
れた既知の安定電圧を提供するのに使われ、従ってそれ
は銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）で具合いよく作られる
か飽和カロメル電極（ＳＣＥ）である。電圧制御器６６
は、２電極様式運転では作用電極５６と電極５８だけを
対向／照合電極として使って運転できる。この２電極様
式運転では、対向／照合電極５８が電圧制御器６６の電
圧制御端子７８、８４に電気的に接続される。この場
合、電圧制御器６６は本質的にはバッテリーとして運転
する。電圧制御器６６は、電圧シグナルを作用電極５６
と対向電極５８に供給しそれぞれの電極を通して流れる
電流を随時測定する。照合電極７０は、白金、金、ステ
ンレス鋼またはその他の材料で作るいわゆる「準照合」
電極とも言われ、安定性が少ないが接触した溶液に関し
て測定可能になる電圧を与える。２電極と３電極様式の
両方の様式では照合電極７０または５８が標準を与える
目的に使われ、それに対して作用電極５６に加えられた
電圧が測定される。釣合のとれた電圧標準が目下のとこ
ろより好都合だと考えられている。ポテンシオスタット
運転で電圧制御器６６は、照合電極７０に関して作用電
極５６、５８に既知電圧を与え一方作用電極５６、５８
と対向電極７２、７４の間に流れる電流を測定すること
で種々の電極を制御する。この目的にはポテンシオスタ
ットが周知されていて、従って、電圧制御器６６の内部
構造は従来の市販品のどのポテンシトスタットにも対応
し上記の機能を作り出すのでそれ自体は本発明の一部を
形成はしていない。確かに、装置１０はあるいはまた内
部電圧制御器６６なしで作られ、必要な電圧シグナルを
電極５６、５８、７２、７４、７０に与えるために別々
に制御される外部ポテンシオスタットと接続して適合さ
れることがある。下記するような特定のやり方で加えら
れるこれらの電圧シグナルは、作用電極５６、５８の表
面と都合よく全体としてセル１２の表面に反復できる初
期条件を与え、その特性はＥＣＬ測定の精度改良にかな
り貢献する。
【００３５】ポンプ１６は、溶液を試料容積から入口管
２２へ矢印Ａの方向に「引っ張る」ために都合のよい出
口管２４のところに位置する。溶液は入口管２２、試料
保持容積３０、出口管２４を経て照合電極７０を通過し
て矢印Ｂの方向に流れ出る。その代わりに、ポンプ１６
を入口管２２のところに位置して溶液を装置１０を経て
「押し出す」こともある。都合よく入口管２２、試料保
持容積３０、出口管２４を経るこの同じ流路が全溶液と
流体に用いられ、それはセル１２を通過してその際各流
体は前の残っていた流体をセル１２の外に押し出しなが
ら水力学的洗浄活動を行う。ポンプ１６の運転を止め
て、セル１２中の特殊な溶液を或る時間保持するように
制御することもできる。装置１０の流れが通過する構造
では、作用電極に変動電圧を印加することあるいは作用
電極５６、５８（または対向電極７２、７４と照合電極
７０）を大気に曝すことなしに１つ以上の溶液に連続し
て曝されながら予め運転できるポテンシャルに絶えず保
持することができる。大気に曝されると、照合電極７０
への回路が開かれて未知の乱れた電圧の変動が起こって
作用電極５６、５８の表面条件の再現性がなくなる。こ
の流れ通過の構造では、電極システム５４を浄化し状態
調節をする初期段階と１つ以上のＥＣＬトリガーの波形
または掃引の測定段階の間での急速な交替が可能であ
る。
【００３６】図２３と２４はセルとマグネットシステム
を装備した磁石２７／３７の概略を表していて、このマ
グネットシステムは電極表面５６、５８の面に大体平行
な磁場線を都合よく印加する。マグネットシステムは複
数のそれぞれの永久磁石または電磁石から成り立ってい
て、それらは磁石２７／３７の北極と南極を交替に積み
重ね配向してある。磁石２７／３７のそれぞれの磁石は
空間または磁気に感応しない材料で分けられている。そ
の配置は図２３と２４に示すように、電極面に殆ど水平
になるように磁力線を作用電極の上の領域に都合よく並
べる。これが磁気感応性粒子を配向させて粒子が電極表
面上に並び電極が供給した電気化学エネルギーに容易に
アクセスできるようになる（図２０参照）。図２３と２
４に示すマグネットシステム２７／３７は、磁場線が磁
石構造から長い距離伸びていないことが都合よい（図２
０参照）。その様なマグネットシステムからの磁場は、
従って永久磁石の挙動または強磁性体を電極装置の近く
に引き起こす恐れがなく、フローセル装置に近い増倍型
光電管の運転に厳しい影響を与えない。図２５に描かれ
た装置は図１と２に表した通りであり、また図１と２に
関しての上記の説明の通りであるが、図２５を除いて、
水平に向けられた電極５６または電極５６、５８の下に
垂直に位置したのは図２３と２４に示すように北と南に
配向した複数の磁石２７／３７である。
【００３７】この発明はまた試薬の組成にも向けられて
いる。大まかには試薬組成はこの発明の検定システム成
分のどれかになるであろう。即ち、（ａ）電解質、
（ｂ）ＥＣＬ部分含有の標識化合物、（ｃ）磁気感応性
粒子を含む粒子、（ｄ）興味の検体または興味の検体の
類似物、（ｅ）興味の検体の結合相手またはその類似
物、（ｆ）（ｄ）と（ｅ）との反応能力のある反応性成
分、（ｇ）還元体、または（ｈ）電気化学ルミネセンス
反応の増強剤。試薬は使用上の都合により互いに組み合
わされる。即ち、意図した検定での成分機能が損なわれ
る程成分が保管中に互いに反応しないならば、２成分、
３成分、および多数成分の混合物が調製される。望まし
いのは、試薬が２成分または多数成分の混合物であって
それには粒子および１つ以上の他の成分が含まれている
ことである。この発明はまたキットにも目を向けてい
る。そのキットには上記のような１つ以上の成分（ａ）
〜（ｈ）を入れた容器があるか、そのキットにはこれら
の成分の混合物から成る上記のような１つ以上の試薬組
成を入れた容器があり、全てがこの発明の検定法とシス
テムに使われる。
【００３８】発明の好適な実施例の説明 この発明の粒子での検定には広範囲の粒子が採用される
が、一般的には粒子は密度1.０〜5.０g ／mL（1.１〜２
g ／mLが好ましい）を持つ。最適な密度を選ぶことはこ
の技術技能の範囲内であり、重力駆動の検定での沈降速
度は検定のスピードと複合体を電極表面上に一様な層に
作り上げたい要望との間で妥協することになる。広範囲
の平均直径を持った粒子も採用される。例えば0.０５〜
２００μm のような好ましくは0.０１〜１０μm と0.０
０１〜２００μm 範囲内の平均直径の粒子は使用でき
る。検定組成での粒子の広範な濃度も採用される。例え
ば、濃度は１〜１0,０００μg ／mL、好ましくは５〜１
０００μg ／mLの範囲に限られる。望ましくは粒子密
度、そのサイズ、その濃度は粒子が少なくとも0.５mm／
分の速度（好ましくはもっと早い速度）で沈降するよう
に選ばれる。この発明を行うろ過様式で、ろ過手段は平
均直径で測ったポアサイズとして粒子の平均直径の大体
0.０１〜９０％、好ましくは１０〜９０％、が望まし
い。
【００３９】先行技術はこの発明の検定で使用できる多
数の磁性粒子を述べている。例えば米国特許Ｎｏ．４，
６２８，０３７、４，６９５，３９２、４，６９５，３
９３、４，６９８，３０２、４，５５４，０８８、英国
特許出願ＧＢ２，００５，０１９ＡとＥＰ０，１８０，
３８４。これらの全てがここに引用されて組み込まれて
いるが、うまく使用できた多数の磁性粒子を記述してい
る。粒子は常磁性体か強磁性体であり、磁性粒子が免疫
検定に使うことができるように結合化合物がつながる種
々の材料で粒子は被覆されている。望ましくはこの発明
で使用される磁性粒子は少なくとも0.００１ｃｇｓ単位
の磁化率、好ましくは少なくとも0.０１ｃｇｓ単位の磁
化率を持っている。磁性粒子は広範囲の密度を持つ。即
ち、水の密度より十分小さい0.０１〜５g ／mL、好まし
くは0.５〜２g ／mL。粒子サイズは、例えば0.００１〜
２００または0.０５〜２００μm 、好ましくは0.０１〜
１０μm の範囲となる。粒子濃度は大まかに１〜１0,０
００μg ／mL、好ましくは５〜１０００μg ／mLの範囲
となる。使用する磁性粒子は例えばＥＰ０，１８０，３
８４で述べたように低い磁気共鳴を持っているのが望ま
しい。従ってこの磁性粒子から磁場が取り除かれた後に
粒子を消磁して検定セルから掃き出す。磁性粒子の密
度、濃度と粒子サイズは沈降時間が少なくとも0.５mm／
分、好ましくはそれ以上の速度、になるように選ばれ
る。磁性セルの運転では、倍増型光電管の運転に干渉し
ないために電気化学ルミネセンスを誘起する前に電極表
面から磁化手段を取り除くことが望ましい。
【００４０】検定 この発明の方法を用いて種々の検定が行われる。或る検
定が行われたのを図３に示す。反応で生じたＰＣＲ生成
物をビオチンとＥＣＬ標識（トリス（2,２’ビピリジ
ン）ルテニウムII、ルテニウム（ｂｐｙ） 3 2+ ）で標識
付けした。ストレプトアビジンのビーズがビオチンとス
トレプトアビジン結合を経て２官能化されたＤＮＡを捕
らえた後それを洗浄した。次に、ビーズに結合した生成
物をＥＣＬ標識検出の分析にかけた。或る検定が行われ
たのを図４に示す。ビオチニル化したＰＣＲ生成物をス
トレプトアビジンのビーズ上で捕らえビオチニル化して
いない要素を取り除いた。ビーズに結合したＰＣＲ生成
物を次にＥＣＬ標識（ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ ）付け
したオリゴヌクレオチドで異種形成した。これをＥＣＬ
分析して標識を検出した。或る検定が行われたのを図５
に示す。異種形成したものをストレプトアビジンのビー
ズ上で捕らえた。これを洗浄しないでＥＣＬ分析した。
或る検定を行いその結果を図６に示す。ＨＰＶ１６と１
８の存在検定を、両ウイルス型に陽性の細胞系統ＳｉＨ
ａとＨｅＬａと両ウイルス型に特殊なオリゴヌクレオチ
ドから分離したＤＮＡ試料を用いて行った。プライマー
の２ＰＶ１６と２ＰＶ１８はビオチニル化され、３ＰＶ
１６と３ＰＶ１８はＥＣＬ標識付けオリゴヌクレオチド
であった。２／３ＰＶ１６と２／３ＰＶ１８オリゴヌク
レオチドはＨＰＶ１６とＨＰＶ１８にそれぞれ特定のも
のであった。生じたビーズに捕らえられたＥＣＬ標識
を、図１に記した分析器を用いてＥＣＬ分析した。その
結果を、各試料プライマーの組合せに対するＥＣＬ計数
としてプロットした。
【００４１】或る検定を行いその結果を図７に示す。生
じたビーズに結合したＥＣＬ標識を図１に記した分析器
を用いてＥＣＬ分析した。ＥＣＬピークのフォトン計数
をＨＰＶ１６ＤＮＡ濃度の増加に対してプロットし、全
セルラーＤＮＡコピーに対するウイルスコピーの比率と
して表示した。このＨＰＶ１６の分析に使用したプライ
マーは１ＰＶ１６（ビオチン標識）と２ＰＶ１６（ＥＣ
Ｌ標識）であった。各ＰＣＲに用いたＤＮＡは子牛胸腺
ＤＮＡを用いて一定の１μg に保持した。或る検定を行
いその結果を図８に示す。標識のないＨＲＰ１とビオチ
ニル化したＨＲＰ２（プローブ１Ｔ２４と１ＣＨＲに）
および標識のないＨＲＰ２とビオチニル化したＨＲＰ１
（プローブ２Ｔ２４と２ＣＨＲに）を用いてＰＣＲを行
い、ビーズに結合した単一要素の異種形成用のターゲッ
トを作った。ＤＮＡ試料は、正規（胎盤）Ｈａ−ｒａｓ
遺伝子と突然変種（ＮＨ３Ｔ３−Ｔ２４）Ｈａ−ｒａｓ
遺伝子であった。ＥＣＬ標識の１Ｔ２４（１Ｔ２４）、
ＥＣＬ標識の２Ｔ２４（２Ｔ２４）、ＥＣＬ標識の１Ｃ
ＨＲ（１ＣＨＲ）、ＥＣＬ標識の２ＣＨＲ（２ＣＨＲ）
とビーズに結合のＤＮＡの異種形成に続いてＴＭＡＣ洗
浄した。生成したビーズ結合のＥＣＬ標識を図１に記し
た分析器を用いてＥＣＬ分析した。結果を各試料プロー
ブの組合せに対するＥＣＬ計数としてプロットした。
【００４２】或る検定を行いその結果を図９に示す。標
識のないＨＲＰ１とビオチニル化だけしたＨＲＰ２を用
いて（プローブ１Ｔ２４と１ＣＨＲに）図８に記したよ
うにＰＣＲが行われた。使用したプローブは：標準物と
してＰ３２（１Ｔ２４−Ｐ、１ＣＨＲ−Ｐ）含有の１Ｔ
２４と１ＣＨＲであった。Ｐ32とＥＣＬ標識の両方を含
有する１Ｔ２４と１ＣＨＲでＥＣＬ標識の効果を決定す
る。以前の様にＴＥＭＡＣで試料を洗浄した。生成した
ビーズ結合のＰ32をシンチレーション計数管内でシンチ
レーションカクテルを加えて分析した。その結果を、各
試料プローブの組合せに対するＰ32計数／秒としてプロ
ットした。或る検定を行いその結果を図１０に示す。検
定は図４に記したように行った。試料は胎盤ＤＮＡであ
り、増幅は標識のないＨＲＰ１（プローブ１Ｔ２４と１
ＣＨＲに）とビオチニル化したＨＲＰ２を用いて行っ
た。生成したＰＣＲ物を次に異なった量の生成物を含む
一連の試料となるように試料作りをした。これら一連の
試料を次にＰ32で標識付けしたプローブ（１Ｔ２４−Ｐ
３２と１ＣＨＲ−Ｐ３２）またはＥＣＬ標識で標識付け
したプローブ（１Ｔ２４−ＥＣＬと１ＣＨＲ−ＥＣＬ）
のどちらかと異種形成した。次にそれぞれの実験結果
を、９０ μL の試料に対する各標識からの平均ピーク
値を用いて標準化した。これらの標準化した数値はバッ
クグランドに対するシグナルの更に効果的な比較とな
り、この２つの方法の比較応答を示す。挿入した数値は
希釈曲線の低レベルでの応答を表している。試料は以前
に述べたように取り扱った（図６と図８）。或る検定を
行いその結果を図１１に示す。ビオチニル化した２ＰＶ
１８と標識のない１ＰＶ１８を用い、ＨｅＬａＤＮＡ
（セル当り４００コピー）を用い、図３で説明したＰＣ
Ｒ方式を用いてＰＣＲを行った。生成ＰＣＲ反応物を次
に特定のプローブＥＣＬ標識の３ＰＶ１８で異種形成し
た。異種形成した混合物を次にストレプトアビジン被覆
ビーズに添加して生成したビーズ結合のＥＣＬ標識を図
１に記したＥＣＬ分析器を用いて直接ＥＣＬ分析をし
た。その結果を、ＰＣＲに添加したＨＰＶ１８コピーに
対するＥＣＬ計数にプロットした。次に、制限のない例
を説明図で示すがこの発明を制限するものと見なすべき
ではなく、この発明の精神または範囲から外れることな
しに、その多くの明らかな変更が可能である。
【００４３】例 計装、材料、方法 （１）計装 図１と２に記した３電極を採用した流れ通過の装置を用
いた。 作用電極： 金ディスク、３mm直径 対向電極： 金ディスク、３mm直径 照合電極： 銀／塩化銀 テフロンガスケット（0.１５インチ厚さ） プレキシガラスの面板 入口管＝0.０４２インチ内径ポリプロピレン 吸引速度： 可動、0.０１〜５mL／分 ポテンシオスタット： マイクロプロセサーで制御 浜松Ｒ３７４ＰＭＴ（低利得で赤色に良感度の管）使用
のルミノメーター；ＰＭＴ電圧は０〜１４００Ｖ可動
【００４４】（２）材料 （ａ）ＥＣＬ標識： ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ （ｂ）ＥＣＬ緩衝液：１１２mM ＫＨ2 ＰＯ4 、８８m
M；Ｋ2 ＨＰＯ4 ・３Ｈ 2 Ｏ、５０μM ＮａＣｌ、6.
５mM ＮａＮ3 、0.８μM トリトンＸ−１０００、0.４
m Ｍツイーン２０、１００mM；トリプロピルアミン水溶
液 （ｃ）ＥＣＬ希薄液：３7.５mM ＫＨ2 ＰＯ4 、１０9.
２mM；Ｋ2 ＨＰＯ4 ・３Ｈ2 Ｏ、１５１.7 mM ＮａＣ
ｌ、0.６５mM ＮａＮ3 、0.４３mM 牛血清アルブミン
水溶液 （ｄ）ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ ＮＨＳ：ルテニウム
（２，２’−ビピリジル）2 （４−［３−（１，３−ジ
オキソラン−２−イル）プロピル］−４’−メチル−
２，２’−ビピリジン）2+ （ｅ）Ｄｙｎａｌ粒子： （ｉ）ＤｙｎａｌＭ−４５０Ｄｙｎａビーズ、4.５μm
直径、超常磁性粒子、３０mg／mL、ニューヨーク州１１
０２１、グレートネック、ノースステーションプラザ４
５、Ｄｙｎａｌ社から求める。 （ii）ＤｙｎａｌＭ−２８０Ｄｙｎａビーズ、2.８μm
直径、超常磁性粒子、１０mg／mL、ニューヨーク州１１
０２１、グレートネック、ノースステーションプラザ４
５、Ｄｙｎａｌ社から求める。
【００４５】（３）ＥＣＬ測定サイクル（３電極セル運
転） ＥＣＬ測定サイクルは３段階から成り立つ： （１）予備状態調節、（２）測定、（３）洗浄。 予備状態調節の段階では0.０ボルト〜＋2.２ボルト〜−
1.０ボルト〜＋0.６ボルトの電圧三角波を2.０ボルト／
秒で印加する。測定段階では三角波形を＋0.６ボルトか
ら＋2.８ボルト、＋2.０ボルトに1.０ボルト／秒で印加
する。洗浄段階では電圧矩形波を＋0.０ボルトから＋3.
０ボルト、−0.５ボルト、0.０ボルトに印加する。全電
圧は銀／塩化銀照合電極に対するものである。
【００４６】
【実施例】例１．重力による微粒子収集の装置と方法 測定は図１２に示すようにセル内で行う。重力を用いて
検定を行うための装置記載の図１２を参照のこと。装置
の構成部分には参照数字４８で示した透明窓、参照数字
２２２で示したガスケット、入口２２、作用電極５６／
５８、対向電極７２／７４、出口２４を含めたブロック
２０がある。セルブロックの面は水平で、即ち地球の重
力場の方向に垂直である。ＥＣＬ緩衝液中の標識付き微
粒子（Ｄｙｎａｌ）は、ぜん動ポンプの手段でセルに引
かれる。粒子がセルに到達した後にポンプを停止する。
セル室内の微粒子は作用電極の表面上に沈降する。微粒
子の沈降速度は図１３に示すように１０mmの距離にわた
って大体一定の0.５mm／分に決められる。沈降粒子の数
は時間と沈降速度の関数である。ＥＣＬ強度は作用電極
上に沈降する粒子数に比例する。その表面に到達する粒
子数、従ってＥＣＬ強度は、作用電極上の流体試料の高
さによって制限される。図１４は、それぞれ0.０１５と
0.０７５インチの異なるガスケット厚さの２つのセルに
ての沈積時間の関数としてＥＣＬ強度を示す。セルは両
方とも同様な微粒子の沈積速度を持つが厚いガスケット
のセルは５倍は大きい最大の読みを示す。ＡＦＰ（アル
ファ胎児タンパク質）検定の結果を２つのセルで比較し
て図１５に示す。またもや厚いガスケットのセルでは５
倍のＥＣＬシグナル強度が生じる。
【００４７】例２．微粒子沈積のＥＣＬ装置と方法 沈積セルを用いた磁気収集。 微粒子を沈降させるのに磁力を用いて検定を行うための
セルを図１６に示す。参照番号４８は透明窓、参照番号
１２２はガスケット、参照番号２２はセルブロックの入
口、参照番号５６／５８は作用電極、参照番号２４は試
料出口、参照番号２０はセルブロック自体、参照番号２
７は電磁石を言う。セルブロックの面は水平を向いてい
る。ＥＣＬ緩衝液中の標識付きの微粒子（Ｄｙｎａｌ）
をぜん動ポンプでセルまで引き上げる。微粒子がセルに
到達したらポンプを停止する。セル室内の微粒子は、１
２ボルト、1.５アンペヤーで操作した電磁石２７を用い
て生じた磁場の手段で作用電極まで引き上げる。電磁石
の応用によって微粒子の沈積速度は、単に重力によって
微粒子を沈降させる場合に観察されるものより大きく増
加している。それを図１７に示す。
【００４８】例３．微粒子を沈積するＥＣＬ装置と方法 収集セルを用いた磁気収集 図１８に示すようにセル内で検定が行われる。図１８を
参照すると、参照番号４８は透明窓、参照番号１３２は
ガスケット、参照番号２２はセルブロックの入口、参照
番号５６／５８は作用電極、参照番号２０はセルブロッ
ク自体、参照番号２４は試料出口、参照番号３７は永久
磁石を言う。セルブロックの面は水平に向けられる。Ｅ
ＣＬ緩衝液中の標識付きの微粒子（Ｄｙｎａｌ）をぜん
動ポンプで電気化学セルまで引き上げる。試料を入れる
前に、永久磁石３７を作用電極／溶液界面のすぐ下の0.
０３５インチの距離に置く。試料がセルに引き上げられ
たら微粒子が作用電極上の磁石の区域で決められた区域
に沈積する。全試料が沈積した後ポンプを停止し磁石を
取り除く。収集時間が長くなるほど多くの粒子が沈積す
る。図１９に示すように作用電極上の粒子濃度が増加す
るとＥＣＬ強度が増す。
【００４９】例４．微粒子沈積のための磁石の使用 磁場の向き 磁石２７／３７が永久磁石であれ電磁石であれ、それに
引かれた微粒子９６、９６’は図２０のように磁場９
８、９８’の向きに並ぶ。ここに図は磁場９８と９
８’、生成した粒子配置９６と９６’が作用電極５６／
５８の面の近くでそれに平行（Ａ）と垂直（Ｂ）してい
ることを描いている。
【００５０】例５．ろ過による粒子の収集と濃縮 磁気感応性、非磁気感応性、また広範囲にわたる密度の
微粒子はろ過によって薄膜フィルターの面上に具合よく
集められる。この発明の或る実施例では、孔サイズが粒
子直径より小さい、好ましくは実質的に粒子直径より小
さく十分大きな表面密度で粒子が集まっても孔が詰まら
ないようなフィルター膜部分を通して粒子をポンプで引
く。フィルターは具合いよく大体透明なので、粒子から
ＥＣＬを誘起し粒子のＥＣＬ標識量を測定するためにル
ミネセンスを測る目的で粒子収集後のフィルターを作用
電極の表面上に置くことができる。別な実施例では、上
記の孔サイズの膜フィルターを吸収剤の表面に付着させ
るかその上に置いて毛細管または「ウイッキング」が微
粒子を含有する流体を膜フィルターを通して自発的に引
っ張るようにすると、フィルターを通過する流体の流れ
を引き起こす装置は必要がない。好適な実施例では、上
記のような孔サイズを持った膜フィルターは薄い金属フ
ィルムまたはその他の電導性材料で被覆されているの
で、その膜面はＥＣＬ装置の作用電極として使用でき
る。マイクロエレクトロニック機器の製作で普通使われ
ている方法、例えば熱蒸着またはスパッタリングによっ
て、電導性フィルムは容易に膜面に付けられる。その様
なフィルター電極は容易にフローセルに装備できるので
流体の流路はフィルター電極を通ることになる。流れの
中の粒子はフィルター電極で捕まえられ、不均一検定を
行うための迅速で簡単な手段を準備すれば外部の洗浄装
置なしでもその場で容易に洗浄できる。
【００５１】例６．遠心法による粒子の収集と濃縮 図２１に示す回転フローセルは、ルミネセンス測定のた
めの作用電極表面で複合体を捕まえる別な方法を提供す
る。検定溶液は入口２６１を経てその装置に入り、それ
は矢印Ｒで示したような回転運動をセルに与えながら回
転シール２６３を通してセル２６２にポンプで引かれ
る。複合体の濃い粒子が作用電極２６４の表面に濃縮さ
れる。セルがまだ回転している間に、溶液は出口２６８
を経てセルから出る。セルの窓２６７を通過する光出力
は増倍型光電管２６５で測定される。光出力は、垂直な
作用電極２６４から出てセル中央に置かれた曲面鏡２６
６で反射するように向けられる；対向電極２６９も示
す。セルはそこで次のサイクルのためにフラッシュ洗浄
される。これはセルが停止しても回転していても行え
る。そこで図２１は粒子を捕まえるためのこの発明の遠
心法と装置、ならびにこの発明の遠心フローセルを示
す。
【００５２】例７．中程度の表面濃度に標識を付けた不
特定タンパク質での粒子被覆 ３０mg（１mL）の4.５μm 径の非被覆の磁気感応性ポリ
スチレンＭ−４５０ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｄｙｎａｌ
社、ノルウェー、オスロ）を１５０mMの燐酸塩緩衝pH7.
５溶液での磁気分離により２mL／洗浄の割合で洗浄し
た。１mLの燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）と0.０５％のシメ
ラゾル中に１５０μg のルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識
の付いたマウスＩｇＧ（ジャクソン免疫化学会社）を含
む溶液を粒子に添加した。この混合物は一晩室温で回転
しながら定温放置した。次にその溶液を粒子から磁気的
に分離し取り除いた。未反応箇所を塞ぐために１mLの３
％ＢＳＡ／ＰＢＳと0.０５％のアジ化ナトリウムを粒子
に加えて、生成した溶液を２時間室温で放置した。粒子
を５回（２mL／洗浄の割合）洗浄し、次に最後であるが
保管するため６mLの同じ緩衝液で再び懸濁した。
【００５３】例８．磁気感応性粒子を用いた電気化学ル
ミネセント（ＥＣＬ）測定 均一と不均一、高分子量と非高分子量、磁気感応性粒子
（Ｄｙｎａｌ社、ノルウェー、オスロ；ポリサイアンス
社、ワーリントン、ペンシルバニア州１８９７６；コル
テックスバイオ化学社、サンレアンドロ、カルフォルニ
ヤ州９４５７７；アルドリッチ社、ミルウオーキー、ビ
スコンシン州５３２０１）を、例７で述べたように標識
付きタンパク質で被覆した。被覆した粒子を２mLの３０
０μg ／mL懸濁液を作る前にＥＣＬ緩衝液で３回洗浄し
た。ぜん動ポンプを使って、５００μL の粒子懸濁液を
フローセルに吸引した（例３）。粒子は作用電極に流れ
て、磁石で作用電極の表面上に引っ張られ濃縮された。
粒子が濃縮された作用電極の面上にあるフローセルの上
の中央に置かれている浜松Ｒ３７４増倍型光電管を使っ
て磁性粒子の電気化学ルミネセンスを測定した。標識の
付いたタンパク質で被覆した磁気感応性粒子から得られ
たＥＣＬ光放出レベルを表Ｉに示す。
【表１】 表Ｉ 異なる磁気感応性粒子でのＥＣＬ測定 ──────────────────────────── 粒 子 直 径 密 度 材 料 ECL タイプ (μm) (g/mL) 計数 ──────────────────────────── ──────────────────────────── ガラス 8.0 2.4 ソーダ石灰ガラス 2200 2.0 2.4 ソーダ石灰ガラス 8500 ──────────────────────────── 石 英 0.3-3.5 2.5 SiO2 1150 ──────────────────────────── 金 1.0-2.0 19.3 Au 1100 ────────────────────────────
【００５４】例９．非磁性粒子を用いた電気化学ルミネ
センス（ＥＣＬ）の測定 均一と不均一、高分子量と非高分子量、非磁気感応性粒
子（アルドリッチ社、ミルウオーキー、ビスコンシン州
５３２０１；デューク科学社、パロアルト、カルフォル
ニヤ州９４３０３）を、例７で述べたように標識付きタ
ンパク質で被覆した。被覆した粒子を２mLの３００μg
／mL懸濁液を作る前にＥＣＬ緩衝液で３回洗浄した。ぜ
ん動ポンプを使って、５００μL の粒子懸濁液をフロー
セルに吸引した。次に被覆した粒子を例１に述べた重力
の手段で作用電極上に濃縮した。粒子が濃縮された作用
電極の面上にあるフローセルの上の中央に置かれている
浜松Ｒ３７４増倍型光電管で非磁性粒子の電気化学ルミ
ネセンスを測定した。被覆した非磁性粒子から得られた
ＥＣＬ光放出レベルを表IIに示す。
【表２】
【００５５】例１０．物理吸着した羊の抗甲状腺刺激ホ
ルモン（ＴＳＨ）を被覆したＤｙｎａｌ粒子の調製（試
薬Ｉ） １mLの4.５μm の被覆のない磁性ポリスチレン粒子で表
面にヒドロキシル基の残査があるもの（ＤＹＮＡＬ、Ｄ
ＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−４５０、Ｄｙｎａｌ社、ノルウ
ェー、オスロ）を１５０mLの炭酸ナトリウム／重炭酸ナ
トリウムpH9.６溶液を使って２mL／洗浄の割合で磁気分
離で洗浄した。0.５mLの親和性の純化羊抗ＴＳＨ、ＨＣ
Ｇ除去の抗体（ＣＩＢＡ）を１mLの炭酸ナトリウム／重
炭酸ナトリウム溶液に溶かした溶液を粒子に添加した。
この混合物を一晩撹はんしながら室温で定温放置した。
次にその溶液を粒子から磁気分離して取り除いた。１mL
の３％ＢＳＡ／ＰＢＳｗ／0.０５％のアジ化ナトリウム
を加え未反応箇所を防ぐために撹はんしながら室温で２
時間定温放置した。粒子を５回（２mL／洗浄の割合）洗
浄してから最後に保管するために１mLの同じ緩衝液に再
び懸濁した。ビーズ試薬Ｉの最終濃度は３重量％であっ
た。
【００５６】例１１．ウアベイン−ＢＳＡ共役物の調製
（試薬II）ウアベインの活性化：６0.４mgのウアベイン
オクタヒドレート（アルドリッチ社、カタログ番号１
４，１９３−３）を６mLの脱イオン（ｄｉ）水（箔包
装）に入れ８７mgのメタ過よう素酸ソーダ（モールイン
クロッド社、カタログ番号１１３９）と混合しその混合
物を回転しながら室温で２時間定温放置した。反応物を
ドウエックス１Ｘ８−５０イオン交換樹脂（アルドリッ
チ社、カタログ番号２１，７４０−９）と脱イオン水の
中を通して反応を止めた。２００μL の１Ｍ燐酸ソーダ
pH7.２を加えて溶液のpHを7.０に調節した。活性化した
ウアベインと牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の共役物：５
０mgの活性化したウアベイン（4.６mL）を次に５mL0.１
５ＭのＰＢＳpH7.８中に１０８mg含まれた牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）に滴下して添加する（マイルスフラクシ
ョンＶ）。これは４０：１（ウアベイン：ＢＳＡ）の比
率となる。この反応物を混ぜながら室温で２時間定温放
置した後３０mgのシアノボロハイドライドソーダを撹は
んしながら急激に添加した。遊離したウアベインと過剰
のシアノボロハイドライドソーダを0.１５ＭＰＢＳｗ／
0.０５％アゾ化ソーダpH7.８中で４℃で透析して取り除
いた。このウアベイン−ＢＳＡの共役試薬IIを４℃で保
管した。
【００５７】例１２．物理吸着したウアベイン−ＢＳＡ
被覆のＤｙｎａｌ粒子の調製（試薬III ） ５mgの4.５μm の被覆のない磁性ポリスチレン粒子で表
面にヒドロキシル基の残査があるもの（ＤＹＮＡＬ、Ｄ
ＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ−４５０、Ｄｙｎａｌ社、ノルウ
ェー、オスロ）を１５０mLの炭酸ナトリウ／重炭酸ナト
リウムpH9.６溶液を使って１０mL／洗浄の割合で磁気分
離で洗浄した。３mgのウアベイン−ＢＳＡ共役物（共役
試薬II）を５mLの炭酸／重炭酸塩溶液に溶かしたものを
粒子に添加した。この混合物を一晩回転しながら室温で
定温放置した。次にその溶液を粒子から磁気分離し取り
除いた。５mLの３％ＢＳＡ／ＰＢＳｗ／0.０５％のアジ
化ナトリウムを加え未反応箇所を防ぐため回転しながら
室温で２時間定温放置した。粒子を５回（１０ml／洗浄
の割合）洗浄してから最後に保管するために１mLの同じ
緩衝液に再び懸濁した。ビーズ試薬III の最終濃度は３
重量％であった。
【００５８】例１３．ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識の
付いたマウス抗ジゴキシンの調製（試薬IV） １mgのマウス抗ジゴキシン（ケンブリッジ医学技術社、
カタログ番号２００−１４、ロットＡ３５７５）にルテ
ニウム（ｂｐｙ）3 2+ で標識を付けた。単クローン抗体
（ＭＡｂ）抗ジゴキシン抗体をセントリコン３０のミク
ロ濃縮器（アミコン社）を使って0.１５Ｍ燐酸カリ緩衝
液と交換して最終の容積0.５mLの0.１５Ｍ塩化ナトリウ
ムpH溶液とした。使用直前に、0.５mgのルテニウム（ｂ
ｐｙ）3 2 + ＮＨＳを１２５μL の無水ジメチルスルホキ
シド（アルドリッチ社）で溶解した。ルテニウム（ｂｐ
ｙ）3 2+ ：分子量がそれぞれ１０５７と１５０，０００
のタンパク質のモル比が２５：１になるように、0.１５
mgのルテニウム（ｂｐｙ） 3 2+ −ＮＨＳ（４５μL ）を
振とうしながらタンパク質に加えた。反応管を室温の暗
所で３０分振とうしながら定温放置した。２５μL の１
Ｍグリシンを添加して反応を止め、１０分間定温放置し
た。反応混合物をセパデックスＧ−２５カラム（１Ｘ２
０cm、0.１５Ｍ燐酸カリ、0.１５Ｍ塩化ナトリウムを0.
０５％アジ化ナトリウムpH7.５溶液に）を通して精製し
た。ルテニウム（ｂｐｙ）3++ 標識を付けたマウス抗ジ
ゴキシン部分を集めて貯めた。標識の付いたタンパク質
（試薬IV）は、タンパク質の分子当り１２標識を持つこ
とが測定された。
【００５９】例１４．ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識付
きマウス抗甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の調製（試薬
Ｖ） 0.５mgのマウス抗ＴＳＨ（ＣＩＢＡ）をルテニウム（ｂ
ｐｙ）3 2+ で標識を付けた。ＭＡｂ抗ＴＳＨ抗体をセン
トリコン３０マイクロ濃縮器（アミコン社）を使って0.
１５Ｍ燐酸カリ緩衝液に交換して最終容積が0.３５mLの
0.１５Ｍ塩化ソーダpH7.８溶液にした。使用直前に、0.
５mgのルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ ＮＨＳを７５μL の無
水ジメチルスルホキシド（アルドリッチ社）で溶解し
た。ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ ：分子量がそれぞれ１０
５７と１５0,０００のタンパク質のモル比が５０：１に
なるように、0.１７６mgのルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ −
ＮＨＳ（２6.４μL ）を振とうしながらタンパク質に加
えた。反応管を室温の暗所で３０分振とうしながら定温
放置した。２５μL の１Ｍグリシンを添加して反応を止
め、１０分間定温放置した。反応混合物をセパデックス
Ｇ−２５カラム（１ｘ２０cm、0.１５Ｍ燐酸カリ、0.１
５Ｍ塩化ナトリウムを0.０５％アジ化ナトリウムpH7.２
溶液に）を通して精製した。ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+
標識を付けたマウス抗ＴＳＨ部分を集めて貯めた。標識
の付いたタンパク質（試薬Ｖ）は、タンパク質の分子当
り１４標識を持つことが測定された。
【００６０】例１５．甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を
１段階で分離するサンドイッチ検定１００μL の血清試
験検定液（ロンドン診断用ＴＳＨルミＴＡＧキット）、
ＥＣＬ緩衝液中の２５μL のルテニウム（ｂｐｙ）3 2+
標識を付けたマウス抗ＴＳＨ（試薬Ｖ）、ＥＣＬ緩衝液
中の２５μL 羊抗ＴＳＨ−Ｄｙｎａｌ粒子（試薬Ｉ）を
組合せポリプロピレン管中で１５分間室温で混ぜながら
定温放置した。次に粒子を磁気分離で洗浄してから５０
０μL のＥＣＬ緩衝液に懸濁した。この洗浄操作を２回
追加して繰り返した。最後に、粒子を１mLのＥＣＬ緩衝
液に再度懸濁した。各試料の電気化学ルミネセンス（Ｅ
ＣＬ）を例３に述べたように読み取った。ＥＣＬ計数
は、試料中に存在する検体濃度に正比例する（検体濃度
が増すと計数が増加する）。表III に代表的な検定値を
示す。
【表３】 表III ───────────────────────── ───────────────────────── ＴＳＨ濃度 ＥＣＬ計数 （μIU/mL) （二重反復試料） ───────────────────────── ───────────────────────── 0.00 1918 1885 0.05 2584 2530 0.10 3365 3288 0.50 8733 8652 2.50 35688 35347 10.0 125316 136994 25.0 300248 288272 50.0 549034 564948 ─────────────────────────
【００６１】例１６．甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の
１段階非分離サンドイッチ検定 １００μL の血清試験検定液（ロンドン診断用ＴＳＨル
ミＴＡＧキット）、ＥＣＬ緩衝液中の２５μL のルテニ
ウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けたマウス抗ＴＳＨ（試薬
Ｖ）、ＥＣＬ緩衝液中の２５μL 羊抗ＴＳＨ−Ｄｙｎａ
ｌ粒子（試薬Ｉ）を組合せポリプロピレン管中で１５分
間室温で混ぜながら定温放置した。次に粒子を磁気分離
で洗浄してから５００μL のＥＣＬ緩衝液に懸濁した。
結果を読み取る前に、１mLのＥＣＬ緩衝液を加えた。各
試料の電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）は例３に述べた
ように読み取った。ＥＣＬ計数は、試料中に存在する検
体濃度に正比例する（検体濃度が増すと計数が増加す
る）。表IVに代表的な検定値を示す。
【表４】
【００６２】例１７．ジゴキシンの２段階分離競合検定 ５０μL の血清試験検定液（ＴＤｘ検定、アボット研究
所、イリノイ州、シカゴ）とＥＣＬ緩衝液中の２５μL
のルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けたマウス抗ジゴ
キシン（試薬IV）を組合せてポリプロピレン管中で２０
分間室温で混ぜながら定温放置した。ＥＣＬ緩衝液中の
２５μL のウアベイン−ＢＳＡ−Ｄｙｎａｌ粒子（試薬
III ）を加え混ぜながら更に２０分室温で定温放置し
た。次に、粒子を磁気分離で洗浄してから５００μL の
ＥＣＬ緩衝液に再び懸濁した。この洗浄は２回追加して
繰り返した。最後に、粒子を１mLのＥＣＬ緩衝液に再懸
濁した。各試料の電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）は例
３に述べたように読み取った。ＥＣＬ計数は、試料中に
存在する検体濃度に反比例する（検体濃度が増すと計数
が減る）。表Ｖに代表的な検定値を示す。
【表５】
【００６３】例１８．ジゴキシンの２段階非分離競合検
定 ５０μL の血清試験検定液（ＴＤｘ検定、アボット研究
所、イリノイ州、シカゴ）とＥＣＬ緩衝液中の２５μL
のルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けたマウス抗ジゴ
キシン（試薬IV）を組合せて２０分間室温で混ぜながら
定温放置した。ＥＣＬ緩衝液中の２５μL のウアベイン
−ＢＳＡ−Ｄｙｎａｌ粒子（試薬III ）を加え混ぜなが
ら更に２０分室温で定温放置した。読み取る前に、粒子
を１mLのＥＣＬ緩衝液に再懸濁した。各試料の電気化学
ルミネセンス（ＥＣＬ）は例３に述べたように読み取っ
た。ＥＣＬ計数は、試料中に存在する検体濃度に反比例
する（検体濃度が増すと計数が減少する）。表VIに代表
的な検定値を示す。
【表６】
【００６４】例１９．電極上に最終反応試料を追加洗浄
しサイクル毎に読み取る方式のジゴキシンの２段階非分
離競合検定 ５０μL の血清試験検定液（ＴＤｘ検定、アボット研究
所、イリノイ州、シカゴ）とＥＣＬ緩衝液中の２５μL
のルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けたマウス抗ジゴ
キシン（試薬IV）を組合せ２０分間室温で混ぜながら定
温放置した。ＥＣＬ緩衝液中の２５μL のウアベイン−
ＢＳＡ−Ｄｙｎａｌ粒子（試薬III ）を加え混ぜながら
更に２０分室温で定温放置した。読み取る前に、粒子を
１mLのＥＣＬ緩衝液に再懸濁した。各試料の電気化学ル
ミネセンス（ＥＣＬ）を例３に述べたように読み取っ
た。ＥＣＬ計数は、試料中に存在する検体濃度に反比例
する（検体濃度が増すと計数が減少する）。表VII に代
表的な検定値を示す。
【表７】
【００６５】例２０．オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドはβシアノエチルフォスフォルアミ
ダイト（１）を用いて応用バイオシステム自動オリゴヌ
クレオチド合成器で作る。５’末端のオリゴヌクレオチ
ドアミノ変性は最後のカプリング段階で起こり、３’末
端には変性した固相（制御ポアガラス）を用いる。クロ
ーン技術社（カルフォルニヤ州、サンディエゴ）がアミ
ノ変性剤を供給している。その結果生じた５’変性オリ
ゴヌクレオチドは総て６炭素間隔の腕が指定のアミノ基
に付いている（Ｃ６、ＮＨ2 ）。３’変性オリゴヌクレ
オチドは総て３炭素間隔の腕がアミノ基に付いている。
構成されたオリゴヌクレオチド、その変性と利用を下記
する。ＨＰＶ研究のためのオリゴヌクレオチドは前記の
ようにＥ６の領域に向けられた（２）。
【００６６】オイゴヌクレオチドの順列は次のようであ
った：
【化４】 NPV16; 1PV16 5'(C6,NH2) TTAGTGAGTATAGACATTATTGTTAT
AGTT; 2PV16 5'(C6,NH2) CAGTTAATACACCTAATTAACAAATCACAC; 3PV16 5'(C6,NH2) ACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCG; HPV18;1PV18 5'(C6,NH2) TTAGAGAATTAAGACATTATTCAGAC
T; 2PV18 5'(C6,NH2) CACCGCAGGCACCTTATTAATAAATTGTAT; 3PV18 5'(C6,NH2) GACACATTGGAAAAACTAACTAACACTGGG.
【００６７】これらのオリゴヌクレオチドは、種々の断
片のＰＣＲ発生を可能にしている：３ＰＶ１６または３
ＰＶ１８がそれぞれ２ＰＶ１６または２ＰＶ１８と６２
ｂｐ断片を形成；１ＰＶ１６が２ＰＶ１６と１００ｂｐ
断片を形成；１ＰＶ１８が２ＰＶ１８と１０３ｂｐ断片
を形成。また３ＰＶ１６と３ＰＶ１８のオリゴヌクレオ
チドは１ＰＶ１６と２ＰＶ１６および１ＰＶ１８と２Ｐ
Ｖ１８のＰＣＲ反応から生成物を異種形成するプロー
ブ、更にＰＣＲ内でオリゴヌクレオチド２ＰＶ１６と２
ＰＶ１８によって作った要素（ストランド）を異種形成
するプローブとして使用できることが評価される。Ｈａ
−ｒａｓ点突然変異検定のためのオリゴヌクレオチドは
次のようであった：
【化５】 HRP1 5'(C6,NH2) GCGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTG; HRP2 5'(C6,NH2) TTCTGGATCAGCTGGATGGTCAGCGCACTC; これらの２つのオリゴヌクレオチドプライマー８０ｂｐ
断片の合成を目指している。この点突然変異研究のため
のプローブ順列は次のようであった：
【化６】 1T24 5'(C6,NH2) GGCGCCGTCGGTGTGGGCAA; 1CHR 5'(C6,NH2) GGCGCCGGCGGTGTGGGCAA; 2T24 5'(C6,NH2) TTGCCCACACCGACGGCGCC; 2CHR 5'(C6,NH2) TTGCCCACACCGCCGGCGCC.
【００６８】これらの順列とは別に、我々は上記の１Ｃ
ＨＲと２Ｔ２４順列を５’アミノ変性でなく３’アミノ
基で合成した。これらの３’アミノ変性オリゴヌクレオ
チドはＥＣＬ標識で標識を付けられ異種形成に用いられ
た。突然変異／不整合の箇所は肉太のヌクレオチドで表
示する。プローブ１Ｔ２４と１ＣＨＲは、ＰＣＲ内でオ
リゴヌクレオチドＨＲＰ２によって作られた要素と異種
形成する。プローブの２Ｔ２４と１ＣＨＲをＰＣＲ内で
オリゴヌクレオチドＨＲＰ１で作られた要素（ストラン
ド）に異種形成する。粒子に結合するオリゴヌクレオチ
ドＪＫ８とＪＫ８Ｃは：
【化７】 JK8 5' (C6,NH2)GTCCAATCCATCTTGGCTTGTCGAAGTCTGA JK8C 5'(C6,NH2)TCAGACTTCGACAACCCAAGATGGATTGGA1C. これらの２つの順列はエクオリン順列から導かれ、それ
は互いに補足し合っている。
【化８】 JK7 5'TCAGACTTCGACAA(NH2)CCCAAGATGGATTGGA; このオリゴヌクレオチドは、順列内のアミノ変性を可能
にするクローン技術社（カルフォルニヤ州サンディエ
ゴ）のアミノ変性剤を用いてアミノ変性した。ＪＫ７は
ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を用いて標識付けをし
た。試験管内での転写により作られたエクオリンＲＮＡ
のオリゴヌクレオチドプローブ：
【化９】 T35 5' (NH2)GATTTTTCCATTGTGGTTGACATCAAGGAA; このオリゴをビオチンとルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識
の両方で標識付けした。大腸菌ＤＮＡの検出のために、
我々はゲノムのＴｒｐＥ／Ｄ領域に特有なオリゴヌクレ
オチド（３）を次のように合成した：
【化１０】TRP.CO3 5' (C6,NH2)GCCACGCAAGCGGGTGAGGAG
TTCC(H2); この順列はルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識で
標識付けした。
【化１１】 TRP.CO4 5' (C6,NH2)GTCCGAGGCAAATGCCAATAATGG は下記のようにビオチンで標識付けした。
【００６９】例２１．オリゴヌクレオチドの標識付け 合成オリゴヌクレオチドは総て、バイオゲルＰ６（バイ
オ研究所）カラム上のゲルろ過によって不純物のアミノ
基を除去するために精製した。ＮＨＳ−ビオチン（クロ
ーン技術社、カルフォルニヤ州サンディエゴ）を用いて
ビオチンがＰＣＲプライマーの５’アミノ基を経て導入
した（４）。変性オリゴヌクレオチドのアミノ基を経て
ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ −ＮＨＳが次のように導入し
た。１００μL のＰＢＳ（pH7.４）中のオリゴヌクレオ
チド（0.１μモル）をＤＭＳＯに溶解した５μモルのル
テニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識と一晩暗所で室温で反応し
た。オリゴヌクレオチドはこれらの標識付けの反応から
エタノール沈澱法で回収された。最近の研究は、0.５μ
モルのルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を用いて効果的に
標識付けすることができることを実証している（データ
は示されない）。標識を付けたオリゴヌクレオチドを、
Ａ）１００mMの酢酸テトラエチルアンモニウムpH7.０と
Ｂ）５０％のＡ）と５０％のアセトニトリルの移動相が
ある逆相ＶｙｄａｃＣ−１８セミプレプカラム上でＢの
２０％から４０％の勾配を作ってＨＰＬＣにより更に精
製した。プローブ１ＣＨＲと１Ｔ２４もまた、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用い確立された方法を用いて比
活性が７7,０００ｃｐｍ／ngのプローブを作ってＰ32で
標識を付けた（５）。
【００７０】例２２．核酸磁性粒子の調製 ＤｙｎａｌＭ４５０粒子を標準手順を用いて２フルオロ
−１−メチルピリジニウムトルエン４スルフォネートで
活性化した（６）。この活性化した粒子を次に、オリゴ
ヌクレオチドＪＫ８とＪＫ８Ｃで反応した。１００mgの
活性Ｄｙｎａｌ粒子に６５０μL の0.１Ｍ重炭酸ナトリ
ウム中に３３ｎモルのオリゴヌクレオチドのある溶液を
添加した後、混ぜながら３時間定温放置した。粒子はエ
タノールアミン（４mL，0.１Ｍ）を添加して遮断した。
結合した粒子は0.５mg／mLの単一要素の鮭精液ＤＮＡの
ＥＣＬ緩衝液と混ぜて４〜５回ＥＣＬ緩衝液に洗い込
み、１００μg ／mLの単一要素の鮭精液ＤＮＡを含んだ
１０mg／mLのＥＣＬ緩衝液で再懸濁した。
【００７１】例２３．ＤｙｎａｌＭ４５０粒子を標準手
順を用いて２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトル
エン４スルフォネートで活性化した（６）。この活性粒
子を次にストレプトアビジン（シグマ社）で反応した。
活性粒子（５０mg）を0.１Ｍの重炭酸ナトリウムで洗浄
後、ストレプトアビジン（1.５mg）を添加して一晩反応
した。粒子はエタノールアミン（４mL，0.１Ｍ）を添加
して遮断した。結合した粒子は0.５mg／mLの単一要素の
鮭精液ＤＮＡのＥＣＬ緩衝液と混ぜて４〜５回ＥＣＬ緩
衝液に洗い込み、１００μg ／mLの単一要素の鮭精液Ｄ
ＮＡを含んだ１０mg／mLのＥＣＬ緩衝液で再懸濁した。
ＤｙｎａｌＭ−２８０からのストレプトアビジン粒子も
価値あることを示したが、目下の検定次第では低いシグ
ナルしか出さない。免疫検定に適用するために、不動態
被覆に用いた緩衝液を使って抗原または抗体と結合した
後に粒子をＢＳＡで遮断した。
【００７２】例２４．ストレプトアビジン磁性粒子の調
製II １５mgのＢＳＡ（２〜３mLのＰＢＳ中）に、５０mg／mL
のビオチン−ｘ−ＮＨＳ（クローン技術社、カルフォル
ニヤ州サンディエゴ、５００２−１）含有の１０５μL
のジメチルスルフォキシドを添加した後、混合し室温で
３０分間定温放置した。３０μl の１Ｍリシンを添加し
て反応を停止し室温で１０分間定温放置した。反応混合
物をゲルろ過クロマトグラフ法（バイオラド社、バイゲ
ルＰ６）で精製した。この１０mLの0.２Ｍ炭酸／重炭酸
ソーダ緩衝剤pH9.６（炭酸塩／重炭酸塩）緩衝液中のビ
オチン−ＢＳＡを、３００mgの炭酸塩／重炭酸塩で洗浄
したＤｙｎａｂｅａｄ（Ｄｙｎａｌ１４００２）に添加
した。この混合物を渦巻き撹はんをしてから混ぜながら
一晩室温で定温放置した。この粒子を磁気分離した後、
１０mLのＥＣＬ希釈液と１００μL のｔＲＮＡ（１０mg
／mL）を添加した。この混合物を３〜４時間室温で混ぜ
ながら定温放置した。この粒子を１回１０mLのＥＣＬ希
釈液で洗浄し１０mLのＥＣＬ希釈液と１００μL のｔＲ
ＮＡ（１０mg／mL）に再懸濁した。この混合物を混ぜ２
〜６℃で一晩定温放置して粒子上のタンパク質を安定化
した。粒子は磁気分離し１５mgのストレプトアビジン
（スクリップス社、Ｓ１２１４）含有の１０mLのＰＢＳ
に懸濁した後、１時間混合した。粒子を１０mLＥＣＬ希
釈液で洗浄毎に５分間撹はんしながら４回洗浄した。粒
子を最後に２9.７mLのＥＣＬ希釈液と３００μL のｔＲ
ＮＡ（１０mg／mL）中で再懸濁し最終の濃度を１０mg／
mLの粒子と１００μg ／mLのｔＲＮＡとした。
【００７３】例２５．ＥＣＬ・ＤＮＡプローブと異種形
成によって粒子上に固定したＤＮＡの検出 粒子を異種形成した後のＥＣＬ検出能力が、ルテニウム
（ｂｐｙ）3 2+ 標識のオリゴヌクレオチドＪＫ７とＪＫ
８とＪＫ８Ｃ（例２２）に結合した粒子の異種形成によ
って実証された。ＥＣＬ緩衝液中のそれぞれのロットの
粒子（３００μg ）を５０μL の１2.５、6.３、3.０
１、1.５ｆモルの標識付きのＪＫ７含有の５０μL ＥＣ
Ｌ緩衝液と混合した。これらの混合物を４時間５２℃で
異種形成した後、１mLのＥＣＬ緩衝液で洗浄し８３０μ
L のＥＣＬ緩衝液に再懸濁した。これらの試料を例１に
記したように分析した。プローブＪＫ７はＪＫ８順列と
補足し合うがＪＫ８Ｃ順列とは補足し合わない。
【表８】 表VIII 粒 子 プローブ量（f モル) ＥＣＬ計数 JK8 12.5 5085 6.3 3035 3.01 1345 1.5 657 JK8C 12.5 451 6.3 345 3.01 256 1.5 212 表VIIIに示す結果は、ＥＣＬによって粒子表面上に直接
固定された特定順列の存在を特別な異種形成により検出
できることを実証している。
【００７４】例２６．ビーズ結合のＥＣＬに基づくＲＮ
Ａ検定 ＤｙｎａｌＭ４５０粒子を、標準手順に従ってＲＮＡ／
ＤＮＡ抗体特定の抗体（７）で被覆した（例１０）。我
々のクローン化したエクオリン遺伝子から導いたプラス
ミドを用いて特定のＲＮＡ種を作成した（８）。簡単に
は、プラスミドｐＡ５’は大腸菌（ＥｃｏＲＩ）で切断
し、精製し、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて現場転写
を受けＴ３−ＲＩＲＮＡ（負のＲＮＡ）を生じた。ま
た、プラスミドｐＡ５’はＢａｍＨＩで切断し、精製
し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写を
受けＴ７−ＢａｍＲＮＡ（正のＲＮＡ）を生じた。これ
らの２つのＲＮＡ種は従って２つの補足的なＲＮＡ種を
表している。これらのＲＮＡ種は同量のフェノール：ク
ロロフォルム（５０：５０）で抽出して精製した後、ク
ロロフォルム抽出して2.５容積のエタノールを用いて上
澄液を沈澱した。ＲＮＡの量は、ゲル電気泳動と分光分
析を用いて測定した。これらの方法は確立されていてそ
れらの技術技能は周知されている（９）。確立された方
法を用い２５：１モル過剰のルテニウム（ｂｐｙ）3 2+
標識をストレプトアビジン上に用いて、ストレプトアビ
ジンにルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けた（例１
３）。この標識付きのストレプトアビジンを、確立され
た方法にしたがってイミノビオチンカラムを用いて精製
した（10）。このストレプトアビジンは、ストレプトア
ビジンテトラマー当り１０個のルテニウム（ｂｐｙ）3
2+ 標識を含むと見積られた。この標識付きのストレプ
トアビジンは次に、ビオチニル化Ｔ３５と複合したが、
これはオリゴヌクレオチド：標識付きストレプトアビジ
ン（１：１）の混合を用いて達成した。特に、２０ｐモ
ルのそれぞれのものを最終容積が１５μL のＥＣＬ緩衝
液に混合し、一晩４℃で定温放置して標識付きストレプ
トアビジン−オリゴヌクレオチド（ＳＡ−Ｔ３５）複合
体を形成した。正と負のＲＮＡ試料（１０ng）は異種形
成して２μL のＳＡ−Ｔ３５複合体（１段階検定）また
は２５ngのビオチニル化Ｔ３５（２段階検定）となっ
た。試料を５０μL に調合し３時間５０℃で異種形成し
た後、２０μL のＰＢＳ（0.１％ＢＳＡ）中に２００μ
g の抗ＤＮＡ／ＲＮＡ抗体で被覆の粒子を添加した。こ
の混合物を室温で１時間混合した後、ＥＣＬ緩衝液で２
回洗浄した。ＳＡ−Ｔ３５複合体と異種形成の試料を５
３０μL のＥＣＬ緩衝液中に再懸濁し例１に記したよう
に分析した。
【００７５】ビオチニル化Ｔ３５のみとの異種形成から
の試料を５０ｐモルの標識付きのストレプトアビジンと
１時間撹はんしながら定温放置し、その後ＥＣＬ緩衝液
で２回洗浄した。異種形成からの試料を５３０μL のＥ
ＣＬ緩衝液に再懸濁し例１に記したように分析した。そ
の結果を表IXに表わした。
【表９】 表IX 定 量 ＲＮＡ ＥＣＬ計数（平均） １ステップ 正 815 負 91 ２ステップ 正 1123 負 194
【００７６】例２７．ポリメラーゼの連鎖反応 ポリメラーゼの連鎖反応は大体記述したように行われた
（11,12,13）。特記しない限り１００μL の反応が代表
的である。ＰＣＲは、５ｐモルのビオチニル化オリゴヌ
クレオチドと５０ｐモルのルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標
識付きオリゴヌクレオチドを用いてルテニウム（ｂｐ
ｙ）3 2+ 標識の組み込みを目指す非対称の様式で行われ
た。我々はＨａ−ｒａｓ点突然変異の検定を同じ条件
下、但しルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識付きオリゴヌク
レオチドなしで行った。また、我々は非対称、非分離、
但し１０倍過剰のビオチニル化オリゴヌクレオチド（典
型的には４０ｐモル）を使ったＨＰＶ検定を行った。熱
的サイクル条件は次のようであった：直接組み込みのＨ
ＰＶ１８と１６検定の場合には、その輪郭は９３℃で１
秒、５０℃で１秒、６０℃で２分；Ｈａ−ｒａｓの点突
然変異検定の場合には、９３℃で１秒、６９℃で２分；
非分離ＨＰＶ検定の場合には、９３℃で１０秒、５０℃
で３０秒、６０℃で２分。これらのＰＣＲ運転のサイク
ル数は、検定と要求される感度に依存して３０〜４０回
であった。
【００７７】例２８．ＤＮＡ−プローブ検定方式Ｉ．酵
素的組み込みによるヒト乳頭腫ウイルスＰＣＲ生成物の
検出と定量 ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識のオリゴヌクレオチドの
直接組み込みを用いたＰＣＲに従って、全反応混合物
（９０〜１０μL ）を６００μg のストレプトアビジン
結合の磁性粒子Ｉに添加した後、２０分間室温で振とう
しながら定温放置した。これらの試料中の固相は磁気ラ
ックを用いて分離し、２回ＥＣＬ緩衝液で洗浄し、５３
０μL のＥＣＬ緩衝液で再懸濁し次に例１で述べたよう
に電気化学ルミネセンスを分析した。図３はこの検定方
式を説明する。この検定方式の結果をヒト乳頭腫ウイル
ス試料で説明した（2,14）。ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+
標識のオリゴヌクレオチドをビオチニル化ＰＣＲ生成物
に直接組み込む特異性の研究は、密接に関係するウイル
ス型のＨＰＶ１６とＨＰＶ１８を利用した。ＨＰＶ１６
と１８の存在の検定は、両ウイルス型に正のＤＮＡ試料
と両ウイルス型に負のオリゴヌクレオチドを用いて行っ
た。そのプライマーは次のように、２ＰＶ１６と２ＰＶ
１８はビオチニル化であり３ＰＶ１６と３ＰＶ１８はル
テニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識のオリゴノヌクレオチドで
あった。２／３ＰＶ１６と２／３ＰＶ１８オリゴヌクレ
オチドは、それぞれＨＰＶ１６と１８に特定された。生
成のビーズに捕らえられたルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標
識を、例１に記したようにＥＣＬ分析した。その結果は
各試料プライマー組合せでのＥＣＬ計数としてプロット
した（図６参照）。
【００７８】我々の検定方式の定量的特性を実証するた
めに、ＨＰＶ１６ＰＣＲ生成物に直接組み込んだルテニ
ウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識とビオチニル化オリゴヌクレオ
チドの標準曲線を作成した。生成したビーズ結合のルテ
ニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を例１に記したようにＥＣＬ
分析した。ＥＣＬフォトン計数は、増加するＨＰＶ１６
ＤＮＡ濃度に対してプロットし、ウイルスコピー：全セ
ルラーＤＮＡコピー比率として表した。このＨＰＶ１６
分析に用いたプライマーは、１ＰＶ１６（ビオチン標
識）と２ＰＶ１６（ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識）で
あった。各ＰＣＲに用いたＤＮＡは、子牛胸腺ＤＮＡを
用いて一定の１μg に保持した。この標準曲線の結果を
図７に示す。この方式の特異性と定量の結果は、これら
ＥＣＬ標識が簡単で迅速なＤＮＡに基づく検定を形成す
る能力のあることを実証している。また、この標識が酵
素化プロセスでは干渉しないで酵素反応で容易に干渉す
ることを実証している。
【００７９】例２９．ＤＮＡ−プローブ検定方式II．ヒ
トＨａ−ｒａｓ腫瘍遺伝子ＰＣＲ増幅生成物の点突然変
異の検出と決定 我々はオリゴＨＲＰ１とＨＲＰ２をつかってＨａ−ｒａ
ｓ遺伝子のＰＣＲ反応を行った。標識のないＨＲＰ２と
ビオチニル化したＨＲＰ１を用いて生じたＰＣＲ生成物
はルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識プローブの２ＣＨＲと
２Ｔ２４に異種形成する。反対に、標識のないＨＲＰ１
とビオチニル化したＨＲＰ２を用いて生じたＰＣＲ生成
物はルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識プローブの１ＣＨＲ
と１Ｔ２４に異種形成する。使用のＤＮＡはヒト胎盤
（正常）と膀胱癌腫Ｔ２４からの突然変異Ｈａ−ｒａｓ
遺伝子で伝染されたマウスＮＩＨ３Ｔ３セルＤＮＡであ
った（15）。検定手順規定は次のようである：９０μL
のＰＣＲ反応混合物を６００μg のストレプトアビジン
結合の磁性粒子Ｉに添加した後、室温で３０分間定温放
置した。これら試料中の固相を磁気ラックを使って分離
し５０mMの苛性ソーダで洗浄し、異種形成緩衝液（0.９
Ｍ塩化ナトリウム、５０mM燐酸ナトリウム、pH7.７、５
mMＥＤＴＡ、0.１％ｗ／ｖ甲状腺刺激アルブミン）で洗
浄し１０μg ／mLのルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識のオ
リゴヌクレオチド含有の異種形成緩衝液で再懸濁した。
これらの試料を１５分間６６℃で異種形成した。固相を
磁気ラックを使って分離し２回0.９Ｍ塩化ナトリウム、
５０mM燐酸ナトリウム、pH7.７、５mMＥＤＴＡで洗浄し
３Ｍのテトラメチルアンモニウム塩化物、５０mMのトリ
ス塩酸、pH8.０、２mMのＥＤＴＡ、0.０２５％トリトン
Ｘ−１００で室温で１回、６６℃で２回、それぞれ２０
分間洗浄した。固相をＥＣＬ緩衝液で３回洗浄し５３０
μL のＥＣＬ緩衝液に再懸濁して例１に述べたように電
気化学ルミネセンスを検出した。図４はこの検出方式を
説明している。
【００８０】Ｐ32標識付きのプローブを使ったＨａ−ｒ
ａｓＰＣＲ生成物の検定は、固相を最後に２５０μL の
ＥＣＬ緩衝液に再懸濁する以外はルテニウム（ｂｐｙ）
3 2+標識使用のものと同様であった。これらの懸濁試料
を次に、５mLのシンチレーション流体に移しベクマンＬ
Ｓ−１００Ｃの液体シンチレーション計数管上で計数し
た。図８にＨａ−ｒａｓ腫瘍遺伝子の点突然変異検定か
ら得た我々のデータを示す。ＰＣＲは、標識なしのＨＲ
Ｐ１とビオチニル化したＨＲＰ２を使い（プローブ１Ｔ
２４と１ＣＨＲの場合）、また標識なしのＨＲＰ２とビ
オチニル化したＨＲＰ１を使い（プローブ２Ｔ２４と２
ＣＨＲの場合）検定を行い、異種形成にはビーズ結合の
単一要素の目標を作成した。ＤＮＡ試料は、正常（胎
盤）Ｈａ−ｒａｓ遺伝子と突然変異（ＮＩＨ３Ｔ３−Ｔ
２４）Ｈａ−ｒａｓ遺伝子であった。ルテニウム（ｂｐ
ｙ）3 2+ 標識の１Ｔ２４（１Ｔ２４）、ルテニウム（ｂ
ｐｙ）3 2 + 標識の２Ｔ２４（２Ｔ２４）、ルテニウム
（ｂｐｙ）3 2+ 標識の１ＣＨＲ（１ＣＨＲ）、ルテニウ
ム（ｂｐｙ）3 2+ 標識の２ＣＨＲ（２ＣＨＲ）とビーズ
結合のＤＮＡの異種形成に続いてＴＥＭＡＣ洗浄をし
た。生成のビーズ結合のルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識
は例１に記したようにＥＣＬ分析した。結果は各試料プ
ローブの組合せについてのＥＣＬ計数としてプロットし
た。その結果（図８）は、正常ＤＮＡにうまく異種形成
している正常プローブ（ＣＨＲプローブ参照）と突然変
異遺伝子に異種形成している突然変異プローブ（Ｔ２４
プローブ参照）では予想通りであった。これらのプロー
ブが総て等しく行われなかったのは興味がある。この外
見上の異常性を調べるのに、我々はルテニウム（ｂｐ
ｙ）3 2+ 標識のあるのとないＰ32標識付きのプローブを
使って更にこれらのプローブを研究した。Ｈａ−ｒａｓ
腫瘍遺伝子についてＰ32標識付きのプローブを使ったル
テニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識付きのプローブの特異性評
価を次のように実施した。即ちＰＣＲは図８に記すよう
に標識のないＨＲＰ１とビオチニル化したＨＲＰ２だけ
を使って（１Ｔ２４と１ＣＨＲの場合）行った。使用し
たプローブは：Ｐ32含有の１Ｔ２４と１ＣＨＲ（１Ｔ２
４−Ｐ、１ＣＨＲ−Ｐ）を標準として；Ｐ32とルテニウ
ム（ｂｐｙ）3 2+ 標識の両方を含有する１Ｔ２４と１Ｃ
ＨＲでルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識の効果を決める。
試料を前と同様にＴＥＭＡＣで洗浄した。生成したビー
ズ結合のＰ32は、シンチレーション計数管内でシンチレ
ーションカクテルを添加して分析した。その結果は、各
試料プローブの組合せについてＰ32計数／秒としてプロ
ットした（図９参照）。この結果は、Ｐ32プローブとル
テニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けたプローブは同じよ
うに機能しプローブの特異性の問題は使用した特定のプ
ローブ順列によることを実証した。
【００８１】更に、我々が行ったこれらの標識を付けた
プローブ間の比較は、我々のルテニウム（ｂｐｙ）3 2+
標識とＰ32が同等であることを実証している。胎盤ＤＮ
Ａを使い、標識のないＨＲＰ１とビオチニル化ＨＲＰ２
を使い（プローブ１Ｔ２４と１ＣＨＲの場合）前記のよ
うにして増幅を行った。生成のＰＣＲ生成物を次に、異
なる量の生成物を含有する一連の試料を与えるように試
料採取した。次に、これら一連の試料をＰ32で標識付け
したプローブ（１Ｔ２４−Ｐ３２と１ＣＨＲ−Ｐ３２）
またはルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けたプローブ
（ＩＴ２４−Ｒｕ（ｂｐｙ）3 2+ とＩＣＨＲ−Ｒｕ（ｂ
ｐｙ）3 2+ ）のどちらかと異種形成した。次に、各研究
の結果を、９０μL の試料について各標識の平均値を用
いて標準化した。これらの標準化した数字は、バックグ
ラウンドに対するシグナルの効果的な比較となりこの２
方法の比較応答となる。図１０に挿入のものは、希釈曲
線の低レベルでの応答を示す。試料は前記したように取
り扱った（図８と図９）。図１０の結果は、我々のルテ
ニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けたプローブから良い応
答を示す２つの標識の同等性が実証される。これらの研
究は、ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けたプローブ
が試料ＤＮＡ中の単一ベース変化を区別する能力の点で
Ｐ32標識を付けたプローブと同様に機能する能力のある
ことを実証している。この証拠は、ルテニウム（ｂｐ
ｙ）3 2+ 標識が異種形成反応で標識を付けたプローブの
性質に殆ど影響しないことを示している。
【００８２】例３０．ＤＮＡプローブ検定方式III ．非
分離検定でのヒト乳頭腫ウイルスＰＣＲ生成物の検出と
定量ＨＰＶ１８の非分離検定で、我々は過剰のビオチニ
ル化したプライマーと非対称ＰＣＲ反応を行った。この
ＰＣＲ反応は、ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識のプロー
ブによって直接異種形成にすぐ利用できる過剰のビオチ
ニル化した単一要素ＤＮＡを作り出す。異種形成のため
に、我々はＨＰＶ遺伝子に特有な１０００ＥＣＬ計数の
ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けたオリゴヌクレオ
チド（約２ng）を添加して１５μL のＰＣＲに増幅し、
その増幅が完了後に１５分間５０℃で定温放置した。こ
の異種形成混合物に６００μg のストレプトアビジン結
合の磁性粒子Ｉ含有の６０μL のＥＣＬ緩衝液を添加し
撹はんしながら室温で１５分間定温放置した。試料容積
はＥＣＬ緩衝液を加えて５３０μL に増加した後、例１
に記したように電気化学ルミネセンスを検出した。図５
はこの検出方式を説明している。この非分離検定を実証
するため、我々はＨＰＶ１８ＤＮＡの標準曲線を使っ
た。ＨｅＬａＤＮＡを使いビオチニル化２ＰＶ１８と標
識のない１ＰＶ１８を使ってＰＣＲを行った（14）。次
に、生じたＰＣＲ反応物を特定プローブのルテニウム
（ｂｐｙ）3 2+ 標識を付けた３ＰＶ１８と異種形成し
た。次に、異種形成混合物をストレプトアビジン被覆粒
子に添加し生成したビーズ結合のルテニウム（ｂｐｙ）
3 2+ 標識を例１に述べたように直接ＥＣＬ分析した。そ
の結果を、ラス・オリゴヌクレオチドプローブの標準で
ＰＣＲに添加したＨＰＶ１８コピーに対するＥＣＬ計数
としてプロットした（図１１参照）。これらの結果は、
ＥＣＬ検定システムの性質に基づいて核酸順列の迅速非
分離検定を作り出す能力を実証している。
【００８３】例３１．特定ゲノムＤＮＡ順列の検定 ここに述べる検定方式は、２つのオリゴヌクレオチドを
利用する。その両方が同じＤＮＡ要素を互いに隣合わせ
るように異種形成し、一方のプローブは捕獲でき、他の
プローブは複合体を標識付ける（サンドイッチ異種形
成）。この検定は大腸菌ＤＮＡとｔｒｐＥ／Ｄ遺伝子領
域に特定にプローブを用いて実証された。大腸菌ＤＮＡ
は次のような標準手順規定に従って調製された（16）。
鮭精液制御ＤＮＡはシグマ社から購入した。ＤＮＡ試料
に１４μL の異種形成緩衝液（１０ｘＰＢＳ、１０mMの
ＭＥＤＴＡ、0.７％ＳＤＳ）、２ngのビオチン標識付き
ＴＲＰ・ＣＯ4 と５ngのルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ 標識
のＴＲＰ・ＣＯ3 を添加した。これらの試料を水で１０
０μL に調製した。試料を９７℃に加熱し９７℃で１０
分間定温放置し、５０℃に冷却してから２時間異種形成
した。我々はこれらの試料に２０μL のストレプトアビ
ジン被覆の磁性粒子IIを添加し２時間室温で混合した。
次に、粒子をＥＣＬ緩衝液で４回洗浄し５００μL のＥ
ＣＬ緩衝液に再懸濁し、例３に述べたように分析した。
正のＤＮＡは大腸菌であり負のＤＮＡは鮭の精液であ
る。結果を表Ｘに示す。
【表１０】表Ｘ ＤＮＡ 量 平均ＥＣＬ計数 正 10 184 25 257 50 266.5 負 10 87 25 70 50 75 これらの結果は、増幅なしのＤＮＡにサンドイッチ異種
形成検定方式を用いて大腸菌のゲノム遺伝子検出に機能
するＥＣＬ検定システムの能力を実証した。ストレプト
アビジン被覆の磁性粒子Ｉは、ストレプトアビジン被覆
の磁性粒子IIがこの例に使われている様式と同様に使う
ことができる。
【００８４】例３２．エバネッセント波蛍光検出器上の
粒子濃度 検出面上の標識付き複合体の濃度は、エバネッセント波
検出器を用いた検定の感度増加に利用できる。その様な
検出器は、光ファイバーか平面光学導波管３００のどち
らかを使って光３１０を光源から流体環境の所まで導い
てくるのに使われる。光は導波管か光ファイバーを経
て、入射光線が高い屈折率（ｎ1)とより低い屈折率（ｎ
2)の誘電体媒体間の界面に当たるときに生じる内部全反
射（ＴＩＲ）３１０’で反射される。光線の入射角度が
臨界角度（θ0)（垂直線３００’と光路３１0'の間の角
度）３１５より大きいときには、θ0 ＝ｓｉｎ−１（ｎ
2 ／ｎ1)となり光はその界面で１００％内部に反射す
る。光学導波管と光ファイバー内を光はこの臨界角度よ
り大きな入射角度で進み、媒体内を内部全反射して伝播
する。図２２は、導波管または光ファイバー内のＴＩＲ
伝播を記載している。光束は界面で互いに作用し合って
全反射するが、その電磁場は媒体外ではゼロではない。
界面をよぎる物理的連続の必要条件は、光が光ファイバ
ーまたは導波管の外側の外部環境に貫通すると電磁場は
指数的に減衰することを要求する。この場をエバネッセ
ント場３２０と呼び蛍光体を励起して蛍光を発する能力
がある。エバネッセント場の減衰速度は入射波長、屈折
率ｎ1 とｎ2 、入射角度に依存する。石英導波管と水環
境内の可視線を使うと、エバネッセント場３２０は、導
波管／溶液界面から１００ｎｍの距離内で約９０％減衰
する。図２２では、周囲の媒体３３０が屈折率ｎ2 と光
ファイバーまたは導波管３００、屈折率ｎ1 を持ってい
る。
【００８５】導波管または光ファイバー内を伝播する光
のエバネッセント場を作るのと同じ原理で、蛍光体が光
学要素に効率的に捕獲されて輝くときに発する光が認め
られる。それに加えて、エバネッセント地帯３２０外に
形成されたどんな光も、光学要素への侵入を効率的に拒
否される。これらの効果の組合せは、光ファイバーまた
は導波管が水の環境でその表面上または近くの蛍光体標
識の存在または濃度を測定するための効率的な光学要素
として使用されることを認めている。ここに引用されて
いる米国特許Ｎｏ．４，４４７，５４６は、標識付きの
免疫反応体からのエバネッセント地帯の蛍光を励起し測
定するのに光ファイバーを採用し蛍光免疫検定を行うの
に適した方法と装置を記述している。この発明は、光フ
ァイバーまたは導波管を使って蛍光に結び付いた検定の
感度を改良するのに適用できる。この検定は、蛍光部分
で標識を付けた試薬を使って行っている。粒子、試料と
試薬を定温放置した後に、粒子を導波管または光ファイ
バーの表面に濃縮した。粒子の表面積は導波管または光
ファイバーの幾何学的面積より大きいので、光学要素を
取り巻くエバネッセント地帯にもっと多くの蛍光体を収
集できる。従って、粒子からのルミネセントシグナルは
大きくなり検体の定量がもっと感度良く、検出限界が改
良されることになる。このようにこの発明の好適な実施
例が詳細に述べられたが、添記のクレームで規定される
この発明は、多くの明らかな変更が本発明の精神または
範囲から外れることなしに可能であり上記の説明で明ら
かにした特殊な詳細に限られるものではないことを理解
してもらいたい。
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の微粒子に基づく非分離と分離検定を
行うためのセルの概略図。
【図２】図１のセルと一緒に使う電圧制御装置の簡単な
図形。
【図３】電気化学ルミネセント標識を付けたオリゴヌク
レオチドとビオチン電気化学ルミネセント標識を付けた
オリゴヌクレオチドをプライマーとした直接組み込みＰ
ＣＲ方式の概略表示。
【図４】ビオチニル化ＰＣＲ生成物を作り出すためにビ
オチニル化プライマーを使った正常ＰＣＲ方式の概略表
示。
【図５】電気化学ルミネセント標識付きオリゴヌクレオ
チドに後ほど異種形成するために単一要素ビオチニル化
ＤＮＡを作り出す非対称ＰＲＣ検定方式の概略表示。
【図６】電気化学ルミネセント標識付きオリゴヌクレオ
チドをビオチニル化ＰＣＲ生成物に直接組み込む特異性
の研究を示すグラフ。
【図７】ＨＰＶ１６ＰＣＲ生成物に直接組み込んだ電気
化学ルミネセント標識とビオチニル化オリゴヌクレオチ
ドの標準曲線。
【図８】Ｈａ−ｒａｓ腫瘍遺伝子のための点突然変異検
定を示すグラフ。
【図９】Ａｒ−ｒａｓ腫瘍遺伝子のためにＰ32電気化学
ルミネセント標識を付けたプローブを用いて電気化学ル
ミネセント標識を付けたプローブの特異性評価を示すグ
ラフ。
【図１０】Ｈａ−ｒａｓ腫瘍遺伝子の点突然変異決定の
ためのＰ32電気化学ルミネセント標識での電気化学ルミ
ネセント標識の相対値測定を示すグラフ。
【図１１】ＨＰＶ１８の迅速「洗浄なし」異種形成検定
の標準曲線。
【図１２】複合体を沈降させるのに重力に頼る検定を行
うために用いた検定セルの概略表示。
【図１３】重力の影響を受けた複合体の時間の関数とし
た沈降距離；即ちDynal 粒子の沈降速度（y=-0.28+0.48
x; 速度＝0.５mm／分）を示すグラフ。
【図１４】電極上に異なる検定組成の高さを有する重力
セル中での時間を関数とした電気化学ルミネセンス強度
を示すグラフであり、即ち、２つのガスケット厚さに対
する強度と時間の関係を比較する。ここに白丸で表す値
は0.０１５インチガスケットのものであり、黒丸で表す
値は0.０７５インチガスケットのものである。
【図１５】アルファ胎児タンパク質測定のための検定で
測った電極表面上の異なる高さの検定組成を有する重力
セル中での電気化学ルミネセンス強度を示すグラフであ
り、即ち、ＡＦＰ検定のためセルを比較する。ここに白
丸で表す値は0.０１５インチガスケットのものであり、
黒丸で表す値は0.０７５インチガスケットのものであ
る。
【図１６】複合体を電極表面に沈降させるのに電磁石を
用いる沈降検定セルの概略表示。
【図１７】それぞれ磁場と重力の影響下で沈降する相対
速度を示すグラフであり、即ち、磁場が引き起こす沈降
と重力沈降との間の微粒子沈降時間の比較である。ここ
に磁場沈降の値は白丸で表し重力沈降は黒丸で表してい
る。
【図１８】永久磁石を持った収集セルの概略表示。
【図１９】図１８のセルで行った検定時間を関数とした
ＥＣＬ強度の増加を示すグラフであり、即ち、ＥＣＬ強
度におよぼす収集時間の影響である。
【図２０】電極表面下の磁石の向きの関数とした電極表
面付近の力線の概略表示。
【図２１】複合体が遠心分離によって電極表面に沈積す
るような回転流セル；粒子を捕獲するための発明の遠心
方法と装置；発明の遠心流セルの概略表示。
【図２２】エバネッセント波蛍光の検出の概要表示。
【図２３】この発明の磁性微粒子に基づいた分離または
非分離の検定法を行うためのセルと複数の磁石；電極表
面の面に大体平行した磁線を与える磁石装置の複数の磁
石を示している。
【図２４】この発明の磁性微粒子に基づいた分離または
非分離の検定法を行うためのセルと複数の磁石；電極表
面の面に大体平行した磁線を与える磁石装置の複数の磁
石を示している。
【図２５】この発明の微粒子に基づいた非分離と分離の
検定を行うためのセルの概略図面であり、そのセルは図
２３、２４のような作用電極と複数の磁石を用いてい
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５７５ ５７５ ５９３ ５９３ ５９５ ５９５ 27/46 Ｕ (72)発明者 ケンテン，ジョン，エィチ. アメリカ合衆国20879 メリーランド州ゲ イサースバーグ，ウインドジャマー ウエ イ 1921 (72)発明者 グッドマン，ジャック，イー. アメリカ合衆国22201 バージニア州アー リントン，サード ストリート ノース 3011 (72)発明者 ロウク，ジョージ，イー. アメリカ合衆国20882 メリーランド州レ イトンズビル，モブリィ ファーム ドラ イブ 21706 (72)発明者 ブラックバーン，ゲイリー，エフ. アメリカ合衆国20882 メリーランド州ゲ イサースバーグ，ローリング フォーク ウエイ 23627 (72)発明者 マッセイ，リチャード，ジェイ. アメリカ合衆国20852 メリーランド州ロ ックビル，バレリアン コート ５

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 電極面での粒子に結合した標識の電気化
    学ルミネセンス測定に基づいて試料中に存在する興味あ
    る検体の結合検定を行うために次のものから成り立つ装
    置： （ａ）試料を規定し、容積を含み、入口と出口手段を有
    するセル、電極、および電極に近接した該粒子を捕集す
    るための捕集手段； （ｂ）該電極に電圧を印加する手段；および （ｃ）該電極で発生する電気化学ルミネセンスを測定す
    る手段。
  2. 【請求項２】 電極面での電気化学ルミネセンス測定に
    基づいて試料中に存在する興味ある検体の結合検定を行
    うために次のものから成り立つ装置： （ａ）検定試料を規定し容積を含み入口と出口手段を有
    するセルで、更に該電極面上の該複合体の実質的に一様
    な分布が得られる手段も包含している； （ｂ）該電極に電圧を印加する手段；および （ｃ）該電極で発生する電気化学ルミネセンスを測定す
    る手段。
  3. 【請求項３】 複合体の一様な分布が得られる該手段に
    は該電極に関した配向磁場を発生する手段を含み、該磁
    場の力線は該電極面の領域ではその面と実質的に平行と
    なるようにしてある特許請求の範囲第２項記載の装置。
  4. 【請求項４】 磁場を発生する該手段は該電極の下に垂
    直に位置した南北を向いた磁石を含む特許請求の範囲第
    ３項記載の装置。
  5. 【請求項５】 電極面での磁気粒子に結合した標識の電
    気化学ルミネセンス測定に基づいて試料中に存在する興
    味ある検体の結合検定を行うために次のものから成り立
    つ装置： （ａ）試料を規定し、容積を含み、延長された領域を有
    し、入口と出口手段を有するセル、電極、および電極に
    近接した該磁気粒子を捕集するために配置された磁石； （ｂ）該電極に電圧を印加する手段；および （ｃ）該電極で発生する電気化学ルミネセンスを測定す
    る手段。
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