CN1780895A - 适于(f)ret－分析的芯/壳纳米粒子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发光无机纳米粒子，包括(a)由第一金属盐或氧化物制成的芯，其被(b)由第二金属盐或氧化物制成的壳所包围，该壳可发光并具有非半导体性能。这些粒子可用于(荧光)共振能量转移((F)RET)基生物分析中，因为它们具有较高的(F)RET效率。

Description

适于(F)RET-分析的芯/壳纳米粒子
本申请涉及发光纳米粒子，尤其是具有金属盐或氧化物芯并被发光壳包围的光致发光的纳米粒子，这些粒子的合成，及它们在(F)RET-分析、尤其是生物分析中的用途。
申请背景
在过去十年中，纳米粒子(即尺寸小于1微米的粒子)由于其独特的性质，而在研究和工业上吸引了极大的关注。光电子领域中的研究和发展集中于发光粒子，其可能的应用包括光发射二极管(LED)，显示器，纳米尺寸的光电子，或在低阈值激光器中作为光源。
在发光材料中，经常分成半导体和非半导体材料两类。
半导体纳米粒子(通常称作″量子点″)，如可以掺杂或未掺杂的II-VI或III-V半导体，其特征是电子和空穴在全部三维空间中受到量子限制，从而使得随结晶尺寸的减小，有效能带隙增加。因此，随着纳米粒子尺寸变小，可以将半导体纳米粒子的光学吸收和发射转移至蓝光(高能量)。
水可溶的芯/壳半导体纳米晶体例如公开于WO 00/17655中。
如果与量子点相比，纳米结晶非半导体基发光材料具有特殊的吸引力，尤其是镧系元素掺杂的金属氧化物或盐，它们的荧光发射相对较窄，在很大程度上不取决于主体材料和纳米粒子的尺寸。只有镧系元素金属的种类决定发射颜色。本申请人所有的PCT/DE01/03433公开了镧系元素掺杂的纳米粒子的常用合成方法。这些纳米粒子的尺寸(小于30nm)不再与可见光波长相互作用，从而例如在有机或水性溶剂中形成透明分散体。
涉及镧系元素掺杂的非半导体基发光纳米粒子的其他出版物，例如是：
K.Riwotzki等人：Angewandte Chemie，Int.Ed.40，2001，第573-576页，关于LaPO4：Ce，Tb；
K.Riwotzki，M.Haase，J.Phys.Chem.B；Vol.102，1998，第10129-10135页，关于YVO4：Eu，YVO4：Sm和YVO4：Dy；
H.Meyssamy等人，Advanced Materials，Vol.11，Issue 10，1999，840-844页，关于LaPO4：Eu，LaPO4：Ce和LaPO4：Ce，Tb；
K.Riwotzki等人，J.Phys.Chem.B 2000，Vol.104，第2824-2828页，《Liquid phase synthesis doped nanoparticles：colloids of luminescentLaPO4：Eu and CePO4：Tb particles with a narrow particle sizedistribution》；
M.Haase等人，Journal of Alloys and Compounds，303-304(2000)第191-197页，″Synthesis and properties of colloidal lanthanide-dopednanocrystals″；
Jan W.Stouwdam和Frank C.J.M.van Veggel，Nano Letters，ASAP论文，网页公开2002年5月15日，″Near-infrared emission ofredispersible Er3+，Nd3+and Ho3+doped LaF3 nanoparticles″；和
G.A.Hebbink等人，Advanced Materials 2002，14，No.16，第1147-1150页，″Lanthanide(III)-doped nanoparticles that emit in thenear-infrared″。
半导体基纳米粒子(″量子点″)已被用于生物分析。Bawendi等人，Physical Review Letters，76，1996，1517-1520页，报道了在具体标记的生物体系中的FRET作用。此外，WO 00/29617公开了蛋白或核酸可以借助于(F)RET分析中的″量子点″作为标记来检测。US 6,468,808B1和US 6,326,144B1中也公开了量子点的生物分子共轭物及它们在荧光光谱中的用途。
(F)RET(荧光共振能量转移)和相关的共振能量转移(RET)是基于将能够发出荧光的供体中的激励能量转移至邻近的受体。使用这种技术，例如通过生物体系中的适合荧光标记，在分子水平上测得的距离约为1～8nm。转移至受体的能量在没有内部转换的发射下会松弛(RET)，然后仅取消(猝灭)供体荧光。可选择地，受体也发出荧光(FRET)形式的可接受能量。这些现象很好理解，并且在供体和受体之间偶极-偶极相互作用的情况下也能通过Frester理论解释(例如，J.R.Lakowicz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，Kluwer AcademicPress，New York，1990，368-445页)。能量转移降低了供体荧光的强度及其寿命，同时引发、敏化或提高受体荧光。能量转移的效率取决于分子间分离的反转第6次能量，按比例降低到R0 6/(R0 6+R6)。R0是所谓的Frster半径，其特征是供体和受体间的距离，此时能量转移效率是50％。
F(RET)效率可通过分别在有受体(QDA)和没有受体(QD)的情况下的供体荧光强度来测定，方程式为1-(QDA/QD)，或在受体探针存在下(TDA)和不存在下(TD)比较供体寿命，方程式为1-(TDA/TD)。
然而，在生物分析中使用″量子点″具有多种缺点。由于荧光″量子点″的发射波长取决于粒子尺寸，因此仅有极窄尺寸的分布可以使用。这对合成和/或尺寸选择技术提出了难题。此外，″量子点″通常表现出相对较低的量子效率，这会使发射自由的电子-空穴对复合。为了克服这些缺陷，提出CdSe/CdS芯/壳结构，其中CdS涂层保护并增强发光CdSe芯的光稳定性(X.Peng等人，J.Am.Chem.Soc.119，1997，7019-7029页)。
通常，使用有机染料分子进行(F)RET基分析，如荧光素或若丹明。对于多种应用而言，与这些有机荧光染料相关的一般缺点是它们对入射光的稳定性不够。在密封环境下，它们的光学毒性会进一步损害生物材料。其他不需要的性能是它们较宽的发射能带和较小的斯托克迁移，即激励和发射最大值间的差，及相对较窄的光谱激励能带，这样通常需要使用几个光源和/或复杂的光学体系。
因此，本发明的一个目的是提供荧光无机材料，其特别适合于(F)RET-分析，尤其是生物分析，并可克服上述缺点。
本发明的另一目的是提高(F)RET效率。较高的(F)RET效率可以提高方法的灵敏度，并改进例如信/噪比。
此外，(F)RET基分析需要高量子产率(发射与吸收光子的比例)的供体分子，以提高分析的总体灵敏度。因此，本发明的另一目的是提供高量子产率的无机荧光粒子，它们也特别适用于生物分析之外的应用中。
本发明的再一个目的是提供一种制备这些荧光材料的具体方法。
最后的目的是基于无机纳米粒子材料提供生物分析。
发明概述
上述技术目的可由发光无机纳米粒子及其制备方法来解决，该粒子包括
(a)由第一金属盐或氧化物制成的芯，其被
(b)由第二金属盐或氧化物制成的壳所包围，该壳可发光并具有非半导体性能。
附图简要说明
图1表明均匀CePO4芯粒子和本发明的CePO4/TbPO4芯/壳粒子的荧光光谱。
图2是一个CePO4：Tb/LaPO4芯/壳粒子的各种能量过滤透射电子显微照片。
图3表明本发明CePO4/TbPO4芯/壳粒子的两种荧光衰减曲线，它们分别被改变及与荧光素化学结合。其也表明了作为参考的未与荧光素结合的CePO4/TbPO4芯/壳粒子的荧光衰减曲线。
图4表明与荧光素结合的均匀LaPO4：Ce，Tb粒子(比较例1)的荧光衰减曲线。
图5a分别表明本发明的CePO4/TbPO4芯/壳粒子按时间闸(TGF)方式测得的两种荧光光谱，它们没有进一步被改变或与荧光素结合。
图5b表明均匀LaPO4：Ce，Tb纳米粒子(比较例1)分别在520nm和542nm按时间闸方式测得的荧光光谱。
图6a：用与一个分子结合的(F)RET配偶体进行的均匀激酶分析。
图6b：用与一个分子结合的(F)RET配偶体进行的均匀免疫分析。
图7：用与一个分子(抗原决定部位)结合的(F)RET配偶体进行的竞争免疫分析。
图8：用与单独分子结合的(F)RET配偶体进行的均匀饱和免疫分析。
图9：用与单独分子结合的(F)RET配偶体进行的均匀竞争免疫分析。
图10：用与一个分子结合的(F)RET配偶体进行的均匀分析。
图11：按分子信标方法进行的分析。
发明详细说明
I.发光纳米粒子
本发明的发光、尤其是光致发光粒子(a)由第一金属盐或氧化物制成的芯，其被(b)由第二金属盐或氧化物制成的发光非半导体壳所包围。
″发光″是指待保护的纳米粒子具有吸收能量的性能(例如，光子形式(IR，可见光，UV)，电子射线，X-射线等)，然后以低能量的光发射出。应该理解，在说明书和权利要求书中，术语″发光″包括更具体和优选的含义″光致发光″。
″光致发光″，应理解成是指无机金属盐在一定时间内，吸收具体能量的光子(例如UV，可见光)和并发出低能量光(较长波长，例如UV，可见光，IR)。发光时间可以相应于激发态的寿命10-7或10-8sec，这通常称为荧光，但也可以更长。对于镧系元素掺杂的盐，例如硫酸盐、磷酸盐或氟化物，通常激发态寿命是毫秒级(例如1-20ms)。
根据本发明，优选的是壳和芯材料都没有表现出半导体性能。
壳和芯优选也由结晶材料组成。这可以由X-射线粉末衍射图确定。
待保护的芯/壳粒子形状例如可以是针状、椭圆或球形，后两种形状是优选的。
待保护的芯/壳纳米粒子优选沿其最长轴测量的平均尺寸为1～100nm，更优选1～50nm。更优选平均尺寸最大为30nm，最大为20nm，最大为10nm，例如2～8nm，或4-6nm。在各种情况下，标准偏差优选小于30％，尤其是小于10％。
粒子尺寸和分布可根据K.Riwotzki等人和M.Haase等人所公开的技术来测量，例如，通过透射电子显微镜(TEM)。也可以使用凝胶渗透色谱和超离心法来测定尺寸。
壳厚度优选是至少两个单层。壳厚度的优选上限是2个芯直径(对于非球状粒子沿最长轴测量)，更优选1个芯直径，例如其2/3。
根据本发明第一实施方案，芯(a)由金属盐或氧化物制成，在电子激发后，其不会从壳接受能量，尤其是非发光金属盐或氧化物，壳(b)由发光、尤其是掺杂的金属盐或氧化物制成。
在本申请中，″掺杂″应按最广泛意义理解。所用掺杂剂的上限应足够低，从而产生的发光不会因浓度猝灭现象而降低。相应地，此上限取决于各种因素，如掺杂离子类型，晶格中掺杂剂金属离子间的距离，每种芯材料具有特定的晶格。优选地，主体材料由其量为50mol％、优选0.1～45mol％(例如0.5～40mol％)或1～20mol％的掺杂剂代替。
对于待混合的掺杂剂金属类型也没有特殊的限制，只要其能将吸收的光子转化成光发射。因此，例如，可以使用各种金属，如Ag，Cu，Co或Mn(例如，与作为主体金属的锌混合)。然而，由于镧系元素金属的发光与其晶格环境特别无关，因此用镧系元素金属掺杂是优选的。通常，优选使用二价或三价掺杂剂，尤其是镧系元素掺杂剂。二价镧系元素(+II氧化态)的特征是具有相对较强的吸收，但具有相对较宽的发射谱带。为此，它们适于用作感光剂，将能量转移至其他发光金属(例如Eu2+至Mn2+)。三价镧系元素(氧化态+III)具有发射相对较尖锐谱带的光的能力，这使它们成为特别有吸引力的单独使用的掺杂剂，尽管如下所述，也存在适合的三价镧系元素掺杂剂体系组合。
适于壳的掺杂剂材料包括Al，Cr，Tl，Mn，Ag，Cu，As，Nb，Ni，Ti，In，Sb，Ga，Si，Pb，Bi，Zn，Co，它们取决于所用的主体材料而具有发光性能，尤其是Mn，Ag，Cu，Bi，Cr，Sn，Sb，并优选镧系元素，尤其是Ce(58)，Pr(59)，Nd(60)，Sm(62)，Eu(63)，Gd(64)，Tb(65)，Dy(66)，Ho(67)，Er(68)，Tm(69)，Yb(70)或其组合。
由于镧系元素金属的发光与其晶格环境特别无关，因此用镧系元素金属掺杂是优选的。
从实用观点来看(荧光类型，强度等)，Ce，Tb，Eu，Nd，Dy，Th，Sm，Gd，Ho，Er和Yb表现出最令人感兴趣的发光性能。
Er3+，Nd3+和Ho3+在通信领域中受到了特别关注，这是由于它们在1300～1600nm间发光。Ce优选与另一种掺杂剂材料一起使用，如Nd，Dy或Tb。公知的是Ce可强烈地吸收波长为250～300nm的UV辐射，但是取决于主晶格(例如磷酸盐)，它们在330nm周围表现出相当宽的发光谱带。如果与能够转移吸收能量的其他掺杂剂混合，那么可以得到极有效的发光体系。掺杂剂金属另一种有吸引力的组合是Yb和Er，在Er3+掺杂的光学放大器中这一点很重要，其中Er3+通过Yb3+间接抽运，与Er3+相比，Yb3+有10倍高的吸收横截面并且在980nm有更宽的峰。Nd3+和Gd3+也可组合。
如前所述，可以使用这些镧系元素金属组合作为壳的掺杂剂。同样可用作主体金属，其中镧系元素金属离子(例如Ce3+，Yb3+，Nd3+)具有较高的吸收横截面，并用较少量的其他金属(例如Tb3+，Er3+，Gd3+)代替其一部分。为此，镧系元素盐(例如Ce3+，Yb3+，Nd3+盐)也可用作壳的主体材料。
在水性介质用于生物分析的应用中，最优选的掺杂剂是在可见光区域发光的那些(例如Tb，Dy，Tm，Sm)，从而最小化与水的相互作用，而水可以吸收发射的光。
没有具体限制壳的主体材料，并可选自公知的非发光金属氧化物或盐，如硫化物，硒化物，硫硒化物，氧硫化物，磷酸盐，卤代磷酸盐，砷酸盐，硫酸盐，硼酸盐，铝酸盐，镓酸盐，硅酸盐，锗酸盐，氧化物，钒酸盐，铌酸盐，钽酸盐，钨酸盐，钼酸盐，碱性卤化物，其他卤化物，尤其是氟化物，磷化物，或氮化物。特别优选的是使用硫酸盐、磷酸盐或氟化物。
这些盐的金属优选属于主族1、2、13或14，副族3、4、5、6、7，或镧系元素。因为大多数发光掺杂剂是二价或三价金属离子，因此优选使用的壳的相反电荷离子是非发光二价或三价金属原子，如族2金属(碱土金属，如Mg，Ca，Sr，或Ba)，或族3金属(Sc，V或La)或族13金属(例如，Al，Ga或In)或Zn。
主体金属盐的优选实施方案包括：
相应数量金属(以确保电荷中性)的磷酸盐，选自主族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(元素58～71，即Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb和Lu)；
相应数量金属的硫酸盐，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(如上所述)；
相应数量金属的硼酸盐，选自主族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或族13(Al，Ga，In，Tl)或镧系元素(如上所述)；
相应数量金属的氟化物，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，副族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(如上所述)；
相应数量金属原子的铝酸盐(例如Al5O12或AlO4)，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(如上所述)；
相应数量金属原子的镓酸盐(例如Ga5O12)，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(如上所述)；
相应数量金属的硅酸盐(例如SiO3或SiO4)，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，族12(例如Zn，Cd)或镧系元素(如上所述)；
相应数量金属原子的钒酸盐(例如VO4)，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(如上所述)；
相应数量金属原子的钨酸盐(例如WO4)，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(如上所述)；
相应数量金属原子的钼酸盐(例如MoO4)，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(如上所述)；
相应数量金属原子的钽酸盐(例如TaO4)，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(如上所述)；或
相应数量金属原子的砷酸盐(例如AsO4)，选自族2(例如Mg，Ca，Sr，Ba)，族3(例如Sc，Y，La)，或镧系元素(如上所述)。
当针对特定掺杂剂选择适合的主体材料时，本领域中公知需要进一步考虑的是，主体和掺杂剂金属优选应该有相同的化合价和相似的(容差例如±20％)或相同的离子直径。同时，若这些掺杂剂和主体金属能够与特定阴离子形成相同或相似晶格类型的晶体，并具有相同或相似的晶格常数(容差例如±20％)，那么通常会提高掺杂剂和主体金属的相容性。
上述标准通常可以使用Ba和La作为芯主体材料金属来满足，因为这些金属的离子直径与二价(+II)镧系元素极相似。由于同样原因，La和Y盐代表三价(+III)镧系元素掺杂剂的适合的主体材料。
发光壳材料的具体实例例如是：LiI：Eu；NaI：Tl；CsI：Tl；CsI：Na；LiF：Mg；LiF：Mg，Ti；LiF：Mg，Na；KMgF3：Mn；Al2O3：Eu；BaFCl：Eu；BaFCl：Sm；BaFBr：Eu；BaFCl0.5Br0.5：Sm；BaY2F8：A(A＝Pr，Tm，Er，Ce)；BaSi2O5：Pb；BaMg2Al16O27：Eu；BaMgAl14O23：Eu；BaMgAl10O17：Eu；BaMgAl2O3：Eu；Ba2P2O7：Ti；(Ba，Zn，Mg)3Si2O7：Pb；Ce(Mg，Ba)Al11O19；Ce0.65Tb0.35MgAl11O19：Ce，Tb；MgAl11O19：Ce，Tb；MgF2：Mn；MgS：Eu；MgS：Ce；MgS：Sm；MgS：(Sm，Ce)；(Mg，Ca)S：Eu；MgSiO3：Mn；3.5MgO·0.5MgF2·GeO2：Mn；MgWO4：Sm；MgWO4：Pb；6MgO·As2O5：Mn；(Zn，Mg)F2：Mn；(Zn4Be)SO4：Mn；Zn2SiO4：Mn；Zn2SiO4：Mn，As；Zn3(PO4)2：Mn；CdBO4：Mn；CaF2：Mn；CaF2：Dy；CaS：A(A镧系元素，Bi)；(Ca，Sr)S：Bi；CaWO4：Pb；CaWO4：Sm；CaSO4：A(A＝Mn，镧系元素)；3Ca3(PO4)2·Ca(F，Cl)2：Sb，Mn；CaSiO3：Mn，Pb；Ca2Al2Si2O7：Ce；(Ca，Mg)SiO3：Ce；(Ca，Mg)SiO3：Ti；2SrO·6(B2O3)-SrF2：Eu；3Sr3(PO4)2·CaCl2：Eu；A3(PO4)2·ACl2：Eu(A＝Sr，Ca，Ba)；(Sr，Mg)2P2O7：Eu；(Sr，Mg)3(PO4)2：Sn；SrS：Ce；SrS：Sm，Ce；SrS：Sm；SrS：Eu；SrS：Eu，Sm；SrS：Cu，Ag；Sr2P2O7：Sn；Sr2P2O7：Eu；Sr4Al14O25：Eu；SrGa2S4：A(A＝镧系元素，Pb)；SrGa2S4：Pb；Sr3Gd2Si6O18：Pb，Mn；YF3：Yb，Er；YF3：Ln(Ln＝镧系元素)；YLiF4：Ln(Ln＝镧系元素)；Y3Al5O12：Ln(Ln＝镧系元素)；YAl3(BO4)3：Nd，Yb；(Y，Ga)BO3：Eu；(Y，Gd)BO3：Eu；Y2Al3Ga2O12：Tb；Y2SiO5：Ln(Ln＝镧系元素)；Y2O3：Ln(Ln＝镧系元素)；Y2O2S：Ln(Ln＝镧系元素)；YVO4：A(A＝镧系元素，In)；Y(P，V)O4：Eu；YTaO4：Nb；YAlO3：A(A＝Pr，Tm，Er，Ce)；YOCl：Yb，Er；LnPO4：Ce，Tb(Ln＝镧系元素或镧系元素混合物)；LuVO4：Eu；GdVO4：Eu；Gd2O2S：Tb；GdMgB5O10：Ce，Tb；LaOBr：Tb；La2O2S：Tb；LaF3：Nd，Ce；BaYb2F8：Eu；NaYF4：Yb，Er；NaGdF4：Yb，Er；NaLaF4：Yb，Er；LaF3：Yb，Er，Tm；BaYF5：Yb，Er；Ga2O3：Dy；GaN：A(A＝Pr，Eu，Er，Tm)；Bi4Ge3O12；LiNbO3：Nd，Yb；LiNbO3：Er；LiCaAlF6：Ce；LiSrAlF6：Ce；LiLuF4：A(A＝Pr，Tm，Er，Ce)；Li2B4O7：Mn，SiOx：Er，Al(0≤x≤2)；Y2O3：Ln(Ln＝镧系元素，尤其是Eu)，Y2O2S：Eu，Y2SiO5：Eu，SiO2：Dy，SiO2：Al，Y2O3：Tb，CaSiO3：Ln，CaS：Ln，CaO：Ln，其中Ln为一种、两种或多种镧系元素。
如果根据主晶格类型进行分类，那么可以列举出下面的优选实施方案。
1.卤化物：例如XY2(X＝Mg，Ca，Sr，Ba；Y＝F，Cl，I)，CaF2：Eu(II)，BaF2：Eu；BaMgF4：Eu；LiBaF3：Eu；SrF2：Eu；SrBaF2Eu；CaBr2：Eu-SiO2；CaCl2：Eu；CaCl2：Eu-SiO2；CaCl2：Eu，Mn-SiO2；CaI2：Eu；CaI2Eu，Mn；KMgF3：Eu；SrF2：Eu(II)，BaF2：Eu(II)，YF3，NaYF4，：MgF2：Mn；MgF2：Ln(Ln＝镧系元素)。
2.碱土硫酸盐：例如XSO4(X＝Mg，Ca，Sr，Ba)，SrSO4：Eu，SrSO4：Eu，Mn，BaSO4：Eu，BaSO4：Eu，Mn，CaSO4，CaSO4：Eu，CaSO4：Eu，Mn，及混合的碱土硫酸盐，也包括与镁的组合物，例如Ca，MgSO4：Eu，Mn。
3.磷酸盐和卤代磷酸盐：例如CaPO4：Ce，Mn，Ca5(PO4)3Cl：Ce，Mn，Ca5(PO4)3F：Ce，Mn，SrPO4：Ce，Mn，Sr5(PO4)3Cl：Ce，Mn，Sr5(PO4)3F：Ce，Mn，后者也与Eu(II)或与Eu，Mn共掺杂，α-Ca3(PO4)2：Eu；β-Ca3(PO4)2：Eu，Mn；Ca5(PO4)3Cl：Eu；Sr5(PO4)3Cl：Eu；Ba10(PO4)6Cl：Eu；Ba10(PO4)6Cl：Eu，Mn，Ca2Ba3(PO4)3Cl：Eu；Ca5(PO4)3F：Eu2+X3+；Sr5(PO4)3F：Eu2+X3+(X＝Nd，Er，Ho，Tb)；Ba5(PO4)3Cl：Eu；β-Ca3(PO4)2：Eu；CaB2P2O9：Eu；CaB2P2O9：Eu；Ca2P2O7：Eu；Ca2P2O7：Eu，Mn；Sr10(PO4)6Cl2：Eu；(Sr，Ca，Ba，Mg)10(PO4)6Cl2：Eu；LaPO4：Ce；CePO4；LaPO4：Eu，LaPO4：Ce，LaPO4：Ce，Tb，CePO4：Tb。
4.硼酸盐：例如LaBO3；LaBO3：Ce；ScBO3：CeYAlBO3：Ce；YBO3：Ce；Ca2B5O9Cl：Eu；xEuO·yNa2O·zB2O3。
5.钒酸盐：例如YVO4，YVO4：Eu，YVO4：Dy，YVO4：SmYVO4：Bi；YVO4：Bi，Eu，YVO4：Bi，Dy，YVO4：Bi，Sm，YVO4：Tm，YVO4：Bi，Tm GdVO4，GdVO4：Eu，GdVO4：Dy，GdVO4：Sm GdVO4：Bi；GdVO4：Bi，Eu，GdVO4：Bi，Dy，GdVO4：Bi，Sm；YVO4：Eu，YVO4：Sm，YVO4：Dy。
6.铝酸盐：例如MgAl2O4：Eu；CaAl2O4：Eu；SrAl2O4：Eu；BaAl2O4：Eu；LaMgAl11O19：Eu；BaMgAl10O17：Eu；BaMgAl10O17：Eu，Mn；CaAl12O19：Eu；SrAl12O19：Eu；SrMgAl10O17：Eu；Ba(Al2O3)6：Eu；(Ba，Sr)MgAl10O17：Eu，Mn；CaAl2O4：Eu，Nd；SrAl2O4：Eu，Dy；Sr4Al14O25：Eu，Dy。
7.硅酸盐：例如BaSrMgSi2O7：Eu；Ba2MgSiO7：Eu；BaMg2Si2O7：Eu；CaMgSi2O6：Eu；SrBaSiO4：Eu；Sr2Si3O8。SrCl2：Eu；Ba5SiO4Br6：Eu；Ba5SiO4Cl6：Eu；Ca2MgSi2O7：Eu；CaAl2Si2O8：Eu；Ca1.5Sr0.5MgSi2O7：Eu；(Ca，Sr)2MgSi2O7：Eu，Sr2LiSiO4F：Eu。
8.钨酸盐和钼酸盐：例如X3WO6(X＝Mg，Ca，Sr，Ba)，X2WO4(X＝Li，Na，K，Rb，Cs)，XMoO4(X＝Mg，Ca，Sr，Ba)，及多钼酸盐或多钨酸盐，或相应于杂或同多酸的盐。
9.锗酸盐：例如Zn2GeO4
10.此外，下面的类别：AlnO2：Yb，Er(A＝Li，Na；Ln＝Gd，Y，Lu)；Ln2O3：Yb，Er(Ln＝La，Gd，Y，Lu)；LnAO4：Yb，Er(Ln＝La，Y；A＝P，V，As，Nb)；Ca3Al2Ge3O12：Er；Gd2O2S：Yb，Er；La2S：Yb，Er。
根据本发明第一实施方案，芯材料，即金属盐或氧化物，在其电子激发态时，不接受从发光壳转移的能量。
这种要求总是可通过仅具有电子态的芯金属盐或氧化物来满足，其中电子基态和第一电子激发态间的能量距离大于选择的发光壳的第一电子激发态和其基态间的距离。在这种情况下，壳吸收的能量(例如UV，可见光，IR)不能转移至芯金属原子或阴离子。由此得到的壳中能量定位会增强表面猝灭现象，并被认为可以提高粒子的整体(F)RET效率。根据一个优选实施方案，芯盐或氧化物是非发光的，从而缺少吸收能带(UV-可见光或IR)，而能量可从激发的壳转移至吸收能带。由于非发光材料通常比发光材料便宜，因此也具有经济价值。
优选地，芯材料相应于掺杂的壳主体材料。
形成芯的适合阴离子与上述相同，包括但不限于磷酸盐，卤代磷酸盐，砷酸盐，硫酸盐，硼酸盐，铝酸盐，镓酸盐，硅酸盐，锗酸盐，氧化物，钒酸盐，铌酸盐，钽酸盐，钨酸盐，钼酸盐，碱性卤化物，其他卤化物，或氮化物。这种类型的纳米粒子金属盐公开于PCT/DE01/03433中。
选择芯金属原子的唯一依据是用光子辐射后，它们缺少从壳接收光的能力。适用于此的优选金属离子与上述对壳主体材料所述相同。它们包括但不限于族2金属(碱土金属，如Mg，Ca，Sr或Ba)，族3金属(如Sc，Y或La)，锌，或族13金属(如Al，Ga，或In)。为提高壳材料在芯材料表面上生长的倾向，更优选但不绝对必须的是，选择与构成掺杂的壳的主体相同的盐作为芯材料。如果这种需求不能满足，优选的是，芯和壳材料的主体材料属于相同晶格类型，并表现出极相似(容差例如±20％)或相同的晶格常数。
根据第二实施方案，(a)芯包括第一金属盐或氧化物(″供体″)，在激励后能够将激励能量转移至(b)可发出相同光的形成壳的第二发光金属盐或氧化物(″受体″)。
可以在上述掺杂剂中(尤其是镧系元素中选择)适合的供体-受体金属组合，并且通常在供体金属的电子基态和第一激发态之间需要一定距离，这样包括比受体金属相应的距离更高的能量。
在本发明第二实施方案中用作芯材料的适合光子能量吸收体(供体)的例子是具有相对较高吸收横截面的镧系元素离子，如Ce3+，Yb3+，Nd3+或Eu2+。Ce3+优选与Tb3+，Dy3+或Nd3+一起用作壳材料金属和受体，例如以相应硫酸盐、磷酸盐或氟化物的形式。
Yb3+盐(如磷酸盐，硫酸盐或氟化物)作为芯材料优选分别与作为壳材料的Er3+盐(如硫酸盐、磷酸盐或氟化物)结合。这样可以通过Yb3+间接抽运Er3+。
在壳结构方面，受体原子可以用作本发明第一实施方案所述主体材料的高浓度掺杂剂材料。然而，全部壳也可以由相应的受体盐组成，例如金属硫酸盐、磷酸盐或氟化物，从而可以提高芯到壳的能量转移效率。
第二实施方案的芯材料可以包括用作上述主体材料的高浓度掺杂剂的供体金属。可选择地和优选地，芯由相应的供体金属盐构成。
芯盐的阴离子可以自由选自可相容的阴离子，其可使选择的壳材料生长。适合的阴离子的例子在第一实施方案中给出，硫酸盐、磷酸盐或氟化物是优选的。
在第二实施方案中一个特别优选的例子是CePO4/TbPO4芯/壳粒子。
根据第二实施方案，也可以使用钒酸盐，钼酸盐，钨酸盐或锗酸盐作为芯材料(供体)，因为相应的阴离子也能够吸收能量并将能量转移至适合的壳材料(受体)，然后以光形式发射能量。这些也可以与掺杂剂金属混合，从而用作发光中心并增强发光，如对于钒酸盐使用Bi3+和/或Eu3+。芯可以例如包括或由族3金属(如Sc，Y或La)或族13金属(如Al，Ga，或In)的钒酸盐，钼酸盐，钨酸盐或锗酸盐组成。优选与镧系元素盐结合，优选磷酸盐，钒酸盐，钼酸盐，钨酸盐或镓酸盐作为壳材料，其中镧系元素用作能量受体。具体实例包括如下芯/壳组合LaVO4/EuPO4，LaVO4/NdPO4，YVO4/DyPO4。
II.合成芯/壳纳米粒子
本发明的上述芯/壳纳米粒子按下述和权利要求书中的方法合成，包括至少下面两个步骤：
1.在有机介质中制备所谓的″第一混合物″，其包括第一金属盐或氧化物的纳米粒子，例如金属硫酸盐、磷酸盐或氟化物纳米粒子(芯)。
2.在50～350℃的温度下，使所述第一混合物、待形成壳用的阴离子源(尤其是磷酸盐，硫酸盐或氟化物源)、包括形成壳的金属离子的″第二混合物″和所述金属离子用的有机络合剂反应，直到在所述纳米粒子芯周围形成壳。
II.1第一步骤和合成芯粒子
用作芯材料并且在所谓的″第一混合物″中存在的纳米粒子可通过本领域中公知的方法来合成。
通常，湿法合成技术比干法形成方法优选。因为前者方法可以更好地控制粒子尺寸。此外，在湿法合成技术中，可以更容易防止形成的纳米粒子结块。
可以使用公知的湿法合成技术，例如溶胶-凝胶法，水热合成，或用络合剂来调节晶体生长的有机合成方法。此外，可以使用J.W.Stouwdam和F.C.J.M.Van Veggel论文中所述的合成技术来具体制备氟化物。因此，可以通过加热二(正十八烷基)二硫代磷酸铵和NaF在乙醇/水中的溶液制备LaF3纳米粒子和其他氟化物。随后，滴加相应金属硝酸盐在水中的溶液，然后在75℃下搅拌溶液2小时，再冷却至室温。然而，这种技术的缺点是生成的粒子仍表现出相对较宽的粒子尺寸分布，从而必须再进行离心纯化步骤。
镧系元素掺杂的磷酸盐的″水热合成″例如公开于″Wet-chemicalsynthesis of doped colloidal nanomaterials：particles and fibres of LaPO4：Eu，LaPO4：Ce and LaPO4：Ce，Tb″，H.Meyssamy等人，AdvancedMaterials(1999)，Vol.11，No.10，840页，等。
作为原料使用硫酸盐、磷酸盐或氟化物纳米粒子，优选金属氯化物，硝酸盐或醋酸盐。反应用水作为反应介质在高压釜中进行，以保持较高压力，优选反应中压力为10-20bar。
水热合成法得到相对较大的粒子，通常是针状。此外，产物的特征是通常具有相对较宽的粒子尺寸分布。在H.Meyssamy等人所述的上述方法中，直径小于25nm的纳米粒子的百分比例如仅占约20％。这些可通过随后的离心步骤分离。
水热合成的其他实例也公开于PCT/DE01/03433中。该文献在更一般意义上和具体实施例公开了在高压力(高压釜)下在水中合成纳米粒子硅酸盐，钒酸盐，钨酸盐，钼酸盐，钽酸盐等。此外，该文件属于在1，6-己二醇中合成铝酸盐或镓酸盐的相关技术(也称为″甘油热反应(glycothermal)″合成)。
此外，在环境压力下在选自多元醇和亚砜的有机介质中可以选择性地制备掺杂的硫酸盐，有机介质被认为可以通过金属-配合活动调节晶体生长。下面将这种技术称为″多元醇或亚砜合成″。
所使用的多元醇优选具有两个或三个羟基，如甘油，乙二醇或聚乙二醇，优选使用低分子量聚乙二醇(优选乙二醇单元的平均数是4)。作为亚砜，可以使用二甲基亚砜(DMSO)。这种合成技术优选用于制备作为掺杂的主体材料的碱土金属硫酸盐，如镁，钙，锶或钡硫酸盐。
优选的金属原子源是相应的氯化物及其水合物。作为硫酸盐原料，优选使用具有有机阳离子的碱金属硫酸盐，硫酸铵或硫酸盐。同样可以使用相应的硫酸氢盐。
有机阳离子优选选自碱性含N-脂肪族、芳香族和脂肪族/芳香族物质，它们优选具有4～30、优选4～20个碳原子。适合的阳离子包括例如，
·季铵或膦，其中四个取代基独立地选自优选具有1～10个碳原子(优选1～5)的烷基或苄基，或
·质子化的芳香族碱，如肼，金刚烷胺，吡啶或三甲基吡啶。
相应地，硫酸盐纳米粒子可从原料制备，如四丁基硫酸氢铵，四甲基硫酸铵，双四丁基硫酸铵，或三乙基硫酸氢铵。其他适合的原料是硫酸氢铵，硫酸铵，碱金属硫酸氢盐，硫酸金刚烷铵，乙二胺硫酸盐和肼硫酸盐。
作为掺杂硫酸盐主体材料，可以使用相应掺杂剂的硝酸盐或卤化物，尤其是相应的金属氯化物。
如果原料中包括硫酸氢盐，优选向反应介质加入有机碱如咪唑作为除酸剂。反应优选在温度50～240℃下进行，其中甘油优选的低温范围是50～100℃，其他多元醇或亚砜溶剂最适合高温范围是160～240℃，尤其是160～180℃。得到的粒子其平均直径为0.2～50nm，并容易在水性介质中分散。
通过溶胶-凝胶法、水热合成法、甘油热反应合成或所谓的″多元醇或亚砜合成法″得到的纳米粒子芯有时在所保护方法第一步中所用的有机介质中不能分散，特别是本发明方法芯和壳合成所用的反应介质的极性明显不同时。为此，需要用适合的极性有机化合物对纳米粒子进行后处理，以提高其分散度。优选地，在与壳合成所用的相同有机介质(络合剂)或相似极性的有机介质中进行这种后处理。
例如，如果在含N-或含P介质中进行壳合成，那么后处理包括用含N-或含P介质对在溶胶-凝胶方法、甘油热反应或水热合成或所谓的″多元醇或亚砜合成″中得到的粒子进行后处理。
这种后处理包括在相应的有机化合物中加热纳米粒子。发生的作用是水或结合在纳米粒子表面上的其他亲水性残基被极性有机化合物置换。由于上述原因，对于金属离子而言，极性有机化合物优选选自含N-或含P的络合剂，这将在下文中″有机合成″和第二步骤中说明。然而，也可以使用其他功能化的极性有机化合物。
如果随后的制备步骤在多元醇和/或亚砜中进行，那么按″多元醇或亚砜″合成制备的硫酸盐不需要进行后处理。
根据其他和优选的技术，下文中称作″有机合成″，用于制备纳米粒子芯的方法包括如下步骤：
a)在包括至少一种金属络合剂和任选至少一种其他溶剂的有机反应介质中，使反应介质可溶解的或可分散的金属源和反应介质可溶解的或可分散的阴离子源反应，尤其是磷酸盐，硫酸盐或氟化物源，
b)任选地从由此形成的纳米粒子金属盐(例如磷酸盐，硫酸盐或氟化物)中除去反应介质，及
c)任选地回收纳米粒子盐。
作为″有机介质″，应理解除了不可避免的痕量水外不含有水的有机溶剂。有机介质的沸点优选高于下述的反应温度。例如150～400℃，优选高于180℃，尤其是高于210℃(环境压力下)。
取决于金属源被氧化的敏感性，优选在惰性气体如氮气或氩气中进行反应。
关于原料的纯度，推荐使用纯度至少为99.9％的金属盐。使用的所有反应试剂和溶剂优选无水和/或在使用前干燥。然而，常以水合物使用的金属氯化物优选不进行长时间干燥过程，因为这会增加反应介质不可溶解的氧氯化物的形成。
反应优选在50～350℃的温度下进行，例如120°～320℃，尤其是180°～290℃。技术人员可以通过逐渐提高温度来监测反应试剂的反应，从而确定反应进行足够快的合成最小温度，这样很容易测定适合的温度。为此，纳米粒子例如可以从反应介质的样本中沉淀出来，这样可以通过提高反应时间来研究粒子的生长。
适合的反应时间可以按相同方式确定，并优选为10分钟～48小时，尤其是30分钟～20小时。
反应完成后，反应混合物可以冷却至室温。如果在反应中或冷却后，纳米粒子仍没有完全沉淀，那么可以将甲醇加到反应介质中，或进行相反操作，以得到最大的产率。
尽管不限于理论，但是可以认为″有机合成″中所用的金属络合剂与形成的纳米粒子的表面金属原子配位，并在原料反应后停止生长。可以认为金属络合剂与粒子表面保持结合，按这种方式阻止或降低凝结及粒子间的交换过程，如Oswald熟化。有机合成形成相当小的粒子，其中在最长轴测得的平均直径优选为1-10nm，尤其是2-8nm，例如4-6nm，尺寸分布较窄(标准偏差＜30％，尤其是＜10％)。金属络合剂的特征是存在能够使金属离子与至少一种第二分子部分(低极性，优选疏水性)配位的极性基团，例如优选具有4～20、尤其是6～14个碳原子的脂肪族、芳香族/脂肪族、或纯芳香族分子部分。
金属络合剂优选是磷有机化合物或单或二取代的胺。
在后者中，最优选的实施方案是单或二烷基胺，其中烷基残基优选具有4～20，尤其是6～14个碳原子，如十二烷基胺或双(乙基己基)胺。
关于磷有机化合物，优选使用下面物质中的至少一种：
a)次磷酸的酯
Figure A20048001163500251
b)膦酸的二酯
Figure A20048001163500252
c)磷酸的三酯，最优选磷酸三烷基酯，如磷酸三丁基酯或磷酸三(乙基己基)酯，
Figure A20048001163500261
d)三烷基膦，如三辛基膦(TOP)，
Figure A20048001163500262
或
e)三烷基膦氧化物，如三辛基膦氧化物(TOPO)
其中R1，R2和R3独立地选自具有4～20、更优选4～14、尤其是4～10个碳原子的支链或直链脂肪族(优选烷基)，脂肪族/芳香族或芳香族残基。芳香族残基例如是苯基，脂肪族/芳香族残基例如是甲苯基、二甲苯基或苄基。
使用(a)～(c)和(e)的磷有机化合物，尤其(a)～(c)是特别优选的。
金属络合剂可以是有机反应介质中的唯一溶剂。如果其为唯一溶剂，那么按用作金属源的金属原子摩尔量计，优选用量至少为10mol。优选的上限约为1000mol。
取决于选择的金属络合剂及尤其是疏水性分子部分的长度，使用较大量是不方便的，因为这会阻碍形成的纳米粒子完全沉淀。
因此，优选的是另外使用″至少一种其他溶剂″。在此实施方案中，按1mol金属离子(用作金属源)计，金属络合剂(″第一溶剂″)优选使用的摩尔量小于10mol，更优选0.9～6mol。按1mol金属原子(用作金属源)计，″其他溶剂″的量优选为5～100mol。
″其他溶剂″应该与金属络合剂混溶，其沸点高于合成最小温度，优选沸点高于150℃，更优选高于180℃，最优选高于210℃。不希望沸点高于400℃。
″其他溶剂″可以是烃基溶剂或具有至少一个极性基团。如果在金属盐原料中存在结晶水，并且所述水被能够与金属配位的溶剂所置换，那么使用具有至少一个极性基团的溶剂是优选的。″其他溶剂″优选选自
·具有至少一个醚官能团的溶剂；尤其是，每个烷基基团具有5～10个碳原子的二烷基醚，如二戊基醚，二己基醚，二庚基醚，二辛基醚，或二异戊基醚；总共有12～18个碳原子的二芳基醚或二芳烷基醚，如二苯基醚或二苄基醚；或单或聚乙二醇(PEG)二烷基醚(其中每个烷基优选具有1～4个碳原子，PEG单元的平均数优选为10)，如二甘醇二丁基醚，三甘醇二丁基醚，和/或四甘醇二甲基醚；
·支链或非支链烷烃，优选具有10～18个碳原子，尤其是12～16个碳原子，如十二烷或十六烷；和/或
·有机高沸点碱，优选含N脂肪族碱，最优选三取代的胺，尤其是每个烷基基团具有5～10个碳原子的三烷基胺化合物，如三辛基胺或三(2-乙基己基)胺，或优选具有3～20个碳原子的含N芳香族碱，如咪唑。
这些溶剂也可以组合使用。有机高沸点碱不仅可以用作溶剂，而且可以用作除酸剂。例如，如果使用酸如磷酸或HF作为阴离子源，那么优选使用相对于酸的氢原子约等摩尔量(例如约0.6～1.4mol)的碱。
″阳离子源″可以选自任何适合的(足够反应性的)金属盐，并优选金属氯化物，金属醇盐(其中醇盐优选具有1～6个碳原子，尤其是1～4个碳原子)，金属硝酸盐或金属乙酸盐。使用金属氯化物是特别优选的。也可以使用水合的金属盐。然而，优选在反应之前除去结晶水。
″阴离子源″优选选自PCT/DE01/03433中所公开的原料。为合成纳米粒子硫酸盐、磷酸盐，硼酸盐，氟化物，硫化物，砷酸盐或硅酸盐，下列化合物是适合的：
a.硫酸，磷酸，硼酸或HF，
b.在合成混合物中可以溶解或至少分散的硫化物，砷酸盐，磷酸盐，硼酸盐，硫酸盐，硅酸盐或氟化物盐，尤其是具有有机阳离子的盐或碱金属盐，或
c.在高温下分解的酯，如硼酸烷基酯，硫酸烷基酯，砷酸烷基酯或硅酸烷基酯(例如四乙基原硅酸酯)。
对于b项，阳离子优选选自碱性含N脂肪族，芳香族和脂肪族/芳香族物质，优选具有4～30、优选4～20个碳原子。适合的阳离子包括例如上述季铵或膦盐或质子化的芳香族碱，如吡啶或三甲基吡啶。为制备磷酸盐纳米粒子，四丁基磷酸二氢铵，四甲基磷酸二氢铵，或三乙基磷酸二氢铵可以用作阴离子源。相应地，硫酸盐纳米粒子可以从原料中制备，如四丁基硫酸氢铵，四甲基硫酸氢铵，硫酸双四丁基铵，或三乙基硫酸氢铵。为制备含氟阴离子的纳米粒子，可以使用三乙基胺-三氢氟化物，四丁基铵氟化物，四丁基铵氢二氟化物，十二烷基胺氢氟化物或不易溶解的吡啶氢氟化物，或三甲基吡啶氢氟化物。
如果金属离子(阳离子源)在有机介质中溶解很慢，那么在加入金属-络合剂和反应溶剂之前优选在低级醇中溶解，优选甲醇。然后通过蒸馏除去甲醇和结晶水，干燥，然后加入其他反应试剂。
根据要保护的方法，根据上述一种合成技术得到的纳米粒子在有机介质中成为分散体(所谓的″第一混合物″)。
有机介质优选基于一种或多种沸点超过120℃、尤其是超过180℃但小于400℃的极性溶剂。优选选自″金属-络合剂″，尤其是所述的单或二烷基胺，其中烷基残基具有4～20个碳原子，磷有机化合物，多元醇和亚砜。优选地，有机介质含有金属-络合剂及任选地在有机合成部分中所述的″至少一种其他溶剂″。
相应地，可以并优选使用未经分离的要保护方法的第一步骤在″有机″合成或″多元醇或亚砜″中制备的纳米粒子。
应该注意到，有机介质用作纳米粒子芯的分散介质。因此，由于有机介质具有与金属原子配位的能力，在其上生长壳之前，纳米粒子保持在其胶体(非溶解)态。
II.2.第二步骤
在第二步骤中
·上述第一混合物，
·待形成壳用的阴离子源，尤其是磷酸盐，硫酸盐或氟化物源，及
·所谓的″第二混合物″，包括形成壳的金属离子(及其相反电荷离子)和所述金属离子用的有机络合剂
在50～350℃的温度下反应，直到在所述纳米粒子周围形成发光壳。
通常，优选保持阴离子源与第一混合物分开，从而避免过早反应。
第二步骤可以按照下面的三种实施方案(A)，(B)和(C)进行：
方法(A)包括如下步骤
在有机介质中制备第一混合物，包括金属盐或氧化物纳米粒子，例如金属硫酸盐、磷酸盐或氟化物纳米粒子，
加热所述第一混合物至温度为50～350℃，
在此温度下向第一混合物中分别滴加待形成壳用的阴离子源和第二混合物，包括形成壳的金属离子和所述金属离子用的有机络合剂，及
在此温度下使得到的混合物反应，直到在所述纳米粒子周围形成发光壳。
分别但同时加入的阴离子源和第二混合物，例如可以通过两个滴液漏斗加入，它们可以降低壳的活性原料的浓度，从而通过降低单独粒子从壳原料生成来提高反应的选择性。
方法(B)包括如下步骤
在有机介质中制备第一混合物，包括第一金属盐或氧化物的纳米粒子，例如金属硫酸盐、磷酸盐或氟化物纳米粒子，
将形成壳的阴离子源加到所述第一混合物中，
加热得到的混合物至温度为50～350℃，
向其中滴加第二混合物，包括形成壳的金属离子和所述金属离子用的有机络合剂，及
在此温度下使得到的混合物反应，直到在所述纳米粒子周围形成发光壳。
方法(A)和(B)易于形成更均匀的粒子，从而进一步含有较少百分比的形成壳材料的独立生长粒子。
方法(C)包括如下步骤
在有机介质中制备第一混合物，包括第一金属盐或氧化物的纳米粒子，例如金属硫酸盐、磷酸盐或氟化物纳米粒子，
混合所述第一混合物，待形成壳用的阴离子源和第二混合物，包括形成壳的金属离子和所述金属离子用的有机络合剂，优选是将所述第一混合物和所述阴离子源加到所述第二混合物中，及
加热得到的混合物至温度为50～350℃，直到在所述纳米粒子周围形成发光壳。
令人惊讶的是，发现逐渐加入原料，例如滴加，不是绝对需要的。尽管根据方法(C)，可以通过混合完成部分来混合原料，但是所需的芯/壳材料以高选择性和较少独立粒子生长的方式形成。因此，方法(C)比方法(A)和(B)更易于控制。
除非另有所指，下面优选的实施方案适用于所有三种方法(A)，(B)和(C)。
作为金属离子源，可以使用任何足够反应性的金属盐，优选壳金属离子的氯化物或醇盐。醇盐基团优选具有1～4个碳原子。
可以使用任何适合的阴离子源，只要它们能够在第一步骤中制备的芯粒子周围形成壳即可。
形成壳的适合阴离子包括但不限于磷酸盐，卤代磷酸盐，砷酸盐，硫酸盐，硼酸盐，铝酸盐，镓酸盐，硅酸盐，锗酸盐，氧化物，钒酸盐，铌酸盐，钽酸盐，钨酸盐，钼酸盐，碱性卤化物，其他卤化物，氮化物，硫化物，硒化物，硫硒化物或氧硫化物。
优选使用的壳形成阴离子适于在PCT/DE01/03433中所述的相似或相同条件下在有机介质中反应。实例包括硅酸盐，硼酸盐，砷酸盐，硫化物，硫酸盐、磷酸盐，及氟化物，尤其是硫酸盐、磷酸盐和氟化物。该文献也教导了那些阴离子源可用于产生相应的纳米粒子材料。
关于适合的硅酸盐，硼酸盐，砷酸盐，硫化物，硫酸盐、磷酸盐和氟化物源，也参考要保护方法第一步骤中所述的阴离子源，尤其是在″多元醇或亚砜″和/或″有机″合成中所用的那些。
阴离子源优选以″多元醇或亚砜″或″有机″合成中所述的至少一种溶剂中的细分散体或溶液方式加入。
阴离子源，尤其是磷酸盐，氟化物或硫酸盐源，按与所有加入的形成壳的金属原子反应所需的化学计量摩尔量计，优选用量为0.75～3mol，尤其是0.75～2。在二元盐(AB)情况下，B(阴离子)与A(金属)的比例为0.75∶1～2∶1。
在从磷酸盐或氟化物制备的芯或芯/壳粒子″有机″合成中，磷酸盐和氟化物源，如磷酸或HF，优选使用过量。按所需的化学计量摩尔量计，过量的摩尔量优选至少为1.05mol，更优选1.1～2mol，尤其是1.2～1,6mol。
相似地，在硫酸盐芯或芯/壳粒子的″多元醇或亚砜″合成中优选使用过量的硫酸盐源，如季铵硫酸(氢)盐。按所需的化学计量摩尔量计，过量的摩尔量优选至少为1.05mol，更优选1.1～3mol，尤其是1.2～2mol。
第二混合物中所含的有机络合剂也可以选自在纳米粒子有机合成中所述的有机络合剂或在″多元醇或亚砜合成″中所述的溶剂。
通常，需要保持形成壳的离子的有效浓度尽可能低。根据本发明，这可通过使用金属络合剂来实现。尽管不限于理论，但是可以认为，仅有小浓度的反应性(未络合的)金属离子有利于壳生长，从而独立形成新粒子。
根据优选的实施方案，第一混合物中所用的有机介质和第二混合物中存在的络合剂是一种磷有机化合物，单/二取代的胺，前面提到的多元醇或亚砜。更优选使用相同极性的有机化合物作为有机介质和络合剂。
此外，优选以与有机络合剂相同的比例使用上述″至少一种其他溶剂″。这样可以使用较少量金属络合剂，好象其是唯一的溶剂。那么金属络合剂和形成壳的金属离子的摩尔比再优选为0.9∶1～6∶1。
如果壳材料的阴离子源具有酸性氢原子，那么优选使用上述碱。在所述条件下，上述的有机高沸点碱(例如三烷基胺)例如优选用作阴离子源(如磷酸或HF)的除酸剂。通常如果使用具有酸性氢原子的阴离子源，那么这种有机高沸点碱也可以在硅酸盐，硼酸盐，砷酸盐，或硫酸盐的合成过程中加入。根据方法(A)或(B)，碱优选加入作为包括金属源和络合剂的″第二混合物″的成分。
包括金属络合剂的溶剂总量可由技术人员容易地确定，因为通常优选均匀溶解或分散所有原料。在方法(A)和(B)中，优选使用约相同量的溶剂以溶解阴离子源和金属源(第二混合物)。
通常，除非另有所指，反应优选在与项II.1″多元醇或亚砜″或″有机″合成中所述的相同或相似条件下进行。这也适于保护惰性气体和干燥反应试剂的使用。
没有特别限制与其余原料混合的纳米粒子芯的量，主要是取决于目标壳厚度。
根据本发明方法，反应介质从温度50℃加热至350℃，尤其是从120°加热至320℃，直到发光壳形成在按第一步骤制得的纳米粒子芯周围。
对于氟化物和磷酸盐而言反应优选在温度160°～240℃下进行，尤其是180°～220℃，对于硫酸盐而言在160°～180℃下进行。在甘油中形成硫酸盐壳也可以是更低温(例如，50～100℃)。技术人员可以通过逐渐提高温度来监测壳生长，从而确定反应进行足够快但没有不需要的副反应(如从壳原料形成新粒子)时的合成最小温度，这样很容易测定适合的温度。
在滴加原料的方法(A和B)中，加入时间优选为0.5～10小时，尤其是1～5小时。
优选的反应时间为30反应～48小时，尤其是1小时～20小时，特别是1.5～16小时。此外，监测反应可以确定适合的反应时间，例如通过从反应介质样本中沉淀纳米粒子并用TEM显微方法研究粒子尺寸分布。一旦观察到Oswald熟化，即当较小粒子损耗而较大粒子开始生长时，必须终止反应，例如通过冷却。
反应完成后，反应介质冷却至室温。这样可以增强形成的芯/壳纳米粒子的沉淀。如果沉淀未完成，那么可以将沉淀溶剂(例如甲醇)加到反应介质中，或相反加入，从而完成回收反应产物。可选择地，可以蒸馏掉过量的有机溶剂(包括有机络合剂)，或用孔尺寸优选与5000～10000Dalton值相应的膜进行超滤。这些值相应于约3nm的截流，在许多情况下该尺寸大至足以使溶剂通过，小至足以防止纳米粒子穿过并损耗。通常，需要压力为2～5bar，以在相应的超滤孔中交换溶剂。
此外，优选例如用甲醇、乙醇或异丙醇洗涤得到的纳米粒子。
关于氧化物壳材料、荧光合成、掺杂的金属氧化物，例如公开在US 6,309,701中，包括主体金属氧化物如Y2O3，ZrO2，CuO，CuO2，Gd2O3，Pr2O3，La2O3，及混合的氧化物，用至少一种稀土金属(Sc，Y，La和元素58～71)掺杂，尤其是Eu，Ce，Nd，Sm，Tb，Gd，Ho，和/或Tm。
在下述方式和实施例中，可以证实壳生长实际上已发生了。
一种选择包括通过沉淀小样本并在例如TEM显微镜中分析其粒度分布，来连续监测反应。按这种方式得到的样本表明在全部反应时间内是否壳生长，或也可观察到独立形成较小粒子。EDX分析(能量-分散性X-射线分析)可以确定纳米粒子的总组成。如果以不同激励能量进行XPS，那么XPS光谱可以为粒子从外部到内部的组成分布提供额外的信息。此外，芯/壳粒子的发光光谱通常可以容易地与反应中所用的芯纳米粒子相区分，这也表明在下面的实施例中。
III.芯/壳粒子的用途
III.1生物分析中的用途
本发明的芯/壳粒子由于其发光性能可以用在生物分析中。当前芯/壳粒子特别令人感兴趣的应用是(F)RET基分析(″(荧光)共振能量转移″，如上所述)。
在生物体系中，(F)RET经常用于确定相应标记的生物分子或分子组的空间接近度。此方法可用于证实各种生物反应或相互作用，例如蛋白-蛋白相互作用，免疫反应中的抗原-抗体反应，受体-配体相互作用，核酸杂交或蛋白与核酸的结合。
通过测量供体或受体发光的强度或光谱变化，或通过测量供体发光衰减时间的变化，可以对(F)RET发生过程进行测定。
这些技术的多种应用公开于文献中，这些文献用于本发明中，但不构成对本发明限制：在免疫荧光分析中测定特效抗原(US 3,996,345；US 4,160,016；US 4,174,384；US 4,199,559)，在蛋白表面的特定局部面积上测定静电势(Yamamoto等人，J.mol.Biol.241，1994，714-731页)或高产量筛选方法(Boisclair等人，J.of Bio molecular Screening 5，2000，319-328页)。
此外，(F)RET体系也可以分别测定两种生物分子间或一个生物分子部分内的绝对距离。这种技术也已成功地应用到蛋白或DNA结构分析中(Heyduk等人，SPIE，Vol.3256，1998，218-222页)，测量多肽内的距离(Lakowicz等人，Biophys.Chem.36，1990，99-115页)，蛋白(K.Cai等人，J.Biol.Chem.271，1996，27311-27320页)，多核苷酸(Hochstrasser等人，Biophys.Chem.45，1992，133-141页和Ozaki等人，Nucl.Acids Res.20，1992，5205-5214页)或其他大分子，膜和膜蛋白及其结构分析(S.Wang等人，Biochemistry 27，1988，2033-2039页)，检测(US 4,996,143；US 5,532,129；US 5,565,332)和通过PCR(聚合酶链反应)定量放大的核酸(US 5,538,848；US 5,723,591)，例如，在体外诊断，基因分析，法医鉴定，食物和农业化学测试或亲子鉴定。可以直接即没有其他分离步骤检测或定量DNA或RNA。
用(F)RET体系通过实时PCR定量核酸检测是TaqMan分析(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corp.，Foster City，USA)，称为5′-核酸酶分析(US 5,538,848；US 5,210,015；Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，1991，7276-7280页；Lee等人，Nucleic AcidsRes.21，1993，3761-3766页)。分子信标方法(Tyagi和Kramer，NatureBiotechnology 14，1996，303-306页；US 5,312,728)基于相似的机理。
近来对″生物化学中FRET″的评述由S.Brakmann和N.Nbel在Nachrichten aus der Chemie，51，2003年3月公开，319-322页，其中公开了FRET基生物分析的其他变型，其中也可以使用本发明的芯/壳粒子。
因此，本发明的芯/壳粒子可用于(F)RET基生物分析中，包括可以用至少一种能量供体(供体)标记的第一分子组A和用至少一种能量受体(受体)标记的至少一个第二分子组B，其中
供体包括分子或粒子，其可以被外部辐射源积极地激励并能够发光，及
受体包括分子或粒子，其可以受从供体转移的能量激励，从而部分或完全猝灭供体发光，及
供体和/或受体包括本发明的芯/壳粒子，优选沿最长轴测得的平均直径不超过50nm的那些，尤其是不超过30nm等。
这种分析可以以两种方式进行。(F)RET基分析要求受体也能够发光。如果在没有辐射下受体松弛，RET体系也可起作用。
优选地，本发明的芯/壳粒子用作供体。由于这些供体在受能量激励后发出斯托克或反斯托克迁移的电磁辐射，在激励源和发光辐射间产生光谱可区别的差异。
本发明的芯/壳粒子在上述类型的生物分析中表现出极高性能，因为它们的发光可更有效地被猝灭。尽管不希望限于理论，但是可以认为与均匀粒子相比，位于或接近表面的发光中心的较高百分比可解释该现象。较高的易猝灭性为(F)RET基生物分析带来各种优点，如较高的灵敏度。
在衰减曲线(发光强度对时间)中，可以将较高的易猝灭性标注为供体的较短半值(半衰期)。在时间闸荧光光谱中(TGF方式)，因为受体体系的极高效能量转移，供体发光(芯/壳粒子)几乎完全消失，这将在实施例中进一步详细说明。
关于用作供体和/或受体的芯/壳粒子的优选实施方案，优选仅作为供体，可以参考说明书的项I。
当选择适合的供体/受体对，通常推荐使用具有较高量子产率的供体探针。此外，需要供体探针的发射光谱必须相当程度地与受体探针的吸收光谱重叠。进一步需求，供体和受体跃迁偶极方向的适当对齐(约平行)，通常在生物体系中不存在问题，从而不会限制供体和受体的各向同性移动。此外，如前所述，需要考虑Frester距离，从而供体和受体优选彼此相距1±0.5R0(Frester距离)。Frester距离是能量转移效率为50％时的距离。本领域中公知的是可以从供体和受体的光谱性能进行计算。
除了本发明的芯/壳粒子外，通常的供体和/或受体体系是有机染料，如荧光素，四甲基若丹明，IAEDANS，EDANS，Dabcyl，BODIPYFL，QSY 7和QSY 9。适合光谱约350～750nm的其他商业上可得到的发光有机染料包括Alexa Fluor染料(由Molecular Probes制造)或Cy染料(Amersham Pharmacia)。在这些染料中，在较高波长(可见光至近IR)下吸收和发射的染料是特别有吸引力的，因为它们不会损害生物体系。
根据本发明，优选的是使用本发明的芯/壳粒子作为供体，而结合的适合受体选自上述有机荧光染料。
包括Eu3+掺杂的壳的粒子作为供体，例如可以与作为受体的AlexaFluor 680混合，或含有Tb3+的粒子与Dabcyl或荧光素混合。这些含Tb芯/壳粒子的实例例如是芯/壳体系，其具有被Tb3+或Ce3+包围的惰性(非发光)芯，且Tb3+掺杂的金属盐或氧化物作为壳，及基于铈(Ce3+)盐或氧化物芯的芯/壳体系，其并被铽(Tb3+)盐或氧化物壳包围。
由于空间相互作用或在生物分析中的沉淀，与较大粒子相比，平均直径低于50nm的芯/壳粒子具有更小的电压。此外，可以预期，待测定的生物化学方法对结合反应(例如，免疫反应或DNA杂交)动力学影响较小。
通常用两种不同的分光方式测量(F)RET基体系中的能量转移(WO87/07955；EP 242527；EP 439036；WO 92/01225；US 4,822,733；US5,279,943；US 5,622,821；US 5,656,433；US 5,998,146；US 6,239,271)，即时间闸荧光测定法(TGF)和/或时差式荧光测定法(TRF)。根据TGF方式，用脉冲光源(例如激光，闪光灯)激励荧光供体，然后在特定时间窗预定延迟后测量光发射。相对较短时间仍可以以足够高强度测量镧系元素离子的长持续时间发光。通过生物材料固有自身荧光引起的相对较短持续时间的背景荧光(通常小于1μs)，溶剂杂质或周围的生物材料几乎完全由延迟来区分。
与TGF方式相比，TRF方式在恒定波长下以发光作为时间的函数进行测量。供体也由以不同方式调制的脉冲光源或光源激励。
直径不超过50nm的芯/壳粒子适用于TRF方式，因为对于较大粒子而言，大部分粒子体积与受体接近程度不足以参与能量转移，从而降低有效强度。
根据本发明，至少一种(F)RET配偶体，即供体或受体，表现出相对较长的发光衰减时间，而其他(F)RET配偶体的特征是衰减时间短。
优选地，使用发光半值为1微秒～50毫秒，更优选100微秒～10毫秒的芯/壳粒子作为供体。
如果这些供体与通常具有更短衰减时间的常规有机荧光染料混合，那么供体变得敏感，并将受体发光延长超出其固有发光。以TGF方式测量这种体系可以排除短时间固有受体发光，并以高灵敏度测定敏感的受体发光。
其他适合的受体可以选自电导材料，如金，银，铂，或导电金属氧化物，如In-Sn氧化物(ITO)或导电聚合物。
为使本发明的芯/壳粒子与分析所针对的生物分子结合，可以使用下面的技术。
可通过下述产生结合
·化学改变芯/壳粒子，通常包括在表面上产生″官能团″，所述官能团能够与生物分子结合，和/或
·使可任选地化学改变的芯/壳粒子表面与共价或非共价结合的所谓的″连接分子″连接，然后使生物分子与得到的粒子反应。
术语″连接分子″指能够与本发明的芯/壳粒子连接并与亲合性分子或一个分子或分子部分连接的物质，分子部分作为竞争亲合性分子相同结合点的目标分子，例如抗原决定部位。
术语″目标分子″指一种实体或基团，其在材料如生物样本中存在或不存在可以使用本发明的芯/壳粒子来确定。
术语″亲合性分子″指可以选择性地结合待分析材料(例如生物材料)中的目标分子(如果存在)的生物分子。
下文中所用的术语″官能团″没有限制到形成共价键的反应性化学基团，而且包括与生物分子形成离子相互作用或氢键的化学基团。此外，应该注意到，严格区别在表面产生的″官能团″和带有″官能团″的连接分子是不可能的，因为有时改变表面需要使较小连接分子如乙二醇与纳米粒子表面反应。
官能团或带有官能团的连接分子可以选自氨基，羧酸基团，硫醇，硫醚，二硫化物，胍基，羟基，胺基团，邻二醇，醛，α-卤代乙酰基，汞有机物，酯基，酸卤化物，酸硫醚，酸酐，异氰酸酯，异硫代氰酸酯，磺酸卤化物，咪唑酯，重氮乙酸盐，重氮盐，1，2-二酮，膦酸，磷酸酯，磺酸，吡咯，咪唑，吲哚，N-马来酰亚胺，α-β-不饱和的羰基化合物，芳基卤化物或其衍生物。
高分子量其他连接分子的非限制性实例是核酸分子，聚合物，共聚物，聚合的偶联剂，二氧化硅，蛋白，及带有表面的链状分子，相对于芯/壳粒子具有相反极性。核酸可以对本身含有核酸分子的亲合性分子提供连接，尽管相对于连接分子而言具有互补序列。
聚合的偶联剂的实例是丁二炔，苯乙烯丁二烯，乙酸乙烯酯，丙烯酸酯，丙烯酰胺，乙烯基化合物，苯乙烯，硅树脂氧化物，氧化硼，氧化磷，硼酸酯，吡咯，聚吡咯和磷酸酯。
下面进一步详细说明连接技术：
1.芯/壳纳米粒子表面可被化学改变，例如通过结合具有反应性官能团的膦酸衍生物。这些膦酸或膦酸酯衍生物的一个实例是亚氨基-二(亚甲基膦酰基)碳酸，其可使用″Mannich-Moedritzer″反应(Moedritzer和Irani，J.Org.Chem，1966，31，1603)来合成。这种结合反应可以使用直接从本发明制备方法制得的或预处理后(例如用三甲基甲硅烷基溴化物)的芯/壳粒子进行。在第一种情况下，膦酸(酯)衍生物可以例如转移仍与表面结合的反应介质的组分。这种转移在高温下可被进行。另一方面，三甲基甲硅烷基溴化物被认为可以脱去本发明方法中使用的含烷基磷基络合剂的烷基，从而为膦酸(酯)衍生物产生新结合点。膦酸(酯)衍生物，或与其连接的连接分子，可以带有上述相同的官能团。
2.芯/壳纳米粒子表面处理的另一个实例包括在二醇如乙二醇中加热粒子。应该注意到，如果在二醇中已经进行了芯/壳粒子的合成，那么这种处理也许是多余的。在这种情况下，直接得到的合成产物可能带有必须的官能团。然而，这种处理适于在上述含N-或含P络合剂中制备的芯/壳粒子。如果用乙二醇对这种芯/壳粒子进行后处理，那么仍与表面结合的反应介质(例如络合剂)的成分可以由二醇替换，和/或可以被脱去烷基。用二醇处理得到水可溶的粒子。相似地，上述带有反应性第二官能团的伯醇可用于后处理。仍与粒子表面结合的含N络合剂可以由具有选自上述例子中的第二官能团的伯胺衍生物代替。
3.本发明芯/壳粒子的表面刀可以用氧化硅涂覆。氧化硅可以使有机分子形成相对简单的化学结合，因为氧化硅易于与有机连接剂反应，如三乙氧基硅烷或氯硅烷。粒子表面也可以用均聚物或共聚物涂覆。聚合的偶联剂的实例是N-(3-氨基丙基)-3-巯基苄脒，3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酰肼和3-三甲氧基甲硅烷基)丙基马来酰亚胺。聚合的偶联剂的其他实例如上所述。这些偶联剂可以单独使用或混合使用，这取决于作为纳米粒子涂层的共聚物类型。
4.根据另一种表面改性技术，含有氧化过渡金属化合物的芯/壳粒子可以通过氯气或有机氯化剂转化成相应的氧氯化物。这些氧氯化物可以与亲核试剂反应，如在生物分子中经常存在的羟基或氨基。这种技术使得可以与蛋白直接连接，例如通过赖氨酸侧链的氨基。用氧氯化物表面改性后与蛋白连接也可以通过使用双功能连接剂来进行，如马来酰亚氨基丙酸酰肼。
5.对于非共价连接技术，具有与芯/壳粒子表面相反的极性或电荷的链型分子特别适合。可以与芯/壳纳米粒子非共价连接的连接分子例子包括阴离子、阳离子或两性离子表面活性剂，酸性或碱性蛋白，聚胺，聚酰胺，聚砜或聚羧酸。纳米粒子和具有反应性官能团的两性试剂间的疏水性相互作用可以产生必须的连接。尤其适用的是具有两性特性的链型分子，如磷脂或衍生的多糖，它们可以相互交联。在芯/壳粒子表面上吸收这些分子可以通过共孵育进行。在亲合性分子和芯/壳粒子间的结合也基于非共价的自组键。一个例子包括简单地检测探针，其中生物素作为连接分子和抗生物素或strepdavidine连接的亲合性分子。
官能团与生物分子的连接反应的方法公开于文献中，例如″Bioconjugate Techniques″(Greg T.Hermanson，Academic Press 1996)。生物分子，尤其是亲合性分子可以与连接分子以共价或非共价方式根据有机化学中的标准方法连接，如氧化，卤化，烷基化，酰化，加成，取代或氨化。连接生物分子和共价或非共价结合的连接分子的这些方法可以在使连接分子与芯/壳纳米粒子连接之前或之后使用。此外，可以通过孵育使亲合性分子与相应预处理的芯/壳纳米粒子直接结合(例如通过三甲基甲硅烷基溴化物)，由于这种预处理而表现出改性的表面(例如较高电荷或极性表面)。分别用供体或受体标记的分子组A和B可以代表一部分相同分子，并且例如与相同亲合性分子连接。这些分子组的空间距离变化例如可以由确认变化或分子裂解引起。这种确认变化或分子的裂解是亲合性分子和目标分子间相互作用的结果。
可选择地，分子组A和B可以位于不同分子上，所述分子组A和B每一个与自已的亲合性分子连接。空间距离的变化可以由亲合性分子的相互作用引起，而亲合性分子用连接目标分子或彼此间被分派到分子组A和B。这种相互作用例如可以是蛋白间的相互作用，如抗原和抗体的免疫反应，核酸的杂交或核酸和蛋白间的相互作用。
生物分析例如可以是用于检测身体样本中分析物的均匀免疫分析(例如药签，唾液，器官斑点，活组织切片，分泌物，体液，胆汁，血液，淋巴液，尿，粪)。均匀分析不需要洗涤或分离步骤。
使用本发明芯/壳粒子的生物分析也可以是不均匀分析。
在分析中待检测的分析物(通常是目标分子)可以是例如单克隆或多克隆抗体，蛋白，肽，寡核苷酸，核酸，寡或多糖，半抗原或低分子合成或天然抗原。
相似地，亲合性分子的非限制性例子是蛋白，肽，寡核苷酸，或其他核酸分子或相关物质，如PNA或吗啉及寡或多糖，半抗原，如生物素或地高辛，或低分子合成或天然抗原，或抗原决定部位。
分析可用于溶液中，及固相基或阵列基体系，其中寡核苷酸或多核苷酸链或者抗体或抗原分别固定在表面上。
可以按各种方式使用本发明的芯/壳粒子进行分析。
根据一种应用，(F)RET配偶体位于相同分子上，即两个(F)RET配偶体通过相应的连接分子(部分未示)与相同的亲合性分子结合(图6a，6b，7，10和11)。目标分子与亲合性分子的结合包括亲合性分子的确认改变，从而使标记相对于彼此的空间位置改变，从而在(F)RET中产生可测量的差值。
对于其他应用，(F)RET配偶体位于不同分子上，每一个连接到各自的亲合性分子上(图8)，或连接到分析物和亲合性分子(图9)。可以选择各亲合性分子，使得供体和受体间发生相互作用，这种相互作用可由目标分子的反应产生或取消，从而使能量转移发生变化。
下面结合图6～11解释在(F)RET基生物分析中本发明芯/壳纳米粒子的用途。
图6a示意性表明在均匀激酶分析中，位于相同分子上的(F)RET配偶体的相互作用。lad-纳米粒子1(lad＝发光无机掺杂的)和发色团2通过肽序列3连接。肽序列含有激酶-特效识别序列4。如果肽序列3在此位置被激酶5磷酸化，那么存在的磷酸盐6可以改变肽序列3的确认。这样可以测量(F)RET配偶体、纳米粒子1和发色团2之间的相互作用。
图6b示意性表明位于一个分子上的(F)RET配偶体的均匀免疫分析，从而可以确定蛋白-蛋白相互作用，例如抗原-抗体反应。纳米粒子1和发色团2通过肽序列3连接。肽序列含有抗原决定部位14。如果可特效识别抗原决定部位14的抗体15与抗原决定部位14结合，那么肽序列3的确认改变。这样可以测量(F)RET配偶体、纳米粒子1和发色团2间的相互作用。
如图6a和图6b所示，待检测的分子可以直接与亲合性分子结合。然而，也可以使分子与亲合性分子间接结合。一个例子是测量活体细胞中的Ca2+浓度。为此，利用无横纹肌肉中钙调素与肌球蛋白轻链激酶激酶(MLCK)的钙依赖性结合。MLCK的钙调素结合区用作亲合性分子，并与(F)RET配偶体连接。取决于Ca2+浓度，钙调素与结合区结合，并引起了检测探针的确认变化。由此引起可测量(F)RET的变化。
图7示意性表明用位于一个分子上的(F)RET配偶体进行的竞争免疫分析，用于测定身体样本中的分析物26浓度。纳米粒子1和发色团2通过与抗原决定部位27结合的连接分子29连接。根据待检测的分析物26的一个抗原决定部位设计抗原决定部位27。亲合性分子28与抗原决定部位27特效结合。通过加入含有待检测的分析物26的样本(例如身体样本)，仍与抗原决定部位27结合的亲合性分子28从抗原决定部位27移位。这样引起亲合性分子29的确认变化，并使(F)RET配偶体、纳米粒子1和发色团2间的相互作用发生可测量的变化。这种(F)RET变化用于确定分析物26浓度。
图8示意性表明用不同分子上的(F)RET配偶体进行的均匀饱和免疫分析。纳米粒子110的亲合性分子和发色团120分别可以识别相同目标分子130的不同抗原决定部位，从而在目标分子130存在下发生可测量的能量转移。供体和受体位于不同分子上的均匀免疫分析的一个例子是检测血清中的hCG(人绒毛膜促性腺激素)。因此，供体和受体与可以识别hCG不同抗原决定部位的抗体连接。如果身体样本中存在hCG，那么供体和受体探针与分析物结合。可测量的FRET可用于借助校准曲线确定身体样本中的分析物浓度。
图9示意性表明用在不同分子上的(F)RET配偶体210和220进行的均匀竞争免疫分析。一个或多个发色团220与分子222连接，其部分或完全相应于待检测的分子224。lad纳米粒子210与亲合性分子212连接，其与待检测的分子222和分子224发生特别的相互作用。在亲合性分子212和分子222间发生结合，从而能够进行(F)RET。如果向其中含有待检测分子224的样本(例如身体样本)，取决于所述样本中待检测的分子224的浓度，发生移位反应。这样会产生可测量的变化，在这种情况下(F)RET降低，从而可以借助校准曲线测量待检测的分子的浓度。
图10示意性表明用一个分子上的(F)RET配偶体进行的均匀分析。Lad纳米粒子310和发色团320通过作为亲合性分子的肽330连接。这种肽可由待检测的酶340裂解。裂解后，不能再观察到(F)RET。
图10的分析可用于确定样本或细胞中的特效酶活性，例如蛋白酶对HI-病毒的特效性。两个(F)RET配偶体都通过这种蛋白酶的短识别序列连接，并通过这种蛋白酶的活性彼此空间分离，从而肽裂解。待检测的酶活性可源于限制核酸内切酶。然后两个(F)RET配偶体都通过核酸连接。
图11示意性表明按分子信标方法进行的分析。分子信标是DNA分子，其可通过分子间互补序列复制成所谓的茎环或发夹结构。一个lad纳米粒子410与DNA序列430的一个端部连接。另一个端部与作为荧光取消剂或猝灭剂的发色团420结合。在发夹结构中，两个(F)RET配偶体410和420靠近排列。因此，供体410的荧光完成猝灭。目标分子440表现出与DNA序列430的环区域互补的序列。由于目标分子440的结合在能量上更有利，因此发夹确认消失，发色团420和lad纳米粒子410彼此分离，并且因为(F)RET不再引起荧光猝灭，所以发出可测量的荧光。可以调节杂交性能，使得在分子信标430和目标DNA440间不匹配的单碱基对不会打开发夹结构。这样可以检测单碱基的差别(例如SNP，单核苷多态性)。
图11所示的技术也可用于商标保护和/或产品的防伪标记。如果产品用DNA(片断)标记，两端有短的互补结构，其中一端与本发明的芯/壳粒子连接，另一端与上述受体连接，在得到的分子信标(发夹结构)内可观察到(F)RET。一旦这种DNA(片断)与互补结构接触，杂交将取消发夹结构，从而阻止(F)RET。这样可以对商业产品进行特效识别和保护。基于合成DNA识别的商标保护也已商业化，例如NovemberAG，Germany。
III.2其他用途
独立于它们在生物分析中的用途，要保护的芯/壳粒子如果与适合的发光受体组合，通常可以对生物或其他体系中的纳米距离进行(F)RET基测量。这种测量对于纳米材料科学中的光谱方法具有重要意义。
此外，要保护的芯/壳粒子可用于要求优异(光)发光性能的各种工业装置和产品。
为此，它们通常制备成流体或固体介质中的分散体。
适合的流体介质包括例如有机或水性分散介质，涂覆组合物，油墨或染料，聚合物组合物，或气溶胶。适合的有机分散介质包括但不限于甲苯，CHCl3或CH2Cl2。
用上述含N-或含P介质/络合剂合成可确保本发明的芯/壳粒子易于在有机介质中分散。
制备水性分散体需要进行后处理，其中合成中所用的有机材料残渣将被溶剂取代，该溶剂具有一个与粒子的表面和一个分子部分结合的官能团，从而确保在水中所必需的相容性，可任选地与水易混溶溶剂一起使用。
固体分散介质可以选自涂料，油墨或染料，聚合物组合物，尤其是聚合物膜。
纳米粒子或通常含有纳米粒子的流体或固体介质例如可用于产生光、印刷或标记物品和材料。
这种应用例如是发光二极管，显示器，光电子装置(例如nm尺寸的放大器)和零阈值激光器中的光源。它们也可以用作印刷装置中的油墨，这在文件或纸币防伪中有重要意义。
IV.实施例
实施例1：具有TbPO4壳的CePO4纳米粒子芯
在带有高效回流冷凝管、温度探针和加热套的100ml圆底烧瓶中，将3.72g(10mmol)CeCl3·7H2O溶解在约4ml甲醇中，然后向得到的溶液中加入40ml三-2-乙基己基磷酸酯(TEHP)。首先在室温下(1～2小时)，然后在50℃下(约1.5小时)减压圆底烧瓶，除去甲醇和结晶水。
在第二烧瓶中，将干正磷酸(20mmol)溶解在5ml四甘醇二甲基醚中。
在氮气中于50℃下，13.1ml(30.0mmol)三辛基胺和2.5ml正磷酸/四甘醇二甲基醚混合物加到CeCl3在TEHP中的溶液中。随后混合物加热15小时到200℃。这段时间后，得到CePO4粒子(平均直径5mm)的透明分散体(″第一混合物″)。
在带有高效回流冷凝管、温度探针和加热套的第二100ml圆底烧瓶中，将3.72g(10mmol)TbCl3·6H2O溶解在约4ml甲醇中，然后向溶液中加入40ml三-2-乙基己基磷酸酯(TEHP)。首先在室温下(1～2小时)，然后在50℃下(约1.5小时)减压圆底烧瓶，除去甲醇和结晶水。在氮气中于50℃下，13.1ml(30.0mmol)三辛基胺和2.5ml(10mmol磷酸)正磷酸/四甘醇二甲基醚及14ml CePO4分散体(冷却至约20-30℃)加到TbCl3溶液(″第二混合物″)中，随后加热12小时到200℃。冷却至室温，反应混合物倒入甲醇中，以沉淀芯/壳纳米粒子。离心沉淀物(5500upm)，用甲醇洗涤得到的粒子，并干燥。
图2所示的这些粒子的光致发光光谱证实了芯/壳结构。
TEM测量进一步表明这些粒子的平均直径(沿最长轴)约为6nm。
图1表明均匀CePO4粒子(线1)和本发明芯/壳粒子(线2和3)的荧光光谱，其中TbPO4壳在CePO4粒子周围生长。线2反映的光谱反应时间为0.5小时，而线3表明CePO4芯的荧光，该芯具有完全长成的TbPO4壳(反应时间18小时)。以相同的光学密度(10-3wt-％)在异丙醇中记录光谱(λexc＝274nm)。
从图1中可以看出，均匀CePO4粒子的特征是在330nm周围有强荧光发射，但在可见光范围内没有发射。这种情况因TbPO4涂层而明显变化。Ce3+强烈吸收激励的辐射，将吸收的能量转移至Tb3+，Tb3+在488nm，545nm，586nm和617nm处以四个强特征能带形式发光。这种能量转移降低Ce发射，并剧烈提高Tb发射。
实施例2：具有TbPO4壳的LaPO4纳米粒子芯
在带有高效回流冷凝管、温度探针和加热套的100ml圆底烧瓶中，将3.2g(8.6mmol)LaCl3·7H2O溶解在约10ml甲醇中，然后向得到的溶液中加入39ml三-2-乙基己基磷酸酯(TEHP)。首先在室温下(1～2小时)，然后在50℃下(几小时)减压圆底烧瓶，除去甲醇和结晶水。
在第二烧瓶中，将干正磷酸(20mmol)溶解在5ml四甘醇二甲基醚中。
在氮气中于50℃下，11.5ml(26.3mmol)三辛基胺和2.3ml正磷酸/四甘醇二甲基醚混合物加到LaCl3在TEHP中的溶液中。随后混合物加热16小时到200℃。这段时间后，得到LaPO4粒子的透明分散体(″第一混合物″)。
在带有高效回流冷凝管、温度探针和加热套的第二100ml圆底烧瓶中，将2.97g(8mmol)TbCl3·6H2O溶解在约10ml甲醇中，然后向溶液中加入35.2ml三-2-乙基己基磷酸酯(TEHP)。首先在室温下(1～2小时)，然后在50℃下(几小时)减压圆底烧瓶，除去甲醇和结晶水。在氮气中于50℃下，10.5ml(24mmol)三辛基胺和2.0ml(8mmol磷酸)正磷酸/四甘醇二甲基醚及全部量的LaPO4分散体(冷却至约20-30℃)加到TbCl3溶液(″第二混合物″)中，随后加热16小时到200℃。冷却至室温，反应混合物倒入甲醇(300ml)中，以沉淀芯/壳纳米粒子。离心沉淀物(5500upm)，用甲醇洗涤得到的粒子，并干燥。
参考例1：分析芯/壳粒子
下面参考例描述了对具有LaPO4壳的CePO4：Tb纳米粒子芯的化学组成、芯直径和壳厚度的测量。即使这些粒子没有被权利要求所覆盖，但是这种分析技术也完全适用于本发明。
为此，将粒子放在带有孔的碳膜上，并在Philipps CM300UT显微镜下研究。
EELS(电子能量损耗光谱)表明阳离子的平均化学组成是Ce/La＝0.34±0.05，Tb/La＝0.12±0.03，这意味着La/Ce＝3.0±0.4，Ce/Tb＝2.8±0.8，后面值近似相应于所用的摩尔比Ce/Tb(3.14/1)。
HREM(高分辩率电子显微镜方法)证实了得到的芯/壳粒子的结晶度。
此外，用扫描速率为0.48nm/图像点的弱焦点得到Hellfeld图像，从而也覆盖较小的粒子。图像分析表明占大部分体积的主要粒子直径为5～9nm。对6个这样的粒子进行EFTEM(能量过滤透射电子显微镜方法)，所谓的″光谱图像方法″用″Landeszentrum fürHochleistungsspektroskopie，Institut für Anorganische Chemie″in Bonn，Germany进行显影，以进行定量分析。为此，6个结晶粒子以极高放大倍率集中在图像能量过滤器后的CCD照相机上。然后插入最小的物镜屏(4.6mrad)和最大的进入屏(3mm)，以光谱方式使用能量过滤器。从而通过进入屏的全部强度在检测器上形成一条条图像。由于透镜的像差，这种方法成像仅在约±40eV时，并且尖锐(低于nm)，因此在832，849，884和902eV时聚焦在LaM5，4和CeM5，4边缘。在选择主放大倍数为99K时，进入屏直径总是11.2nm。
图2表明(D)被LaPO4壳(直径约7nm)包围的一个CePO4：Tb纳米粒子的Hellfeld图像(带有进入屏)，(E)在860eV能量损耗时的光谱图像，及通过粒子表面(A，C)和中心(B)的外形。外形(A，B和C)表明LaM5，4和CeM5，4峰，其相对强度近似相应于局部组成。
不同形状证实存在富Ce的芯和富La的壳的芯/壳结构。6个选择的粒子其平均直径为7.5±1.9nm，由直径为4.0±1.1nm的富Ce的芯和厚度为1.9±0.7nm的富La的壳组成(在分析中没有测定Tb)。
实施例3：将荧光素与实施例1的芯/壳粒子(CePO4/TbPO4)连接
3-1：用亚氨基-二(亚甲基膦酰基)-十一酸和1，4-二(3-氨基丙氧基)-丁烷对芯(CePO4)-壳(TbPO4)-纳米粒子进行氨基功能化
通过加热至50℃达30min用1.5ml乙二醇和0.51g(2.5mmol)1，4-二(3-氨基丙氧基)-丁烷溶解0.388g(1mmol)亚氨基-二(亚甲基膦酰基)十一酸。得到的溶液略带黄色。将实施例1中得到的25mg(＝71.5nmol)芯(CePO4)-壳(TbPO4)-纳米粒子加到溶液中，搅拌，并加热至～120℃达4h。分散体变混浊，并略带黄色。用2×2l 10mM Na-碳酸盐缓冲液(pH 8.5)过夜透析后(透析管Spectra/Por，5-6.000MWCO，Spektrum，Netherlands)，沉淀粒子。
3-2：将荧光素与氨基-官能化的芯(CePO4)-壳(TbPO4)-纳米粒子连接
在5000rpm下将5mg(25nmol)氨基-官能化的纳米粒子(上述)离心10min，小球再悬浮在500μl 0.2M Na-碳酸盐缓冲液(pH8.5)中，浓度为10mg/ml。FITC(荧光素异硫代氰酸酯)溶解在DMF和0.2m Na-碳酸盐缓冲液(pH8.5)的1∶1溶液中，浓度5mmol/ml。向粒子中加入17-倍过量的(87μl＝429nmol)，混合物在室温下旋转孵育4.5h。使用葡聚糖凝胶G-25M PD 10柱(Amersham Bioscience)和10mM Na-碳酸盐缓冲液(pH8.5)作为洗脱缓冲液分离未结合的FITC。3.9ml的洗脱部分含有荧光素连接的纳米粒子。
比较例1：将荧光素与均匀LaPO4：Ce，Tb粒子连接
CE1-1：制备LaPO4：Ce，Tb纳米粒子
用干氮气流使300ml TEHP(三(2-乙基己基)磷酸酯)脱气。然后，将7.43g LaCl3·7H2O(20mmol)，8.38g CeCl3·7H2O(22.5mmol)，及2.8g TbCl3·6H2O(7.5mmol)溶解在100ml甲醇中，并加到TEHP中。然后在温度30～40℃下减压除去水和甲醇。然后加入4.9g干正磷酸(50mmol)溶解在66.5ml三辛基胺和150ml TEHP的混合物中的新制溶液。减压下放置，立即得到清澈溶液，充入氮气以最小化当温度升高时Ce3+的氧化。然后，溶液加热至200℃。如果沸腾温度降至175℃(约30～40小时后)，那么停止加热。冷却至室温后，加入4-倍过量的甲醇以沉淀粒子。分离粒子，用甲醇洗涤，干燥。
CE1-2：用溴代三甲基硅烷脱烷基化
将CE1-1中得到的300mg LaPO4：Ce，Tb-纳米粒子(约850nmol)与100ml氯仿中的2.3g溴代三甲基硅烷(15mmol)回流4小时。除去过量溴代三甲基硅烷和挥发性中间产物，减压分离。在6ml水和100μl氨水(25％)的混合物中搅拌下水解含有纳米粒子的残渣过夜。得到的粒子形成乳状悬浮液，几小时后部分沉淀。可以通过离心进行分离。
CE1-3：用亚氨基-二(亚甲基膦酰基)己酸对脱烷基的LaPO4：Ce，Tb纳米粒子进行氨基功能化
通过加热至50℃达30min将0.5g(1.75mmol)亚氨基-二(亚甲基膦酰基)己酸(KBD9267)和0.894g(4.375mmol)1，4-二(3-氨基丙氧基)-丁烷(Fluka)溶解在2ml乙二醇中。得到的溶液略带黄色。将CE1-2中得到的35mg(＝175nmol)LaPO4：Ce，Tb-纳米粒子加到溶液中，搅拌，并加热至～120℃达4h。冷却至室温后，分散体透明并呈褐色。用2×2l 10mM Na-碳酸盐缓冲液(pH 8.5)透析后，溶液略带黄色，透明。
CE1-4：将荧光素与氨基-官能化的LaPO4：Ce，Tb纳米粒子连接
CE1-3的氨基官能化的LaPO4：Ce，Tb纳米粒子溶液减压浓缩至～4.8mg/ml。FITC(荧光素异硫代氰酸酯)溶解在DMF和0.2m Na-碳酸盐缓冲液(pH8.5)的1∶1溶液中，浓度5mmol/ml。向5mg(～1ml＝25nmol)的纳米粒子中加入17-倍过量的(87μl＝429nmol)，混合物在室温下旋转孵育4.5h。使用葡聚糖凝胶G-25M PD 10柱(AmershamBioscience)和10mM Na-碳酸盐缓冲液(pH8.5)作为洗脱缓冲液分离未结合的FITC。3.5ml的洗脱部分含有荧光素连接的纳米粒子。
实施例4：用荧光素连接的纳米粒子测量FRET
对实施例3的荧光素连接的芯(CePO4)-壳(TbPO4)-粒子和比较例1的均匀LaPO4：Ce，Tb进行各种光谱分析以确定FRET效率。
用Jobin Yvon制造的FL3-22分光计进行测量，在宽度和深度为1cm的光学室中使用样本的水性分散体。选择浓度使光学密度不超过0.3。
图3表明在280nm脉冲激励后以TRF方式测量的两种类型的粒子的衰减曲线：
·虚线代表实施例1得到的未改性的芯(CePO4)-壳(TbPO4)-粒子在542nm(Tb发射)的衰减曲线；半值1.4ms。
·粗线代表实施例3得到的荧光素连接的芯(CePO4)-壳(TbPO4)-粒子在542nm的衰减曲线；半值0.02～0.1ms。
·细线代表实施例3得到的荧光素连接的芯(CePO4)-壳(TbPO4)-粒子在520nm(荧光素发射)的衰减曲线；半值0.02～0.06ms。
图4表明比较例1的荧光素连接的均匀LaPO4：Ce，Tb粒子的衰减曲线，在280nm脉冲激励后以TRF方式测量：
·粗线代表在542nm的衰减曲线(半值约1.7ms)。
·细线代表相同粒子在520nm的衰减曲线(半值约1.0～1.5ms)。
与比较例1的粒子相比(约1.7ms)，实施例3的荧光素连接的芯(CePO4)-壳(TbPO4)-粒子表现出更短荧光半值(在542nm处0.02～0.1ms)。这表明本发明粒子的芯/壳结构对受体分子(荧光素)有更有效的能量转移，从而增大FRET效率。未改性的芯(CePO4)-壳(TbPO4)-粒子的荧光半值(约1.4ms)比实施例3的荧光素连接的芯/壳粒子至少高14倍。
未改性的均匀LaPO4：Ce，Tb纳米粒子(未与荧光素连接)的荧光半值约2.4ms，即比比较例1中相应荧光素连接的粒子(在542nm处约1.7ms)高约1.5倍。如果将此比值(约1.5/1)与图3的比值(约14/1)相比，可以更清楚本发明对FRET效率的改进。
图5a表明在280nm脉冲激励后并在最后激励脉冲40μs后以TGF方式测量的荧光光谱：
·粗线代表实施例1得到的未改性的芯(CePO4)-壳(TbPO4)-粒子的光谱，及
·细线代表实施例3得到的荧光素连接的芯(CePO4)-壳(TbPO4)-粒子的光谱。
左侧强度标尺相应于粗线，右侧强度标尺相应于细线。改性的芯/壳粒子(实施例3)的发射光谱其特征在于，在545nm特征Tb3+带强度极低(降低至约1/40)，在520nm周围出现源于荧光素发射的新宽带。在激励能量(280nm)从Ce3+(芯)能量转移Tb3+(壳)发光中心后，后者通过FRET使荧光素发光。
图5b表明在280nm脉冲激励后并在对比较例1中荧光素连接的均匀LaPO4：Ce，Tb最后激励脉冲40μs后以TGF方式测量的荧光光谱：
此光谱也证实了FRET的出现，因为观察到源于荧光素的520nm周围的相对较宽发射谱带。然而，供体发射(以545nm的特征Tb3+带表示)仍比图4a(细线)强，这证实了较低FRET效率。
参考例2：生物分析
下面的参考例证实了使均匀纳米粒子与生物分子结合的特效方法，并在生物分析中使用相应标记的生物分子。尽管所用的纳米粒子不是本发明的，但是这些参考例都可完全转换成要保护的芯/壳粒子。在本文中，技术人员可以认识到，下面针对均匀纳米粒子所述的表面改性技术优选用于以相似方法合成的芯/壳粒子，尤其是相对于选择的溶剂而言，溶剂通常与得到的纳米粒子表面结合。
RE 2-1：LaPO4：Ce，Tb纳米粒子的羧基官能化
按比较例CE1-1中所述制备LaPO4：Ce，Tb粒子。
在搅拌下和惰性气体中，将50mg这些纳米粒子(约140nmol)和5ml乙二醇(约180mmol)、5μl硫酸(96-98％)于3小时加热至210℃。可选择地，可以使用其他二醇，优选各种链长度的聚乙二醇，最优选HO-(CH2-CH2-O)n-OH，其中n＝2-9。在约135℃时粒子开始溶解在乙二醇中。处理完成，使用约1.5mbar的真空，然后除去约一半量的乙二醇。从而得到透明残液。然后用水对残渣进行透析(透析管Spectra/Por，5-6.000MWCO，Spectrum，Netherlands)。
100mg(约300nmol)得到的纳米粒子在20mL水的溶液中加入0.5mL硫酸(96-98％)。向得到的混合物中滴加1mM KMnO4溶液，直到不再观察到紫罗兰色脱色。然后再加入相同量的KMnO4溶液，搅拌过夜(＞12h)。通过滴加新制的1mM亚硫酸钠溶液还原过量的高锰酸盐。用0.1M MES，0.5M NaCl，pH6.0对得到的混合物进行透析过夜(透析管Spectra/Por，5-6.000MWCO，Spectrum，Netherlands)。
RE 2-2：用溴代三甲基硅烷脱烷基化
按与比较例CE1-2相同方式处理按比较例CE1-1制备的300mg(约850nmol)LaPO4：Ce，Tb纳米粒子。
RE 2-3：用11-二(磷酰基甲基)氨基-十一酸和1，4-二(3-氨基丙氧基)丁烷连接LaPO4：Ce，Tb纳米粒子。
通过将201g 11-氨基-十一酸，170g磷酸，200mL浓盐酸和200mL水的混合物加热至100℃，然后于1小时内滴加324g甲醛(37％)，并在100℃下搅拌1小时，制备11-二(磷酰基甲基)氨基-十一酸。冷却至室温后，通过真空辅助过滤来分离沉淀的产物，并在真空下干燥。得到334g 11-二(磷酰基甲基)氨基十一酸。相似地，可以使用具有2-18个碳原子的相应酸。
将0.5g(1.85mol)11-二(磷酰基甲基)氨基-十一酸溶解在2mL乙二醇中，然后加入0.894g(4.375mmol)1，4-二(3-氨基丙氧基)丁烷。形成透明溶液后(放热反应)，在50℃下加入在RE 2-2中得到的35mg(100nmol)LaPO4：Ce，Tb纳米粒子，然后加热至125℃。在约120℃下，粒子完全溶解。4小时后，得到略呈褐色的溶液，在冷却至室温后仍保持透明。用2×2L 10mM Na-碳酸盐缓冲液(pH 8.5)对反应混合物进行透析(透析管Spectra/Por，5-6.000MWCO，Spektrum，Netherlands)。透析液中含有沉淀的纳米粒子。
RE 2-4：RE 2-3的LaPO4：Ce，Tb纳米粒子的生物素化
通过旋转蒸发仪减小RE 2-3中得到的6.2mL(＝5mg或～15nmol)纳米粒子混合物的体积，并浓缩至4.81mg/mL。保持旋转，将得到的分散体用20倍摩尔量过量的生物素-X-NHS(硫代-生物素-氨基己酸-N-羟基-琥珀酰亚胺酯，Calbiochem，Schwalbach，Germany)孵育4小时，然后用PBS缓冲液透析(8mM K2HPO4；150mM NaCl；2mMNa2HPO4；pH7.4)(透析管Spectra/Por，5-6000MWCO，Spectrum，Netherlands)。得到的透析液略微混浊。
RE 2-5：将DNA寡核苷酸与RE 2-3的LaPO4：Ce，Tb纳米粒子连接。
用40-倍过量的硫代-SIAB(硫代琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酯，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，Deutschland)活化在RE 2-3中得到的纳米粒子；通过Centricon过滤单元(MW-exclusion at50000，Millipore，Eschborn，Germany)在TSMZ-缓冲液pH7.3(0.1MNaCl；0.1M三乙醇胺-HCl；0.02M NaOH；0.27mM ZnCl2；0.1％Tween20；1mM MgCl2)中重新缓冲7.5mg(～25nmol)氨基-功能化的纳米粒子，并调节至浓度约7mg/mL。50μl 20mM硫代-SIAB的水溶液加到粒子分散体中，然后在25℃孵育15分钟。加入12μl 1M甘氨酸(12-倍过量)终止反应，用葡聚糖凝胶G25PD 10柱(Amersham PharmaciaBiotech，Freiburg，Germany)分离游离的硫代-SIAB。用Interactiva(Ulm，Germany)对DNA寡核苷酸排序，其包括序列5′-CCACGCTTGTGGGTCAACCCCCGTGG-3′和用探针在5′-端的硫醇改性物和在3′-端dabcyl-改性物(4-(4-二甲基氨基苯基重氮)苯甲酰基)，及区别仅在于在3′-端缺少dabcyl分子的对照DNA寡核苷酸。混合等摩尔量的DNA寡核苷酸和SIAB活化的纳米粒子，在25℃下孵育3小时，在4℃下孵育过夜。与DNA寡核苷酸连接的纳米粒子通过FPLC(快速液相色谱)与非连接的粒子和游离DNA寡核苷酸分离。连接的粒子保存在4℃的50mM Tris-HCl，pH7.4；0.1％BSA中。只要不存在目标DNA，得到的分子就折叠成发夹结构，从而分子的两端相互接近，发生FRET。在这种情况下，纳米粒子荧光被dabcyl猝灭。
RE 2-6：将抗-β-hCG单克隆抗体与RE 2-3的LaPO4：Ce，Tb纳米粒子连接
首先，用30-倍过摩量的2-Iminothiolan(2-IT，Traut试剂，PerbioScience Deutschland GmbH，Bonn)活化RE 2-3中得到的LaPO4：Ce，Tb纳米粒子；2mL(～25nmol，4mg/mL)这些粒子转移进TSE-缓冲液pH8.5(0.04M NaCl；0.05M三乙醇胺-HCl；0.04M NaOH；0.5mMEDTA；0.1％Tween 20；pH8.5)中。为此，它们以3000g离心三次，每次15min，倾倒出上清液，每次残液放进700μl TSE-缓冲液pH8.5中。这些粒子用75μl 10mM 2-IT(TSE-缓冲液pH8.5)在25℃下孵育1小时，反应用9μl(12-倍过量的)1M甘氨酸终止。为分离过量的2-IT，得到的混合物以3000g再离心三次，每次15min，然后倾析出上清液，在1mL TSE-缓冲液pH7.3(0.1M NaCl；0.1M三乙醇胺-HCl；0.02M NaOH；1mM EDTA；0.1％Tween 20；pH7.3)中再悬浮沉淀2次，在250μl TSE-缓冲液pH7.3中第三次离心。同时，等摩尔量单克隆小鼠抗体对β-hCG(克隆F199Cl，Perkin-Elmer Life Sciences-Wallac Oy，Finnland)具有特效，并用40-倍过量的SMCC(N-琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基-甲基)-环己烷-1-羧酸酯-Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn)活化，通过Centricon过滤单元(MW为50000)在TSMZ-缓冲液pH7.3(0.1M NaCl；0.1M三乙醇胺-HCl；0.02MNaOH；0.27mM ZnCl2；0.1％Tween 20；1mM MgCl2)中再缓冲750μl抗-β-hCG抗体(＝25nmol，浓度of 5mg/mL)，并调节至浓度约7mg/mL。50μl 20mM SMCC-溶液在DMF(＝1mmol)中的溶液加到抗体溶液中，然后在25℃孵育30分钟。加入12μl 1M甘氨酸(12-倍过量)终止反应，用葡聚糖凝胶G25PD 10备用柱(Amersham PharmaciaBiotech，Freiburg，Germany)分离游离的SMCC。最后，混合等摩尔量的2-IT-活化的纳米粒子分散体和SMCC-活化的抗体溶液，在25℃下孵育3小时，然后在4℃下孵育过夜。抗体连接的纳米粒子在Superdex 200(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)上通过凝胶渗透色谱与非连接的粒子和游离抗体分离。0.1M MES，0.5MNaCl，pH6.0用作缓冲洗脱液。连接的纳米粒子的保留时间为约2小时。
RE 2-7：用hIL-2连接LaPO4：Eu3+纳米粒子
按文献(J.Phys.Chem.B 2000，104，2824-2828)所述，在TEHP中制备LaPO4：Eu3+纳米粒子，与文献不同处仅在于，使用1.76gLaCl3·7H2O代替文献中所述的硝酸盐。将300mg(～1μmol)这些纳米粒子与2.23g(15mmol)溴代三甲基硅烷在125ml氯仿中一起加热回流4小时。蒸馏掉大部分过量的溴代三甲基硅烷和形成的中间产物，然后在略微氨性条件下水解残液。为此，用其中加有100μl氨水的(25％)的6mL水处理残液，并搅拌过夜。得到的粒子形成乳状分散体，几小时后部分沉淀。将5mg(＝25mmol，106μl)溴代三甲基硅烷处理的纳米粒子在37℃下孵育1小时，并与10mM碳酸钠-缓冲液(pH8.5)中的重组人IL-2蛋白(R&D Systems，Mineapolis，MN，USA)以摩尔比2：1一起摇动。随后以3000g离心得到的混合物6次，每次10min，来分离过量的蛋白，然后在1mL 10mM碳酸钠缓冲液(pH8.5)中再悬浮。LaPO4：Eu3+/IL-2共轭物储存在4℃下。
RE 2-8：用RE 2-6的抗体连接的纳米粒子作为供体和荧光连接的抗体作为受体来检测β-hCG的均匀能量转移分析
将抗-β-hCG抗体与荧光素连接：
按照制造者说明，用Molecular Probes制备的FluororeporterFITC蛋白标记试剂盒用于连接荧光素与抗-(β-hCG抗体(M15294，Perkin-Elmer Life Sciences，Wallac Oy，Finnland)。用Centricon过滤单元(MW为50000)在0.2M碳酸氢盐缓冲液(pH9.0)中再缓冲0.5mg抗体。然后用25-倍过量的5mM荧光素异硫代氰酸酯(FITC)溶液(溶解在同体积的DMF和0.2M碳酸氢盐缓冲液pH9.0的混合物中)孵育抗体溶液，并在室温下孵育3小时。用备用的葡聚糖凝胶G25PD 10柱(AmershamPharmacia Biotech，Freiburg，Germany)分离过量FITC，用光谱测定抗体浓度和荧光素/抗体比例。0.01％叠氮化钠和0.1％BSA加到储存在4℃下的共轭物中。
进行分析：
在UV可透过的96-孔微升板中(UVStar，Greiner)，在25℃下孵育源于从商业上可得到的用于测量血清中游离β-hCG的试剂盒(A007-101，Perkin-Elmer Life Sciences，Wallac Oy，Finnland)的50μl β-hCG标准液、在RE 2-6中得到的100nmol纳米粒子-抗体共轭物、200μLtris-HCl缓冲液(pH7.4)中的100nmol荧光素连接的抗-β-hCG抗体达60min。这两种抗-β-hCG抗体直接靠着β-hCG亚单元的不同抗原决定部位。然后用荧光分光计(Jobin Yvon，Fluorolog 3制备)在下列条件下测量样本：波长为280nm的脉冲激励，发射：542nm，缝宽：5nm，积分时间0.1ms。将不同β-hCG浓度的结果绘制进校准曲线。通过以校准曲线为基础测定浓度，可以以与血清样本相似的方式测定身体样本的β-hCG含量。
RE 2-9：用RE 2-7的hIL-2连接的纳米粒子(LaPO4：Eu3+)和AlexaFluor 680连接的抗-hIL-2Rα-链抗体来检测hIL-2的均匀竞争能量转移分析
用Alexa Fluor 680连接的单克隆抗-hIL-2Rα-链抗体：
用PBS渗析可特效识别人白细胞介素-2受体α-链(hIL-2α-链)(ATCC，Rockville，USA)的1mg单克隆抗体7G7B6，调节浓度为2mg/mL，根据制造者指示，用Alexa Fluor 680蛋白标记试剂盒(Molecular探针Europe BV，Netherlands)进行标记。使用0.1M碳酸氢钠缓冲液pH8.3作为反应缓冲液，在室温下孵育1小时。使用含有0.2mM的Na-叠氮化物的PBS-缓冲液作为洗脱缓冲液，用含在试剂盒中的柱纯化连接的抗体。在1cm光学室中，测量280和679nm的吸收(A)，以测定连接的抗体的蛋白浓度，然后用下式计算：
M＝(A280-(A679×0.05))×稀释因子/2030000
其中203000cm-1M-1代表IgG的摩尔消光系数，0.05是染料在280nm吸收时的校正因子。连接的抗体的浓度是1.27，并可以用PBS，0.2mM Na-叠氮化物调节到1mg/mL(～6.5μM)。连接的抗体储存在4℃下。标记效率计算如下。
每摩尔抗体的摩尔染料数＝(A679×稀释因子)/184000×蛋白浓度M
其中184000cm-1M-1代表Alexa Fluor 680染料在679nm的摩尔消光系数。抗体/染料共轭物的比例是3.2。
进行分析：
用50mM TSA-缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.75；0.9％NaCl；0.05％NaN3)得到各组分需要的稀释液。首先，40孔UV-可透过的微升板(UVStar，Greiner)用BSA-溶液(0.5％)在室温下孵育1小时，以饱和非特效结合，然后加入实施例RE 2-7的LaPO4：Eu3+/IL-2共轭物、Alexa Fluor 680-标记的抗-hIL-2α-链抗体和重组hIL-2sRα蛋白(人IL-2可溶解的受体α，R&D Systems，Mineapolis，MN，USA)的混合物，每种最终浓度为40nM。20个这些孔中充入不同浓度的非标记的hIL-2蛋白，剩余20个孔中充入与分析不相关的蛋白。每个浓度提高到50nM，以测试0-950nM的连续浓度。在每种情况下，反应的终体积为200μL。在黑暗、室温的摇动器中孵育45min。用Wallac 1420VictorTM多标记计数器(Perkin-Elmer Life Sciences，Wallac Oy，Finnland)在下列条件下记录信号：激励：340nm，发射：665nm，时间延迟：50μs，时间窗：200μs，循环时间：1000μs。每个值测定两次，并基于用非相关蛋白得到的非特效结合的结果进行校正。以测量值相对于蛋白浓度制图，得到校准曲线，通过校准曲线可以测定人白细胞介素-2的浓度。对于人身体样本可以使用相似方法。
RE 2-10：用RE 2-5的DNA寡核苷酸连接的LaPO4：Ce，Tb纳米粒子通过分子内能量转移进行细菌DNA的定量PCR检测
特别选择用于Mycobacterium tuberculosis的RNA聚合酶基因的定量DNA检测的引物和探针，并由Interactiva(Ulm，Germany)制备。引物包括下述序列：前端5′-GGCCGGTGGTCGCCGCG-3′后端5′-ACGTGACAGACCGCCGGGC-3′。
细菌DNA的定量测定分析
对于50μL PCR反应，混合作为探针的RE 2-5的50nM纳米粒子(dabcyl-寡核苷酸连接的)、500nm每种引物，2U Amplitaq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer)、250μM dATP、250μM dCTP、250μM dGTP、500μM dUTP、4mM MgCl2、50mM KCl和10mM Tris-HCl pH8.0。用相同引物将基因组M.tuberculosis DNA放大成为DNA模板，并利用Invitrogen Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(InvitrogenBV/NOVEX，the Netherlands)在质粒中克隆。为得到标准曲线，使用5个不同浓度的1pg～100ng的DNA质粒，反应未使用DNA模板。对于每种浓度进行30次反应，在第15次循环开始后，在每次附加循环后用光谱分析测量样本。反应体积是50μL，用Thermocycler(PCR-System 2400，Perkin-Elmer)在下列反应条件下进行放大：在95℃下10min；在95℃下30s的15～45循环，在56℃下45s，在72℃下30s。用荧光分光计(Jobin Yvon，Fluorolog 3制备)在下列条件下测样本：波长为280nm的脉冲激励，发射：542nm，缝宽：4nm，时间延迟：50μs，重复速率约25Hz。以相同方式可以检测铽发射线的半值。为此使用下列条件：激励：280nm，发射：542nm，缝宽：5nm，积分时间：0.1ms。在探针和目标DNA的杂交过程中，在连接的纳米粒子和dabcyl间未发生分子内FRET。随着目标DNA浓度增大，因此相对于没有模板的对照样本而言，纳米粒子的Tb-荧光增强。同时，与没有模板DNA的对照样本相比，纳米粒子荧光寿命时间的半值更长。两种参数间的差别都可以相对于循环次数制图，从而对于每个DNA模板浓度得到校准曲线。

Claims (26)

1.发光无机纳米粒子，包括
(a)由第一金属盐或氧化物制成的芯，其被
(b)由第二金属盐或氧化物制成的壳所包围，该壳可发光并具有非半导体性能。
2.如权利要求1所述的发光纳米粒子，其中芯和壳的盐包括相同阴离子，所述阴离子优选选自磷酸盐、硫酸盐或氟化物。
3.如权利要求1或2所述的发光纳米粒子，按最长轴计其平均直径小于30nm。
4.如权利要求1～3中任一项所述的发光纳米粒子，其中壳的平均厚度不超过芯的平均直径。
5.如权利要求1～4中任一项所述的发光纳米粒子，其中(a)芯是非发光的，及(b)壳包括掺杂发光金属原子，该原子优选选自镧系元素Ce(58)，Pr(59)，Nd(60)，Sm(62)，Eu(63)，Gd(64)，Tb(65)，Dy(66)，Ho(67)，Er(68)，Tm(69)，Yb(70)或其组合，或选自Cr和Mn。
6.如权利要求5所述的发光纳米粒子，其中壳包括作为主要金属成分的金属，尤其是作为唯一的金属成分。
7.如权利要求5所述的发光纳米粒子，其中壳包括作为非发光主体材料掺杂剂的金属。
8.如权利要求6所述的发光纳米粒子，其中芯由LaPO4组成，壳由TbPO4组成。
9.如权利要求1～4中任一项所述的发光纳米粒子，其中(a)芯包括第一金属盐或氧化物，在激励后能够将激励能量转移至(b)可发出相同光的第二发光金属盐或氧化物。
10.如权利要求9所述的发光纳米粒子，其中芯金属和壳金属选自Ce(58)，Pr(59)，Nd(60)，Sm(62)，Eu(63)，Gd(64)，Tb(65)，Dy(66)，Ho(67)，Er(68)，Tm(69)，或Yb(70)。
11.如权利要求9或10所述的发光纳米粒子，其中芯金属选自Ce，壳金属选自Nd、Dy或Tb。
12.如权利要求9或10所述的发光纳米粒子，其中芯金属是Yb，壳金属是Er。
13.如权利要求9～12中任一项所述的发光纳米粒子，其中芯和/或壳包括作为主要金属成分的金属，尤其是作为唯一的金属成分。
14.如权利要求9～12中任一项所述的发光纳米粒子，其中芯和/或壳包括作为主体材料掺杂剂的金属。
15.如权利要求9～11中任一项所述的发光纳米粒子，其中芯由LaPO4:Ce或CePO4组成，壳由TbPO4组成。
16.制备前述任一项权利要求中所述的纳米粒子的方法，包括如下步骤
在有机介质中制备第一混合物，其包括第一金属盐或氧化物的纳米粒子，
在50～350℃的温度下，使所述第一混合物、待形成壳用的阴离子源、包括形成壳的金属离子的第二混合物和所述金属离子用的有机络合剂反应，直到在所述第一金属盐或氧化物的纳米粒子芯周围形成壳。
17.如权利要求16所述的方法，其中第一混合物中的有机介质和第二混合物中的有机络合剂相同。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中有机介质和络合剂选自其中烷基具有4～20个碳原子的单或二烷基胺、磷有机化合物、多元醇或亚砜。
19.如权利要求16～18中任一项所述的方法，包括如下步骤：在所述有机介质中合成纳米粒子芯，然后未经预分离使这些芯反应的步骤。
20.如权利要求16～19中任一项所述的方法，其中按与形成壳的金属原子反应所需的化学计量量计，使用的阴离子源尤其是磷酸盐、硫酸盐或氟化物源摩尔量过量。
21.含有权利要求1～15的纳米粒子的流体或固体介质。
22.如权利要求21所述的流体介质，选自有机或水性分散介质、涂料组合物、油墨或染料、聚合物组合物或气溶胶。
23.如权利要求21所述的固体介质，选自涂料、油墨或染料、聚合物组合物，尤其是聚合物膜。
24.如权利要求1～15中任一项所述的纳米粒子在(F)RET基生物分析中的用途。
25.如权利要求24所述的用途，用于检测核酸的(F)RET基生物分析。
26.如权利要求1～15中任一项所述的纳米粒子或权利要求21～23中任一项所述的介质在产生光、印刷或标记物品和材料中的用途。
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