CN1495425A - 发光测定的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及应用电极上的电致化学发光对样品中的有意义的分析物进行结合测量的方法、装置、试剂和药盒。采用该方法时，试剂和药盒颗粒可以通过重力、离心或磁性吸引沉淀在电极表面上。所述装置包括在接近电极区内产生磁场的磁体。

Description

发光测定的装置
本申请是申请号为CN92102540.8母案的分案申请。该母案的申请日为1992年2月7日；发明名称为“改进的发光测定的方法和装置”。
本申请系1991年2月6日提交的题为“电致化学发光测定”(申请号：07/652427，发明人：Massey等)(该申请案又系1988年11月3日提交的申请号为266882的申请案的继续部分，现已放弃)的待批专利的继续部分，本申请也系1990年6月18日提交的申请号为539389(该申请案又系申请号为266882的继续部分)的申请案的继续部分。本申请又是Massey等与题为“含有复合磁体的磁微粒基发光测定的方法和装置”(CMS登记号370068-3401)的申请案(该申请案又系申请号为07/652427的申请案的继续部分)同时提交申请的申请案。上述有关申请均为本申请案的参考文件。
技术领域
本申请一般涉及进行结合测量的方法和装置，具体地说涉及通过测量由测量系统中的一个或多个标记化合物发射的发光测定有意义分析物，更具体地说，本发明涉及高灵敏度的准确、精密和能重现的均相或多相特异性结合测量，其中在产生电致化学发光前，发光组分富集在测量组合物中并在检测系统上进行收集。
背景技术
关于检测和定量分析生化物质和生物物质中的分析物，已经研究和发展了许多方法和体系。能够测量痕量微生物、药物、激素、病毒、抗体、核酸和其他蛋白的方法和体系对研究人员和临床工作人员则具有重要的意义。
采用已知的结合反应方法，已经能检测和分析大量物质，例如抗原-抗体反应，核酸杂交技术和蛋白-配位体系统。许多生化和生物结合体系中的高度特异性产生了对研究和诊断具有重要意义的许多测量方法和系统。具体地说，在一种或多种结合材料上是否存在可观察量的标记物，即可说明是否存在有意义的分析物。特别有意义的是通过光化学、化学和电化学方法，将标记物制成发光材料。“光致发光”是一种当材料吸收电磁辐射时能诱导发光的方法。萤光和磷光则是光致发光的典型例子。“化学发光”方法则是通过能量的化学转化提供发光的方法。“电致化学发光”是通过电化学方法提供发光。
现已发展起来的化学发光测量技术是将含有意义分析物的样品与用化学发光标记物标记的反应物相混合，该反应混合物经诱导后，某些部分的标记反应物与分析物结合。诱导后将混合物的结合部分与未结合部分分离，这两部分或其中的一部分中标记物的浓度可通过化学发光方法进行测定。这两部分或其一部分中所测定的化学发光的量可说明生物样品中有意义的分析物的含量。
电致化学发光(ECL)测量技术是对化学发光技术的改进。该方法提供了灵敏精密地测量有意义分析物的存在及其浓度。使用这类方法时，将经过诱导的样品通过伏安工作电极激发发光。在特定的化学环境中，这种电致化学发光是在一定的时间和采用一定的方法的条件下施加在工作电极上的电压激发的。测量由标记物产生的光，从而可说明分析物的存在或其含量。关于电致化学发光的详细介绍，可参阅PCT已经公开的专利申请文件：US 85/01253(WO 86/02734)、US 87/00987和US 88/03947，上述文献也系本文的参考文献。
在进行电致化学发光测量时，最好在测量程序中不需要分离步骤，并且对不同浓度分析物的信号调制放至最大程度，从而能获得精确灵敏的测量。在不分离测量的已有方法中，将微颗粒悬浮在测量样品中，与一种或多种测量结合组分相结合。
美国专利4305925涉及使用浊度测定法和比浊法检测和测定与临床有关的蛋白和肽，所公开的方法包括将抗原或抗体与具有光散射或光吸收作用的乳胶颗粒相结合。
美国专利4480042涉及使用由壳芯颗粒组成的颗粒试剂的技术，其颗粒壳层含有有意义生物化合物能与之共价结合的官能团；而且壳芯的高反应指数形成了对光散射测量的敏感性。该技术是以凝集反应为基础，其由二价抗体与多价抗原反应产生能用各种方法检测和/或测量的凝集物。
美国专利4419453也涉及可用于检测是否存在免疫化学物质(例如抗体和免疫原)的带色乳胶凝集测定方法的应用。根据该项已有技术，似乎并不可能将微颗粒用于测量发光现象。但是可望由游离化学发光或电致化学发光部分产生的发光可被吸收、散射、甚至还会受到微颗粒物质的影响。
出乎意料的是美国专利539389(PCT申请号U.S.89/04919)公开了发光现象的灵敏的特异性结合测定方法，其中惰性微颗粒可与测定体系中的一个结合反应物进行特异性结合。该项测量可在多相(一个或多个分离步骤)中进行，而在均相(无分离步骤)中进行则更为有利。
美国专利89/04919涉及用于测量发光现象的结合反应的组合物，该组合物包括具有能与测量混合物中的组分相结合的表面的复合悬浮颗粒。另一方面，还提供了检测或定量分析样品中分析物的系统，该系统用本发明的测量组合物能够实现测量方法。该系统包括在测量介质中将标记化合物诱导发光的装置和用于检测样品中分析物的发光测量装置。
现已发现，测量系统中与电致化学发光部分相连接的组分与悬浮微颗粒相结合，可以大大调制由与该组分相连接的电致化学发光部分产生的发光信号的强度，从而提供了监测测量系统中特异性结合反应的装置。更令人惊奇的是还发现，悬浮颗粒对由与该系统中的组分相连接的电致化学发光部分所产生的发光信号强度的影响很小或没有影响，所述系统中的组分仍未与悬浮微颗粒结合。
因此，美国专利89/04919中所述检测样品中分析物的方法包括如下步骤：
(1)组成组合物，该组合物含有：
(a)含有可能存在着所需分析物的样品；
(b)用于测量的物质，选自：(i)需要测量的分析物或类似分析物；(ii)需要测量的分析物或类似分析物的结合对象；和(iii)能与(i)或(ii)结合的反应组分，其中所述用于测量的物质中的一种物质与具有能诱导发光的化学部分的标记化合物相连接；和
(c)能与分析物和/或(b)(i)、(ii)或(iii)中所述物质特异性结合的复合悬浮颗粒；
(2)温育组合物，形成含有颗粒和所述标记化合物的复合物；
(3)将标记化合物诱导发光；以及
(4)测量由组合物发射的发光，检测存在于样品中的分析物。
通过将测量组合物的发光与含有已知量的分析物的组合物的发光的对比，上述同类方法都可用于定量分析样品中分析物的含量。
类似分析物可以是天然的，也可以是合成的，它们是具有与分析物可作对比的结合特异性的化合物，但是也包括结合能力较高或较低的化合物。适宜用于本发明的结合对象均为公众所熟悉的，例如有抗体、酶、核酸、外源凝集素、辅因子和受体。能与分析物或其类似物和/或与其结合对象结合的反应组分可以是次级抗体或诸如蛋白A或蛋白G的蛋白，也可以是抗生物素蛋白或生物素，或本领域已知的能参与结合反应的其他组分。
发光最好是由标记化合物(不管其是否已与特异性结合对象结合或未结合)经伏安工作电极作用诱导的电致化学发光(ECL)产生的发光。电致化学发光反应混合物在一定的时间和以一定的方法，在工作电极上施加电压，使之产生光，从而有控制地发射出光。虽然发射可见光较好，但是组合物或系统也可以发射其他类型的电磁辐射，例如红外光或紫外光、X射线、微波等。本文所用的术语“电致化学发光”、“电致化学发光的”、“发光”、“发光的”和“发射光线”都包括发射光和其他形式的电磁辐射。
美国专利89/04919所介绍的方法，要求在研究和临床方面进行的各种测量中，检测和定量分析非常少量的分析物。研究人员和临床人员的需要使之成为非常迫切地减少采用这些方法进行测量的种种检测限制，提高这些测量的灵敏度以及他们能够进行测量的速度。
在将各种标记物进行测量前，先将它们富集，从而增强由它们产生的信号，关于这方面的各种方法均为公众所知。在美国专利4652333中，用荧光、磷光或原子荧光标记物标记的颗粒可在测量前通过微过滤进行浓缩。
在测量前富集标记免疫化学物质的方法也已为本领域的公众所了解，例如可将磁性感应标记颗粒移近测量容器的表面。在美国专利4731337、4777145和4115535中，就是先将颗粒移近容器壁，然后发射激发光的荧光。
在美国专利4945045中，颗粒富集在磁性电极上。电化学反应发生在通过标记化学介体改进的电极上。发生结合时，免疫化学结合反应改变了产生调制信号的介体的效率。
已有方法均不涉及本发明的表面选择性激发的方法。尽管表面激发(例如电致化学发光)不受任何机械学上解释的限制，但是可以认为固相复合物上的标记物必然在电极上被氧化，这就需要电子由标记物向电极移动。还可以认为，电子的这种“跃变”是由于已知的隧道现象产生的，即电子不必“越过”势垒就能通过空间(势能很高的区域，例如溶液)。电子能够通过势垒无需另外输入能量，即能够由一个分子向另一个分子移动，或由一个分子向电极移动。但是这种隧道现象仅能发生在非常短的距离内，隧道现象的概率以两者增加之间距离的指数下降。如果距离小于25A(2.5nm)，则发生在两者之间的隧道现象的概率非常高；如果距离很大，则概率很低。25A的距离是本领域专业人员使用的经验法则，并非绝对限制。
因此，只有具有25A电极表面的那些电致化学发光标记物才能可望参与电致化学发光的过程。一般说来，在25A电极表面范围内的颗粒面积是非常小的。
因此，不能期望由颗粒表面产生的电致化学发光能测出任何有意义的量。但是由电致化学发光方法产生的光必须通过颗粒才能到达光电倍增器。由于颗粒基本上是不透明的(颗粒的浓缩悬浮液呈黑色)，即使由电致化学发光能够产生大量的光，也不能期望光能通过颗粒并且用光电倍增器测量。
发明内容
本发明的目的之一在于提供进行结合测量的均相(不分离)和多相(分离)的方法、试剂和装置。
本发明的目的之二在于以测量由含微颗粒物质的测量组合物发射的电致化学发光为基础，提供不分离特异性结合测量、试剂和装置。
本发明的目的之三在于与已有技术相比提供灵敏度和精确度高、测量迅速、特异性强和检测限制性低的测量、试剂和装置。
本申请中所用术语的定义为：“电致化学发光部分”、“含金属的电致化学发光部分”、“标记物”、“标记化合物”和“标记物质”均可交换使用。“电致化学发光部分”、“含金属电致化学发光部分”、“有机金属化合物”、“金属螯合物”、“过渡金属螯合物”、“稀土金属螯合物”、“标记化合物”、“标记物质”和“标记物”都与分子相连接，例如分析物或其类似物，分析物或其类似物的结合对象，以及所述结合对象的结合对象，或能与所述分析物或其类似物或结合对象结合的反应组分，以上所述均属本发明的范围。上述各类还能与一种或多种结合对象和/或一种或多种反应组分的组合物相连接。此外，上述各类还能与已与结合对象、反应组分或一种或多种结合对象和/或一种或多种反应组分的组合物结合的分析物或其类似物连接。属于本发明范围的还有上述各类直接或通过以上讨论的其他分子与分析物或其类似物相结合。简言之，这些配位体都可用作测量物质。
术语“检测”和“定量分析”均表示测量，可以理解为：定量分析可以要求制备有关的组合物和进行校准。
术语“收集和富集复合物”可以相互交换地用于描述测量组合物中复合物的富集和在电极表面上复合物的收集。
附图说明：
图1表示实施本发明微颗粒无分离和分离测量的测量室。
图2表示用图1的测量室在测量时的电压控制装置的简图。
图3表示采用电致化学发光标记寡核苷酸和生物素电致化学发光标记寡核苷酸作为引物直接结合PCR。
图4表示使用含生物素引物产生含生物素PCR产物的标准PCR。
图5表示所产生的用于以后与电致化学发光标记寡核苷酸杂交的含生物素单链DNA的不对称PRC测量。
图6表示直接将电致化学发光标记寡核苷酸结合到含生物素PCR产品的特异性研究。
图7表示直接将电致化学发光标记物和含生物素寡核苷酸结合到HPV16PCR产物中的标准曲线。
图8表示Ha-ras致癌基因点突变。
图9表示Aa-ras致癌基因的32P电致化学发光标记探针鉴别电致化学发光标记探针的特异性。
图10表示在测定Ha-ras致癌基因点突变的32P电致化学发光标记物中电致化学发光标记物相对值的测定。
图11表示HPV18快速“不洗涤”杂交测量的标准曲线。
图12表示测量重力沉淀复合物的测量室。
图13表示重力作用下复合物沉淀距离与时间的函数关系，即Dynal颗粒的沉淀速率(Y＝-0.28+0.48X；速度＝0.5mm/min)。
图14表示在对电极不同高度测量组合物的重力室中电致化学发光强度与时间的函数关系，即两垫片厚度的强度-时间关系的对比，其中白点表示0.015″垫片的值，黑点表示0.075″垫片的值。
图15表示在对电极表面不同高度测量组合物的重力室中测量α胎儿蛋白的电致化学发光强度，即AFP测量室的对比，其中白点表示0.015″垫片的值，黑点表示0.075″垫片的值。
图16表示采用电磁体使复合物沉淀在电极表面上的沉淀测量室。
图17表示在磁场和重力作用下微颗粒复合物沉淀的相对速率，即磁场沉淀和重力沉淀之间微颗粒沉淀时间的对比，其中白点表示磁场沉淀值，黑点表示重力沉淀值。
图18表示装有永久磁体的收集室。
图19表示ECL强度的增高与用图18收集室进行测量的时间的函数关系，即收集时间对ECL强度的作用。
图20表示在电极表面的磁力线与在电极表面下磁体取向的函数关系。
图21表示复合物离心沉淀在电极表面的旋转液流室、本发明俘获颗粒的离心方法和装置以及本发明的离心液流室。
图22表示渐消波荧光的检测。
图23和图24表示进行本发明的磁性微颗粒基分离或不分离测量方法的测量室和复合磁体以及磁体系统的复合磁体产生大致与电极表面相平行的磁力线。
图25表示进行本发明微颗粒基不分离和分离测量的测量室，该测量室采用图23和图24的工作电极和复合磁体。
在本发明的一个最宽的实施例中，是结合测量样品中分析物的方法，其测量步骤包括：
(a)组成组合物，其含有：
(i)所述样品；
(ii)测量用物质，其含有与能诱导发光的标记化合物连接的组分，和
(iii)能与分析物或所述测量用物质进行特异性结合的复合颗粒；
(b)温育所述组合物，组成含有颗粒和所述标记化合物的复合物；
(c)在测量区收集所述复合物；
(d)通过表面选择性激发将所述复合物中的标记化合物诱导发光；以及
(e)测量受射发光，从而测量样品中的分析物。
复合物可以通过在电极上施加电压，在受激和诱导电致化学发光的电极表面上进行收集，也可以在表面上进行收集，然后按以下所述的表面激发诱导产生荧光。激发和检测荧光标记物的表面敏感技术已经描述了总内部反射荧光发光(TIRF)，测量标记物的另一项表面敏感技术则采用喇曼和红外吸收的总内部反射。表面细胞质基因组共振是一项根据本发明可用于测量表面标记物的光学技术。因此，本发明是采用表面激发技术激发发光的方法。
然而本发明最好在测量区收集复合物，即在能够产生发光的表面上收集复合物，本发明所用的另一个方法，是在测量区外收集复合物，然后将其置于测量区内或采用其他步骤诱导和测量发光。
复合物的收集也可采用一些不同的方法，包括重力沉淀、过滤、离心和形成部分复合物的磁性感应颗粒的磁性吸引等方法。下面将进一步详述若干实施方案。
采用重力在电极表面测量电致化学发光包括：
(a)组成组合物，其含有：
(i)所述样品；
(ii)测量用物质，其含有与能诱导电致化学发光的标记化合物连接的组分，和
(iii)密度大于所述组合物平衡量并能与分析物或所述测量用物质进行特异性结合的复合悬浮颗粒；
(b)温育所述组合物，组成含有颗粒和所述标记化合物的复合物；
(c)将所述组合物导入测量室；
(d)使所述组合物在所述测量室中滞留足够的时间，从而通过重力使颗粒沉淀在所述电极表面，至少在位于该测量室容器主要部分下面的电极表面收集所述复合物；
(e)通过将电压施加在所述电极上，将所收集的复合物中的标记化合物诱导发光；以及
(f)在电极表面测量受射发光，从而测量样品中的分析物。
在液流室中可以进行连续或半连续测量，同时可以进行分批测量。在液流室中，固相保留在测量室内，而液体流经和流出测量室。如果固相(例如颗粒)密度大于水(大于1.0g/ml)，则作用在颗粒上的重力使其落到室的底部。该室可以构建成使颗粒沉向底部，而液体流经该室，该室也可以构建成使室中的大部分样品都保持在ECL系统工作电极上的柱室中。在室中的足够停留时间则可在诱导ECL前使颗粒沉淀在电极表面上。
在本发明的第二个实施例中，含有密度大于测量组合物平衡量的悬浮颗粒的测量组合物可以通过离心，使颗粒移至测量区与电极接触，诱导电致化学发光，也可在离心步骤中直接与电极接触。在这个实施例中，测量室可以配置使样品迅速转动和包封的装置。离心力使样品中的颗粒由样品外壳转动轴向外移动，并在样品外壳的外表面上进行收集。这类样品外壳的外表面可以构成ECL测量系统的工作电极。
在第三个实施例中，颗粒可以通过过滤从测量组合物中除去。在这个实施例中，颗粒的密度不需要大于测量组合物的平衡量。根据本发明，通过过滤溶液，可将颗粒与溶液分离和浓缩，例如在滤器表面泵集颗粒。滤器的表面可以涂上能用作ECL检测系统中的工作电极的金属薄膜。
在一个较佳实施例中，悬浮颗粒是一种磁性感应颗粒，例如可以是顺磁体颗粒，也可以是铁磁体颗粒，并且通过向颗粒施加磁场，在测量区中收集，最好直接在电极表面上进行收集。测量室装有磁体，当颗粒残留在分批室中或流经液流室时，磁体的磁场将磁力施加在颗粒上，使它们与最靠近磁体的室的表面上的大量溶液分离。如果磁体配置在固有的方向并且紧靠ECL检测系统的工作电极，颗粒则集中在工作电极的表面上。
采用上述方法，在电极表面收集和浓缩复合物，可以实施对各种不同多相和均相形成物进行结合测量。在多相结合测量中，在测量由标记物产生的发光前，应先将复合物与组合物分离。在均相测量中，对结合(固相)和未结合的标记试剂不必进行分离。
在多相测量中，当复合物在工作电极表面上集中时，由标记物产生的测量信号远大于未进行收集步骤的信号。与此相反，由未经复合的标记试剂产生的信号却并无变化。因此，尽管在测量室中存在着未复合的标记试剂，由收集到的复合物产生的信号强于测量时未收集复合物的信号。收集步骤的结果，显著提高了结合测量的检测极限。
在本发明的较佳实施例中，均相结合测量可以包括就地分离步骤。在将测量组合物(即样品、测量用物质和颗粒)泵入测量室并通过工作电极截获复合物后，将另一个液体泵入不含标记物或标记试剂的测量室内，从而进行就地洗涤或将复合物与测量组合物中的未结合组分进行分离。该测量程序从技术角度上说系多相结合测量，但是在测量室内进行分离的优点在于其不需要附加分离装置，而且一般说来，处理也比在外部进行分离迅速。
采用本发明方法，将测量组合物的各组分互相混合并将它们反应预定的时间即可进行多相结合测量。然后将测量组合物进行分离，其中包括溶液与颗粒的分离。接着测量复合物或溶液中的电致化学发光。与未经浓缩的相比在浓缩后测量复合物的电致化学发光可能使测量分析物具有更高的精度和较低的检测极限。
从以下对若干优选实施例的介绍，将会对本发明及其目的和性质更清楚全面地理解。
本发明可广泛应用于能参与结合反应的各种分析物。这些反应包括：抗原-抗体，配位体受体，DNA和RNA的相互反应和其他已知反应。本发明涉及定性和定量检测多组分样品中这类分析物的方法和装置。
样品
含有分析物的样品可以是固体、乳浊液、悬浮液、液体或气体，可以是由细胞和细胞衍生物、水、食物、血液、血清、发毛、汗水、尿、粪便、组织、唾液、油类、有机溶剂或空气衍生的。样品还可以是水、乙腈、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮或醇类，以及它们的混合物。
分析物
样品中典型的分析物是完整细胞或表面抗原、亚细胞颗粒、病毒、Prion、类病毒、抗体、抗原、半抗原、脂肪酸、核酸、蛋白质、脂蛋白、多糖、脂多糖、糖蛋白、肽、多肽、细胞代谢产物、激素、药物、合成有机分子、有机金属分子、安神药、巴比妥酸、生物碱、甾类化合物、维生素、氨基酸、糖、外源凝集素、重组体或衍生蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或无机分子。一般说来，分析物的浓度为10-3摩尔或低于10-3摩尔，例如10-12摩尔或更低。
测量用物质
与含有分析物的样品相结合的测量用物质至少含有一种选自下列的物质：(i)加入以上所述的分析物或其类似物，(ii)分析物或其类似物的结合对象，和(iii)能与(i)或(ii)结合的上述反应组分，所述测量用物质中的一种物质与化合物或部分(例如能够诱导发光的电致化学发光部分)相连接。经过标记的物质可以是完整细胞或表面抗原、亚细胞颗粒、病毒、Prion、类病毒、抗体、抗原、半抗原、脂类、脂肪酸、核酸、蛋白质、脂蛋白、多糖、脂多糖、糖蛋白、肽、多肽、细胞代谢产物、激素、药物、合成有机分子、有机金属分子、安神药、巴比妥酸、生物碱、甾类化合物、维生素、氨基酸、糖、非生物聚合物(优选可溶性)、外源凝集素、重组体或衍生蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或无机分子。在一个实施例中，试剂是一种电致化学发光部分，其与抗体、抗原、核酸、半抗原、短核苷酸顺序、寡聚体、配位体、酶、或生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、蛋白质A、蛋白质G，或它们的复合物，或通过蛋白质相互反应能与最初结合对象结合的其他次生结合对象。
分析物的类似物可以是天然的，也可以是合成的。一般说来，这类化合物的结合性能应与分析物相当，但也可以是具有较高或较低结合能力的化合物。能够与分析物或其类似物和/或其结合对象以及通过它们能与分析物连接的电致化学发光部分的反应组分，最好是次级抗体或蛋白，例如蛋白A或蛋白G，或抗生物素蛋白或生物素，或本领域已知的能参与结合反应的其他组分。
标记物
电致化学发光部分是金属螯合物，该螯合物的金属可以使用任何金属，例如在电化学条件下即施加在所讨论的反应系统上的电学条件下，能发光的金属螯合物。这类金属螯合物的金属，例如有过渡金属或稀土金属。所述金属优先使用钌、锇、铼、铱、铑、铂、铟、钯、钼、锝、铜、铬或钨，最好使用钌和锇。
与螯合物中的金属相连接的配位体通常为天然的杂环或有机化合物，它们在决定金属螯合物是否溶于水、有机溶剂或其他非水溶剂中起着重要作用。配位体可以是多齿化合物，并且可以被取代。有齿化合物配位体包括芳族和脂族配位体。适合的芳族多齿化合物配位体包括芳族杂环配位体。较佳的芳族杂环配位体都是含氮的，例如联吡啶，联吡唑、三联吡啶和菲酚。适宜的取代基包括烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧化物、甲醛、甲酰胺、氰基、氨基、羟基、亚胺基、羟羰基、氨基羰基、脒、胍盐、酰脲、含硫基、含磷基和N-羟基琥珀酰亚胺羧酸酯。螯合物可以含有一种或多种单齿化合物配位体，其中大量的配位体都是已知的。适宜的单齿化合物配位体包括一氧化碳、氰化物、异氰化物、囟化物和脂族、芳族和杂环的膦、胺、芪和胂。
适宜的螯合物可以包括：二〔(4，4′-甲酯基)-2，2′-联吡啶2-〔3-(4-甲基-2，2′-联吡啶-4-基)丙基〕-1，3-二氧戊环钌(II)；二(2，2′-联吡啶)〔4-(丁-1-醛)-4′-甲基-2，2′-联吡啶〕钌(II)；二(2，2′-联吡啶)〔4-(4′-甲基-2，2′-联吡啶-4′-基)-丁酸〕钌(II)；三(2，2′-联吡啶)钌(II)；(2，2′-联吡啶)〔二-二(1，2-二苯基膦基)乙烯〕2-〔3-(4-甲基-2，2′-联吡啶-4′-基)丙基〕-1，3-二氧戊环锇(II)；二(2，2′-联吡啶)〔4-(4′-甲基-2，2′-联吡啶)-丁胺〕钌(II)；二(2，2′-联吡啶)〔1-溴-4(4′-甲基-2，2′-联吡啶-4-基〕丁烷〕钌(II)；二(2，2′-联吡啶)马来酰亚胺基己酸，4-甲基-2，2′-联吡啶-4′-丁酰胺钌(II)。其他的电致光学发光部分可参阅PCT申请US87/00987和88/0394，这些文献也为本申请的参考文献。
电致化学发光部分的作用在于发射电磁辐射，从而将其导入电化学能反应系统。为此，它们必须能被激发成为受激能状态并且还能发射从受激态转变成的电磁辐射，例如光中的光子。并不希望受电致化学发光部分参与电致化学发光反应的机理理论分析的约束，我们认为通过将电化学能导入反应系统而氧化，然后通过与反应系统中的反应物相反应转化为受激态。这种状态相对来说并不稳定，而金属螯合物则迅速转化为较为稳定的状态。于是螯合物发出能被检测的电磁辐射，例如光中的光子。
本发明所用金属螯合物或其他含金属电致化学发光部分的量随着不同系统而改变。一般说来，该部分的用量能有效地使由上述组合物或系统中产生能检测到(需要时可进行定量测量)的电磁能的发射。一般说来，分析物的检测和/或定量测量是将含分析物和电致化学发光部分的样品的发光与用已知量的分析物和电致化学发光部分标定的发光进行对比得到的。这是进行均相测量。至于多相测量，则按如前所述，在进行电致化学发光分析前先进行分离后再测量。
本领域的专业人员可以理解，合金属电致化学发光部分的同一性和用量在不同系统中随具体条件而改变。本领域的专业人员按照本文提供的信息，无需过多的试验，即能根据经验确定获得所需结果的适宜含金属电致化学发光部分及其足够的用量。
颗粒
颗粒具有直径为0.001-200μm(例如0.05μm-200μm)的微颗粒物质，优选直径为0.1μm-100μm，尤以0.5μm-10μm为最佳，其表面组分能够与分析物和/或上述一种或多种其他物质相结合。微颗粒物质可以是交联淀粉、葡聚糖、纤维素、蛋白质、有机聚合物、苯乙烯共聚物，例如苯乙烯/丁二烯共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、丙烯酸乙烯乙酸酯共聚物或氯乙烯/丙烯酸共聚物，惰性无机颗粒，二氧化铬，铁、硅和硅混合物的氧化物，以及蛋白类物质，或它们的混合物。最好将颗粒悬浮在电致化学发光系统中。颗粒可以是或可以包括磁性感应颗粒。
测量介质
为了使由电极导入电化学能的系统能够运作，需要提供能浸入电极并含有电致化学发光部分的电介质。电介质通过离子携带电荷。一般说来，电介质呈液相，是由一种或多种盐或其他类物质与水、有机液体或有机液体混合物或水和一种或多种有机液体混合物组成的溶液。但是，在本发明的若干实施例中也可使用其他形式的电介质。例如电介质可以是一种或多种物质在流体(如液体、蒸汽或超临界流体)中的分散体，也可以是一种或多种物质在固体、蒸汽或超临界流体中的溶液。
适宜的电介质是盐的水溶液。盐可优选使用钠盐或钾盐，但在若干实施例中加入其他阳离子也是适宜的，只要该阳离子不影响电致化学发光反应的顺序。阴离子盐可以是磷酸盐，但在本发明的若干实施例中也可使用其他阴离子，只要所选用的阴离子不影响电致化学发光反应的顺序。
组合物也可是非水组合物。然而在若干实施例中可以使用超临界流体，更具体地说，可以使用含有有机液体的非水组合物的电介质。与水电介质一样，非水电介质也是由离子携带电荷。一般说来，这意味着盐溶解在有机液体介质中。适宜的有机液体有乙腈，二甲亚砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)，甲醇，乙醇，或上述两种或多种的混合物。需要说明的是使用可溶于有机溶体的四烷基铵盐(例如四氟硼酸四丁铵)，其与以上所述一起组成非水电介质。
在本发明的若干实施例中，电介质是一个缓冲系统，常用的磷酸盐缓冲液则是符合理想的。磷酸钠-氯化钠水溶液和磷酸钠-氟化钠水溶液则是这方面的例子。
其他的测量组分
如已公开的PCT申请US89/04859(发明名称：利用胺衍生的还原剂进行电致化学发光反应)所述，合乎需要的还原剂，一般说来为(较大分子的)胺或含胺部分，能够被氧化并且经自然分解后转化为高还原剂。该文也作为本文的参考文献。可以认为，胺或含胺部分还可通过将电化学能导入反应系统而被氧化。胺或含胺部分失去一个电子，然后脱质子化或进行重新排列，转化为强还原剂。该还原剂与经过氧化的含金属电致化学发光部分反应，使其成为如上所述的受激态。为此，胺或含胺部分最好具有碳原子中心的残基，在形成还原剂的脱质子化过程中，其含有一个由该碳原子供给的电子和能够起质子供体作用的α-碳原子。胺衍生的还原剂提供了将含金属电致化学发光部分转化为其受激态所需的激发源，由此发射出可检测到的电磁辐射。
许多胺或相应的含胺部分均可用于实施本发明。一般说来，胺或含胺部分的选择应适合于进行电致化学发光分析的系统的pH值。另一个有关的因素是胺或含胺部分应与进行分析时必须产生的作用的环境相适应，即与可能的水或非水环境相适应。需要考虑的另一个因素则是胺或含胺部分的选择应该在具体的条件下形成的胺衍生的还原剂，其足以在该系统中还原经过氧化的含金属电致化学发光部分。
用于本发明的胺(及由其衍生的相应部分)是脂族胺和取代的脂族胺，例如伯烷基胺、仲烷基胺和叔烷基烷，其中烷基各含有1-3个碳原子。相比而言，三丙胺是特别优选的胺，因其能发射特别高强度的电磁辐射，如在若干实施例中所示，能提高检测和定量测量的灵敏度和精确度。适用的还有二胺(如肼)和聚胺(如聚乙烯亚胺)。适合于实施本发明的其他胺的例子有：三乙醇胺、三乙胺、1，4-二氮二环(2.2.2)-辛烷、1-哌啶乙醇、1，4-哌嗪-二(乙烷磺酸)、三异丙胺和聚乙烯亚胺。
一般地说，用于本发明的含金属电致化学发光部分是限制反应的组分。因此，更具体地说，提供的胺或含胺部分应该过量的化学量。使用胺或胺部分的浓度为50-150mM，为了能在pH7左右时使用，浓度为100mM常常是有利的。在若干实施例中，胺或含胺部分的上限浓度由胺或含胺部分在使用环境中(例如在水中)的最大溶解度决定。一般说来，胺和含胺部分的用量应足以使经过氧化的含金属电致化学发光部分转化为其受激态，从而产生发光。本领域的专业人员根据自己的经验，按照本文提供的信息，无需过多的试验，就能决定在具体分析系统中胺或含胺部分的用量。
如题为增加电致化学发光反应的PCT申请US89/04915所述(该文的内容作为本申请的参考文献)，本发明的测量最好在促进剂存在下进行，具体地说为下式的化合物：
Figure A0213202600201
式中R表示氢或CnH2n+1，R′表示CnH2n，X表示0-70，n表示1-20，其中n最好为1-4。举例来说，可通过商业途径得到的商品名为Triton X-100的下式化合物(式中X表示9-10)：
Figure A0213202600202
和商品名为Triton N-401(NPE-40)的下式化合物(式中X表示40)：
一般说来，促进剂的用量应足以使发射的电磁辐射增加到合乎需要。具体地说，用量为0.01％-5.0％，更具体地为0.1％-1.0％(V/V)。
用于本发明的电致化学发光部分通过将其激发为受激态而诱导发射出电磁辐射，这是通过作用于该系统完成的，在该系统中电致化学发光部分与电化学能相结合。能够发生电致化学发光部分和形成强还原剂的化合物的氧化作用的可能性取决于它们精确的化学结构以及诸如系统的pH值和用于导入电化学能的电极的性质等因素。本领域的专业人员都知道，如何确定最佳可能性和电致化学发光系统的发射波长。在已公开的PCT专利申请US89/01814中，公开了激发电致化学发光系统的若干较佳方法，其内容作为本文的参考。
测量电致化学发光的装置
实施本发明测量的装置示于图1和图2。图1公开了优选的电致化学发光装置，但本发明方法并不限于装置10的应用，而可使用其他类型电致化学发光装置，该装置应包括工作电极或其他触发表面，使提供的电化学能将电致化学发光部分触发为电致化学发光。当本发明的方法以静态方式或流动方式实施时，装置10包括流通室，其为许多种样品(包括结合测量样品)提供了显著的优点。实施本发明电致化学发光测量的装置详细情况已在PCT申请的US89/04854和US90/01370中公开。
装置10包括电化学室12，光检测测量装置14(可以是一个光电倍增管)，光电二极管，电荷耦合装置，照相感光片或乳剂等类似物和泵16(可以是一个蠕动泵)，其通过并由室12输送液体。另外，也可使用正位移泵。在室12和光电倍增管14之间配置一个开闭机制18，仅在电致化学发光测量时光电倍增管14受到室12作用情况下控制开启操作。开闭机制可以关闭(例如运转时)。装置10还可包括防光室(图1中未标出)，其由各种组件组成，在进行电致化学发光测量时，使光电倍增管14不受任何外来光的影响。
室12本身还包括第一组装块20，进料管22和排料管24贯穿该组装块，最好由不锈钢构成。组装块20具有第一外表面26和第二内表面28，以限定室12保持样品的容积30的一侧。在装置10进行运转时，室12可以净化和/或检查和/或测量溶液。进料管和排料管22，24由外表面26向内表面28穿过组装块20，并且通向样品室30。由不锈钢制成的第二组装块32也具有第一外表面34和第二内表面36。第二组装块32由一个特氟隆或其他非可污染的材料制成的环隙38与第一组装块20隔开。因此，组装块32的外表面34限定样品室30另一侧的部分。环隙38具有外围部分40和中心孔42，其内缘44限定样品室30的侧壁。外围部分40将第一组装块20的内表面28与第二组装块32的外表面34隔开，以防止溶液由两表面28和34之间的样品室30中流出。组装块32还具有中心孔46，其中观测窗48被密封，以限定样品室30另一侧的剩余部分(即外表面34的继续部分)。构成观测窗48的材料应在由电致化学发光部分发射的电致化学发光的光波长处基本呈透明状。因此，观测窗48应由玻璃、塑料、石英等材料制成。
进料管22在邻近环隙38的样品室30的一端50与样品室30相交，排料管24在邻近环隙38的样品室30的另一端52与样品室30相交。因此，进料管22、样品室30和排料管24的结合构成了溶液的狭窄的基本上为层流的连续流路，溶液流向、流经室12并可由室12流出。箭号A和B分别表示进料管22和排料管24的流入和流出。
在一个实施例中，工作电极系统54配置在第一组装块20的内表面28，其包括第一和第二工作电极56和58。在另一个实施例中，可以配置一个工作电极，或仅以电极56作为工作电极。在工作电极56，58上进行电化学和电致化学发光反应。工作电极56，58是固体的伏安电极，因此可由铂、金、碳或符合要求的其他材料制成。分别与工作电极56，58连接的接线管60，62穿过第一组装块20。
接线管60，62与电压控制器66的第一“工作电极”末端64连接(示于图2)。因此，电压控制器66按电压稳压器的方式运作，将电压信号供给工作电极56，58，并在测量电致化学发光时可根据需要测量由其流出的电流。此外，接线管60，62可以各自与电压控制器66的末端连接，进行各自的运作。
电压控制器66的电压稳压器的运作还可通过反向电极68和参考电极70产生有效作用。在一个实施例中，组装块32由不锈钢制成，反向电极68在组装块32的暴露面72，74。反向电极72，74和工作电极56，58构成的连接面，将电压施加在样品室30内的溶液上，把能量供给化学反应，激发样品中的电致化学发光和/或提供能量用于净化和检查室12的表面。反向电极72，74通过接线管76与电压控制器66的另一“反向电极”末端78连接。
参考电极70提供参考电压，由工作电极56，58施加的电压是由其产生的，例如+1.2V对参考电压。参考电极70配置在排料管24距室12的位置80上，并通过接线管82与电压控制器66的第三“参考电极”末端84连接。在三个电极工作的情况下，电流可以不通过参考电极70流动。参考电极70可用于三个电极的运作，以提供均衡、已知和稳定的电压，因此其由银/氯化银(Ag/AgCl)制成或是一个饱和甘汞电极。仅用两个电极运作，即用工作电极56和作为反向/参考电极的电极58也可以使电压控制器66运作。以这两个电极运作时，反向/参考电极58与电压控制器66上的电压控制器末端78，84进行电连接。在这种情况下，电压控制器66基本上作为一个电池在工作。电压控制器66将电压信号供给工作电极56和反向电极58，并且可根据需要测量通过各自电极流动的电流。参考电极70也可以是一个由铂、金、不锈钢或其他材料制成的所谓“准参考”电极，其提供稳定性较差的电压，但就溶液而言可以测量。使用两个和三个电极工作时，参考电极70或58可以为测量施加于工作电极56上的电压时提供参考。稳定的电压参考现被认为颇为有利。电压控制器66以其电压稳压器运作时，通过根据参考电极70在工作电极56，58上提供的已知电压，控制各种不同的电极，同时测量工作电极56，58和反向电极72，74之间的电流。用于此目的的电压稳压器都是已知的，电压控制器66的内部结构可以相当于任何常规的通过商业途径可以得到的具有上述功能的电压稳压器，因此其本身并不构成本发明的一部分。装置10的结构也可不包括内电压控制器66，并且可以适合于与外电压稳压器连接，从而可以分别控制，将所要求的电压信号提供给电极56，58，72，74和70。这些电压信号(见如下所述，以一定方式使用)为工作电极56，58的表面和室12的表面提供可重复的初始条件，从整体来说这个特征可以显著提高电致化学发光测量的精度。
泵16配置在排料管24的位置上，将样品溶液沿箭号方向A吸入到进料管22中。溶液流经进料管22、样品室30和排料管24，再经参考电极70，沿箭号方向B排出。此外，泵16也可以配置在进料管22上，使溶液流经装置10。流经室12的所有溶液和流体都使用相同的流路，即流过进料管22、样品室30和排料管24，从而使由室12流出的流体都能经流体动力学的静化处理。泵16可以控制运作，使在任何时间内都能保持溶液于室12中。
装置10的流向结构使工作电极能够接受可变电压或保持原先的运作电压，同时使一种或多种溶液连续得到处理，又不使工作电极56，58(或反向和参考电极72，74，70)受空气的影响。受空气影响则会使电路受到参考电极70的干扰，从而使电压发生未知的任意的变化，破坏工作电极56，58表面条件的再现性。流向结构使进行净化和监测电极系统54的起始步骤和测量一种或多种形式的波的测量步骤之间迅速得到改变，或可加速激发电致化学发光。
图23和图24表示装有磁体系统的室和磁体27/37，该磁体系统产生的磁场线与电极表面56、58大致平行。磁体系统由各永久磁体或电磁体层叠和定向排列复合而成，使磁体27/37的南北极交错层叠。磁体系统27/37的各个磁体由空气或任何非磁性感应材料隔开。按图23图24的排列可使磁力线作用于与电极面几乎呈水平的工作电极上部的区域。这将使位于电极表面的磁性感应颗粒按一定方向排列并且很容易利用由电极供给的电化学能(参阅图20)。
图23和图24中的磁体系统27/37的优点还在于磁场线从磁体结构中并没伸出很长一段距离(参阅图20)，因而由此磁体系统产生的磁场不可能诱导电极装置附近永久磁体和铁磁材料，并且不会严重影响液流室装置附近光电倍增管的运作。图25中的装置如同图1和图2，并可参阅以上对图1和图2的介绍，但图25中的装置垂直配置在水平向电极56下面，或电极56、58如图23和图24一样，是南北向的复合磁体系统27/37。
本发明还涉及试剂组合物。广义地说，该试剂组合物可以是本发明测量系统中的任何一种组成部分，即(a)电介质，(6)含有电致化学发光部分的标记化合物，(c)颗粒，包括磁性感应颗粒，(d)分析物或其类似物，(e)分析物或其类似物的结合对象，(f)能与(d)或(e)反应的反应组分，(g)还原剂，或(h)电致化学发光反应的促进剂。试剂可以与另一种常用试剂相结合，即可制备二种组分、三种组分和更多种组分的混合物，只要这些组分在贮藏期间不与其他组分相反应，以致在所需测量中损害它们的作用。试剂最好是含有颗粒和一种或多种其他组分的二种组分或多种组分的混合物。
本发明还涉及药盒，其可包括含有上述(a)至(h)之一种或多种组分的容器，或该药盒可包括含上述组分的混合物之一种或多种试剂组合物的容器，所有这些组分均可用于本发明的测量方法和测量系统。
本发明优选实施例的介绍
在进行本发明的颗粒测量时，可以使用各种颗粒，一般说来颗粒密度为1.0-5.0g/mL，优选密度为1.1-2g/mL。最佳密度的选择属于本领域专业人员的工作范围，重力测量的沉淀速率可在测量速度和需要在电极表面上获得均匀层的复合物之间进行适当选择。
各种平均直径的颗粒都可使用，可以使用平均直径为0.001-200μm(如0.05-200μm)的颗粒，优选平均直径为0.01-10μm的颗粒。
在测量组合物中还可使用各种浓度的颗粒，例如可以使用1-10000μg/mL的浓度范围，优选5-1000μg/mL的浓度范围。颗粒的密度、粒径和浓度的选择最好能使颗粒沉淀的速率至少达到0.5mm/分钟，优选更快的速率。
采用过滤方法实施本发明时，过滤装置的理想孔径应能测出0.01至90％的平均直径的颗粒，尤以10至90％的平均直径为佳。
已有技术已经介绍了大量磁性颗粒，这些颗粒可以用于本发明的测量。例如，美国专利4628037，4695392，4695393，4698302，4554088，英国专利2005019A和欧洲专利0180384(均为本申请的参考文献)介绍了能够成功地使用的各种磁性颗粒。颗粒可以是顺磁颗粒，也可以是铁磁颗粒，并且可以包覆能够与结合化合物结合的各种材料，使磁性颗粒能够用于免疫测量。用于本发明的磁性颗粒最好具有至少0.001cgs单位的磁化率，优选磁化率至少为0.01cgs单位。磁性颗粒的密度可以具有很宽范围，基本上低于水的密度，即0.01-5g/mL，优选密度为0.5-2g/mL。粒径可以为0.001-200μm，例如0.001-100或0.05-200μm，优选范围为0.01-10μm。颗粒浓度的范围也很宽，可以是1-10000μg/mL，优选范围为5-1000μg/mL。
正如欧洲专利0180384所述，所用磁性颗粒最好为低磁性共振，使从电极表面移去磁场后，将颗粒去磁，并能净化测量室。磁性颗粒的密度、浓度和粒径的选择应使沉淀时间至少达到0.5mm/分钟，最好在该速率以上。在磁室运作时，为了不干扰光电倍增管的运作，在诱导电致化学发光前，先从磁极表面除去磁体装置。
测量
本发明方法可用于各种测量。
按图3所示进行的一种测量。由反应生成的PCR产物用生物素和ECL标记物(tris(2，2′-联吡啶)RuII，Ru(bpy)3 2+)进行标记。用生物素(抗生蛋白链菌素)的结合方法，使抗生蛋白链菌素珠粒俘获双功能DNA，接着进行洗涤，然后将结合产物的珠粒进行检测ECL标记物的分析。
按图4所示进行的一种测量。在抗生蛋白链菌素珠粒上俘获含生物素的PCR产物，并且除去不含生物素的链。然后将结合PCR产物的珠粒与ECL标记的(Ru(bpy)3 2+)寡核苷酸杂交，接着进行ECL分析，检测标记物。
按图5所示进行的一种测量。在抗生蛋白链菌素珠粒上俘获杂交物，然后无需洗涤进行ECL分析。
按图6所示进行的一种测量和得到的结果。该测量是用由对病毒型和对各病毒型具有特异性的寡核苷酸呈正反应的SiHa和HeLa细胞系分离得到的DNA样品检测是否存在HPV16和18。引物2PV16和2PV18含有生物素，而引物3PV16和3PV18则系ECL标记的寡核苷酸。2/3PV16和2/3PV18寡核苷酸分别对HPV16和18具有特异性。用图1所示分析仪分析生成的珠粒俘获的ECL标记物中的ECL。结果用图示表示各样品引物组合的ECL量。
按图7所示进行的一种测量和得到的结果。用图1所示分析仪，对生成的珠粒结合ECL标记物分析ECL。根据HPV16 DNA浓度的增高(病毒拷贝与总细胞DNA拷贝之比)用图示表示ECL光子的峰值。用于分析HPV16的引物是1PV16(生物素标记物)和2PV16(ECL标记物)。用小牛胸腺DNA使用于各个PCR的DNA保持在1μg不变。
按图8所示进行的一种测量和得到的结果。用带未标记的HRP1的含生物素HRP2(探针1T24和1CHR)和带未标记的HRP2的含生物素HRP1(探针2T24和2CHR)进行PCR测量，产生用于杂交的珠粒结合的单链的靶。DNA样品是正常的(胎盘)Ha-ras基因和突变的(NIH3T3-T24)Ha-ras基因。然后用TEMAC洗涤珠粒结合DNA与ECL标记1T24(1T24)、ECL标记2T24(2T24)、ECL标记1CHR(1CHR)和ECL标记2CHR(2CHR)的杂交，用图1所示分析仪，对生成的珠粒结合ECL标记物分析ECL。结果用图示表示各样品探针组合的ECL量。
按图9所示进行的一种测量和得到的结果。用仅带未标记HRP1的含生物素HRP2(探针1T24和1CHR)按图8所示进行PCR测量。所用的探针是含32P的1T24和1CHR(1T24-P，1CHR-P)作为对照。用含32P和ECL标记物的1T24和1CHR测定ECL标记物的效果。按前所述，用TEMAC洗涤样品。在闪烁计数器中加入闪烁合剂，分析生成的珠粒结合的32P。结果用图示表示各样品探针组合的每秒32P数。
按图10所示进行的一种测量和得到的结果。根据图4所述进行测量。所用样品是胎盘DNA，并用带未标记HRP1的含生物素的HRP2(探针1T24和1CHR)进行扩增。从生成的PCR产物中采样，得到一组含有不同量的产物的样品，将这些样品组与用32P标记的探针(1T23-P32和1CHR-P32)或与ECL标记物(1T24-ECL和1CHR-ECL)杂交，然后再用90μl样品的各个标记物的平均峰值将所得各结果标准化，这些标准化图可以使信号与本底和两种方法的对比反应作更有效的对比。插图以稀释曲线的较低量说明其反应。样品按上述方法处理(图6和图8)。
按图11进行的一种测量和得到的结果。用含生物素的2PV18和未标记的1PV18、HeLa DNA(每个细胞400个拷贝数)以图3所述的PCR进行PCR测量。然后将生成的PCR反应物与特异性探针ECL标记3PV18杂交。将杂交混合物加到抗生蛋白包衣的珠粒上，用图1所述ECL分析仪对生成的珠粒结合ECL标记物直接进行ECL分析。结果用图示表示ECL量与加到PCR的HPV18拷贝数之间的相互关系。
以下是非限制性实施例，这些实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，显然可以作出各种改变。
实施例：仪器，材料和方法
(1)仪器
如图1和2所示的流向装置，使用三个电极。
工作电极：Au片，直径3mm
反向电极：Au片，直径3mm
参考电极：Ag/AgCl
特氟隆垫片：3.81mm(0.15″)厚
有机玻璃面板
进料管：1.0668mm(0.042″)，聚丙烯
抽气速率：0.01-5mL/分钟(可变)
电压稳压器：用Hamamatsu R374 PMT(低增益红敏光电管)的微处
            理机控制的发光计；PMT的可变电压为0-1400伏
(2)材料
(a)电致化学发光标记物：Ru(bpy)3 2+
(b)电致化学发光缓冲液：112mM KH2PO4，88mM K2HPO4·3H2O，
                       50μM NaCl，6.5mM NaN3，0.8μM
                       Triton X-100，0.4mM Tween20，100mM
                       三丙胺的水溶液
(c)电致化学发光稀释剂：37.5mM KH2PO4，109.2mM K2HPO4·3H2O，
                       151.7mM NaCl，0.65mM NaN3，0.43mM
                       牛血清清蛋白的水溶液
(d)Ru(bpy)3 2+-NHS：Ru(2，2′-联吡啶基)(4-〔3-(1，3-二氧戊
                   环-2-基)丙基〕-4′-甲基-2，2′-联吡啶)2+
(e)Dynal颗粒
(i)Dynal M-450 Dynabeads，4.5μm直径的超顺磁颗粒，30mg/mL
由Dynal(45 North Station Plaza，Great Neck，NY11021)提供
(ii)Dynal M-280 Dynabeads，2.8μM直径的超顺磁颗粒，10mg/mL由Dynal(45 North Station Plaza，Great Neck，NY11021)提供
(3)电致化学发光周期(三电极室运作)
电致化学发光周期由三个步骤组成：(1)预处理，(2)测量，和(3)净化。预处理步骤包括将电压三角波以每秒2.0V的速率由0.0V-+2.2V变为-1.0V-+0.6V。测量步骤包括以每秒1.0V将三角波由+0.6V-+2.8V变为+2.0V。净化步骤包括将电压方波由+0.0V-+3.0V变为-0.5V-0.0V。所有电压都以Ag/AgCl参考电极作基准。
实施例1：重力收集微颗粒的装置和方法
在图12所示室内进行测量，图12介绍了采用重力进行测量的装置，该装置包括透明窗48，垫片222，沉积室20(包括进料口22，工作电极56/58，反向电极72/74和排料口24)。沉积室呈水平面，即垂直于地球重力场的方向，通过蠕动泵将ECL缓冲液中的标记微颗粒(Dynal)输送到沉积室，在颗粒送至该室后，将泵关闭，室内的微颗粒沉落在工作电极表面上，微颗粒的沉落约以0.5mm/min速率沉落10mm(如图13所示)。颗粒沉落的量与沉落时间和速率成函数关系，ECL强度与沉落在工作电极上颗粒的量成正比。落至表面的颗粒的量以及由此产生的ECL强度均受液体样品对工作电极高度的限制。图14以沉积时间的函数表示2个不同垫片厚度(0.381和1.905mm[0.015和0.075英寸])的室的ECL强度，2个室的微颗粒沉积速率相似，但是垫片较厚的室的最大读数为垫片较薄的室的5倍。2个室的AFP(α-胎儿蛋白)测量的结果示于图15，另外垫片较厚的室产生5倍的ECL信号强度。
实施例2：沉淀微颗粒的电致化学发光装置和方法
用沉积室进行磁性收集
用图16的磁力沉积微颗粒进行测量的沉积室。图16中的标号48表示透明窗，122表示垫片，22表示沉积室中的进料口，56、58表示工作电极，24表示样品排料口，20表示沉积室本身，27表示电磁体。
沉积室的平面呈水平方向，用蠕动泵将电致化学发光缓冲液中的标记微颗粒(Dynal)输送到沉积室，在微颗粒被输送到沉积室后将泵关闭。用电磁体27产生的磁场将沉积室中的微颗粒输送到工作电极，电磁体的运作可用12V和1.5A。由于采用了电磁体，微颗粒的沉积速率远远超过只用重力作用进行颗粒沉积的速率(如图17所示)。
实施例3：沉积微颗粒的电致化学发光装置和方法
用收集室进行磁性收集
测量是在如图18所述收集室中进行。图18中的标号48表示透明窗，132表示垫片，22表示收集室中的进料口，56、58表示工作电极，20表示收集室本身，24表示样品排料口，37表示永久磁体。
收集室的平面沿水平方向取向，用蠕动泵将电致化学发光缓冲液中的标记微颗粒(Dynal)输送到电化学室，在导入样品前，先将永久磁体37以0.889mm(0.035英寸)的间隔直接固定在工作电极/溶液界面之下。当样品输送到电化学室时，微颗粒沉积在工作电极上由磁体面积限定的表面上。在全部样品沉积后，将泵关闭，除去磁场。收集时间越长，沉积的颗粒越多。随着工作电极上颗粒浓度的提高，导致电致化学发光的强度增高(如图19所示)。
实施例4：使用磁体沉积微颗粒
磁场取向
如图20所示电场98和98′，被吸引在磁体27/37上(不论其是永久磁体还是电磁体)上的微颗粒96、96′与磁场98、98′的方向相一致，生成的颗粒排列96和96′与工作电极56/58的表面相平行(A)和垂直于(B)，且在该表面的附近。
实施例5：过滤收集和富集颗粒
磁性感应、非磁性感应和密度范围很宽的微颗粒可通过膜滤器表面的过滤进行收集。在本发明的一个实施例中，用泵将颗粒泵送经过滤膜，该过滤膜的孔径小于颗粒的直径，最好显著小于颗粒的直径，并且具有足够高的表面密度，使颗粒收集不致堵塞膜孔。膜滤器最好具有很高的透明度，在收集颗粒后使膜滤器能够置于工作电极的表面，诱发颗粒产生电致化学发光和测量发光，从而定量测出颗粒上的ECL标记物。
在另一个实施例中，具有上述孔径的膜滤器附加或配置在吸附材料的表面上，使毛细作用将含微颗粒的液体自然流经膜滤器，不需要使液体流经滤器的任何装置。
在一个较佳实施例中，用金属薄膜或其他导电材料包覆具有上述孔径的膜滤器，使膜表面能够用作ECL装置中的工作电极。采用微电子装置制作中的常规方法(例如热蒸发或喷涂方法)，很容易将导电薄膜涂于膜上。这种过滤电极很容易装配在液流室中，使液体的流径通过过滤电极。液流中的颗粒通过过滤电极被俘获，并且很容易就地洗涤，从而为进行多相测量提供快速简便的方法，不需要任何外加的洗涤装置。
实施例6：采用离心方法收集和富集颗粒
图21所示旋转液流室提供了在工作电极表面上俘获复合物进行发光测量的另一个方法。测量溶液通过进料口261进入装置，经转动密封圈263泵入室262内，旋转运动沿箭号R所指方向进入室内。复合物的较密颗粒富集在工作电极264的表面上。在室继续旋转的同时，溶液经排料口268流出该室。流经室透明窗的输出光通过光电倍增管265进行测量。输出光由垂直配置的工作电极表面264反射到位于室中央的曲面镜表面266，图中还给出了反向电极269。然后冲洗和清洁该室，以便用于下一个循环。此项操作可在停止或转动室时进行。图21给出了本发明俘获颗粒的离心方法和装置以及本发明的离心液流室。
实施例7：用中等表面浓度的标记非特异性蛋白包覆颗粒
用150mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)通过磁力分离方法，洗涤30mg(1ml)的4.5μm未包覆的磁性感应聚苯乙烯M-450DYNABEADS(DYNAL，Oslo，Norway)，每次洗涤用2ml溶液。将150μg Ru(bpy)3 2+标记鼠IgG(Jackson Immunochemicals)的磷酸缓冲盐水(PBS，1ml)和0.05％乙基汞硫代水杨酸钠加到颗粒中，该混合物可在室温下旋转温育过夜，然后从颗粒中磁力分离出溶液并将其除去。为了封阻未反应部位，将1ml3％BSA/PBS和0.05％叠氮化钠加到颗粒中，生成的溶液可在室温下温育2小时，洗涤颗粒5次，每次2ml，然后悬浮在6ml相同的缓冲液中，贮藏备用。
实施例8：用磁性感应颗粒测量电致化学发光
用实施例7所述的标记蛋白包覆均匀的和不均匀的、聚合的和非聚合的磁性感应颗粒(Dynal，Oslo，Norway；Polysciences，Warrington，PA18976；Cortex Biochem，San Leandro，CA94577；Aldrich，Milwaukee，WI53201)。经过包覆的颗粒用电致化学发光缓冲液洗涤3次，然后制备2ml的300μg/ml悬浮液。用蠕动泵将500μl的颗粒悬浮液输送到液流室(实施例3)。当颗粒流向工作电极时，由于磁体作用被吸引和富集在工作电极表面上。用配置在液流室(颗粒集中在工作电极表面)上部中心的Hamamatsu R374光电倍增管测量磁性颗粒的电致化学发光。表I给出了由标记蛋白包覆的磁性感应颗粒得到的电致化学发光的光发射量。
    表I：不同磁性感应颗粒的电致化学发光测量
 颗粒种类  直径(μm)  密度(g/ml)    原料    电致化学发光量
  玻璃        8.0         2.4     钠钙玻璃       2200
              2.0         2.4     钠钙玻璃       8500
  石英      0.3-3.5       2.5       SiO2        1150
  金        1.0-2.0       19.3       Au          1100
实施例9：用非磁性颗粒测量电致化学发光
用实施例7所述的标记蛋白包覆均匀的和不均匀的、聚合的和非聚合的非磁性感应颗粒(Aldrich，Milwaukee，WI53201 Duke Scientific，Palo Alto，CA94303)。经过包覆的颗粒用电致化学发光缓冲液洗涤3次，然后制备2ml的300μg/ml悬浮液。用蠕动泵将500μl的颗粒悬浮液输送到液流室。包覆的颗粒按实施例1所述重力作用富集在工作电极上。用配置在液流室(颗粒集中在工作电极表面)上部中心的Hamamatsu R374光电倍增管测量非磁性颗粒的电致化学发光。表II给出了包覆的非磁性颗粒得到的电致化学发光的光发射量。
    表II：由重力收集得到的非磁性感应颗粒测量电致化学发光
  颗粒种类      直径    颗粒密度    原料            电致化学
           (μm)     (g/ml)                      发光量Rhone-Poulenc   4.0       1.5   聚苯乙烯二乙烯基苯    1680
                            /Fe3O4
           1.5-2.1    1.4   聚苯乙烯/Fe3O4      462Polysciences   1.5-2.1    2.1   聚苯乙烯/FeO2        504Dynal          4.5        1.5   聚苯乙烯/Fe2O3      4200Cortex         1.0-10     1.3   纤维素/Fe3O4        125
           1.0-10     1.8   聚丙烯醛/Fe3O4      125
           1.0-25     1.2   聚丙烯酰胺/Fe3O4W   125
                            /活性炭镍           3.0        8.9   Ni                     125
实施例10：物理吸附的羊抗促甲状腺激素(TSH)包覆的Dynal颗粒的制备(试剂I)
用150mM碳酸钠/碳酸氢钠溶液(pH9.6)通过磁力分离洗涤1ml4.5μm未包覆的表面上具有-OH残基的磁性聚苯乙烯颗粒(DYNAL，DYNABEADS M-450，DYNAL A.S.Oslo，Norway)，每次用2ml洗涤。将0.5mg亲和纯化的羊抗TSH，HCG纯净的抗体(CIBA)的碳酸钠/碳酸氢钠溶液(1ml)加到颗粒中。该混合物在室温下温育过夜，然后将溶液与颗粒通过磁力进行分离，并除去溶液。加入1ml 3％BSA/PBSW/0.05％重叠氮钠，在室温下搅拌温育2小时，封阻未反应部位。将颗粒洗涤5次(每次用2ml)，然后悬浮在1ml相同的缓冲液中，贮藏备用。该试剂I的最终浓度为3％(重量)。
实施例11：乌本箭毒苷-BSA结合物的制备(试剂II)
乌本箭毒苷的活化
将60.4mg乌本箭毒苷八水合物(Aldrich Cat#14，193-3)的去离子水(6ml)(薄膜包装)溶液与87mg偏过碘酸钠(Mallinckrodt Cat#1139)混合，该混合物在室温下转动温育2小时。反应混合物通过装有去离子水的Dowex1×8-50离子交换树脂(Aldrich Cat#21，740-9)终止反应。加入200μl 1M磷酸钠(pH7.2)，将溶液的pH调至7.0。
活化的乌本箭毒苷与BSA结合
将50mg活化乌本箭毒苷(4.6ml)滴加到108mg牛血清清蛋白(BSA)(Miles Fraction V)的PBS(5ml，0.15M，pH7.8)溶液中，乌本箭毒苷与BSA的比为40∶1。反应物在室温下温育2小时。在混合的同时迅速加入30mg氰基硼氢钠。游离的乌本箭毒苷和过量的氰基硼氢钠通过在4℃下于pH7.8的重叠氮钠(0.15M PBSW/0.05％)中透析除去。乌本箭毒苷-BSA结合试剂II贮藏在4℃。
实施例12：物理吸附的乌本箭毒苷-BSA包覆的Dynal颗粒的制备(试剂III)
用150mM碳酸钠/碳酸氢钠溶液(pH9.6)通过磁力分离洗涤5mg4.5μm未包覆的表面具有-OH残基的磁性聚苯乙烯颗粒(DYNAL，DYNABEADS M-450，DYNAL A.S.Oslo，Norway)，每次洗涤用10ml。将3mg乌本箭毒苷-BSA结合物(结合试剂II)的碳酸钠/碳酸氢钠溶液(5ml)加到颗粒中。该混合物在室温下转动温育过夜，溶液经磁力与颗粒分离后除去。加入5ml 3％BSA/PBS W/0.05％重叠氮钠，在室温下温育2小时，旋转至封阻未反应部分。颗粒洗涤5次(每次用10ml)，最后悬浮在1ml相同的缓冲液中，贮藏备用。试剂III的最终浓度为3％(重量)。
实施例13：Ru(bpy)3 2+)标记的鼠抗地高辛的制备(试剂IV)用Ru(bpy)3 2+标记1mg鼠抗地高辛(Cambridge MedicalTechnologies Cat#200-014 Lot A3575)，用Centricon 30微浓缩器(Amicon)将单克隆抗体(抗地高辛抗体)缓冲交换到0.15M磷酸钾缓冲液中(0.15M NaCl，pH7.8)，最终容积为0.5ml。用125μl无水二甲亚砜(Aldrich)溶解0.5mg Ru(bpy)3 2+ -NHS后即可使用。将0.18mg Ru(bpy)3 2+-NHS(45μl)振动加入到蛋白溶液，可得到以分子量计分别为1057和150000的25∶1摩尔比的Ru(bpy)3 2+：蛋白。在室温和黑暗下，反应管振动温育30分钟。加入25μl 1M甘氨酸使反应终止，再温育10分钟。反应混合物通过Sephadex G-25柱(1×20cm的0.15M磷酸钾，0.15MNaCl和0.05％重叠氮钠，pH7.2)纯化。收集和沉淀Ru(bpy)3 2+标记的鼠抗地高辛部分，标记蛋白(试剂IV)经测定，每蛋白分子具有12个标记物。
实施例14：Ru(bpy)3 2+标记的鼠抗促甲状腺激素(TSH)的制备(试剂V)
用Ru(bpy)3 2+标记0.5mg鼠抗TSH(CIBA)，再用Centricon 30微浓缩器(Amicon)将抗TSH抗体缓冲交换到0.15M磷酸钾缓冲液、0.15M NaCl(pH7.8)中，最终容积为0.35ml。将0.5mg Ru(bpy)3 2+-NHS溶解到75μl无水二甲亚砜(Aldrich)后即可使用。将0.176mg Ru(bpy)3 2+-NHS(26.4μl)振动加到蛋白溶液中，即可得到以分子量计分别为1057和150000的50∶1摩尔比的Ru(bpy)3 2+标记物：蛋白。在室温和黑暗下，反应管振动温育30分钟。加入25μl 1M甘氨酸使反应终止，再温育10分钟。反应混合物经过Sephadex G-25柱(1×20cm，0.15M磷酸钾、0.15M NaCl和0.05％重叠氮钠，pH7.2)纯化，收集和沉淀Ru(bpy)3 2+标记的鼠抗TSH部分。测定标记的蛋白(试剂V)，每蛋白分子具有14个标记物。
实施例15：促甲状腺激素(TSH)的一步分离夹层测定
将100μl标定血清(London Diagnostics TSH Lumi TAG Kit)、25μl Ru(bpy)3 2+标记的鼠抗TSH(试剂V)的ECL缓冲溶液和25μl羊抗TSH-DYNAL颗粒(试剂I)的ECL缓冲溶液合并后，在室温下置于聚丙烯管中温育15分钟混合，通过磁力分离洗涤颗粒，再将颗粒悬浮到500μl的ECL缓冲液中，该洗涤步骤再重复2次。最后将颗粒悬浮在1ml的ECL缓冲液中，按实施例3所述方法读得各个样品的电致化学发光。电致化学发光量与样品中分析物的浓度成正比(电致化学发光量与分析物的浓度成正比增加)。表III给出了测量曲线的值。
          表III：一步分离夹层测量：检测TSH
       TSH浓度               电致化学发光量
      (μIU/ml)                (双份样品)
      0.00                  1918         1885
      0.05                  2584         2530
      0.10                  3365         3288
      0.50                  8733         8652
      2.50                  35688        35347
      10.0                  125316       136994
      25.0                  300248       288272
      50.0                  549034       564948
实施例16：促甲状腺激素(TSH)的一步不分离夹层测定
将100μl标定血清(London Diagnostics TSH Lumi TAG Kit)、25μl Ru(bpy)3 2+标记的鼠抗TSH(试剂V)的ECL缓冲溶液和25μl羊抗TSH-DYNAL颗粒(试剂I)的ECL缓冲溶液合并后，在室温下置于聚丙烯管中温育15分钟混合，在得出结果之前，先加入1ml ECL缓冲液，然后按实施例3所述，读得各个样品的电致化学发光数。电致化学发光量与样品中分析物的浓度成正比(电致化学发光量与分析物的浓度成正比增加)。表IV给出了测量曲线的值。
        表IV：一步不分离夹层测量：检测TSH
     TSH浓度              电致化学发光量
    (μIU/ml)               (双份样品)
      0.00              2610           2769
      0.05              2870           2894
      0.10              2970           2950
      0.50              3473           3403
      2.50              5588           5495
      10.0              13051          13139
      25.0              26468          27306
      50.0              47104          48664
实施例17：地高辛的两步分离对比测定
将50μl标定血清(TDx Assay，Abbott Labs，Chicago，IL)和25μlRu(bpy)3 2+标记的鼠抗地高辛(试剂IV)的ECL缓冲溶液合并后，在室温下温育20分钟混合，加入25μl乌本箭毒苷-BSA-DYNAL颗粒(试剂III)的ECL缓冲液，再在室温下温育20分钟混合，通过磁力分离洗涤颗粒，再将颗粒悬浮到500μl的ECL缓冲液中，该洗涤步骤再重复2次。最后将颗粒悬浮在1ml的ECL缓冲液中，按实施例3所述方法读得各个样品的电致化学发光数。电致化学发光量与样品中分析物的浓度成反比(电致化学发光量随着分析物的浓度增加而降低)。表V给出了测量曲线的值。
          表V：两步分离对比测量：检测地高辛
    地高辛浓度             电致化学发光量
     (ng/ml)                 (双份样品)
       0.0               22031         21154
       0.5               13367         13638
       1.0               9506          9607
       2.0               5244          5129
       3.0               2959          2994
       5.0               1581          1631
实施例18：地高辛的两步不分离对比测定
将50μl标定血清(TDx Assay，Abbott Labs，Chicago，IL)和25μlRu(bpy)3 2+标记的鼠抗地高辛(试剂IV)的ECL缓冲溶液合并后，在室温下温育20分钟混合，加入25μl乌本箭毒苷-BSA-DYNAL颗粒(试剂III)的ECL缓冲液，再在室温下温育20分钟混合，在读数前将颗粒悬浮在1ml的ECL缓冲液中，按实施例3所述方法读得各个样品的电致化学发光数。电致化学发光量与样品中分析物的浓度成反比(电致化学发光量随着分析物的浓度的增加而降低)。表VI给出了测量曲线的值。
         表VI：两步不分离对比测量：检测地高辛
  地高辛浓度               电致化学发光量
   (ng/ml)                  (双份样品)
    0.0                 42051        39643
    0.5                 28721        28074
    1.0                 22190        21364
    2.0                 14660        14542
    3.0                 11315        11893
    5.0                 9161         8945
实施例19：在电极上加洗最终反应样品通过读数周期进行地高辛两步不分离对比测定
将50μl标定血清(TDx Assay，Abbott Labs，Chicago，IL)和25μlRu(bpy)3 2+标记的鼠抗地高辛(试剂IV)的ECL缓冲溶液合并后，在室温下温育20分钟混合，加入25μl乌本箭毒苷-BSA-DYNAL颗粒(试剂III)的ECL缓冲液，再在室温下温育20分钟混合，在读数前先将颗粒悬浮在1ml的ECL缓冲液中，按实施例3所述方法读得各个样品的电致化学发光数。电致化学发光量与样品中分析物的浓度成反比(电致化学发光量随着分析物的浓度增加而降低)。表VII给出了测量曲线的值。
        表VII：两步分离对比测量：检测地高辛
    地高辛浓度             电致化学发光量
     (ng/ml)                 (双份样品)
      0.0               42613          35309
      0.5               24211          24168
      1.0               17561          17206
      2.0               10491          9909
      3.0               6712           7145
      5.0               4680           4603
实施例20：寡核苷酸的合成
使用β-氨基磷酸氰乙酯(1)在应用生物系统自动寡核苷酸合成仪上合成寡核苷酸，用改性固相(受控带孔玻璃)在最后结合步骤时对5′端和3′端进行寡核苷酸氨基的饰变。Clontech公司(San Diego CA)提供了氨基改性剂，生成的5′端饰变的寡核苷酸被称为(C6，NH)的氨基都含有6个碳原子的间隔链段，3′端饰变的寡核苷酸对氨基则都含有3个碳原子的间隔链段。被构建的寡核苷酸及其修饰和利用将在下面详述。
HPV的寡核苷酸已有文献(2)介绍为E6区。
寡核苷酸顺序如下：
HPV16；1PV165’(C6，NH2)TTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTT；
2PV165’(C6，NH2)CAGTTAATACACCTAATTAACAAATCACAC；
3PV165’(C6，NH2)ACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCG；
HPV18；1PV185’(C6，NH2)TTAGAGAATTAAGACATTATTCAGACT；
2PV185’(C6，NH2)CACCGCAGGCACCTTATTAATAAATTGTAT；
3PV185’(C6，NH2)GACACATTGGAAAAACTAACTAACACTGGG.
上述寡核苷酸能使PCR产生各种片段，3PV16或3PV18与2PV16或2PV18形成62bp片段；1PV16与2PV16形成100bp片段；1PV18与2PV18形成103bp片段。已知3PV16和3PV18寡核苷酸还能用作与由1PV16和2PV16以及1PV18与2PV18的PCR反应的产物进行杂交的探计，以及用作与由PCR内寡核苷酸2PV16和2PV18产生的链进行杂交的探针。
用于Ha-ras点突变测量的寡核苷酸如下：
HRP15’(C6，NH2)GCGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTG；
HRP25’(C6，NH2)TTCTGGATCAGCTGGATGGTCAGCGCACTC；
上述2个寡核苷酸引物就是80bp片段的PCR合成，用于该点突变的探针的顺序如下：
1T245’(C6，NH2)GGCGCCGTCGGTGTGGGCAA；
1CHR5’(C6，NH2)GGCGCCGGCGGTGTGGGCAA；
2T245’(C6，NH2)TTGCCCACACCGACGGCGCC；
2CHR5’(C6，NH2)TTGCCCACACCGCCGGCGCC.
除上述顺序外，我们还合成了上述的1CHR和2T24顺序，其不含5′端氨基饰变但带3′端氨基，这些3′端氨基修饰的寡核苷酸用ECL标记物标记并用于杂交。突变/失配的位点由核苷酸清楚地指出。探针1T24和1CHR与由PCR中的寡核苷酸HRP2产生的链杂交，探针2T24和2CHR与由PCR中的寡核苷酸HRP1产生的链杂交。
与颗粒相结合的寡核苷酸JK8和JK8C的2个顺序是由水母发光蛋白顺序衍生得到的并且彼此互补。JK8和JK8C顺序如下：
JK85’(C6，NH2)GTCCAATCCATCTTGGCTTGTCGAAGTCTGA
JK8C5’(C6，NH2)TCAGACTTCGACAACCCAAGATGGATTGGA1C.
寡核苷酸JK7是用由Clontech公司(San Diego CA)得到的能在顺序内进行氨基饰变的氨基改性剂修饰过的氨基。J K7用Ru(bpy)3 2+标记物标记，其顺序如下：
JK75’TCAGACTTCGACAA(NH2)CCCAAGATGGATTGGA：
由离体转录产生的用于水母发光蛋白RNA的寡核苷酸探针T35用生物素和Ru(bpy)3 2+标记物标记，T35的顺序如下：
T355’(NH2)GATTTTTCCATTGTGGTTGACATCAAGGAA
为了检测大肠杆菌DNA，我们合成了对如下所示的基因组(3)的Trp E/D区具有特异性的寡核苷酸：
TRP.CO35’(C6，NH2)GCCACGCAAGCGGGTGAGGAGTTCC(NH2)该顺序用Ru(bpy)3 2+标记物标记，和
TRP.CO45’(C6，NH2)GTCCGAGGCAAATGCCAAATAATGG该顺序用生物素标记，详述于后。
实施例21：标记寡核苷酸
所有合成寡核苷酸都通过Biogel P6(BioRad Lans)柱的凝胶过滤进行纯化，除去杂的氨基。使用NHS-生物素(Clontech，San Diego CA)，通过PCR引物的5′-氨基引入生物素(4)。按如下所述，通过修饰的寡核苷酸的氨基引入Ru(bpy)3 2+-NHS。在室温和黑暗条件下，将溶于100μl PBS(pH7.4)的寡核苷酸(0.1μmole)与溶于DMSO的5μmoleRu(bpy)3 2+标记物反应过夜。用乙醇沉淀法由这些标记反应物中回收寡核苷酸。最近的研究证明，用o.5μmole Ru(bpy)3 2+标记物能够有效地进行标记(＞80％)(数据未示)。
标记的寡核苷酸通过逆向Vydac C-18半制备柱上的HPLC进一步进行纯化，其流动相为：(A)100mM乙酸四乙铵，pH7.0；和(B)50％的(A)和50％乙腈，由20％至40％B梯度移动。
探针1CHR和1T24也用32P、T4多核苷酸激酶和由已建立的方法产生的比活性为77000cpm/ng的探针进行标记(5)。
实施例22：核酸磁性颗粒的制备
按常规方法(6)，用甲苯-4-磺酸2-氟-1-甲基吡啶鎓激活DynalM450颗粒，然后将激活的这些颗粒与寡核苷酸JK8和JK8C反应，将33nmole寡核苷酸的650μl 0.1M NaHCO3溶液加到100mg激活的Dynal颗粒中，温育3小时混合，再加入4ml乙醇胺(0.1M)封阻颗粒。将结合的颗粒与0.5mg/ml鲑鱼精子单链DNA的ECL缓冲液混合，在ECL缓冲液中洗涤4-5次，再悬浮在10mg/ml含100μg/ml鲑鱼精子单链DNA的ECL缓冲液中。
实施例23：抗生蛋白链菌素磁性颗粒I的制备
按常规方法(6)，用甲苯-4-磺酸2-氟-1-甲基吡啶鎓激活DynalM450颗粒，然后将激活的颗粒与抗生蛋白链菌素(Sigma Ltd)反应。用0.1M NaHCO3洗涤激活颗粒(50mg)，再加入1.5mg抗生蛋白链菌素，反应过夜。加入4ml乙醇胺(0.1M)封阻颗粒。结合的颗粒与0.5mg/ml鲑鱼精子单链DNA的ECL缓冲液混合，在ECL缓冲液中洗涤4-5次，悬浮在含100μg/ml鲑鱼精子单链DNA的10mg/ml ECL缓冲液中。由DynalM-280得到的抗生蛋白链菌素还证明具有重要意义，但用现在的测量顺序则信号较低。为了进行免疫测量，可用被动包覆用的缓冲液结合抗原或抗体后，再用BSA封阻所用颗粒。
实施例24：抗生蛋白链菌素磁性颗粒II的制备
将105μl含50mg/ml生物素-x-NHS(Clontech，San Diego CA，5002-1)的二甲亚砜加到15mg BSA(于2-3ml PBS中)中，混合后在室温下温育30分钟。加入30μl 1M甘氨酸使反应终止，再在室温下温育10分钟。该反应混合物经凝胶过滤层析(Biorad，Bio-Gel P6)纯化。生物素-BSA用0.2μm注射器过滤。将5mg生物素-BSA的10ml 0.2M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)加到300mg经碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液洗涤过的Dynabead(Dynal 14002)中，混合物经涡动后，在室温下温育过夜混合。这些颗粒经磁力分离后，加入10ml的ECL稀释液和100μl tRNA(10mg/ml)，再在室温下温育3-4小时混合，用10ml的ECL稀释剂一次洗涤这些颗粒，然后悬浮在10ml的ECL稀释液和100μl tRNA(10mg/ml)中。混合后在2-6℃下温育过夜，使蛋白质固定在颗粒上。颗粒经磁力分离后，悬浮在含15mg抗生蛋白链菌素(Scripps S1214)的10ml PBS中，混合1小时，颗粒在10ml的ECL稀释液中洗涤4次，每次洗涤都经5分钟混合。最后将颗粒悬浮在29.7ml的ECL稀释液和300μl tRNA(10mg/ml)中，使最终浓度达到10mg/ml颗粒+100μg/ml tRNA。
实施例25：通过与ECL DNA探针的杂交检测固定在颗粒上的DNA
通过结合着JK8和JK8C的颗粒(实施例22)与Ru(bpy)3 2+标记寡核苷酸Jk7杂交，证明能够检测与颗粒杂交后的ECL。将于ECL缓冲液中的大量颗粒(300μg)分别与含有12.5、6.3、3.01和1.5fmole标记JK7的50μl ECL缓冲液混合，这些混合物在52℃下杂交4小时后，用1mlECL缓冲液洗涤，然后悬浮在830μl ECL缓冲液中。按实施例1所述分析上述样品，探针JK7与JK8顺序互补，但不与JK8C顺序互补。
                        表VIII
          颗粒       探针量(fmole)    ECL量
          JK8            12.5         5085
                         6.3          3035
                         3.01         1345
                         1.5          657
         JK8C            12.5         451
                         6.3          345
                         3.01         256
                         1.5          212
示于表VIII的结果证明，经过特异性杂交，由ECL能够检测直接固定在颗粒表面上存在的特异性顺序。
实施例26：根据珠粒结合的ECL测量RNA
按常规方法(实施例10)，用对RNA/DNA抗体具有特异性的抗体(7)包覆Dynal M450颗粒，特异性RNA是用由我们克隆的水母发光蛋白基因(8)得到的质粒产生的。简要地说，质粒pA5′用纯化的EcoRI切割，并用产生T3-RI RNA(负RNA)的T3 RNA聚合酶进行体外转录。质粒pA5′还用纯化的BamHI切割，并用产生T7-Bam RNA(正NRA)的T7 RNA聚合酶进行体外转录。因此，这两种RNA代表两种互补RNA，并且都用等体积的苯酚∶氯仿(50∶50)提取纯化，再用氯仿提取和2.5体积乙醇沉析出上清液，经凝胶电泳和分光光度法测定RNA的量。这些方法都已建立并为本领域专业人员所熟知(9)。按已知方法，以25∶1(Ru(bpy)3 2+标记物：抗生蛋白链菌素)的过量摩尔比，用Ru(bpy)3 2+标记物标记抗生蛋白链菌素(实施例13)。该标记的抗生蛋白链菌素按知方法(10)用亚氨基生物素柱进行纯化。经过测定抗生蛋白链菌素，每个抗生蛋白链菌素四聚物含有10个Ru(bpy)3 2+标记物。然后将该标记的抗生蛋白链菌素与含生物素的T35复合，寡核苷酸与标记抗生蛋白链菌素的混合比为1∶1。每20pmole混合成最终体积为15μl的ECL缓冲液，在4℃下温育过夜，形成标记的抗生蛋白链菌素-寡核苷酸(SA-T35)复合物。正和负RNA(10ng)的样品与2μl SA-T35复合物(一步测量)或与25ng含生物素的T35(两步测量)杂交。将样品配制成50μl，并在50℃下杂交3小时，然后加200μg抗DNA/RNA抗体包覆的颗粒(于20μl PBS0.1％BSA中)。该混合物在室温下混合1小时后，在ECL缓冲液中洗涤2次。将与SA-T35复合物杂交后的样品悬浮在530μl ECL缓冲液中，并按实施例1所述方法进行分析。将仅与含生物素的T35杂交过的样品与50pmole标记抗生蛋白链菌素一起混合温育1小时，再在ECL缓冲液中洗涤2次。经过杂交的样品悬浮在530μl ECL缓冲液中，并按实施例1所述方法进行分析。结果示于表IX。
                       表IX
     测量            RNA        ECL平均量
    一步法           正           815
                     负           91
    两步法           正           1123
                     负           194
实施例27：聚合酶链反应
基本上按(11，12，13)所述进行聚合酶链反应。除非另有说明外，一般说来各反应都用100μl。PCR是以不对称方式掺入Ru(bpy)3 2+标记物，使用5pmole含生物素的寡核苷酸和50pmole Ru(bpy)3 2+标记的寡核苷酸。Ha-ras点突变的测量是在相同条件下进行的，但不加Ru(bpy)3 2+标记的寡核苷酸。不分离的HPV测量是以不对称方式进行的，但使用了10倍过量的含生物素的寡核苷酸，一般为40pmole。热周期的条件如下：直接掺入HPV18和16的测量为93℃1秒，50℃1秒，60℃2分钟；Ha-ras点突变的测量为93℃1秒，69℃2分钟；不分离的HPV测量为93℃10秒，50℃30秒，60℃2分钟。根据测量和所要求的灵敏度，进行PCR的循环数为30至40。
实施例28：DNA探针的测量(I)：通过掺入酶检测和定量分析人乳头状瘤病毒PCR产物
在直接掺入Ru(bpy)3 2+标记的寡核苷酸进行PCR后，将整个反应混合物(90-100μl)加到600μg抗生蛋白链菌素结合的磁性颗粒I中，在室温下振荡温育20分钟。用磁条将样品中的固相分离，经ECL缓冲液洗涤2次后，悬浮在530μl ECL缓冲液中，按实施例1所述分析电致化学发光。图3解释了这个测量，用人乳头状瘤病毒样品(2，14)证明该测量的结果。关于将Ru(bpy)3 2+标记的寡核苷酸直接掺入到含生物素的PCR产物中的特定研究则使用了密切相关的HPV16和HPV18型病毒，对于是否存在HPV16和18的测量使用对病毒型和病毒特异性寡核苷酸均为正反应的DNA样品。各个引物如下：2PV16、2PV18是含有生物素的，3PV16、3PV18是Ru(bpy)3 2+标记的寡核苷酸。2/3PV16和2/3PV18寡核苷酸分别对HPV16和18具有特异性。生成的珠粒俘获的Ru(bpy)3 2+标记物按实施例1所述方法分析ECL。结果以样品引物的各种组合的ECL量示于图6。
为了说明我们所进行的测量的量的性质，给出了将Ru(bpy)3 2+标记物和含生物素的寡核苷酸直接掺入到HPV16 PCR产物中的标准曲线，生成的珠粒结合的Ru(bpy)3 2+标记物按实施例1所述方法分析ECL。与HPV16 DNA浓度的增加相比较，用病毒拷贝数与总的细胞DNA拷贝数之比表示，给出了ECL光子的峰值。用于HPV16分析的引物是1PV16(生物素标记)和2PV16(Ru(bpy)3 2+标记)。用于各PCR的DNA使用小牛胸腺保持在1μg的恒量。该标准曲线的结果示于图7。关于该测量的特异性和定量分析的结果说明，这些ECL标记物能够用于简便快速地进行DNA测定。同时还说明，该标记物能够很容易与酶反应相联系但并不影响酶的方法。
实施例29：DNA探针的测量(II)：检测和测定人Ha-ras致癌基因PCR扩增产物中的点突变
我们使用寡核苷酸HRP1和HRP2进行Ha-ras基因的PCR反应。使用带未标记HRP2的含生物素的HRP1，生成的PCR产物能够与Ru(bpy)3 2+标记的探针2CHR和2T24杂交。反之，使用带未标记HPR1的含生物素的HRP2，则生成的PCR产物能够与Ru(bpy)3 2+标记的探针1CHR和1T24杂交。所用的DNA是人胎盘细胞DNA(正常)和用由膀胱癌T24得到的突变Ha-ras基因转染过的鼠NIH3T3细胞DNA(15)。
测量方法如下：将90μl PCR反应混合物加到600μg抗生蛋白链菌素结合的磁性颗粒I，然后在室温下温育30分钟，用磁条分离出这些样品中的固相，先后用50mM NaOH和杂交缓冲液(0.9M NaCl，50mMNaPO4，pH7.7，5mM EDTA，0.1％W/V聚蔗糖，0.1％W/V聚乙烯吡咯烷酮，0.1％W/V牛血清清蛋白)洗涤，然后悬浮在含10μg/ml Ru(bpy)3 2+标记寡核苷酸的杂交缓冲液中。上述样品在66℃下杂交15分钟。
用磁条分离出固相后，经0.9M NaCl、50mM NaPO4 pH7.7、5mMEDTA洗涤2次，再用3M氯代四甲铵、50mM Tris-HCl pH8.0、2mMEDTA、0.025％triton X-100在室温下洗涤1次，在66℃下洗涤2次，每次20分钟。固相用ECL缓冲液洗涤3次后，悬浮在530μl ECL缓冲液中，按实施例1所述方法检测电致化学发光。图4说明了该项测量。
用32P标记探针进行的Ha-ras PCR产物的测量与用Ru(bpy)3 2+标记的相类似，只是将固相最终悬浮在250μl ECL缓冲液中，然后将这些样品转移到5ml闪烁液体中，并用Beckman LS-100C液体闪烁计数管计数。
由图8可以看到Ha-ras致癌基因点突变测量的数据。如图4所示，PCR的测量使用了带未标记HRP1的含生物素的HRP2(用于探针1T24和1CHR)和带未标记HRP2的含生物素的HRP1(用于探针2T24和2CHR)，得到用于杂交的珠粒结合的单链靶。DNA样品是正常的(胎盘)Ha-ras基因和突变的(NIH3T3-T24)Ha-ras基因。珠粒结合的DNA与Ru(bpy)3 2+标记的1T24(1T24)、Ru(bpy)3 2+标记的2T24(2T24)、Ru(bpy)3 2+标记的1CHR(1CHR)和Ru(bpy)3 2+标记的2CHR(2CHR)杂交后经TEMAC洗涤，生成的珠粒结合的Ru(bpy)3 2+标记物按实施例1所述方法进行ECL分析。结果用样品探针的各种组合的ECL量表示。如所期望的结果(示于图8)，正常探针与正常DNA杂交情况良好(见CHR探针)，突变探针能与突变基因杂交(见T24探针)。颇有意义的是这些探针的性能并非完全相同。为了研究这个明显的异常情况，我们用含或不含Ru(bpy)3 2+标记物的32P标记探针对上述探针作进一步的研究。按如下所述，用32P标记探针研究Ru(bpy)3 2+标记探针对Ha-ras致癌基因的特异性。如图8所示，仅用带未标记HRP1的含生物素的HRP2(用于探针1T24和1CHR)进行PCR测量。所用的探针为：以含32P的1T24和1CHR(1T24-P，1CHR-P)作为对照，用含32P和Ru(bpy)3 2+标记物的1T24和1CHR测量Ru(bpy)3 2+标记物的作用。样品按上所述用TEMAC洗涤，生成的珠粒结合的32P在加入闪烁合剂的闪烁计数管中进行分析。结果用样品探针的各种组合的每秒32P数表示(见图9)。该结果说明，32P探针和Ru(bpy)3 2+标记的探针的作用是相同的，关于探针特异性的种种问题则是由于所用特异性探针的各种顺序造成的。为了进一步说明我们的Ru(bpy)3 2+标记物和32P的相同性，我们对这些标记探针进行了对比。按前所述，用胎盘DNA和带未标记HRP1的含生物素的HRP2(用于探针1T24和1CHR)进行扩增。然后从生成的PCR产物中取样，得到一组含有不同产物数量的样品。将这些样品与用32P标记的探针(1T24-P32和1CHR-P32)杂交，或与Ru(bpy)3 2+标记物(1T24-Ru(bpy)3 2+和1CHR-Ru(bpy)3 2+)杂交。用从90μl样品的各个标记物的平均值，将上述各项研究结果标准化，这些标准化图可使信号与本底进行更有效的对比，并且可对两种方法进行对比。附图10说明了在稀释曲线中含量较低时的反应。样品按前所述方法进行处理(图8和图9)。图10中的结果说明，两个标记物与我们的Ru(bpy)3 2+标记探针的良好反应具有相同性。这些研究证明，在区别样品DNA中的单个碱基的改变方面，Ru(bpy)3 2+标记探针与32P标记探针都能起相同的作用。这个事实可以说明，在杂交反应中Ru(bpy)3 2+标记物对标记探针的性质几乎没有影响。
实施例30：DNA探针的测量(III)：在不分离的测量中检测和定量分析人乳头状瘤病毒PCR产物
关于HPV18的不分离测量，我们用过量含生物素的引物进行不对称PCR反应。该PCR反应可以通过用Ru(bpy)3 2+标记探针进行直接杂交，从而产生过量的含生物素的单链DNA。为了杂交，在完成扩增后我们将对经过扩增的HPV基因具有特异性的1000ECL量的Ru(bpy)3 2+标记寡核苷酸(～2ng)加到15μl PCR中，然后在50℃下温育15分钟。再将含有600μg抗生蛋白链菌素结合的磁性颗粒I的60μl ECL缓冲液加到该杂交混合物中，在室温下振动温育15分钟。加入ECL缓冲液，使样品体积增至530μl，然后按实施例1所述方法检测电致化学发光。图5说明了该测量。为了说明这个不分离测量，我们作了HPV18 DNA的标准曲线。用含生物素的2PV18、未标记1PV18和HeLa DNA进行PCR测量(14)。生成的PCR反应物与特异性探针Ru(bpy)3 2+标记3PV18杂交。然后将杂交混合物加到抗生蛋白链菌素包覆的颗粒中，按实施例1所述方法生成的珠粒结合的Ru(bpy)3 2+标记物直接进行ECL分析。结果用ECL量与加到含对照ras寡核苷酸探针的PCR中的HPV18拷贝数的关系表示(见图11)。这些结果说明，根据ECL测量系统的性质，能够快速不分离测定核酸顺序。
实施例31：特异性基因组DNA顺序的测定
此例所述测定使用了2个寡核苷酸，都与相互靠近的相同的DNA链杂交，其中一个俘获，另一个标记复合物(夹层杂交)。该测定使用了对trp E/D基因区有特异性的大肠杆菌DNA和探针。大肠杆菌DNA按常规方法(16)制备，鲑鱼精子对照DNA由Sigma司提供。将14μl杂交缓冲液(10×PBS，10mM EDTA和0.7％SDS)、2ng生物素标记的TRP.CO4和5ng Ru(bpy)3 2+标记TRP.CO3加到DNA样品中，用水将样品制备成100μl，加热至97℃，再在97℃下温育10分钟，然后冷却至50℃，杂交2小时。将20μl抗生蛋白链菌素包覆的磁性颗粒II加到样品中，在室温下混合2小时，颗粒在ECL缓冲液中洗涤4次，再悬浮在500μlECL缓冲液中，按实施例3所述方法进行分析。正DNA是大肠杆菌，负DNA是鲑鱼精子，结果示于表X。
                     表X
DNA          含量                 电致化学发光平均量
              10                         184
              25                         257
              50                         266.5
负            10                         87
              25                         70
              50                         75
上述结果说明，使用夹层杂交测量方法在未扩增的DNA上，电致化学发光测量系统能够用于检测大肠杆菌中的基因组基因。在这个实施例中，与抗生蛋白链菌素包覆的磁性颗粒II一样，也可使用抗生蛋白链菌素包覆的磁性颗粒I。
实施例32：在渐消失波荧光检测器上颗粒的富集
使用渐消失波检测器在检测表面上标记复合物的富集可用于提高测量的灵敏度。这类检测器可以使用光学纤维或平面光波导300将光310由光源带至液体环境。由于入射光束射到高折射指数电介质(n1)和低折射指数电介质(n2)间的界面产生的总内部反射(TIR)310′，光反射穿过波导或光纤。当光束入射角大于临界角θ0 315(该角表示垂直线300′和光程310′之间的角度)，θ0＝Sin-1(n2/n1)，光在界面处100％的内反射。在光波导和光纤中，光以大于临界角的入射角传播，并且以总内部反射穿过介质。图22表示在波导或光纤中TIR的传播。
虽然光线在与界面相互作用的各点上能够完全反射，但是在介质外的电磁场并不等于0。当电磁场由光纤或波导外部透入到外部环境时，连续穿过界面就物理学要求而言，电磁场需要按指数衰减。这个电磁场称为渐消失场320，并且能将荧光团激发为荧光。渐消失场的衰减率决定于入射波长、折射指数n1和n2和入射角。在水环境中使用石英波导和可见光，在由波导/溶液界面的100nm距离内，渐消失场320约衰减90％。在图22中，周围介质330具有折射指数n2和光纤或波导300以及折射指数n。
光在波导和光纤中传播产生渐消失场的同样原理也可使荧光团发光时产生的光有效地被吸收到光学元件中。此外，在渐消失区320外产生的任何光都可有效地由进入光学元件中返回。将这些作用结合起来就能使光纤或波导作为有效的光学元件用于水环境中在荧光团标记物的表面上或表面附近测量荧光团标记物的存在和浓度。美国专利4447546(系本文的参考文献)介绍了使用光学纤维激发和测量标记免疫反应物的渐消失区荧光进行荧光免疫测量的一种适宜方法和装置。
本发明使用光纤或波导能够提高荧光结合测量的灵敏度，该测量可使用由荧光标记的试剂来完成。将颗粒、样品和试剂进行温育后，颗粒富集在波导或光纤的表面上。由于颗粒的表面积大于波导或光纤的几何面积，在光学元件周围的渐消失区能够收集更多的荧光团。因此，由颗粒产生的发光信号将较强，使定量分析的灵敏度更高，从而使各种检测限度得到改进。
上述较佳实施例详细介绍了本发明，但不能因此限制本发明，在不脱离本发明实质的情况下，根据说明书的介绍，显然可以作出各种改变，但无疑这也应属本发明的范围。
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Claims (4)

1.应用电极表面测量电致化学发光对样品中的有意义分析物进行结合测量的装置，该装置包括：
(a)限定样品含量的具有垂直柱状区和进料排料装置的样品室，还包括基本上沿水平方向的位于所述样品室和柱状区主要部分下面的电极；
(b)将电压施加在所述电极上的装置；以及
(c)测量在所述电极上产生的电致化学发光的装置。
2.应用电极表面测量电致化学发光对样品中的有意义分析物进行结合测量的装置，该装置包括：
(a)限定测量样品含量的具有进料排料装置的样品室、电极、以及使所述复合物在所述电极表面上基本均匀分布的装置；
(b)将电压施加在所述电极上的装置；以及
(c)测量在所述电极上产生的电致化学发光的装置。
3.按权利要求2的装置，其中所述使复合物均匀分布的装置包括产生磁场的装置，其与所述电极的取向应在所述表面区内使该磁场的磁力线与该电极表面基本平行。
4.按权利要求3的装置，其中所述产生磁场的装置包括垂直配置在所述电极下面的南北向磁体。
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