CN1662815A - 功能化纳米微粒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

用生物活性的分子，如抗体和核苷酸对涂有氧化硅的纳米微粒进行官能化，并用于标记细胞，检测和分离具有特定核苷酸序列的核酸分子，分离不同核酸分子的混合物。

Description

功能化纳米微粒及其使用方法
相关申请的相互参照
本发明要求美国临时专利申请号60/375122和60/374405的权益，这两份专利均提交2002年4月22日。
关于联邦赞助研究的声明
本发明是在美国政府的支持下进行的，海军研究局(Office of NavalResearch)授予的资助号为N00014-98-1-0621；国家科学基金(National ScienceFoundation)授予的资助号为DBI-9871880、CTS-0087676和CHE-9733650；国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的资助号为CA92581和NS39891。美国政府拥有本发明的某些权利。
发明领域
本发明一般涉及纳米微粒和制备及使用纳米微粒的方法。更具体地说，本发明涉及涂敷生物活性物质的纳米微粒，以及使用这种纳米微粒的方法。
发明背景
纳米微粒是非常小的颗粒，其直径通常小达1纳米到大达数百纳米。因为尺寸小，纳米微粒有待用来生产各种产品，例如许多不同的生物和医药应用中的有用工具。
发明概述
本发明基于开发与一种或多种生物活性分子，如核酸、抗体和酶结合的纳米微粒。本发明的纳米微粒可用作信号探针和分离工具，用于超灵敏细胞标记和核酸的分析及分离。
因此，本发明的特征是将纳米微粒定向靶分子的方法。该方法包括如下步骤：提供具有氧化硅表面的纳米微粒，氧化硅表面与至少一个能与靶分子特异性结合的官能团偶联；然后在至少一个官能团与靶分子结合的条件下，纳米微粒和靶分子混合在一起。
所用纳米颗粒可具有被氧化硅表面包封的一个芯。所述芯可以是金属(例如磁性金属)或染料(例如有机或无机染料)。偶联氧化硅表面的官能团可以是蛋白质，如抗体、酶、抗生物素蛋白或生物素，也可以是核酸，如DNA。核酸可呈分子信标的形式，例如与荧光团和荧光团的淬灭剂偶联的分子信标。官能团可以通过生物素-抗生物素蛋白与氧化硅表面偶联。
与纳米微粒定向结合的靶分子可以是细胞内、细胞表面上的分子或在细胞内部。细胞可以是真核细胞，如哺乳动物细胞(例如癌细胞)，也可以是原核细胞，如细菌。靶分子也可以包含在液体中。
本发明方法还包括检测纳米微粒与靶分子结合的步骤，例如通过观察纳米微粒的性质(例如光发射)的改变来检测纳米微粒与靶分子的结合。如果靶分子包含在混合物内，则该方法可包括将含有纳米微粒的复合物从混合物中分离出来的步骤，其中纳米微粒结合在靶分子，还包括将靶分子从复合物中分离出来的步骤。
这里所用词汇“纳米微粒”是指直径在约1-1000nm之间的微粒。纳米微粒的“尺寸”是指纳米微粒最大的直线尺寸的长度。例如，完整的球形纳米微粒的尺寸是其直径。
这里所用“核酸”或“核酸分子”是指两个或多个核苷的链，如RNA(核糖核酸)和DNA(脱氧核糖核酸)。“纯化的”核酸分子是指细胞或生物体的其他核酸序列中基本分形或分离的核酸分子，其中核酸是天然产生的(例如30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99、100％无污染物)。
这里所用“蛋白质”或“多肽”是同义词，指由氨基酸的任何肽连接的链，不管长度或翻译后修饰，例如糖基化或磷酸化。
当涉及一种核酸与另一种核酸的杂交时，“低严格条件”指在42℃10％甲酰胺、5X Denhart溶液、6X SSPE、0.2％SDS中，接着在50℃1X SSPE、0.2％SDS中洗涤；“中等严格条件”指在42℃50％甲酰胺、5X Denhart溶液、5X SSPE、0.2％SDS中，接着在65℃0.2X SSPE、0.2％SDS中洗涤；“高严格条件”指在42℃50％甲酰胺、5X Denhart溶液、5X SSPE、0.2％SDS中，接着在65℃0.1X SSPE、0.1％SDS中洗涤。“严格杂交条件”指低、中等或高严格条件。
这里所用“序列同一性”是指当两个序列对齐使亚基配对最大化时，在两个序列中的对应位置上相同亚基的百分数，即要考虑到间隙和插入。当两个序列中的亚基位置被同样核苷或氨基酸所占据时，存在序列同一性，例如，如果一个特定位置被各自的两个DN中的腺嘌呤占据时，分子在该位置上是相同的。例如，如果10个核苷酸长度的序列中17个位置与另一10个核苷酸序列中的对应位置相同，则两个序列的同一性为70％。序列同一性通常用序列分析软件测定(例如，威斯康辛大学生物技术中心基因计算组开发的序列分析软件包，学府大道1710，麦迪逊，W威斯康辛53705)。
这里所用“抗体”包括完整多克隆和单克隆抗体，以及抗体片段。
“词组特异结合”指样品中的一个分子识别并粘附于特定的另一个分子上，但不充分识别或粘附于样品中的其他分子。一般地，与第二个分子“特异结合”的第一个分子是指结合具有结合亲和力大于约105-106mol/l的和二个分子的分子。
这里所用词组“官能团”指化学基团，它能赋予含有化学基团的物质(例如纳米微粒)一种特定功能。例如，官能团可以包括生物活性物质，如抗体、寡核苷酸、生物素或链霉抗生物素蛋白，已知它们与特定分子结合；或者小的化学基团，如胺、羧酸盐等。
词组“与……偶联”指共价或非共价键键合，或相反例如通过直接或间接连接稳定地紧靠着相连。例如，涂敷有抗生的素蛋白的纳米微粒可通过抗生物素蛋白-生物素连接与生物素化抗体偶联。
除非另有说明，这里所用的全部技术术语与作为本发明所有领域中普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的方法和材料类似或相等的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但下面介绍合适的方法和材料。这里提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都纳八本文作参考。在冲突的情况下，则以本说明书，包括定义为准。此外，下面所讨论的具体实施方式仅是说明性的，不是对本发明的限制。
附图简述
图1是本发明所用纳米微粒的剖面图。
图2是制备本发明所用纳米微粒的方法中涉及的一般步骤的流程图。
图3是用纳米微粒标记细胞的方法的两个示意图(A和B)。
图4是检测核酸分子存在的方法的示意图。
图5是用分子信标(MB)特异结合并检测具有特定核苷酸序列的靶核酸分子的高度简化示意图。
图6是从核酸与蛋白质的复杂混合物中分离感兴趣的多核苷酸(DNA1’)中涉及的步骤的示意图。
图7是用于检测本发明核酸的一碱基错配选择性方法的两个图。(A)是来自完全互补核酸的信号与来自单碱基错配核酸的信号；(B)是来自A-T单碱基错配核酸的信号与来自G-C单碱基错配核酸的信号。
图8是在MB固定于基因磁性纳米俘获剂(MB-GMNC)或游离于溶液的条件下，显示MB与靶DNA双联的熔化温度曲线的一系列图。
图9是显示MB-GMNC从复杂DNA-蛋白质混合物中俘获痕量DNA靶的能力的图。
图10是显示MB-GNMC从细胞裂解液中俘获痕量靶mRNA的能力的图。
发明详述
生物活性的氧化硅涂层纳米微粒是用油包水微乳液方法制备的，该方法产生大小均匀的颗粒，所述颗粒由被氧化硅壳包封的芯组成。微乳液的制备方法是，组合相对极性液体(如水)、相对非极性液体(如液态烷烃)和一种或多种表面活性剂，形成各向同性、热力学稳定的单相体系。此体系包含许多很小的球形水池(即反胶团)，作为产生纳米微粒芯的反应器。芯产生后，用硅化剂，如原硅酸四乙酯(TEOS)涂敷氧化硅。为了使这些氧化硅涂层的纳米微粒具有生物活性，氧化硅涂层与一个或多个生物活性官能团偶联，如核酸或多肽。下面描述的优选实施方式说明了本发明的各种适应。尽管如此，从这些实施方式的描述中，通过对下面讨论的部分稍作调整或改进，容易地适合本发明的其他方面。
纳米微粒的特点
在简要描述中，用图1表示，本发明的优选纳米微粒10包含芯12、涂覆芯12的壳14和衍生到壳14上的一种或多种官能团16。尽管纳米微粒10的直径可在约1-1000nm或更大的范围，对于许多应用，优选在约10-300nm(例如，约10、15、20、25、30、35、50、75、100、150、200、250或300nm)之间。在大量纳米微粒10的分散液中，尺寸分布的标准偏差最好不超过纳米微粒10的平均直径(或最大直线尺寸)的约25％(例如1、2、3、5、10、15、20或25％)。
图1所示纳米微粒10是实心的(即基本上没有孔隙)。尽管此形式是许多应用的优选形式，但本发明的纳米微粒也可以是多孔的。实心形式可以按下述方法，用壳14均匀涂敷芯12来制备。可通过用腐蚀剂(例如，当壳14由氧化硅组成时，一种强碱性溶液)降解实心纳米微粒来制备多孔形式，并任选用氧化硅重新涂敷芯12。一般地，当希望芯12与外界隔绝时，最好采用实心形式；当希望增加壳14与外界接触的表面积时(例如，当用纳米微粒10作催化剂时)，或者有时用纳米微粒10隔离各种物质时(例如用来“捕获”孔内物质时)，最好采用多孔形式。纳米微粒10中的孔可以具有小于纳米微粒10的直径的任何合适尺寸。例如，这些孔的平均尺寸可以是约0.1、0.5、1、2、3、5、10、20、50或100nm。
芯12可由任何与壳14相容的物质组成。由于芯12将功能特征赋予纳米微粒10，本领域的技术人员可根据组分的已知特点选择芯12的组成，以适合纳米微粒10的特定用途。例如，在希望纳米微粒10具有磁性的优选实施方式中，芯12由磁性金属如磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γFe2O3)或硫复铁矿(Fe3S4)组成。在此实例中，芯12的组成将磁性赋予纳米微粒10，这样纳米微粒10可用在基于磁性的应用中，例如细胞分离/纯化。
对于其他应用，芯12可由非磁性金属或金属盐(例如金、银、硫化钙等)组成。例如，具有、涂有氧化硅的CdS芯的纳米微粒可用作高荧光性或发光性探针。作为另一个例子，为生产染料或色素纳米微粒，芯12可包括用于制备“无色素”色素的无机盐，例如铕盐、三(2，2’-二吡啶基)二氯钌(Ru/Bpy)、高锰酸钾、重铬酸钾、硫酸镍、氯化钴、氯化铁(III)、硝酸铜等。
芯12也可以由荧光或发光有机染料组成，许多有机染料是已知的。例如，参见《荧光探针和研究产品手册》(Handbook of Fluorescent Probes and ResearchProducts)，第8版，分子探针公司(Molecular Probes Inc.)。有用的染料的具体例子包括若丹明6G(R6G)、羧基-四甲基-若丹明(TMR)和荧光素。光稳定性实验显示，纯R6G的强度快速下降，而纳米微粒内的同样R6g的荧光强度在相同条件下没有明显变化。由于这种掺杂染料的纳米微粒的光稳定性改进，使光褪色减少到最低程度，并能提高使用这种荧光团的测定的精确度。芯12也可由不同物质的混合物构成。例如，如果希望制备一种磁性掺杂染料的纳米微粒，芯可由磁性金属和染料构成。
芯12可以具有小于纳米微粒10大小的任何尺寸。因此，芯12的直径在小于1nm至1000nm之间。对于许多应用，芯12的直径优选约为1-200nm。作为一个例子，由于动物能排泄尺寸小于约100nm的纳米微粒，但保留大于100nm的微粒(主要在肝脏和脾脏中)，所以小到足以掺入在尺寸小于100nm的纳米微粒中的芯子优选用于不希望纳米微粒留在受试者中的诊断或治疗用途。
当用微乳液纳米微粒生产技术制备(见下面)时，芯12一般是球形的(常规的反胶团为球形)。但芯12不限于球形。例如，纳米微粒10可以是椭圆形或管形，这种形状优选适用于许多磁性用途，而不是完全的圆形。如果芯12是晶体形式，则纳米微粒10可以具有规则或不规则的多面体形状，如立方形。
壳14是涂敷芯12的物质，它可由可以用本发明方法施涂到芯12上的任何可相容材料组成。例如，壳14可由聚合物(例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、丙烯酸聚合物等)、多糖(如糊精)、无机氧化物(如氧化铝或氧化硅)或它们的混合物组成。在目前的优选实施方式中，壳14可部分或全部由氧化硅组成。氧化硅优选用于各种应用，因为它在许多环境中是相对不活泼的，是生物相容的，可避免在分散液中与其他纳米微粒成团，并且易用许多不同的官能团衍生。尽管图1所示壳14是单层构型，它也可以是多层构型。例如，壳14可包括涂敷且紧靠芯12的第一个氧化硅涂层，然后是涂敷氧化硅层的第二个层。第二层可由能涂敷到第一层上的任何物质组成。例如，第二层可由浸渍了药物的可生物降解材料(例如糖或聚合物)组成。当导入动物中时，可生物降解材料和药物将逐步溶解到动物体内。在其他应用中，壳14可由3、4、5或更多个独立层组成。
在图1所示优选实施方式中，壳14完全包封芯12，因此将芯12与外界隔断。当要求防止芯12与外部因素相互作用时，最好采用这种形式。例如，氧化硅涂层可防止铁基芯的腐蚀。类似地，完全氧化硅涂层可增强纳米微粒基色素的储存期限，通过防止颜料在溶剂中降解或溶解，并通过氧化作用。在一些变动中，纳米微粒10不包括壳14，或者仅部分涂敷壳14(例如当外14已从芯12上部分溶解或降解时)。
壳14可具有任何厚度(即从芯12的外表面到外壳14的外表面的长度)，此厚度与本发明制备纳米微粒10的方法相容。利用本发明的优选方法，制成的壳14的厚度可以从小于约1nm到大于约300nm。壳14的优选厚度可随纳米微粒10的特定应用而变化。例如，如果希望减少纳米微粒的聚集(此时芯彼此吸引)或壳的降解(例如在苛性溶剂中)，则一般优选相对厚的壳。另一方面，如果希望放大芯的性质(例如色素的颜色)，则一般优选相对较薄的壳。
如图1所示，官能团16可衍生到壳14的表面上。通过壳14连接于纳米微粒10的任何化学或生物基团的形式获得官能团16。例如，官能团16可以是一种生物活性物质，例如蛋白质，如抗体(单克隆，多克隆)、酶、生物素和链霉抗生物素蛋白；核酸分子(例如RNA、DNA)；生化基团，如胺和羧酸盐。
制备纳米微粒的方法
现在参看图2，制备纳米微粒的优选方法包括：提供微乳液的步骤50；提供反应物水溶液的步骤52；将水溶液加入各等分微乳液中的步骤54；混合等分液以形成产生纳米微粒芯的反应混合物的步骤56；在芯中加入涂层剂以形成涂敷纳米微粒的步骤58。
步骤50中制备微乳液的方法是，在至少一种表面活性剂的存在下，将至少两种不溶混的液体混合在一起，形成热力学稳定的光学各向同性的分散液，此分散液是另一种液体中一种或两种液体的纳米大小液滴。分散液借助表面活性剂得到稳定，因为表面活性剂可减少两种液体界面上的表面张力。微乳液可以是油包水型(即反胶团或水滴分散在油中)、水包油型(即胶团或油滴分散在水中)，或者含类似量的两种不溶混流体的双连续体系。在某些情况下，微乳液可通过将两种极性不同、互溶解度可忽略不计的非水液体混合在一起来制备。本发明目前优选采用油包水型微乳液，因为它们与许多已知的化学反应相容，用来在水溶液中沉淀固体。
步骤50中所用不溶混液体一般包括相对极性(即疏水)液体和相对非极性(即亲水)液体。尽管可采用各种极性/非极性液体混合物形成用于本发明的微乳液，但具体所用液体的选择取决于所制备的纳米微粒的类型。熟练技术员通过制备本发明所用微乳液的已知方法，可以选择具体应用的特定液体。尽管其他极性液体也是有用的，但目前优选的相对极性液体是水。优选水是因为它廉价、易得，没有毒性，便于搬运和储藏，与大量不同的沉淀反应相容，不溶混于大量非极性溶剂。合适的非极性液体的例子包括烷烃(例如任何液体形式的己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷等)、环烷烃(例如环戊烷、环己烷等)、芳烃(例如苯、甲苯等)和它们的混合物(例如石油和石油衍生物)。一般地，任何这种非极性液体均可采用，只要它与用于形成微乳液的其他组分相容，并且不干扰所涉及的沉淀反应。
步骤50至少需要一种表面活性剂形成微乳液。表面活性剂是在热力学上稳定微乳液中很小分散胶团或反胶团的表面活性物质。表面活性剂通常具有两性结构，可在油相和水相之间形成具有界面张力很低的膜。因此，能减少相对极性和相对非极性液体的界面上的表面张力，并且与本发明其他方面相容的任何物质都可用来形成微乳液，进而用来制备纳米微粒。表面活性剂的选择取决于所用具体液体和要制备的纳米微粒的类型。适合特定用途的具体表面活性剂可根据制备微乳液的已知方法或表面活性剂的已知特征进行选择。例如，当微乳液的过程中采用离子反应物，并且离子洗涤剂或许与离子反应物结合或相反干扰离心反应物时，通常优选采用非离子表面活性剂。
已知有许多合适的表面活性剂。不详尽的名单包括皂类，如油酸钾、油酸钠；阴离子洗涤剂，如AerosolOT、胆酸钠、辛酸钠等；阳离子洗涤剂，如十六烷基氯化吡啶鎓、烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵等；两性洗涤剂，如N-烷基-N，N-二甲基氨丙磺酸盐和CHAPS；非离子洗涤剂，如聚氧乙烯酯、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯山梨聚糖酯、山梨聚糖酯和各种Triton(例如TX-100、TX-114等)。
步骤50中所用表面活性剂的浓度取决于许多因素，包括所选的具体表面活性剂、所用液体和要制备的纳米微粒的类型。合适的浓度可根据经验确定，即尝试不同浓度的表面活性剂，直到发现在特定应用中表现最好的浓度。合适的浓度范围也可根据已知的临界胶团浓度确定。
在优选实施方式中，用二(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠盐(AerosolOT、AOT)产生水和异辛烷的微乳液；用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)产生正己烷、正己醇和水的微乳液；用Triton X-100(TX-100)产生环己烷、正己醇和水的微乳液。虽然在本发明的大多数应用中，步骤50只用一种表面活性剂稳定微乳液，但也可以用一种或多种共表面活性剂。使用共表面活性剂有时有利于稳定反胶团体系。例如，在油和水的混合物中加入表面活性剂(如肥皂)的水溶液产生牛奶状乳化。加入共表面活性剂，如中等链长的醇，可使牛奶状乳液自然澄清，由于在油中形成很小的球形分散水滴。这种共表面活性剂功能进一步降低相间的界面张力，从而促进分散相的很小颗粒的形成。用于本发明的合适的共表面活性剂包括己醇、丁醇、戊醇、辛醇等中等链长的醇。步骤50的微乳液可通过简单地混合相对极性液体、相对非极性液体和一种或多种表面活性剂制备。对于制备油包水微乳液(含有水性反胶团)，相对非极性液体的体积大大超过相对极性液体的体积(例如，非极性液体：极性液体体积比在约10000∶1-100∶1之间)。尽管加入表面活性剂有时在不另外搅拌的情况下形成微乳液，但一般对混合物进行机械搅拌(例如用磁力)或超声处理。以形成微乳液。用于本发明的许多微乳液可在室温制备(即约20℃)，不需要加热。在其他情况下，通过提高表面活性剂在液体中的溶解度而加快微乳液的形成，有时要将成分的混合物加热(例如用加热板)到约25-80℃。
再来参看图2，在提供反应物的水溶液的步骤52和可将步骤52的水溶液加入步骤54中以分离微乳液的等分，采用上述方法制备油包水微乳液。步骤52和54可以这样完成，首先提供第一水溶性反应物(反应物A)和第二水溶性反应物(反应物B)，然后将反应物A加入第一等分的油包水微乳液中，将反应物B加入第二等分的油包水微乳液中。分别混合两等分微乳液，直到反应物A在第一等分微乳液的每个反胶团(在微乳液中连续形成、聚结和分裂的反胶团，从而使包含在其中的任何反应物在反胶团中等量分布)中达到平衡分布，反应物B在第一等分微乳液的每个反胶团中达到平衡分布。在步骤56中，溶解物种分布到平衡后，混合两等分微乳液。由于反胶团的碰撞和聚结，反应物A的阳离子和反应物B的阴离子彼此接触，反应形成作为纳米微粒芯的沉淀。
一般选择反应物A和b，这样它们可在微乳液的反胶团内反应形成沉淀。它们通常溶解在水性反胶团中，可以是固体、液体或气体。在优选实施方式中，反应物A是一种盐(例如具有假设的通式A+X-)，在第一等分微乳液的反胶团中溶解放出可溶阳离子(例如A+)，而反应物B是另一种盐(例如具有通式B+Y-)，在第二等分微乳液的反胶团内溶解到可溶性阴离子(例如Y-)中。所选反应物A的阳离子和反应物B的阴离子在二者在水溶液中混合时可形成沉淀(A+Y-)。尽管前面说明了本发明的一个优选方法，但用微乳液制备纳米微粒芯的其他方法也包括在本发明范围之内许多只需对前述优选方法稍作改变即可使用。例如，形成芯的反应可以在单一等分的微乳液中进行，而不是将两个不同等分的微乳液混合在一起。在这种情况下，可将反应物加入单一等分中，在微乳液的反胶团中溶解和平衡。随后，在单一等分中加入液体或气体形式的沉淀(例如还原或氧化)剂(例如氢、肼、NH4OH)，使溶解在反胶团中的反应物沉淀。
在微乳液中加入溶剂，如丙酮或乙醇，可以从微乳液中分离纳米微粒芯，然后对混合物过滤并/或离心，分离纳米微粒。在过滤时，过滤器的孔径小于纳米微粒的尺寸。在离心时，混合物可在微离心机中以10000RPM或更大的速度离心15分钟或更长时间，使纳米微粒形成小球，然后倾出上清液。用丙酮或乙醇/水溶液将分离的纳米微粒洗涤一次或多次，以除去任何表面活性剂或其他微乳液组分。分离和洗涤的纳米微粒可通过丙酮干燥。在使用或功能化之前，纳米微粒可重悬浮在合适的液体中。
在使用油包水微乳液技术时，纳米芯的尺寸是高度可控的。虽然芯尺寸通常与反胶团尺寸有关，但不一定是严格的关系，因为芯尺寸并不总是与最初存在于每个反胶团中的反应物的量有相关性。例如，即使是小纳米微粒芯(例如直径为2-5nm)，也包含约300-1000个原子，这在大多数情况下都比反应之前存在于每个胶束中的反应物分子的数目大得多。这表明，纳米微粒芯核首先在小部分胶团中形成，然后通过碰撞-聚吉过程消耗其他胶团中的反应物。
因此，制备纳米微粒芯时需要考虑的一个因素是纳米微粒芯形成的速率。纳米微粒芯形成的速率与反胶团聚结的速率直接相关。因此，选用的具体表面活性剂强烈也影响着芯的形成速率，控制着反胶团聚结的速率。也就是说，使微乳液的两个不溶混液体之间形成相对刚性界面的表面活性剂降低芯形成的速率，而形成流体界面的表面活性剂则提高速率。操作微乳液的其他性质，如离子强度、pH和温度以控制芯形成的速率。
通过经验调整初始反应物浓度和微乳液的组成参数，可得到大小分布均匀的纳米微粒芯(例如，芯尺寸的标准偏差百分数在约1-5％之间(例如，1、2、3、4和5％))，其平均直径约为1-300nm或更大。较大尺寸的芯(例如约1微米)可这样制备：(1)在反应介质(例如微乳液的反胶团)中加入浓度较高的试剂，和/或(2)通过声化学方法(即超声法)将分离的芯分散在合适的溶剂而不是微乳液中，制成均匀的芯悬浮液，然后在分散液中加入其他试剂。在后一种方法中，单独的芯常融合。
在大多数情况下，根据上述油包水微乳液技术制备的纳米微粒芯具有球状体形状(常规反胶团常是球状体)。通过改变芯形成过程中的各种参数，有可能产生其他形状的芯。例如，通过在微乳液中加入浓度很高的十二烷基硫酸钠，可制成椭圆形或管形的芯。作为另一个例子，如果选择反应物可形成具有晶体结构的芯，可制备具有规则或不规则多面体形状的纳米颗粒芯。
可采用磁性材料，如磁铁矿、磁赤铁矿和硫复铁矿作为芯子的部分制成磁性纳米微粒。通过改变这种磁性芯的整体尺寸和形状，它们可制成超顺磁性或稳定的单域(从磁场中移走后保持稳定磁矩的粒子)。芯子尺寸与磁性纳米微粒是不是超顺磁性的还是单域有关。因此，相对等大的超顺磁性粒子的芯尺寸一般小于50-80nm。对于尺寸超过此上限的粒子，粒子的磁化分成不同磁化矢量区，以便最大程度减小内磁能。再来参看图2，本发明制备纳米微粒的方法的一个特征是包含步骤58，此步骤加入涂层剂，形成涂层纳米微粒。步骤58所用涂层剂可以是使氧化硅(或其他物质)沉积到纳米微粒芯表面上的任何涂层剂。目前优选的试剂包括活性硅酸盐，如原硅酸四乙酯(TEOS)或氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)(均购自Sigma，St.Louis)。为涂敷芯，可在纳米微粒芯的溶液(例如，在其中制备芯的微乳液)中简单加入这种活性硅酸盐和诸如氢氧化铵或NaOH的还原剂。对混合物可搅拌适当长的时间，使芯氧化硅涂敷。
氧化硅涂层的厚度和形成氧化硅涂层的反应速率取决于加入活性硅酸盐的量、反应时间、加入还原剂的量和反胶团的尺寸(当在油包水微乳液中进行涂敷时)。提高还原剂(例如[NH4OH])与活性硅酸盐(例如[TEOS])的浓度通常导致在指定反应时间后形成较厚的涂层。提高极性液体(例如水)与活性硅酸盐的浓度通常导致在指定反应时间后形成较薄的涂层。控制涂层厚度的精确反应条件可随所用特定试剂、芯材料等而变化。但是，这些条件可根据经验，通过简单的实验改变试剂浓度和反应时间及条件来确定。
本发明方法还包括对如上所述制备的涂层纳米微粒进行功能化的步骤(即用一个或多个化学官能团衍生)。在氧化硅上连接官能团的许多已知方法都适用于本发明。(例如，参见Iler，R.，《氧化硅的化学：溶解度、聚合作用、胶体和表面性质及生物化学》(The Chemistry of Silica：Solubility，Polymerization，Colloid and Surface Properties，and Biochemistry)，Wiley-Interscience，NY，1979；VanDerVoort，P.和Vansant，E.，Journal of Liquid Chromatography and RelatedTechnologies，19：2723-2752，1996；Weetall，H.编，《固定化酶、抗原、抗体和肽：制备和鉴定》(Immobilized Enzymes，Antigens，Antibodies，and Peptides：Preparation and Characterization)，M.Dekker，NY，1975.)在涂有氧化硅的纳米微粒上添加官能团的典型过程包括用硅烷化剂处理纳米微粒，硅烷化剂与纳米微粒的氧化硅表面反应并使一个化学基团与纳米颗粒的氧化硅表面结合。化学基团本身可以是官能团，或可以作为可结合官能团的基底。
例如，在一个示范性方法中，可上述制备涂有氧化硅的纳米微粒，用三甲基甲硅烷基丙基二亚乙基三胺(DETA)对微粒表面进行硅烷化，DETA是将伯胺基连接到氧化硅表面上的硅烷化剂。然后，可用溴化氰(CNBR)法将抗体或其他蛋白质共价地与硅烷化表面结合。例如，以CNBR介导的结合可这样完成，即将事先用DETA硅烷化的氧化硅涂层纳米微粒悬浮在2M碳酸钠缓冲液中，对混合物进行超声处理，产生微粒悬浮液。然后在微粒悬浮液中加入CNBR溶液(例如2g CNBR/1ml乙腈)，以活化纳米微粒。用中性缓冲液(例如PBS，pH＝8)洗涤纳粹微粒后，在活化纳米微粒悬浮液中加入抗体溶液，使抗体结合到纳米微粒上。在涂有抗体的纳米微粒中还可加入甘氨酸溶液，以屏蔽任何剩余的未反应位置。
在其他方法中，用生物素-链霉抗生物素蛋白连接对纳米微粒进行官能化。例如，首先用戊二醛交联法以抗生物素蛋白涂敷纳米微粒的氧化硅壳，以稳定氧化硅表面上的抗生物素蛋白。然后用常规方法使官能团(例如抗体或核酸分子)生物素化。生物素化的官能团然后与涂有抗生物素蛋白的纳米微粒混合，形成涂有官能团的纳米微粒。
使用纳米微粒的方法
本发明的纳米微粒可用于各种用途。例如，涂有抗体的荧光纳米微粒可用来有特异地标记细胞。涂有核酸的荧光纳米微粒可用来检测特异的多核苷酸。此外，涂有核酸的磁性纳米微粒可用来从混合物中分离并收集特异的多核苷酸，包括DNA和RNA。
标记细胞
本发明的纳米微粒可用来标记细胞(例如真核细胞或原核细胞)，其中一种方法如图3所示。在图3A中，抗体衍生的掺杂了染料的纳米微粒10在容器30中与靶细胞20(例如癌细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、细菌细胞等)和非靶细胞21混合。靶细胞20在其表面上表达靶抗原22，而非靶细胞21则没有。在所示纳米微粒中，芯12包含荧光/发光材料，如R6G、荧光素、Ru/Bpy或TMR，官能团16包含可特异地结合靶抗原22的抗体。现在看图3B，纳米微粒10通过官能团16与靶抗原22的相互作用和靶细胞20用物理方法结合。当容器30中的纳米微粒10与靶细胞20在允许抗体-抗原结合的条件下(例如约室温，中性至稍碱性pH的低盐缓冲液)混合时，这种结合自发地形成。非靶细胞21不特异地结合纳米微粒10，因为它们不表达靶抗原22。
核酸检测
本发明还提供了检测样品中具体靶核酸分子存在的方法。一种方法采用结合了官能团(例如，与部分或全部靶核酸互补的寡核苷酸)的发光或荧光纳米微粒，所述官能团在指定反应条件下(例如严格的杂交条件)杂交到具体靶核酸分子的特定核苷酸序列中。在此方法中，可将发光/荧光纳米微粒加入含有靶核酸分子的样品中，所述靶核酸分子具有特定核苷酸序列，通过(例如)分析发光或荧光，检测纳米微粒与具有特定核苷酸序列的靶核酸分子之间的结合。
参见图4，检测样品中核酸分子存在的另一种方法是采用在基底上固定核酸分子。在此方法中，将俘获核酸分子固定在合适的基底上，如涂有氧化硅的石英表面。然后将样品加入基底，这样，如果样品包含具有核苷酸序列的靶核酸分子，该分子杂交到俘获核酸上，则靶核酸将结合俘获核酸。为检测这种相互作用，可使基底与探针核酸接触，探针核酸分子与发光或荧光纳米微粒结合。探针核酸分子有杂交到靶核酸上的核苷酸序列，但没有俘获核酸。如果样品中存在靶核酸，在基底上将检测到荧光/发光的增加(例如通过光谱)。
用MB检测核酸
检测核酸存在和/或从核酸混合物中分离核酸的另一个方法是利用固定在基底上的MB，所述基底如玻璃板或纳米微粒。MB是设计的单链寡核苷酸探针，在它们的靶DNA序列不存在的情况下，这些分子具有茎环结构(Tyagi S和Kramer FR，Nature Biotechnology，14，303-308，1996)。分子的环部分是用来与特异性互补靶核酸杂交的。信标两端的碱基形成茎，且彼此互补。茎的一端与荧光团结合，另一端与淬灭剂结合。在靶DNA不存在的情况下，分子的发夹形使荧光团与淬灭剂非常接近。在这种构型中，荧光团捕获的光能转移到淬灭剂上。淬灭剂优选为非荧光发色团，它将从荧光团接收的能量以热的形式扩散，结果使发夹形构型中探针的荧光强度经探针呈开放或线性构型时的荧光强度小得多。
在茎的两端上标记了荧光团和淬灭剂的MB用示意图如图5所示。当探针遇到合适的靶DNA分子时，其环部分形成比茎更长、更稳定的杂交体。由于与靶DNA序列形成的杂交体的刚性和长度，茎杂交体的继续存在是不可能的。因此，与靶DNA序列杂交时，MB经历自发的构型重组，迫使茎分开，并使荧光团和淬灭剂离开。荧光团从淬灭剂中分离然后逆转淬灭，从而通过荧光团检测发射的荧光。因此，MB与靶分子杂交时发出的荧光信号比不杂交时更强。MB已经成功地用于DNA杂交研究(Tyagi S和Kramer FR，Nature Biotechnology，14，303-308，1996；Tyagi S，Bratu D，Kramer FR，Nature Biotechnology，16，49-53，1998；Kostrikis LG，Tyagi S，Mhlanga MM，Ho DD，Kramer FR，Science 279，1228-1229，1998；Giesendorf BAJ，Vet JAM，Tyagi S，Mensink EJMG，TrijbelsFJM，Blom HJ，Clinical Chemistry；44：482-486，1998)。环的尺寸及其含量可通过设计不同的MB来改变。此外，淬灭剂和荧光团可视具体用途而改变。
参见图5，本发明提供了固定在基底上的MB如固体板或纳米微粒，以特异地结合具有特定核苷酸序列的靶核酸分子。如图5所示，用于本方法的优选MB包括探针寡核苷酸(示于茎-环结构中)。寡核苷酸具有能与靶核酸分子杂交的核苷酸序列。它还结合到荧光团(例如荧光素或若丹明基染料)和荧光团的淬灭剂(例如DABCYL)上。可使用任何合适的荧光团-淬灭剂组合，例如TMR和DABCYL(见下面的实施例部分)，只要当荧光团靠近淬灭剂时，发生荧光能共振转移(FRET)，这样可检测到荧光团的发射光谱中的变化。非荧光发色团DABCYL[4-(4’-二甲基氨基苯基偶氮苯甲酸)]优选用于许多用途，因为它可用作MB中任何荧光团的通用淬灭剂(Tyagi S，Bratu D，Kramer FR，NatureBiotechnology，16，49-53，1998)。
在图5所示模型中，荧光团结合到探针寡核苷酸的一端(例如5’端)，淬灭剂结合到寡核苷酸的另一端(例如3’端)。在靶核酸分子不存在的情况下，探针寡核苷酸呈茎-环结构的构型(由于自身杂交)，其中荧光团靠近淬灭剂——在该构型中，FRET引起荧光团发射的荧光减少。设计可形成这种茎-环结构的寡核苷酸的方法是众所周知的。当存在靶核酸分子时，它杂交到探针上，使探针重新配置成线性结构，由于荧光团和淬灭剂分离时FRET减少或消失，荧光发射增加。因此，靶核酸的存在可通过观察荧光的增加来确定。
MB的固定
MB可用已知化学方法固定到基底上，如纳米微粒或载玻片。例如，可用生物素-抗生物素蛋白体系将生物分子固定到固体表面上(Anzai，J.，Hoshi，T.和Osa，T.Trends in Analytical Chemistry，13，205-210，1994；Narasaiah，D.，Nowall，W.B.和Kuhr，W.G.Anal.Chem.69，2619-2625，1997)。例如，在本发明的一个实施方式中，生物素分子掺入MB的结构内。然后可将生物素化的MB通过生物素-抗生物素蛋白连接到涂有抗生物素蛋白的表面上。
将生物素官能团连接到MB上需要定位连接位点，使靶DNA分子与MB的单链环区中的互补DNA最佳杂交。测试生物素连接的不同位置：环序列、茎的荧光团一侧的第二碱基对位置和茎的淬灭剂一侧的相同位置。生物素连接到茎的淬灭剂一侧的结构将生物素对MB发荧光、淬灭和杂交能力的影响减少到最低程度。利用具有18个碱基对环序列的MB，在生物素和序列之间插入间隔物。用生物素-dT使靶DNA分子容易与环序列杂交，并使它们足够的分离，以便将抗生物素蛋白与DNA序列之间潜在的相互作用减少到最低程度。
基因磁性纳米微粒
本发明还有一种方法是使用MB结合的纳米微粒从样品中分离特定靶核酸分子，如包括不同于仅有一个碱基的靶寡核苷酸的样品，或者含有DNA和蛋白质混合物的样品。在此方法的一种型式中，磁性纳米微粒与MB结合，而MB与靶核酸结合(例如，在严格的杂交条件下)。这些结合的磁性纳米微粒已称为基因纳米俘获剂(GMNC)。参见图6，可在样品中加入MB-GMNC，在MB与靶核酸(即DNA1’)和相差一个碱基的靶(即DNA2’)杂交的条件下，用荧光成像检测杂交的序列(见下面的具体实施例)。在本发明的另一个实施方式中，可用MB-GMNC从复杂混合物中分离痕量RNA(例如mRNA)，包括细胞裂解液。MB与选择的DNA或RNA靶杂交后，然后用磁铁从样品中取出MB-GMNC与靶核酸结合。然后可用分离杂交核酸的常规方法，例如提高含MB-GMNC的溶液的温度或盐浓度，将靶核酸从MB-GMNC中分离出来。尽管前述方法可用没有结合荧光团或淬灭剂的MB进行，使用这种结合的MB，可通过荧光分析监控分离过程。
实施例
实施例1制备掺杂的纳米微粒
(A)在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/正己烷/正己醇(共表面活性剂)/水组成的油包水微乳液中制备Eu/Bpy(Eu3+/2，2’-二吡啶基)-掺杂的氧化硅纳米微粒。使用磁搅拌器混合2.916g CTAB、75ml正己烷、15ml正己醇和880μl水，制备90ml油包水微乳液贮存液。10ml贮存液等分成两份5ml等分液。在其中一份5ml等分液中加入50μl TEOS和5μl 0.1M Eu/Bpy(水溶液)，搅拌混合物1小时，形成TEOS/Eu/Bpy溶液。在另一份5ml等分液中加入137μl NH4OH，搅拌混合物1小时，形成NH4OH溶液。然后将NH4OH溶液滴加到TEOS/Eu/Bpy溶液中，所得混合溶液搅拌过夜。混合溶液中水与表面活性剂的摩尔比为15(水∶表面活性剂)。在混合溶液形成的微乳液中加入25ml丙酮，使Eu/Bpy掺杂的氧化硅纳米微粒以粉末形式分离出来，在微离心机中以10000RPM对所得混合物离心15分钟，沉淀纳米微粒，除去上清液，用丙酮或乙醇/水溶液将剩余的纳米微粒洗涤数次，以进一步除去表面活性剂和其他微乳液组分。然后用丙酮干燥洗涤过的纳米微粒。
(B)制备Ru/Bpy[RuII(Bpy)3]掺杂的纳米微粒。用磁搅拌器混合7.5ml环己烷、1.8ml正己醇、1.77ml TX-100、340μl水和140μl 0.1M RuII(Bpy)3(水溶液)1小时，制备10ml油包水微乳液。然后将所得溶液分成两份5ml等分液。在一份等分液中加入100μl TEOS，搅拌混合物30分钟，形成TEOS溶液。在另一份5ml等分液中加入60μl NH4OH，搅拌混合物30分钟，形成NH4OH溶液。然后在10分钟内将NH4OH溶液滴加到TEOS溶液中，所得混合溶液搅拌过夜。用上面实施例1A所述方法分离Ru/Bpy掺杂的氧化硅纳米微粒。
(C)制备四甲基罗丹明(TMR)掺杂的纳米微粒。
混合1.77ml Triton X-100(表面活性剂)、1.8ml正己醇(共表面活性剂)、7.5ml环己烷(油)和0.48ml 1.2mM TMR的乙酸(水)溶液，制备油包水微乳液。在微乳液中加入前体(100μl TEOS)，接着搅拌30分钟。再搅拌24小时，完成氧化硅聚合反应。为打破微乳液体系，进一步从溶液中分离纳米微粒，在微乳液中加入20ml丙酮。超声处理和涡动搅拌后，对溶液进行离心，得到TMR掺杂的纳米微粒。所得纳米微粒用95％乙醇洗涤4次，用丙酮洗涤1次。每次洗涤后，使用超声处理和搅拌纳米微粒完全分散在溶液中。
为阐明在形成纳米微粒的过程中乙酸在掺杂TMR分子中的作用，用一种无机酸，即盐酸(HCl)与乙酸作了比较。在不同浓度的HCl中加入恒量的TMR，形成水滴(Water Pool)。就像用纯水一样，在水滴中用HCl得到不含TMR的氧化硅纳米微粒。此结果表明，TMR在氧化硅基体内捕获不是由pH变化引起的，而是TMR在有机酸中的溶解度引起的。
在微乳液体系中合成TMR掺杂纳米微粒的过程中，乙酸还用作TEOS水解的催化剂。在微乳液体系中加入60μl NH4OH改进了聚合过程。为进一步降低大颗粒形成的可能性，在合成过程后，用乙醇和丙酮洗涤所得纳米微粒。用TEM观察由微乳液法制备的TMR掺杂的氧化硅纳米微粒，表明纳米微粒的最终尺寸很大程度上取决于球形水滴的大小。通过改变水与表面活性剂的比值(W0)，可得到不同尺寸的纳米微粒。作为一个实例，使用W0值为10，得到直径为60±4nm的纳米微粒。
乙酸浓度对TMR掺杂的影响。水滴中乙酸的浓度极大地影响纳米微粒内捕获的TMR分子的量。当乙酸浓度低于10.0M时，掺杂的TMR分子很少，如纳米微粒的低荧光强度所示。当水滴中乙酸的浓度高于10M时，掺杂的TMR量极大地增加。
TMR浓度对纳米微粒的荧光强度的影响。TMR掺杂的纳米微粒的荧光强度取决于氧化硅基体内掺杂的TMR分子的数目。由于自淬灭，纳米微粒的荧光强度并不与染料掺杂的分子的数目成正比。对于特定尺寸的纳米微粒，存在一个最佳染料浓度，在此浓度下可获得最大荧光强度。为确定最佳TMR浓度，在0-4mM(相对于水滴总体积)改变染料浓度的条件下，合成TMR掺杂的氧化硅纳米微粒。所得纳米微粒的荧光强度用分光荧光计在550nm激发波长和575nm发射波长下检测含有0.1mg/ml纳米微粒的溶液。结果显示，TMR浓度为1.2mM时，TMR掺杂的纳米微粒的荧光强度最高。另外，TMR分子负载减少纳米微粒的荧光强度，因为TMR分子的自身淬灭。
TMR掺杂的纳米微粒的荧光信号的放大。测定了TMR掺杂的纳米微粒相对于无机染料掺杂的纳米微粒的可达到的信号增强的程度。用上述相同的微乳液法合成了RuBpy掺杂的纳米微粒。用显微镜和高灵敏分光荧光计检测溶液中和固定在固体表面上的纳米微粒的荧光信号。两类纳米微粒样品用相同的方法处理。
对于在溶液中检测，用分光荧光计分析了几种浓度的纳米微粒，范围在0.1-1μg/ml。根据纳米微粒的密度，计算每个样品中纳米微粒的数目，得到单个纳米微粒的平均荧光信号。结果显示，一个TMR纳米微粒的荧光强度比一个RuBpy纳米微粒的荧光强度高40倍。
又用类似的方法比较了TMR掺杂的纳米微粒和TMR分子。结果表明，TMR纳米微粒比TMR分子的信号增强了15000倍。用不同实验方法进一步证实所得放大作用。根据用显微镜观察到的玻璃表面上的荧光成像，检测单个纳米微粒的荧光强度。在频繁的超声处理和涡流搅拌下，纳米微粒溶液稀释到样品中很少有纳米微粒聚集的程度(此结果由SEM证实)。因此，显镜成像中的每个荧光斑点对应于单个纳米微粒。一个TMR纳米微粒的平均荧光强度可用ImageJ软件通过统计方法获得，所得结果与分光荧光计测得的结果有好的相关性。
TMR掺杂的纳米微粒的稳定性。为证实纳米微粒的光学稳定性，比较了纯TMR分子和溶液中的TMR掺杂的氧化硅纳米微粒。用550nm的光连续辐射20分钟后，纯染料分子的荧光强度减少85％，而纳米微粒的荧光强度保持恒定。
TMR掺杂的纳米微粒在水溶液中的长期稳定性。此分析集中于染料分子从长期浸泡在溶液中的氧化硅基体中渗漏出来的可能性。TMR掺杂纳米微粒在水溶液中分别浸泡3天和7个月，随后检测溶液的荧光强度。对样品进行离心，将TMR掺杂的纳米微粒从含有任何TMR分子的上清液中分离出来，TMR分子是从纳米微粒中沥出的。将沉淀重悬浮在水中到其原来的体积，并检测荧光强度。离心前后荧光强度的对比表明，在水溶液中3天后，TMR分子没有从基体中泄漏。贮存7个月后，只有8.5％TMR从氧化硅基体中泄漏。这些结果清楚表明，TMR一旦在氧化硅基体内捕获，它们仍牢固地包埋在纳米微粒内。
(D)制备R6G掺杂的纳米微粒。3ml染料的乙醇溶液(浓度为1mM)与1.0ml苯基三乙氧基硅烷(PTES)混合。向所得溶液中加入盐酸或氢氧化胺，使PTES开始水解。几个小时后，通过形成单相体系表明反应完成。然后在水解溶液(0.5ml)加入100μl溶解在5.0ml乙醇中的TEOS，进一步通过Stber过程与氢氧化胺反应(Stber等，J.Colloid and Interface Sci.26：62，1968)。在连续超声处理和频繁涡流搅拌下，反应在0℃进行1小时。在混合物中加入过量的丙酮，终止纳米微粒形成。
TEM和SEM表明，上述过程导致产生直径大约100nm的有机染料掺杂的纳米微粒。反应进行12小时以上时，得到微米级微粒。
PTES的量对于在纳米微粒中俘获R6G来说是一个重要因素。增加PTES的量，相应地增加掺杂的染料分子的产量，从荧光强度的增加可看出。比较了不同PTES∶TEOS体积比的样品的荧光强度，这些体积比是(1SR1)0.25∶1，(1SR2)0.5∶1，和(1SR3)1∶1。据测定，沉淀开始形成时，有一个限制比。PTES浓度太高，产生的纳米微粒的疏水性高。发现2∶1或较低比例产生水溶性纳米微粒产物。在PTES和TEOS恒定量的条件下，测定了溶液中R6G的浓度的影响。R6G的标称浓度增加，观察到荧光强度也增加。比较了分散在1ml溶液中的1mg样品和各种浓度纯R6G的荧光强度。根据用纯R6G分子建立的校正曲线，在纳米微粒中捕获的R6G的量计算小于1％。如果纳米微粒内R6G的浓度为1％，则纳米微粒显示的荧光强度高于染料的最佳含量20％的RuBpy掺杂的纳米微粒。
一旦氧化硅基体内捕获染料分子，就用丙酮和水洗涤纳米微粒。掺杂的染料分子在水溶液中显示出最小的泄漏。将样品浸泡在溶液中3天，比较了离心前后溶液的荧光强度。对3天的水溶液进行离心，将染料掺杂的纳米微粒从上清液中分离出来。将沉淀再次重悬浮在水到原来的体积，并比较了原来溶液和再悬浮沉淀的荧光强度。没有观察到荧光强度的明显差异，这表明大多数染料分子保留在纳米微粒的基体中，推测是由于PTES的疏水物性。
为测定光褪色，比较了纯染料和染料掺杂的纳米微粒的光稳定性。连续辐照样品1000秒，用固态分光荧光计照测荧光强度。为最大程度减少实验的不稳定性，在鉴定中将样品夹在两个盖玻片之间。结果表明，纯R6G的强度迅速下降，而纳米微粒内R6G的荧光强度在相同条件下没有明显改变。有机染料在纳米微粒中的光稳定性大幅度提高，这最大程度减少了生物鉴定的光褪色，从而提高了用这些纳米微粒进行生物分析的准确性。
实施例2用抗体结合的纳米微粒进行细胞检测
在几个应用中使用涂有氧化硅的纳米微粒表明它们在细胞识别和标记中的用途。在一种实施方式中，涂有氧化硅的纳米微粒与抗体结合。如实施例1(A)所述方法制备的纳米微粒与抗体衍生的方法是，首先用DETA对微粒表面进行硅烷化，DETA是将伯胺基连接到氧化硅表面上的硅烷化剂。用荧光胺证实纳米微粒表面上存在氨基，荧光胺是非荧光分子，但与伯脂族胺基反应时强荧光(Cordek等，1999；Chung，1997)。用DETA进行表面硅烷化后，用溴化氰(CNBR)法将抗体(鼠抗人CD10)固定到硅烷化氧化硅表面上。如上述方法制备染料掺杂的微粒，干燥，用超声法悬浮在9.0ml 2M碳酸钠溶液(活化缓冲液)中。然后在搅拌和室温下，于5分钟内将CNBR的乙腈溶液(1.0mg CNBR溶解在0.5ml乙腈中)滴加到纳米悬浮液(10mg/ml)中。所得CNBR活化的微粒用冰凉的水洗涤两次，用PBS缓冲液(pH 8.0)洗涤两次。然后在表面修饰的微粒中加入40μl在PBS缓冲液(pH 8.0)中稀释的抗体，在4℃下继续搅拌24小时。然后用10ml0.03M甘氨酸溶液处理所得抗体衍生的纳米微粒30分钟，以屏蔽任何剩余的活性位点。洗涤最终产物，将其再悬浮在PBS缓冲液(pH 8.0)中，贮存在4℃备用。没有观察到纳米微粒的光学和光谱性质的变化。
将单核淋巴细胞悬浮在细胞培养基中(约200万个细胞/ml)。用抗CD10固定纳米的微粒培养细胞悬浮液2小时。培养后，用光学显微镜和荧光显微镜对细胞悬浮液成像。显微镜分析表明，大多数细胞得到标记(染料掺杂的微粒发出亮光)。光学图像与荧光图像的相关性很好。在用非抗体衍生的染料掺杂微粒进行的对照实验中，没有观察到标记的细胞。在标记的细胞中，信噪比(即荧光图像中亮区和暗区的强度比)超过500。
实施例3采用蛋白质结合的纳米微粒的方法
PDGF结合的纳米微粒。为评价纳米微粒在检测血小板源性生长因子(PDGF)受体中的用途，使PDGF与TMR纳米微粒(如实施例1所述制备)结合，通过共价固定到纳米微粒上。首先对TMR掺杂的氧化硅纳米微粒的表面进行化学修饰。为了在纳米微粒表面上形成胺官能化基团，在室温下使氧化硅纳米微粒与1％DETA在1mM乙酸中反应30分钟，连续搅拌。用去离子蒸馏水将胺官能人的纳米微粒彻底洗涤3次。用DMF洗涤后，在N2气下，纳米微粒与10％琥珀酸酐于DMF溶液中反应6小时，连续搅拌。纳米微粒用水彻底洗涤后，在室温用100mg/ml EDC和100mg/ml NHS在MES缓冲液(pH 8.0)中活化25分钟，连续搅拌。用水洗涤的纳米微粒分散在0.1M PBS(pH 7.3)中。为了将PDFG共价固定在纳米微粒表面上，在连续搅拌下，使纳米微粒与10nM PDGF在室温反应3小时，形成纳米微粒-蛋白质的结合物，接着用PBS缓冲液洗涤。为减少后续反应中非特异性结合的效应，在使用之前蛋白质结合的纳米微粒与1％BSA反应，并用0.1M PBS(pH 7.3)洗涤。
用乳房癌细胞秒HTB-26测试PDGF-纳米微粒的结合。在37℃5％CO2下，用PDGF-TMR-纳米微粒培养HTB-26细胞悬浮液30分钟。用光学和荧光显微镜分析表明，明亮标记的细胞表示在用PDGF-TMR-纳米微粒培养的细胞中在HTB-26细胞上存在PDGF受体。相反，用不含PDGF的TMR-纳米微粒培养的细胞没有荧光。这些结果表明，细胞的荧光标记是由于PDGF-TMR-纳米微粒与细胞表面上的PDGF受体结合。对于TMR掺杂的纳米微粒在细胞研究中可用作强荧光和光稳定的生物标记、涉及受体结合，上述结果提供了一个清楚的应用例子。在此方法的另一个例子中，用PDGF结合的TMR掺杂纳米微粒培养表达PDGF受体的腺癌细胞(MDA-MB-231)。荧光显微镜再次表明，细胞表面连接PDGF结合的TMR掺杂纳米微粒。
GDH结合的纳米微粒。测试了R6G掺杂的纳米微粒在谷氨酸盐检测中作为生物传感器，通过将一种酶，即谷氨酸盐脱氢酶(GDH)固定到纳米微粒表面。采用已述方法的改变形式将GDH固定到纳米微粒上(Cordek J.等，Anal.Chem.71：1529，1999；Qhobosheane S.等，Analyst 126：1274，2001)。简单地说，为与酶生物结合，用2％氨基硅烷N1-[3-(三甲氧基硅烷基)丙基]二亚乙基三胺的1mM乙酸溶液进行修饰。所得纳米微粒进一步用双功能交联剂戊二醛处理，然后与谷氨酸盐脱氢酶(GDH)结合。每步之后都进行充分洗涤。在测定固定在纳米微粒上的GDH分子的活性时，采用酶反应： 。检测NADH的荧光，以分析谷氨酸盐。
用涂有BSA的纳米微粒检测固定的分析物。用物理方法将抗生物素蛋白吸附到涂有氧化硅、R6g掺杂的纳米微粒和玻璃板上。然后抗生物素蛋白与戊二醛交联，并储存在Tris-HCl缓冲液中。用两种不同浓度的生物素化牛血清白蛋白(BSA)处理涂层玻璃板。每个BSA分子平均含9个生物素分子。生物素-抗生物素蛋白的相互作用如下检查，即使涂有抗生物素蛋白的纳米微粒与玻璃板上的生物素分子结合。用荧光显微镜进行实验，所选滤光器组适合罗丹明6G的520nm激发和550nm发射。含生物素标记BSA的浓度最高(2mg/ml)的玻璃表面粘附的纳米微粒的数量增加最多，而含未修饰的BSA的对照玻璃上观察到结合很少。
实施例4核酸的检测
用Ru/Bpy掺杂的氧化硅纳米微粒用作检测特定DNA分子的探针。此方法的概要于图4，其中三个不同的寡核苷酸(即DNA1、DNA2和DNA3)用于夹心测定。一种生物素捕获DNA-DNA1固定在涂有抗生物素蛋白的玻璃基底上。靶DNA-DNA2在促进杂交的条件下在基底上接触。与DNA3结合的染料掺杂的氧化硅纳米微粒也加入基底中。DNA1和DNA3包含与靶DNA-DNA2不同部分互补的核苷酸序列。用倒置显微镜检测发光信号，用SEM确定纳米微粒探针与基底表面的结合。
DNA固定在石英玻璃基底上。将盖玻片浸泡在10M NaOH中清洁过夜，然后在含1mg/ml抗生物素蛋白(Molecular Probes，Eugene，OR)的10mM磷酸盐溶液缓冲液(pH 7.0)溶液中温育12小时。抗生物素蛋白层通过与戊二醛(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)交联(戊二醛浓度为1％，室温下在100mM磷酸钾缓冲液中1小时)得到稳定，随后在1M Tris-HCl(pH 7.5)温育。将250nL 20μM生物素DNA1(5’TAA CAA TAA TCC T3’；SEQ ID NO：1)(IDT，Coralville IA)等分液点在基底上，然后在增湿室中温育12小时。
DNA固定在纳米微粒探针上。将10mgRu/Bpy掺杂、涂有氧化硅的纳米微粒在1ml抗生物素蛋白溶液中温育(Fang等，Anal.Chem.72：747A，2000)。抗生物素蛋白涂层与1％戊二醛交联，纳米微粒在Tris-HCl溶液中温育。然后将纳米微粒在1ml 20μM DNA3中温育12小时，将DNA3(5’TAT CCT TAT CAA TATT3’；SEQ ID NO：2)固定在纳米微粒的表面上。每步之后严格洗涤和离心。当温育用DNA3的浓度为1μM时，再悬浮所得微粒，最终浓度为0.5mg/ml。
DNA杂交。将等分靶溶液，即DNA2溶液(5’GGA TTA TTG TTA AAT TTAGAT AAG GAT 3’；SEQ ID NO：3)(IDT，Coralville IA)加热到50℃，放到固定在基底上的DNA1的斑点上，温育4小时。用缓冲液严格洗涤后，将DNA3结合的纳米微粒加到基底上，在增湿室中杂交4小时。每步之后严格洗涤。然后进行温育。分析了10-12-10-6范围不同浓度的靶DNA2。在所有实验中，所用探针DNA和俘获DNA的浓度相等。
光学测试和成像。用装有增强电荷偶联装置(ICCD)的倒置荧光显微镜(Olympus，IX708F型)获得发光图像。SEM图像用Hitachi S-4000 FE-SEM获得。浓度依赖的发光强度数据用来估计检测限度。选择性实验用类似方法进行。比较了来自互补靶和单碱基错配DNA的发光信号。
用上述方法可将DNA1固定在涂有抗生物素蛋白的玻璃基底上。然后使固定的DNA1与DNA2的一端杂交。然后使DNA2的未杂交的15个碱基与连接到Ru/Bpy掺杂的、涂有氧化硅的纳米微粒上的生物素DNA3杂交。洗涤掉任何未杂交DNA探针和物理吸附的纳米微粒后，对基底表面进行成像。荧光和SEM图像证实，纳米微粒连接到基底表面上，表明三种不同的DNA发生杂交。
为检验温度对杂交过程的影响，分别在25℃、35℃、45℃和55℃重复前述测定。用恒温控制使温度达到平衡。发光强度随着温度的升高而增加达到45℃，高于此温度观察到强度下降。在下面讨论的大多数实验中，为方便起见，采用25℃。
DNA靶的高灵敏度分析。还用荧光成像技术测试了不同范围的靶DNA(DNA2)，即10-12-10-6M浓度的信号的浓度依赖性。绘制了10-11-10-9M和10-9-10-6M的校正曲线。用成像软件得到了每个样品的平均信号强度。除了最高浓度范围(1μM及以上)外，靶DNA浓度与发光信号之间总体上有极好的线性关系。在5×10-7M和1×10-6M观察到可能的饱和。这种浓度依赖性在荧光发光图像和SEM图像上是明显的。SEM图像表明，纳米微粒的密度随着靶DNA浓度的增加而增加。俘获DNA和探针DNA的浓度在这些实验中保持不变。引人注意的是，此测定的检测限度为3×10-12M。
区分A-T和G-c错配。上述方法如此灵敏，以致可区分27bp线性DNA中单个碱基的错配。如图7A所示，由相等浓度的互补DNA(即DNA2)和单碱基错配的靶DNA，即xDNA2(5’GGA T AA TTG TTA AAT TTA GAT AAG GAT 3’；SEQ ID NO：4)得到的发光强度之间有大的差异。而且，染料掺杂的纳米微粒提供的信号放大如此强，以至于A-T错配能够与G-c错配不同，参见图7B。
实施例5用固定分子信标检测和分离核酸
化学制品和设备。所有生化制品购买来即可使用。溶菌酶(Lyz)、血红蛋白(Hb)和BSA购自Sigma(St.Louis，MO)。氯化铁、氯化亚铁、Triton X-100、异辛基苯基醚、4-(C8H17)C6H4(0CH2CH3)nOH(n～10)和TEOS购自Aldrich ChemicalCo.Inc.(Milwaukee，WI)。环己烷、正己醇、氢氧化钠购自Fisher ScientificCo.(Pittsburgh，PA)。在合成磁性纳米微粒时，所有水溶液均用去离子蒸馏水(Easy Pure LF)制备。FS20超声仪(Fisher Scientific Co.)、离心机5810R(Eppendorf)、Hitachi H-7000透射电子显微镜(日本)和MPMS-5S超导量子干涉仪(SQUID)磁力仪用于合成和表征磁性纳米微粒。用Fluorolog TAU-3分光荧光计(Jobin Yvon-Spex，Instruments S.A.，Inc.)检测不同温度下的荧光强度。
(A)制备连接到表面上的生物素MB。
合成生物素MB。适合连接到表面上的MB的设计基于抗生物素蛋白-生物素连接。设计的MB的核苷酸序列总共28个碱基对，其中18个碱基对是感兴趣的环序列。5个碱基对彼此互补形成茎。所选荧光团是TMR，淬灭剂是DABCYL(均购自Molecular Probes，Eugene，OR)。靶DNA具有如下序列：5’-TTCCTT CCT GGG CAT GGA-3’(SEQ ID NO：5)。设计与靶DNA杂交的生物素MB的分子量为10076，其序列如下5’-GCA CGT CCA TGC CCA GGA AGG AACG(生物素dT)G C-3’(SEQ ID NO：6)，分别在其5’和3’端与TMR和DABCYL结合。
生物素MB用DABCYL-CPG(可控孔度玻璃)为原料合成。合成涉及4个重要步骤。第一，CPG固相支持体与DABCYL衍生，用于启动3’端的合成。用标准氰乙基亚磷酰胺化学法依次加入剩余的核苷酸，包括生物素-dT残基，它含有与环的C5碳连接的生物素(Glen Research)。生物素的目的是提供与抗生的素蛋白分子连接，该分子与表面结合。第二，核苷酸的5’端与(CH2)6-NH连接臂连接，在5’端产生伯胺基。5’端的伯胺基通过6碳间隔臂与磷酸二酯相连。最后的5’端有一个三苯甲基保护基团，用于保护氨基。第三，用反相HPLC纯化寡核苷酸，并转化为钠盐形式。最后，在碳酸氢钠/DMF缓冲液中用TMR标记纯化后的寡核苷酸过夜。用乙酸处理1小时，除去5’三苯甲基，接着真空干燥过夜。标记后，用凝胶过滤色谱在Sephadex G-25上除去过量的染料。然后用反相HPLC纯化代表设计的生物素MB的寡核苷酸，并收集主峰。
用生物素MB在溶液中进行杂交研究。用新合成的生物素MB测定其在溶液中的DNA杂交性质。杂交性质用荧光测定法在SPEX Industries F-112A分光光度计上进行测定。杂交实验中采用亚微石英池。制备了三种溶液，它们包含：单独MB；超过其互补靶DNA5倍摩尔的MB；超过非互补DNA5倍摩尔的MB。所有三种溶液中MB的最终浓度均为50nM。在缓冲液中培育上述溶液(200μl)20分钟，缓冲液包含20mM Tris-HCl、50mM KCl和5mM MgCl2(pH＝8.0)。在室温下记录515nm处激发的发射光谱。
在溶液中杂交的生物素MB显示，与靶DNA分子反应时，荧光信号增强了10倍以上。具有非互补DNA的溶液显示，在相同条件下荧光信号没有增强。比较了生物素MB与没有生物素的MB的杂交动力学，两种情况下得到了类似结果。
(B)制备和使用固定在固体板上的MB。
生物素MB固定在氧化硅板上。为制备氧化硅涂层表面，先用1∶1的HCl∶水溶液清洁氧化硅玻璃盖玻片2小时。用水彻底清洗后，将盖玻片放在10MNaOH溶液中过夜，再次用水清洗。然后在抗生的素蛋白溶液(0.1mg/ml，10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0)中培育处理过的盖玻片12小时。在1％戊二醛缓冲液中交联1小时使物理吸附的抗生物素蛋白稳定，接着在1M Tris-HCl(pH 6.5)中培育3小时。然后用磷酸盐缓冲液洗涤涂有抗生物素蛋白的盖玻片，在氮气下干燥。为产生涂有MB的表面，将一滴生物素MB溶液(1×10-6M，在缓冲液中)加到涂有抗生物素蛋白的盖玻片上。抗生物素蛋白-生物素结合时间从几分钟到半小时。然后用杂交缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM KCl，5mM MgCl2，pH 8.0)洗涤盖玻片，以除去任何未结合的MB。结合过程快速且高效，在数分钟之内就达到覆盖平衡。甚至在缓冲液中浸泡几天后，固定的MB仍连接在涂有抗生物素蛋白的表面上。
用固定在板上的生物素MB进行杂交研究。在不同杂交条件下监测MB荧光强度。用荧光显微镜、ICCD、氩离子激光器和将光传导到显微镜载物台的光纤探针监测荧光信号，如前面所述(Fang，X和Tan，W，Anal.Chem.71，3101-3105，1999)。先将514nm的激发激光光束导入具有50μm芯子的光纤探针，然后偶联于显微镜载物台上的棱镜。棱镜表面上产生了渐消场，棱镜夹在MB固定的氧化硅板玻璃上，并用于激发固定的MB。这样产生的荧光信号用物镜收集，并导向ICCD。
当固定在氧化硅板上的MB与其互补DNA靶分子相互作用时，形成双链DNA双链体，从而使连接在MB上的荧光团发出的荧光信号增加。MB探针的测试用不同浓度的互补DNA分子进行，浓度范围为5-600nM。结果表明，MB固定的板可用于检测纳摩尔范围内的靶DNA分子。当用非互补DNA分子时，荧光信号没有增加。其他实验表明，固定在板上的MB在杂交后可再生，因而这种板可反复用于DNA的检测和相互作用的研究。
(C)固定在纳米微粒表面上的MB的制备。
生物素MB的设计与合成。为用于研究固定在纳米微粒表面上的MB，用上述方法设计并合成了MB，它具有15个核苷酸环和5个核苷酸臂。环序列5’-ATC AAT ATT TAA CAA-3(SEQ ID NO：7)与编码炭疽致死因子的DNA互补。为研究DNA与MB的杂交，制备了四个不同的DNA靶序列：DNA1’：5’-TTGTTA AAT ATT GAT-3(SEQ ID NO：8)；DNA2’：5’-TTA TTA AAT ATT GAT-3’(SEQ ID NO：9)；DNA3’：5’-TAG TTA TAA ATT GTT-3’(SEQ ID NO：10)和DNA4’：5’-TAG TTA TAA ATT ATT-3’(SEQ ID NO：11)。在此生物素MB中，用荧光素作荧光团，用DABCYL作淬灭剂。用根据上述设计合成的MB固定在磁性纳米微粒的表面上。
MB在磁性纳米微粒表面上的固定。涂有氧化硅的磁性纳米微粒用上述油包水微乳液法合成。微乳液用Triton X-100表面活性剂制备。用FeCl2和FeCl3形成氧化铁纳米微粒。在微乳液中加入TEOS，形成氧化硅层。MB通过抗生物素蛋白-生物素连接固定在磁性纳米微粒的表面上。简言之，先在冰箱中抗生物素蛋白溶液(2mg/ml，在10mM磷酸盐缓冲液中，pH＝7.3)培育涂有氧化硅的磁性纳米微粒14小时，将抗生物素蛋白涂敷在纳米微粒表面上。随后用0.5ml缓冲液将涂有抗生物素蛋白的纳米微粒洗涤三次。室温下，在100mM磷酸钾缓冲液中使涂层纳米微粒与1％戊二醛交联1小时，从而稳定抗生物素蛋白层。涂有抗生物素蛋白的纳米微粒用0.5ml 1M Tris-HCl缓冲液(pH＝7)洗涤三次后，在冰箱中于Tris-HCl缓冲液中培育3小时。
为将MB固定的涂有抗生物素蛋白的磁性纳米微粒的表面上，在冰箱中用含有1.0×10-6M生物素MB的溶液培育12小时。每个抗生物素蛋白分子有四个生物素结合位点。为保证每个外露生物素基团与抗生物素蛋白分子结合，使用过量的抗生物素蛋白。纳米微粒用20mM Tris-HCl/5mM MgCl2缓冲液(pH＝8)洗涤三次，将具有表面结合的MB的磁性纳米微粒(MB-GMNC)储存在冰箱中备用。
为研究MB固定方法的有效性，比较了MB培育上清液、洗液和MB-GMNC的荧光强度。向三种溶液中各加入6倍过量的互补DNA’。由于荧光素与DABCYL分子之间荧光能量转移，向MB中添加DNA1’减少了荧光淬灭。GMNC样品的荧光强度比上清液或洗液都高得多，这表明大多数MB(在一个实验中为92.2％)都与GMNC结合，MB与GMNC结合保留了结合靶DNA的能力。
(D)用MB-GMNC分离和收集靶DNA。
分离程序的设计和步骤。测定了按上述方法制备的MB-GMNC从多核苷酸复杂混合物中选择性地俘获靶DNA的能力，某些情况下存在蛋白质。图6以图解形色说明分离过程的总体设计和步骤。在混合物中掺入DNA和蛋白质的试验中，所选混合物包含痕量靶DNA1’和DNA2’、大量随机DNA3’和DNA4’(100倍浓度)和1000倍浓度的几种蛋白质，即BSA、Hb和Lyz。DNA1’是MB环序列的完整互补靶，而DNA2’是单碱基错配序列。
在30分钟内，在18℃向DNA-蛋白质复杂混合物中加入MB-GMNC，使DNA靶与MB-GMNC结合，从而开始实验。分离过程涉及三个步骤。第一步是从复杂混合物中分离并回收靶序列(DNA1’和DNA2’)。DNA1’和DNA2’在GMNC表面上与MB有特异地杂交，而随机DNA序列和蛋白质则没有。当混合物暴露于磁铁时，从混合物中收集并分离含有痕量DNA1’和DNA2’的GMNC。
第二步是从DNA2’中分离DNA1’。DNA1’和DNA2’的分离基于用MB形成的双链体的熔化温度中的差异。在GMNC中加入20μl 20mM Tris-HCl/5mMMgCl2缓冲液。在15分钟内将GMNC缓冲液的温度升到32℃，从而分离DNA1’和DNA2’。在此温度下，DNA2’完全从GMNC中解离，而DNA1’仍结合在GMNC表面上。然后溶液重暴露于磁场，将结合DNA1’的GMNC除去。上清液含有DNA2’。因此，DNA1’和DNA2’从混合物中分离出来，也彼此分离开来。
分离过程的最后一步是从MB-GMNC回收DNA1’。在结合DNA1’的MB-GMNC中加入20μl 20mM Tris-HCl/5mM MgCl2缓冲液。在15分钟内将溶液的温度升到并固定于52℃，导致DNA1’从MB-GMNC中完全解离。然后采用施加磁场将MB-GMNC从溶液中除去。
选择熔化温度分离和收集DNA。如图6所示，分离过程的第二步涉及紧密相关的DNA序列的分离，借助于MB和靶DNA序列间形成的DNA双链体的熔化温度中的差异。进行测试验确定差别分离完全匹配，即互补的DNA序列(例如DNA1’)和结合MB-GMNC表面的单碱基错配DNA序列(例如DNA2’)的合适温度。这需要测定MB与互补序列(DNA1’)能稳定杂交而与单碱基错配序列(DNA2’)不能稳定杂交的温度范围。用具有与MB相同环序列的线性DNA探针发现，互补序列和单碱基错配DNA之间的熔化温度差异为7℃。相反，用与MB的环的相同序列，则温度差导为21℃。
在温度范围内进一步研究了温度对DNA1’和DNA2’与MB结合的影响，有和没有固定在GMNC上。结果示于图8。图8a显示固定在GMNC上的MB的结果。在含有MB-GMNC的溶液中加入过量6倍的DNA1’(0.6μM，曲线1)或DNA2’(0.6μM，曲线2)。检测了溶液的荧光强度随温度而变化。将温度从8℃缓慢增加到75℃，为达到平衡，每次测试间隔2℃，持续时间5分钟。如图8A所示，在低温下，GMNC表面上的DNA1’-MB和DNA2’-MB双链体发出荧光良好，这表明MB因杂交作用而呈开放(线性)构型。随着温度的升高，两种样品中发射的荧光下降。但是，即使在最低温度下，单碱基错配样品(DNA2’)的荧光强度也大大低于互补DNA(DNA1’)。错配双链体在18℃以上就变得不稳定，在32℃完全解离。相反，32℃仅3％解离的DNA1′双链体的稳定。因此，将温度升到32℃有可能从DNA2′中分离DNA1′。在此温度下，用解离到溶液中的3％DNA1′分离了100％的DNA2’。
还测定了未结合到GMNC上(即在溶液中)的MB双链体的熔化温度曲线。图8b显示溶液中的游离MB与其靶序列之间的杂交结果。实验条件和过程同图8A。DNA1’溶液包含0.6μM DNA1’和0.1μM MB(曲线1)，DNA2’溶液包含0.6μM DNA2’和0.1μM MB(曲线2)。曲线3显示溶液中只有MB的对照。比较图8A和8B的结果，可以看到由MB固定在GMNC表面上形成的双链体(图8A)和溶液中的双链体(图8B)的熔化曲线间有明显差异。很明显，当MB固定在GMNC表面上时，具有DNA1’和DNA2’的MB双链体的熔化温度曲线均向较高温度偏移。这一点大图8c中进一步说明，该图直接比较了MB与DNA2’在两种条件下形成的双链体的熔化曲线，即MB固定在GMNC表面上(曲线1)和MB在缓冲液中(曲线2)。如图8C所示，DNA2’-MB双链体开始解离的温度从MB在溶液中的10℃偏移到MB结合GMNC的18℃。
(E)用MB-GMNC从DNA-蛋白质复杂混合物中回收痕量靶DNA。
为进一步探测MB-GMNC的性能，研究了从蛋白质/多核苷酸复杂混合物中回收痕量靶DNA的效率。分析了三种普通蛋白质Hb、BSA、Lyz和两个15个碱基随机多核苷酸(DNA3’和DNA4’)与MB-GMNC相互作用，与其靶DNA(即DNA1’和DNA2’)结合的能力。制备一种含10-7M Hb、BSA、Lyz，10-8M DNA3’和DNA4’，3fmol(3.13×10-10M)DNA1’和DNA2’的溶液，向其中加入0.1ml含MB-GMNC的等分溶液。根据上述步骤进行分离。
DNA1’和DNA2’与GMNC表面上的MB特异地杂交，而随机DNA序列和蛋白质则不能。对MB-GMNC进行磁分离后，测定了DNA1’和DNA2’的荧光信号。如图9所示，MB-GMNC能够从多核苷酸和蛋白质的复杂混合物中俘获痕量，即3fmol靶DNA1’和DNA2’。在这些研究中，收集的互补DNA1’的浓度低至3×10-15M，而收集的单碱基错配DNA2’的浓度低至约9×10-15M。在此情况下，只需用常规分光计进行研究。用更灵敏的分析方法(例如，见Fang和Tan，Anal.Chem.71，3101-3105，1999；Zhang和Tan，Chem.-Eur.J.6，1087-1092，2000)，俘获甚至更低浓度的靶应可检测到。
(F)用MB-GMNC俘获DNA靶的效率比。
用上述DNA-蛋白质复杂混合物中的DNA1’和DNA2’进一步研究了用MB-GMNC收集和分离它们的互补DNA和单碱基错配DNA的效率。在一组试验中，浓度均为25nM的DNA1’和DNA2’溶液与过量MB-GMNC杂交，用分光计测定两种溶液的荧光光谱。同时，制备25nM DNA1’和25nM DNA2’的混合物，根据上述过程和步骤从混合物中分离DNA1’和DNA2’。分离并收集DNA1’和DNA2’后，分别在分离的DNA1’和DNA2’溶液中加入过量MB-GMNC，其浓度与分离前所用的相同，然后测定荧光。分离和收集前后，DNA1’和DNA2’的量没有差异。结果显示，用浓度为25nM(2.5×10-10M)的DNA靶分离和收集的效率高于97％。
为确定该方法在其他靶浓度的收集效率，用MB-GMNC测试了具有DNA1’和DNA2’浓度较低(即在皮摩尔范围内)的复杂样品。结果取每个条件下5个重复实验的平均值，示于表1。在每个混合物中，潜在干扰物的浓度相同。即使靶DNA1’和DNA2’的浓度低至8.25×10-12M，收集效率也接近或高于95％。
                    表1从复杂混合物中分离DNA1’和DNA2’的效率*
  样品号   混合物中的靶浓度(pM)   分离后的靶浓度(pM)       收集效率(％)
   DNA1’     DNA2’     DNA1’     DNA2’     DNA1’     DNA2’
    1    25.0     25.0     24.4     24.3     97.6     97.2
    2    12.5     50.0     11.8     48.5     94.4     96.9
    3    8.25     8.25     7.82     8.15     94.8     98.8
    4    8.25     100.0     8.56     98.6     103.4#     98.6
*在每个样品中，Hb、BSA、Lyz的浓度为1×10-7M，DNA3的浓度为1×10-8M。靶DAN1’和DNA2’的浓度范围分别在8.25-25×10-12M和8.25-100×10-12M。#：由于测定的体积较小而产生的误差。
G.用MB-GMNC从混合物中俘获mRNA。
合成分子信标。如上所述设计第一分子信标(MB1；SEQ ID NO：7)，它具有15个核苷酸环和5个核苷酸臂。选择荧光素作为荧光团，用DABCYL[4-(4’-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸]作淬灭剂。设计第二MB(MB2)，它具有18个碱基环和5个碱基臂。此环序列与部分鼠204核苷酸(nt)γ-肌动蛋白mRNA互补。为比较线性DNA探针和分子信标，设计了15个碱基线性DNA探针，它的序列与MB1的环序列相同，以荧光素为荧光团。线性DNA探针的靶向用DABCYL作为淬灭剂标记。设计几种不同的靶DNA序列用于以MB和线性探针研究DNA杂交。所有的DNA序列示于表2。
         表2DNA探针和靶的序列
  MB1    5’-ATC AAT ATT TAA CAA-3’(SEQID NO：7)
靶DNA1(与MB1环序列完全互补) 5’-TTG TTA AAT ATT GAT-3’(SEQID NO：8)
靶DNA2(与MB1环序列单碱基错配) 5’-TTA TTA AAT ATT GAT-3’(SEQID NO：9)
随机DNA3 5’-TAG TTA TAA ATT GTT-3’(SEQID NO：10)
随机DNA4 5’-TAG TTA TAA ATT ATT-3’(SEQID NO：11)
MB2 5’-TMR(-C6Am)GCA CGT CCA TGCCCA GGA AGG AAC G(生物素dT)GC(DABCYL)-3’(SEQ ID NO：12)
靶DNA5(与MB2环序列完全互补) 5’-TTC CTT CCT GGG CAT GGA-3’(SEQ ID NO：13)
204ntγ-肌动蛋白mRNA的碱基815-832(与MB2环序列互补) TTC CTT CCT GGG CAT GGA(SEQID NO：14)
线性DNA探针 5’-荧光素/C ATC AAT ATT TAACAA-3’(SEQ ID NO：15)
靶DNA6(与线性DNA探针完全互补) 5’-TTG TTA AAT ATT GATG/DABCYL-3’(SEQ ID NO：16)
靶DNA7(与线性DNA探针单碱基错配) 5’-TTA TTA AAT ATT GATG/DABCYL-3’(SEQ ID NO：17)
制备γ-肌动蛋白mRNA。从鼠肺组织中分离RNA，然后用cDNA循环试剂盒(Introgen BV)反向转录到具有Oligo(dT)引物的cDNA上。引物对5’-GCGCTT CCG GTG TCC AGA-3’(SEQ ID NO：18)和5’-GCC AGG GCT GTG ATCTCC-3’(SEQ ID NO：19)用于PCR扩增。反应进行25次循环。用PCR2.1载体(TA Cloning Kit，Invitrogen)克隆204-bp DNA片段的PCR产物。然后将重组质粒转人入大肠杆菌INVα细胞。制备DNA的微量制品，并用BamHI线性化。为产生γ-肌动蛋白RNA，在Ambion Megascript中将1.0μg线性化质粒DNA模板用于T7转录反应。纯化后，产生204nt鼠γ-肌动蛋白mRNA。
从混合物中俘获痕量mRNA。为测定MB-GMNC从混合物中收集mRNA和PCR产物的能力，制备含有204nt鼠γ-肌动蛋白mRNA片段(与MB2环序列互补的碱基782-985，碱基815-832)的人工混合物。混合物中蛋白质和随机DNA序列与上述实施例5E中的相同。
DNA分离过程。用纯MB2和mRNA绘制荧光强度随mRNA的浓度变化的校正曲线。在室温下杂交后，MB的荧光强度增加，其方式类似于MB2与完全互补的靶DNA5杂交的方式。此结果表明，即使靶的序列比MB长10倍，MB也能与靶mRNA杂交。这些实验的结果也表明，当mRNA的浓度很低时，mRNA与其靶杂交的时间较长。
校正后，将包含不同浓度mRNA的混合物加入MB-GMNC溶液。对于mRNA浓度低的样品，采用60分钟的杂交时间，以确保检测到所有的mRNA。按照上述DNA分离研究所用分离程序，用施加磁场将MB-GMNC从混合物中分离出来。MB-GMNC与mRNA杂交后，通过检测溶液的荧光强度，研究了收集的mRNA的量。用MB-GMNC收集mRNA的效率列于表3。
                        表3从混合物中分离DNA1和DNA2的效率
 样品号  分离前的浓度(pM)      分离后的浓度(pM)       回收率(％)
 DNA1   DNA2  DNA1平均值±SD，n＝5  DNA2平均值±SD，n＝5   DNA1(％)  DNA2(％)
  1  8.25  100.0    8.56±0.28    98.6±1.01    103.4#   98.6
  2  12.5  50.0    11.8±0.74    48.5±0.72    94.4   96.9
  3  25.0  25.0    24.4±0.45    24.3±0.63    97.6   97.2
  4  50.0  12.5    46.9±0.71    11.1±0.57    93.8   88.8
  5  8.25  8.25    7.57±0.52    8.15±0.44    91.8   98.8
  6   mRNA：10.0pM        9.30±0.73          93.0
  7   mRNA：15.0pM        14.7±0.79          98.7
  8   mRNA：20.0pM        18.9±0.47          94.5
*在每个样品中，Hb、BSA、Lyz的浓度为1×10-7M，DNA3的浓度为1×10-8M。#：由于测定的体积较小而产生的误差。
H.用MB-GMNC从细胞中俘获mRNA。
用MB-GMNC从培养的HTB-26细胞中收集156个碱基的mRNA序列。按供应商的说明在90mm烧瓶中培养乳房癌细胞系HTB-26(购自美国模式培养物保藏所)。在细胞中加入萃取液/BME缓冲液，进行细胞裂解，连续涡流搅拌1分钟。为使细胞碎片的匀浆液澄清并沉淀蛋白质，室温下以12.000xg对裂解物10离心分钟。将含mRNA的上清液倾出，在70℃变性5分钟。在含1％β-巯基乙醇的稀释缓冲液中使MB-GMNC与细胞裂解物混合。然后对混合物施加磁场，将MB-GMNC从溶液中分离出来，然后直接检测荧光强度。mRNA序列中的18个碱基与MB2环序列完全互补。在HTB-26细胞内没有具有相同的18个碱基的另外mRNA。
从培养的细胞中俘获mRNA。从细胞中萃取mRNA后，用MB-GMNC特异地俘获mRNA分子。从细胞溶解物(图10，曲线a)分离的MB-GMNC中可检测到明显的荧光信号可证明这一点。两个对照实验的结果证实，荧光信号实际上由于MB与靶mRNA的杂交。一种对照实验是在裂解细胞之前加入MB-GNMC，接着磁场分离并洗涤。如曲线b所示，在与曲线a相同的条件下分析时，在MB-GMNC溶液中可检测到没有荧光。此外，在相同条件下用HTB-26细胞裂解物培养具有来自MB2的不同序列的MB时，在MB-GMNC溶液中观察到没有可检测的荧光信号(图10，曲线c)。
实施例6细菌的标记
染料掺杂的纳米微粒与对大肠杆菌菌株O157:H7特异的抗体结合。这些抗体结合的纳米微粒和未结合的纳米微粒(作为负对照)分别与含有大肠杆菌菌株O157:H7的溶液混合，混合时间要足以使抗体与结合抗原。然后过滤混合物，用扫描电镜(SEM)和荧光显微镜进行分析。SEM和荧光显微镜均显示，抗体结合的纳米微粒与细菌相连，而未结合的纳米微粒则没有。
其他实施方式
虽然上述说明书包含许多细节，但不应认为对本发明范围的限制，而只是优选实施方式的例子而已。其他许多变化是可能的。因此，本发明的范围不由所述实施方式决定，而由附加权利要求书和它们的合法同等物决定。
序列表
<110>W.谭(Tan，Weihong)
     J.寿光(Jin，Shouguang)
     X.赵(Zhao，Xiaojun)
     R.T.戴蒂奥科(Dytioco，Rovelyn)
     T.J.德拉克(Drake，Timothy)
     L.R.西拉德(Hilliard，Lisa)
<120>功能化纳米微粒及其使用方法
<130>5853-252WO
<160>19
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>13
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<400>1
taacaataat cct                                                       13
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<400>2
tatccttatc aatatt                                                    16
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
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<223>人工合成的寡核苷酸
<400>3
ggattattgt taaatttaga taaggat                                        27
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<400>4
ggataattgt taaatttaga taaggat                                        27
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
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<223>人工合成的寡核苷酸
<400>5
ttccttcctg ggcatgga                                                  18
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(26)
<223>Biotin dT
<400>6
gcacgtccat gcccaggaag gaacgtgc                                       28
<210>7
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
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<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
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ttgttaaata ttgat                                                     15
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<223>人工合成的寡核苷酸
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tagttataaa ttgtt                                                     15
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
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<223>人工合成的寡核苷酸
<400>11
tagttataaa ttatt                                                     15
<210>12
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>人工合成的寡核苷酸
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<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>羧基-四甲基-若丹明(TMR)(-C6Am)
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(26)
<223>Biotin dT
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(28)
<223>DABCYL
<400>12
gcacgtccat gcccaggaag gaacgtgc                                       28
<210>13
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<212>DNA
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<223>人工合成的寡核苷酸
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<212>DNA
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<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<400>14
ttccttcctg ggcatgga                                                  18
<210>15
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>荧光素
<400>15
catcaatatt taacaa                                                    16
<210>16
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>DABCYL
<400>16
ttgttaaata ttgatg                                                    16
<210>17
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>DABCYL
<400>17
ttattaaata ttgatg                                                    16
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<400>18
gcgcttccgg tgtccaga                                                  18
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<400>19
gccagggctg tgatctcc                                                  18

Claims (33)

1.一种使纳米微粒定向靶分子的方法，该方法包括如下步骤：
(a)提供具有氧化硅表面的纳米微粒，所述氧化硅表面与至少一个能与靶分子特异结合的官能团结合；
(b)在所述至少一个官能团能结合靶分子的条件下，混合纳米微粒和靶分子。
2.权利要求1所述方法，其特征在于纳米微粒还包含由氧化硅表面包封的芯。
3.权利要求2所述方法，其特征在于所述芯包含金属。
4.权利要求3所述方法，其特征在于所述金属是磁性金属。
5.权利要求2所述方法，其特征在于所述芯包含染料。
6.权利要求5所述方法，其特征在于所述染料是有机染料。
7.权利要求5所述方法，其特征在于所述染料是无机染料。
8.权利要求5所述方法，其特征在于染料选自：Ru II/2，2’-二吡啶基、Eu3+/2，2’-二吡啶基、罗丹明6G、四甲基罗丹明和荧光素。
9.权利要求1所述方法，其特征在于所述官能团是蛋白质。
10.权利要求9所述方法，其特征在于蛋白质是抗体。
11.权利要求9所述方法，其特征在于蛋白质是酶。
12.权利要求9所述方法，其特征在于蛋白质是抗生物素蛋白。
13.权利要求9所述方法，其特征在于蛋白质是生物素。
14.权利要求1所述方法，其特征在于官能团是核酸。
15.权利要求14所述方法，其特征在于核酸是DNA。
16.权利要求14所述方法，其特征在于核酸呈分子信标的形式。
17.权利要求16所述方法，其特征在于分子信标与荧光素结合。
18.权利要求17所述方法，其特征在于分子信标还与荧光团的淬灭剂结合。
19.权利要求1所述方法，其特征在于官能团通过生物素-抗生物素蛋白连接与氧化硅表面结合。
20.权利要求1所述方法，其特征在于靶分子在细胞内。
21.权利要求20所述方法，其特征在于靶分子在细胞表面上。
22.权利要求20所述方法，其特征在于靶分子位于细胞内部。
23.权利要求20所述方法，其特征在于所述细胞是真核细胞。
24.权利要求23所述方法，其特征在于真核细胞是哺乳动物细胞。
25.权利要求24所述方法，其特征在于哺乳动物细胞是癌细胞。
26.权利要求20所述方法，其特征在于细胞是原核细胞。
27.权利要求26所述方法，其特征在于原核细胞是细菌。
28.权利要求1所述方法，其特征在于靶分子包含在液体中。
29.权利要求1所述方法，其特征在于它还包含检测纳米微粒与靶标分子的结合的步骤(c)。
30.权利要求29所述方法，其特征在于纳米微粒与靶分子的结合通过观察纳米微粒的性质变化来检测。
31.权利要求30所述方法，其特征在于所述性质是发光。
32.权利要求1所述方法，其特征在于靶分子包含在混合物内，该方法还包含从混合物中分离出包含与靶分子结合的纳米微粒的复合物的步骤(c)。
33.权利要求32所述方法，其特征在于它还包含从复合物中分离靶分子的步骤(d)。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100371713C (zh) * 2006-01-13 2008-02-27 东南大学 金或银纳米粒子的表面功能化及比色检测生物分子的方法
CN100441677C (zh) * 2005-10-20 2008-12-10 上海师范大学 免疫磁性纳米粒子细菌分离器及其制法和应用
CN1987454B (zh) * 2006-10-31 2011-01-12 成都夸常医学工业有限公司 含定向纳米结构功能化区的纳米结构组成及其制备和应用方法
CN102192986A (zh) * 2010-03-19 2011-09-21 胡卫红 一种心肌肌钙蛋白i的检测试剂及其制备方法和用途
CN102786030A (zh) * 2012-07-06 2012-11-21 江苏大学 一种通过溶剂处理制备多肽纳米薄膜的方法
CN103443626A (zh) * 2011-02-15 2013-12-11 协和梅迪克斯株式会社 链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法
CN101827896B (zh) * 2007-08-13 2014-05-07 宝洁国际运营股份有限公司 染料吸附颗粒
CN105579068A (zh) * 2013-09-23 2016-05-11 伦斯勒理工学院 在各种细胞群中纳米颗粒介导的基因传递、基因组编辑和靶向配体的修饰
CN107735684A (zh) * 2015-06-26 2018-02-23 柯尼卡美能达美国研究所有限公司 快速且高敏感的细菌检测

Families Citing this family (170)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7192713B1 (en) 1999-05-18 2007-03-20 President And Fellows Of Harvard College Stabilized compounds having secondary structure motifs
CN1312479C (zh) * 2003-08-08 2007-04-25 清华大学 一种纳米荧光磁粒及其制备方法
PL1680443T3 (pl) 2003-11-05 2014-02-28 Dana Farber Cancer Inst Inc Stabilizowane alfa-helikalne peptydy i ich zastosowanie
US7906345B2 (en) * 2003-11-12 2011-03-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Magnetic nanoparticles, magnetic detector arrays, and methods for their use in detecting biological molecules
US7462452B2 (en) 2004-04-30 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Field-switch sequencing
CA2569067C (en) * 2004-06-01 2013-04-02 James H. Adair Unagglomerated core/shell nanocomposite particles
EP1756169B1 (de) * 2004-06-04 2009-11-11 Basf Se Verfahren zum markieren von materialien
EP1787124A2 (en) 2004-06-23 2007-05-23 The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of biological molecules using a two particle complex
US7405002B2 (en) * 2004-08-04 2008-07-29 Agency For Science, Technology And Research Coated water-soluble nanoparticles comprising semiconductor core and silica coating
US7534489B2 (en) * 2004-09-24 2009-05-19 Agency For Science, Technology And Research Coated composites of magnetic material and quantum dots
WO2007001448A2 (en) 2004-11-04 2007-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals
KR100613189B1 (ko) 2004-11-15 2006-08-21 미지테크주식회사 은 나노 합성 섬유 및 그 제조방법
KR100624447B1 (ko) 2004-11-25 2006-09-18 삼성전자주식회사 은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법
US20060217893A1 (en) * 2005-01-07 2006-09-28 Yanbin Li Method for detecting an unknown contaminant concentration in a substance
US7699979B2 (en) * 2005-01-07 2010-04-20 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Separation system and efficient capture of contaminants using magnetic nanoparticles
US20080135490A1 (en) * 2005-01-07 2008-06-12 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Quantum dot biolabeling and immunomagnetic separation for detection of contaminants
US20070055013A1 (en) * 2005-02-21 2007-03-08 Noriho Kamiya Substrate and method of immobilizing protein
CA2599975C (en) * 2005-03-03 2013-07-30 University Of North Dakota Surfaces coated with target-induced fluorescent compounds for detection of target elements
CN1861628B (zh) * 2005-05-11 2010-05-05 上海师范大学 一种分离中药蛋白质的方法
KR101111747B1 (ko) * 2005-05-16 2012-06-12 삼성엘이디 주식회사 혼합 나노 입자 및 이를 이용한 전자소자
ATE496380T1 (de) 2005-06-23 2011-02-15 Siemens Healthcare Diagnostics Magnetpartikel mit einer geschlossenen, ultradünnen silikaschicht, verfahren zu deren herstellung und verwendung
US20110097277A1 (en) 2005-08-25 2011-04-28 University Of Washington Particles coated with zwitterionic polymers
WO2007029980A1 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Biterials Co., Ltd. Magnetic nanoparticle having fluorescent and preparation method thereof and use thereof
US8906609B1 (en) 2005-09-26 2014-12-09 Arrowhead Center, Inc. Label-free biomolecule sensor based on surface charge modulated ionic conductance
CN101321686A (zh) * 2005-10-07 2008-12-10 佛罗里达大学研究基金会有限公司 用于多路信号传递和光编码的多组分纳米颗粒
JP5451074B2 (ja) * 2005-12-06 2014-03-26 エルジー・ケム・リミテッド コアシェル型のナノ粒子及びその製造方法
US20090317802A1 (en) * 2005-12-09 2009-12-24 Bhatia Sangeeta N Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells
WO2007075456A2 (en) * 2005-12-15 2007-07-05 University Of Florida Research Foundation, Inc. Colorimetric light switching probe for ultrasensitive detection of target compounds
WO2007070682A2 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Massachusetts Institute Of Technology System for screening particles
JP4670659B2 (ja) * 2006-01-25 2011-04-13 住友電気工業株式会社 蛍光標識金属粉末、ならびに該蛍光標識金属粉末を含有する異方導電膜、実装品
FR2898519B1 (fr) * 2006-03-20 2009-01-09 Commissariat Energie Atomique Nanoparticules notamment a structure coeur coquilles, enrobees
WO2008105773A2 (en) 2006-03-31 2008-09-04 Massachusetts Institute Of Technology System for targeted delivery of therapeutic agents
JP5630998B2 (ja) 2006-05-15 2014-11-26 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 機能的粒子のためのポリマー
US9381477B2 (en) 2006-06-23 2016-07-05 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic synthesis of organic nanoparticles
EP1889810A1 (en) * 2006-08-10 2008-02-20 HeiQ Materials AG Method for producing nanoparticle loaded powders using flame spray pyrolysis and applications thereof
WO2008028124A1 (en) * 2006-09-01 2008-03-06 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods and systems for detection of contaminants
US20100303723A1 (en) * 2006-11-20 2010-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Drug delivery systems using fc fragments
US20110189101A1 (en) * 2006-12-01 2011-08-04 National University Corporation Shimane University Fluorescent labeling agent and fluorescent labeling method
WO2008073856A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of nanoparticles and/or agents to cells
CA2674632A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 University Of Washington Dual-functional nonfouling surfaces and materials
CA2939778C (en) 2007-01-31 2019-01-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized p53 peptides and uses thereof
US9217129B2 (en) * 2007-02-09 2015-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Oscillating cell culture bioreactor
EP2508531B1 (en) * 2007-03-28 2016-10-19 President and Fellows of Harvard College Stitched polypeptides
JP2010523595A (ja) 2007-04-04 2010-07-15 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ポリ（アミノ酸）ターゲッティング部分
WO2008124634A1 (en) 2007-04-04 2008-10-16 Massachusetts Institute Of Technology Polymer-encapsulated reverse micelles
US20080255403A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-16 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Magnetic nanoparticle therapies
EP2137533A2 (en) * 2007-04-19 2009-12-30 3M Innovative Properties Company Uses of water-dispersible silica nanoparticles for attaching biomolecules
US8597959B2 (en) * 2007-04-19 2013-12-03 3M Innovative Properties Company Methods of use of solid support material for binding biomolecules
JP4981510B2 (ja) * 2007-04-27 2012-07-25 古河電気工業株式会社 逆ミセル分散系を用いてなるシリカナノ粒子の製造方法、該方法により得られたシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬
DE102007020220B3 (de) 2007-04-28 2008-11-13 Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh Verfahren zur magnetisch unterstützten Extraktion
US20080269086A1 (en) * 2007-04-30 2008-10-30 Atanu Adhvaryu Functionalized nanosphere lubricants
US20090215643A1 (en) * 2007-07-26 2009-08-27 Cellay, Llc Highly Visible Chromosome-Specific Probes and Related Methods
EP2025364A1 (en) * 2007-08-13 2009-02-18 Procter &amp; Gamble International Operations SA. Compositions comprising dye-loaded particles
EP2025720B1 (en) * 2007-08-13 2010-12-08 Procter & Gamble International Operations SA Spray-drying process for the manufacture of dye-loaded particles
JP5192752B2 (ja) * 2007-08-15 2013-05-08 古河電気工業株式会社 逆ミセル分散系を用いてなるシリカナノ粒子の製造方法、該方法により得られたシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬
US20090047222A1 (en) * 2007-08-15 2009-02-19 Ben Gu Color Stable Peroxide Containing Dentifrice Formulations With Dye Encapsulated Silica Shell Nanoparticles
MX350501B (es) 2007-10-12 2017-09-07 Massachusetts Inst Technology Nanotecnologia de vacuna.
US9533006B2 (en) 2007-11-19 2017-01-03 University Of Washington Marine coatings
ES2457541T3 (es) 2008-04-11 2014-04-28 Board Of Regents Of The University Of Texas System Método y aparato para la amplificación de la quimioluminiscencia electrogenerada por nanopartículas
EP2294387B1 (en) * 2008-05-08 2017-08-23 Board of Regents of the University of Texas System Luminescent nanostructured materials for use in electrogenerated chemiluminescence
JP2009275006A (ja) * 2008-05-16 2009-11-26 Univ Of Tokyo 低酸素環境測定用試薬
EP2356139A4 (en) 2008-07-23 2013-01-09 Harvard College LIGATURE OF STAPLED POLYPEPTIDES
EP2321426A4 (en) * 2008-07-30 2011-12-14 Dana Farber Cancer Inst Inc COMPOSITIONS FOR DETECTING CELL DEATH AND USE METHOD
CN102203126A (zh) 2008-09-22 2011-09-28 爱勒让治疗公司 用于制备纯化的多肽组合物的方法
US8277812B2 (en) 2008-10-12 2012-10-02 Massachusetts Institute Of Technology Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen
US8591905B2 (en) 2008-10-12 2013-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nicotine immunonanotherapeutics
US8343497B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics
US8343498B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 Massachusetts Institute Of Technology Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics
US8512417B2 (en) 2008-11-14 2013-08-20 Dune Sciences, Inc. Functionalized nanoparticles and methods of forming and using same
US10080578B2 (en) 2008-12-16 2018-09-25 Nico Corporation Tissue removal device with adjustable delivery sleeve for neurosurgical and spinal surgery applications
CN101444503B (zh) * 2008-12-31 2011-02-02 江苏大学 一种水飞蓟宾高效长效制剂及其制法
CN101439025B (zh) * 2008-12-31 2011-05-11 江苏大学 一种水飞蓟素高效长效制剂及其制法
AU2010204648B2 (en) 2009-01-14 2016-09-01 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
US8961825B2 (en) 2009-04-15 2015-02-24 Cornell University Fluorescent silica nanoparticles through silica densification
MX350667B (es) 2009-05-27 2017-09-12 Selecta Biosciences Inc Nanoportadores que poseen componentes con diferentes tasas de liberacion.
US20120142111A1 (en) * 2009-06-15 2012-06-07 Tour James M Nanomaterial-containing signaling compositions for assay of flowing liquid streams and geological formations and methods for use thereof
US9377449B2 (en) 2009-06-15 2016-06-28 William Marsh Rice University Nanocomposite oil sensors for downhole hydrocarbon detection
AU2010273220B2 (en) 2009-07-13 2015-10-15 President And Fellows Of Harvard College Bifunctional stapled polypeptides and uses thereof
CA2774973A1 (en) 2009-09-22 2011-03-31 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
KR101616465B1 (ko) 2009-11-02 2016-04-28 펄스 테라퓨틱스, 인코포레이티드 기자성 스테이터 시스템 및 마그네틱 로터의 무선제어 방법
EP2496267A4 (en) 2009-11-06 2016-02-17 Univ Washington Ct Commerciali ZWITTERIONIC POLYMER BIOKON JUGATES AND CORRESPONDING METHODS
JP5503382B2 (ja) * 2010-04-05 2014-05-28 古河電気工業株式会社 イムノクロマトグラフィー用複合粒子
US20120015344A1 (en) * 2010-05-14 2012-01-19 1. Board of Trustees of MICHIGAN STATE UNIVERSITY Methods, compositions, and apparatus for the detection of viral strains
WO2011150240A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Selecta Biosciences, Inc. Nanocarrier compositions with uncoupled adjuvant
WO2012016186A1 (en) 2010-07-29 2012-02-02 President And Fellows Of Harvard College Macrocyclic kinase inhibitors and uses thereof
US9121065B2 (en) 2010-08-09 2015-09-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nanoparticle-oligonucleotide hybrid structures and methods of use thereof
JP2013535514A (ja) 2010-08-13 2013-09-12 エイルロン セラピューティクス，インコーポレイテッド ペプチド模倣大環状分子
US8957026B2 (en) 2010-09-22 2015-02-17 President And Fellows Of Harvard College Beta-catenin targeting peptides and uses thereof
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
EP2624868B1 (en) 2010-10-08 2018-09-26 City of Hope A monoclonal antibody framework binding interface for meditopes, meditope delivery systems and methods for their use
WO2012158196A2 (en) 2010-11-05 2012-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Core-shell magnetic particles and related methods
GB201019434D0 (en) * 2010-11-17 2010-12-29 Isis Innovation Sonosensitive nanoparticles
JPWO2012111686A1 (ja) * 2011-02-15 2014-07-07 協和メデックス株式会社 ストレプトアビジン結合磁性粒子の製造方法
JPWO2012111687A1 (ja) * 2011-02-15 2014-07-07 協和メデックス株式会社 ストレプトアビジン結合磁性粒子の製造方法
US8916696B2 (en) 2011-06-12 2014-12-23 City Of Hope Aptamer-mRNA conjugates for targeted protein or peptide expression and methods for their use
US9487562B2 (en) 2011-06-17 2016-11-08 President And Fellows Of Harvard College Stabilized polypeptides as regulators of RAB GTPase function
CN105873910A (zh) 2011-07-01 2016-08-17 哈佛大学的校长及成员们 大环胰岛素降解酶(ide)抑制剂及其用途
KR20140050698A (ko) 2011-07-29 2014-04-29 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 체액성 및 세포독성 t 림프구(ctl) 면역 반응을 발생시키는 합성 나노운반체
EA201490644A1 (ru) 2011-09-30 2014-09-30 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Терапевтические пептиды
CN104039809A (zh) 2011-10-10 2014-09-10 希望之城公司 中间位和中间位结合抗体及其用途
MX358886B (es) 2011-10-18 2018-08-31 Aileron Therapeutics Inc Macrociclos peptidomimeticos.
EP2858661B1 (en) 2011-12-29 2020-04-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized antiviral fusion helices
KR20130084091A (ko) 2012-01-16 2013-07-24 삼성전자주식회사 화상형성장치
US10031138B2 (en) 2012-01-20 2018-07-24 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Hierarchical films having ultra low fouling and high recognition element loading properties
US9428553B2 (en) 2012-02-10 2016-08-30 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
US9005483B2 (en) * 2012-02-10 2015-04-14 Lockheed Martin Corporation Nanoparticle paste formulations and methods for production and use thereof
BR112014020103A2 (pt) 2012-02-15 2018-10-09 Aileron Therapeutics, Inc. macrociclos peptidomiméticos
CN108912211A (zh) 2012-02-15 2018-11-30 爱勒让治疗公司 三唑交联的和硫醚交联的拟肽大环化合物
CN102618257B (zh) * 2012-03-09 2014-01-29 浙江大学 一种上转换荧光纳米材料的表面包覆方法
US9464293B2 (en) 2012-04-10 2016-10-11 City Of Hope RNA aptamers for therapeutic and diagnostic delivery to pancreatic cancer cells
US9883878B2 (en) 2012-05-15 2018-02-06 Pulse Therapeutics, Inc. Magnetic-based systems and methods for manipulation of magnetic particles
WO2013173235A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Pulse Therapeutics, Inc. Magnetic-based systems and methods for manipulation of magnetic particles
KR101543583B1 (ko) 2012-08-24 2015-08-11 단국대학교 산학협력단 생체 분자 분석용 미소 입자 및 키트와 생체 분자 분석용 미소 입자의 제조 방법
ES2874525T3 (es) 2012-09-26 2021-11-05 Harvard College Péptidos grapados bloqueados con prolina y usos de los mismos
US20150225471A1 (en) 2012-10-01 2015-08-13 President And Fellows Of Harvard College Stabilized polypeptide insulin receptor modulators
WO2014065753A1 (en) * 2012-10-23 2014-05-01 Dso National Laboratories Direct visual detection of nucleic acid using gold nanoparticles
BR112015009470A2 (pt) 2012-11-01 2019-12-17 Aileron Therapeutics Inc aminoácidos dissubstituídos e seus métodos de preparação e uso
WO2014107449A1 (en) * 2013-01-01 2014-07-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Molecule structure probe methods, devices, and systems
WO2014116813A1 (en) * 2013-01-25 2014-07-31 Douglas Scientific Silica-based biological material isolation
WO2014130488A1 (en) * 2013-02-19 2014-08-28 University Of Massachusetts Functionalized nanoparticles for medical treatments
KR20150131244A (ko) 2013-03-13 2015-11-24 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 스테이플드 및 스티치드 폴리펩티드 및 그의 용도
WO2014151369A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized ezh2 peptides
US10745483B2 (en) 2013-03-15 2020-08-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides
US10106590B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. BH4 stabilized peptides and uses thereof
AU2014227824B2 (en) 2013-03-15 2018-09-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized SOS1 peptides
BR112015031277A2 (pt) 2013-06-14 2017-09-19 Harvard College Moduladores do receptor de insulina de polipeptídeos estabilizados, análogos de insulina, composições farmacêuticas compreendendo os referidos polipeptídeos e métodos de preparação e usos dos mesmos
US9409148B2 (en) 2013-08-08 2016-08-09 Uchicago Argonne, Llc Compositions and methods for direct capture of organic materials from process streams
KR101660399B1 (ko) * 2013-08-23 2016-09-28 주식회사 메디센서 금 나노 입자를 포함하는 형광 입자 및 그 제조방법
WO2015034469A2 (en) * 2013-09-03 2015-03-12 Aneeve Nanotechnologies, Llc A process for cleaning carbon nanotubes and other nanostructured films
WO2015054125A1 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Trustees Of Tufts College Tunable covalently crosslinked hydrogels and methods of making the same
WO2015054493A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-16 Nanocomposix, Inc. Encapsulated particles
US10513802B2 (en) 2013-11-08 2019-12-24 Tufts University Peptide-based nanofibrillar materials
MX371187B (es) 2013-12-06 2020-01-22 Dana Farber Cancer Inst Inc Péptidos terapéuticos.
EP3089653A1 (en) * 2013-12-31 2016-11-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Systems, methods, and apparatus for multichannel imaging of fluorescent sources in real time
JP2017510631A (ja) 2014-03-14 2017-04-13 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 癌に対しｎｋｇ２ｄ経路機能を回復させるためのワクチン組成物および方法
JP6156229B2 (ja) * 2014-03-31 2017-07-05 株式会社Ｊｖｃケンウッド 粒子の製造方法
IL288147B2 (en) 2014-05-21 2024-03-01 Harvard College RAS inhibitory peptides and their uses
WO2015177933A1 (ja) * 2014-05-23 2015-11-26 株式会社島津製作所 磁性体粒子の操作方法および磁性体粒子操作用デバイス
JP6734011B2 (ja) * 2014-06-06 2020-08-05 古河電気工業株式会社 生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用試験片及び生体分子検出用標識試薬
WO2016049359A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
US10905739B2 (en) 2014-09-24 2021-02-02 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and formulations thereof
CN117442748A (zh) 2014-10-02 2024-01-26 希望之城公司 多价中间表位、中间表位结合抗体及其用途
JP6182520B2 (ja) * 2014-12-01 2017-08-16 三洋化成工業株式会社 磁性シリカ粒子、該磁性シリカ粒子を用いた測定対象物質測定方法及び測定対象物質測定用試薬
FR3031063B1 (fr) * 2014-12-30 2017-02-10 Biomerieux Sa Complexe multicouches, procede de fabrication et utilisation du complexe
BR112017019389A2 (pt) 2015-03-12 2018-04-24 Univ Tufts materiais de seda com memória de forma
AU2016232833A1 (en) 2015-03-18 2017-10-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Selective Mcl-1 binding peptides
CA2979847A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
US11040976B2 (en) 2015-04-24 2021-06-22 President And Fellows Of Harvard College Substrate selective inhibitors of insulin-degrading enzyme (IDE) and uses thereof
US10174363B2 (en) 2015-05-20 2019-01-08 Quantum-Si Incorporated Methods for nucleic acid sequencing
KR101646610B1 (ko) 2015-05-28 2016-08-09 (주)바이오니아 생체 물질 정제용 고활성 실리카 자성나노입자 및 이의 제조 방법
WO2017004548A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
WO2017023527A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Advanced Endovascular Therapeutics Novel coatings for medical devices
JP2018528217A (ja) 2015-09-10 2018-09-27 エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． Ｍｃｌ−１のモジュレーターとしてのペプチド模倣大環状分子
WO2017059338A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Cornell University Enzyme-responsive peptide nanofiber compositions and uses thereof
US11833272B2 (en) 2015-12-17 2023-12-05 Trustees Of Tufts College Silk-fibroin hydrogels, methods of forming, and uses thereof
US11198715B2 (en) 2016-07-22 2021-12-14 Massachusetts Institute Of Technology Selective Bfl-1 peptides
US11248313B2 (en) 2016-08-01 2022-02-15 Trustees Of Tufts College Biomimetic mechanical tension driven fabrication of nanofibrillar architecture
JP7069126B2 (ja) 2016-08-26 2022-05-17 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 化学療法誘発性末梢性ニューロパシーおよび難聴を処置または予防するためのｂｃｌ－ｗポリペプチドおよび模倣物
US10369167B2 (en) 2016-11-01 2019-08-06 City Of Hope Continuously expressed therapeutic RNAs for targeted protein binding and methods for their use
JP7317706B2 (ja) 2016-12-14 2023-07-31 リガンダル インコーポレイテッド 核酸およびタンパク質ペイロード送達のための方法および組成物
WO2019086517A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Roche Diagnostics Gmbh Improved magnetic particles and uses thereof
US20200385776A1 (en) * 2017-12-19 2020-12-10 3M Innovative Properties Company Compositions and methods to detect microorgnaisms
US11674136B2 (en) 2018-02-09 2023-06-13 President And Fellows Of Harvard College DNA-templated macrocycle library
US11918315B2 (en) 2018-05-03 2024-03-05 Pulse Therapeutics, Inc. Determination of structure and traversal of occlusions using magnetic particles
WO2020060975A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Massachusetts Institute Of Technology Peptides selective for bcl-2 family proteins
CA3113568A1 (en) * 2018-10-01 2020-04-09 Kemira Oyj A method for determining concentration of polyelectrolytes and phosphonates
CN109444406A (zh) * 2018-11-09 2019-03-08 深圳市众循精准医学研究院 定量检测标志物cyfra21-1的试纸条及其制备方法和检测方法
CN109521194B (zh) * 2018-11-30 2023-03-31 暨南大学 DNA免疫吸附剂在制备抗ds-DNA抗体检测试剂中的应用
CN110878336B (zh) * 2019-11-18 2022-06-14 大连理工大学 一种基于Fe3O4@C纳米颗粒的miRNA光学传感检测方法
US20230355811A1 (en) * 2020-09-28 2023-11-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions including magnetic nanoparticles and methods of using and making the same

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4297337A (en) * 1979-04-13 1981-10-27 Corning Glass Works Solid-phase immunoassays using magnetic glass
US4661408A (en) * 1986-03-18 1987-04-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Coated chromium dioxide particles
US5091206A (en) * 1987-10-26 1992-02-25 Baxter Diagnostics Inc. Process for producing magnetically responsive polymer particles and application thereof
JP3413415B2 (ja) * 1994-04-29 2003-06-03 セラディン インコーポレイテッド イムノアッセイ試薬およびそれを用いたイムノアッセイ法
DE69636553T2 (de) 1995-07-07 2007-05-31 Toyo Boseki K.K. Nukleinsäuren bindender magnetischer Träger und Verfahren für die Nukleinsäureisolierung unter dessen Verwendung
WO1998051435A1 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Weixin Tang Fully-coated, uniform-sized metallic particles
US5990479A (en) * 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6251303B1 (en) * 1998-09-18 2001-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Water-soluble fluorescent nanocrystals
DE10046508A1 (de) * 1999-09-14 2001-04-05 Tridelta Bio Medical Gmbh Magnetische Nanoteilchen mit biochemischer Wikrsamkeit und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung
JP2004500109A (ja) * 2000-03-22 2004-01-08 クァンタム・ドット・コーポレイション ビーズベースの核酸アッセイにおける半導体ナノクリスタルの使用方法
US6548264B1 (en) * 2000-05-17 2003-04-15 University Of Florida Coated nanoparticles

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100441677C (zh) * 2005-10-20 2008-12-10 上海师范大学 免疫磁性纳米粒子细菌分离器及其制法和应用
CN100371713C (zh) * 2006-01-13 2008-02-27 东南大学 金或银纳米粒子的表面功能化及比色检测生物分子的方法
CN1987454B (zh) * 2006-10-31 2011-01-12 成都夸常医学工业有限公司 含定向纳米结构功能化区的纳米结构组成及其制备和应用方法
CN101827896B (zh) * 2007-08-13 2014-05-07 宝洁国际运营股份有限公司 染料吸附颗粒
CN102192986A (zh) * 2010-03-19 2011-09-21 胡卫红 一种心肌肌钙蛋白i的检测试剂及其制备方法和用途
CN102192986B (zh) * 2010-03-19 2014-06-11 成都盛泰尔生物医药科技有限公司 一种心肌肌钙蛋白i的检测试剂
CN103443626A (zh) * 2011-02-15 2013-12-11 协和梅迪克斯株式会社 链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法
CN102786030A (zh) * 2012-07-06 2012-11-21 江苏大学 一种通过溶剂处理制备多肽纳米薄膜的方法
CN102786030B (zh) * 2012-07-06 2014-03-12 江苏大学 一种通过溶剂处理制备多肽纳米薄膜的方法
CN105579068A (zh) * 2013-09-23 2016-05-11 伦斯勒理工学院 在各种细胞群中纳米颗粒介导的基因传递、基因组编辑和靶向配体的修饰
US10526616B2 (en) 2013-09-23 2020-01-07 Rensselaer Polytechnic Institute Nanoparticle-mediated gene delivery, genomic editing and ligand-targeted modification in various cell populations
CN107735684A (zh) * 2015-06-26 2018-02-23 柯尼卡美能达美国研究所有限公司 快速且高敏感的细菌检测

Also Published As

Publication number Publication date
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