DE102005026485A1

DE102005026485A1 - Hydrophile Nanoteilchen mit funktionellen Oberflächengruppen, deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE102005026485A1
Application number: DE102005026485A
Authority: DE
Inventors: Werner Dr. Hoheisel; Karlheinz Dr. Hildenbrand
Original assignee: Bayer Technology Services GmbH
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2005-06-09
Filing date: 2005-06-09
Publication date: 2006-12-14
Also published as: JP2008545980A; US8658213B2; US20100086488A1; CA2611171A1; CN101238196A; WO2006131226A1; AU2006257017B2; CA2611171C; AU2006257017A1; EP1893720A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberflächenbeschichtung sowie Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung in biologischen, molekularbiologischen, biochemischen und medizinischen Anwendungen.

Description

Der Einsatz von Nanoteilchen in der in vivo oder in vitro Diagnostik, in der Therapie, in der Embryologie und allgemein in vielen molekularbiologischen oder biochemischen Anwendungen sowie auch in der Wirkstofffindung gewinnt seit einigen Jahren eine immer größere Bedeutung. Hierzu sind in den meisten Anwendungen Nanoteilchen notwendig, die eine hydrophile Oberfläche besitzen, um sie in biologischen Umgebungen, d.h. in wässrigem Milieu zu dispergieren. Idealerweise sollten die Nanoteilchen monopartikulär bzw. monodispers, d.h. nicht agglomeriert vorliegen, um einerseits ungewollte Sedimentation zu verhindern und/oder um andererseits die Dynamik oder Kinetik von biochemischen oder biomolekularen Vorgängen oder Bewegungsabläufen so wenig wie möglich zu beeinflussen. Weiterhin sollten die Nanoteilchen Idealerweise funktionelle, reaktive chemische Gruppen aufweisen, die eine Ankopplung von funktionellen Molekülen erlauben. Funktionelle Moleküle können z.B. biologische Makromoleküle wie z.B. Oligonukleotide (z.B. DNA oder RNA) oder Polyeptide (z.B. Proteine oder Antikörper), biologische Kopplungsmoleküle wie z.B. Biotin oder Streptavidin, oder andere organische Moleküle sein.

Die Herstellung von fluoreszierenden, anorganischen Nanoteilchen erfolgt häufig in organischen Lösemitteln, wobei hydrophobe Endprodukte erhalten werden. Die am häufigsten verwendeten fluoreszierenden, anorganischen Nanoteilchen sind Halbleiter-Nanoteilchen bestehend aus II-VI- oder III-V-Halbleitern, die meist eine Kern-Hüllenstruktur aufweisen. U.S. 6,322,901, U.S. 6,576,291 und U.S. 6,423,551 beschreiben diese Teilchen, deren anorganischer Kern dabei eine Größe von unter 10 nm besitzt, und die auch unter der Bezeichnung „Quantum Dots" bekannt sind. Herstellungsbedingt besitzen sie häufig eine organische Hülle bestehend aus Trioctylphosphin.

Eine weitere Klasse von fluoreszierenden, anorganischen Nanoteilchen sind phosphoreszierende Nanoteilchen, die aus nichtleitendenden Materialien bestehen, und mit Ionen der Seltenen Erden und/oder der Nebengruppenelemente dotiert sind.

Diese werden auch als Nanophosphore bezeichnet, wobei in WO 04/04605 A1, WO 02/020695 A1, K. Koempe; H. Borchert; J. Storz; A. Arun; S. Adam; T. Moeller; M. Haase; Angewandte Chemie, International Edition (2003), 42(44), 5513-5516) so genannte down-converting Nanophosphore beschrieben sind, bei denen die Emissionswellenlänge größer als die der Anregung ist, und in S. Heer; O. Lehmann; M. Haase; H. Guedel; Angewandte Chemie, International Edition (2003), 42(27), 3179-3182 so genannte up-converting Phosphore, bei denen die Emissionswellenlänge kleiner als die der Anregung ist.

WO 01/86299 A1, WO 03/040024 A1 beschreiben den Einsatz solcher Nanophosphore auch als Biolabel.

WO 02/020695 A1 beschreibt Nanophosphore aus CePO₄:Tb und ihre Herstellung in beispielsweise Tris-Ethylhexylphosphat (TEHP), wobei Teilchen erhalten werden, die an der Oberfläche anhaftendes TEHP enthalten. Anstelle des TEHP können auch Tributylphosphat oder andere hydrophobe Derivate der Phosphate verwendet werden. Während derartig hergestellte Nanoteilchen in Wasser nicht dispergierbar sind, können sie in organischen Lösemitteln dispergiert, d. h. in monopartikuläre Suspensionen überführt werden.

Für die angestrebte Anwendung in biologischen Systemen ist jedoch eine hydrophile Oberfläche der Nanophosphore unabdingbare Voraussetzung. Die Hydrophilisierung von Nanoteilchen mit einer hydrophoben Oberfläche ist vom Prinzip her, wie in WO 02/055186 (Quantum Dot Corp.) beschrieben, bekannt. Dort erfolgt die Hydrophilisierung der hydrophoben Nanoteilchen mit Hilfe von amphiphilen Dispergatoren, die beispielsweise durch partielle Umsetzung von Polyacrylsäure mit Octylamin hergestellt werden.

In wässriger Phase kommt es zur Wechselwirkung der hydrophoben Octylamid Seitenketten mit der hydrophoben Oberfläche der Nanoteilchen, während die freien Acrylsäuregruppen des amphiphilen Dispergators zur wässrigen Phase hin orientiert sind. So ausgerichtet können an die Acrylsäurereste über kovalente Bindungen weitere Moleküle, beispielsweise Proteine oder andere biologische Makromoleküle, angebunden werden. Der amphiphile Dispergator dient hierbei als Bindeglied.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist die relativ aufwändige Herstellung der als amphiphile Dispergatoren genutzten hydrophobierten Polyacrylsäurederivate in reproduzierbarer Qualität sowie der relativ große Raumbedarf, der durch die hydrophobe Wechselwirkung der hydrophoben Oberfläche der Nanoteilchen mit den Octylamid-Gruppen des amphiphilen polymeren Dispergators zustande kommt. Derartig modifizierte Nanoteilchen haben, im Vergleich zu den nicht modifizierten Primärteilchen, auch im Falle einer monopartikulären Dispersion, eine stark erhöhte mittlere Teilchengröße. Diese Volumenerhöhung ist nachteilig für verschiedene biologische Applikationen, bei denen z.B. die markierten Moleküle Biomembranen (z.B. Zellwand) durchdringen oder durch Kanalproteine diffundieren sollen. Sie ist besonders nachteilig für den Einsatz in homo genen Assays, bei denen ein (Fluoreszenz) resonanter Energietransfer, (F)RET, zu einem räumlich in der Nähe liegenden (F)RET-Partner für die optische Auswertung eine Rolle spielt.

Es stellt sich damit, ausgehend vom benannten Stand der Technik, die Aufgabe, anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche bereitzustellen, ohne dass sich der mittlere Teilchendurchmesser stark vergrößert, die vorzugsweise reaktive, funktionelle chemische Gruppen aufweisen, und damit eine Ankopplung von funktionellen Molekülen erlauben und die für biologische, molekularbiologische, biochemische und medizinische so z.B. für diagnostische und therapeutische Anwendungen, insbesondere in homogenen biologischen Assays basierend auf resonanten Energietransfer-Prozessen, einsetzbar sind, und dabei kostengünstig und einfach herzustellen sind.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen gelöst. Die erfindungsgemäßen Nanoteilchen sind anorganische, lumineszierende oder magnetische oder elektromagnetische Strahlung streuende oder absorbierende, insbesondere durch die Anregung einer Plasmonenresonanz verstärkt streuende oder absorbierende Nanoteilchen mit einer mittlere Teilchengröße von 1 nm bis 500 nm, bevorzugt 1 nm bis 100 nm, besonders bevorzugt 1 nm bis 40 nm, ganz besonders bevorzugt 1 bis unter 20 nm. Die erfindungsgemäßen Nanoteilchen sind mit einer hydrophilen, mindestens ein Polymer enthaltenden Oberflächenbeschichtung ausgestattet und dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächenbeschichtung eine geringe Dicke von 0,5 nm bis 7 nm, bevorzugt 0,5 bis 4 nm, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 nm aufweist.

Ein entscheidender Unterschied dieser polymeren Dispergatoren im Vergleich zu denen, die in WO 02/055186 A1 beschrieben werden, ist, dass sie keine hydrophoben Seitenketten besitzen, die über hydrophobe Wechselwirkungen die Nanophosphore umhüllen. Dadurch ist der mittlere Teilchendurchmesser der mit den erfindungsgemäßen Polymeren modifizierten erfindungsgemäßen Nanoteilchen im Vergleich zu denen über das in WO 02/055186 genannte „hydrophoben Umhüllungsverfahren" zugänglichen deutlich geringer, was für viele Anwendungen von Vorteil ist. Solche Anwendungen umfassen z.B. solche, bei denen die Nanoteilchen als Partner für (Fluoreszenz) resonanten Energietransfer agieren, und/oder solche, bei denen die Nanoteilchen Transportprozessen unterworfen sind. Die erfindungsgemäßen Nanoteilchen haben neben ihrer dünnen Hülle den zusätzlichen Vorteil, eine hohe Stabilität gegen Temperatur-, Salz- und pH-Einflüsse aufzuweisen.

Im Sinne der Erfindung geeignete Materialien für die Nanoteilchen sind solche, die anorganische Kerne enthalten, deren Kristallgitter (Wirtsmaterial) mit Fremdionen dotiert sind. Hierunter zählen insbesondere alle Materialien und Materialklassen, die als sogenannte Phosphore z.B. in Leuchtschirmen (z.B. für Elektronenstrahlröhren) oder als Beschichtungsmaterial in Fluoreszenzlampen (für Gasentladungslampen) Verwendung finden, wie sie zum Beispiel in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, WILEY-VCH, 7^th edition, 2004 Electronic Release, Kapitel „Luminescent Materials: 1. Inorganic Phosphors" genannt sind. Neben den ab-convertierenden Phosphoren, die energieärmeres Licht emittieren als sie absorbieren, können auch auf-convertierende Phosphore, die energiereicheres Licht emittieren als sie absorbieren, Verwendung finden. In allen diesen Materialien dienen die Fremdionen als Aktivatoren für die Emission von Fluoreszenzlicht nach Anregung durch UV-, sichtbares oder IR-Licht, Röntgen- oder Gammastrahlen oder Elektronenstrahlen. Bei einigen Materialien werden auch mehrere Sorten von Fremdionen in das Wirsgitter eingebaut, um einerseits Aktivatoren für die Emission zu erzeugen und um andererseits die Anregung des Teilchensystems effizienter zu gestalten oder um die Absorptionswellenlänge durch Verschiebung an die Wellenlänge einer gegebenen Anregungslichtquelle anzupassen (sogenannte Sensitizer). Der Einbau mehrerer Sorten von Fremdionen kann auch dazu dienen, gezielt eine bestimmte Kombination von Fluoreszenzbanden, die von einem Nanoteilchen emittiert werden sollen, einzustellen.
Im Sinne der Erfindung geeignete Materialien für die Nanoteilchen sind auch solche, die einen geschichteten Aufbau (Kern-Hüllen-Struktur mit einer oder mehreren Hüllen) von geeigneten Materialien aufweisen. Dabei sind in mindestens einem Teil, Kern oder mindestens einer Hülle Fremdionen in das Wirtsgitter eingebaut. Das Wirtsmaterial der den erfindungsgemäßen Nanoteilchen zugrunde liegenden lad-Nanoteilchen besteht vorzugsweise aus Verbindungen des Typs XY. Dabei ist X ein Kation aus Elementen der Hauptgruppen 1a, 2a, 3a, 4a der Nebengruppen 2b, 3b, 4b, 5b, 6b, 7b oder der Lanthaniden des Periodensystems. In einigen Fällen kann X auch eine Kombination bzw. Mischung aus den genannten Elementen sein. Y kann ein mehratomiges Anion, enthaltend ein oder mehrere Elemente) der Hauptgruppen 3a, 4a, 5a, der Nebengruppen 3b, 4b, 5b, 6b, 7b und/oder 8b sowie Elemente der Hauptgruppen 6a und/oder 7a, sein. Y kann aber auch ein einatomiges Anion aus der Hauptgruppe 5a, 6a oder 7a des Periodensystems sein. Das Wirtsmaterial der den erfindungsgemäßen Nanoteilchen zugrunde liegenden lad-Nanoteilchen kann auch aus einem Element der Hauptgruppe 4a des Periodensystems bestehen. Als Dotierung können Elemente der Hauptgruppen 1a, 2a oder aus der Gruppe enthaltend Al, Cr, Tl, Mn, Ag, Cu, As, Nb, Nd, Ni, Ti, In, 5b, Ga, Si, Pb, Bi, Zn, Co und/oder Elemente der Lanthaniden dienen. Auch Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Elemente können in unterschiedlichen relativen Konzentrationen zueinander als Dotierungsmaterial dienen. Die Konzentration des Dotierungsmaterials im Wirtsgitter beträgt zwischen 10^–5 mol-% und 50 mol-%, bevorzugt zwischen 0,01 mol-% und 30 mol-%, besonders bevorzugt zwischen 0,1 mol-% und 20 mol-%. Das Dotierungsmaterial wird so gewählt, dass die Zerfallszeit der durch es induzierten Fluoreszenz lang ist (> 100 ns).
Bevorzugt werden Sulfide, Selenide, Sulfoselenide, Oxysulfide, Borate, Aluminate, Gallate, Silikate, Germanate, Phosphate, Halophosphate, Oxide, Arsenate, Vanadate, Niobate, Tantalate, Sulfate, Wolframate, Molybdate, Alkalihalogenide, Fluoride sowie andere Halogenide oder Nitride als Wirtsmaterialien für die Nanoteilchen verwendet. Auch Mischgitter aus einer Kombination der erwähnten Materialklassen werden bevorzugt verwendet. Beispiele für diese Materialklassen sind zusammen mit den entsprechenden Dotierungen in der folgenden Liste angegeben (Materialien des Typs B:A mit B = Wirtsmaterial und A = Dotierungsmaterial):
LiI:Eu; NaI:Tl; CsI:Tl; CsI:Na; LiF:Mg; LiF:Mg,Ti; LiF:Mg,Na; KMgF₃:Mn; Al₂O₃:Eu; BaFCl:Eu; BaFCl:Sm; BaFBr:Eu; BaFCl_0,5Br_0,5:Sm; BaY₂F₈:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); BaSi₂O₅:Pb; BaMg₂Al₁₆O₂₇:Eu; BaMgAl₁₄O₂₃:Eu; BaMgAl₁₀O₁₇:Eu; BaMgAl₂O₃:Eu; Ba₂P₂O₇:Ti; (Ba,Zn,Mg)₃Si₂O₇:Pb; Ce(Mg,Ba)Al₁₁O₁₉; Ce_0,65Tb_0,35MgAl₁₁O₁₉:Ce,Tb; MgAl₁₁O₁₉:Ce,Tb; MgF₂:Mn; MgS:Eu; MgS:Ce; MgS:Sm; MgS:(Sm,Ce); (Mg,Ca)S:Eu; MgSiO₃:Mn; 3,5MgO·0,5MgF₂·GeO₂:Mn; MgWO₄:Sm; MgWO₄:Pb; 6MgO·As₂O₅:Mn; (Zn,Mg)F₂:Mn; (Zn₄Be)SO₄:Mn; Zn₂SiO₄:Mn; Zn₂SiO₄:Mn,As; ZnO:Zn; ZnO:Zn,Si,Ga; Zn₃(PO₄)₂:Mn; ZnS:A (A = Ag, Al, Cu); (Zn,Cd)S:A (A = Cu, Al, Ag, Ni); CdBO₄:Mn; CaF₂:Mn; CaF₂:Dy; CaS:A (A = Lanthanide, Bi); (Ca,Sr)S:Bi; CaWO₄:Pb; CaWO₄:Sm; CaSO₄:A (A = Mn, Lanthanide); 3Ca₃(PO₄)₂·Ca(F,Cl)₂:Sb,Mn; CaSiO₃:Mn,Pb; Ca₂Al₂Si₂O₇:Ce; (Ca,Mg)SiO₃:Ce; (Ca,Mg)SiO₃:Ti; 2SrO·6(B₂O₃)·SrF₂:Eu; 3Sr₃(PO₄)₂·CaCl₂:Eu; A₃(PO₄)₂·ACl₂:Eu (A = Sr, Ca, Ba); (Sr,Mg)₂P₂O₇:Eu; (Sr,Mg)₃(PO₄)₂:Sn; SrS:Ce; SrS:Sm,Ce; SrS:Sm; SrS:Eu; SrS:Eu,Sm; SrS:Cu,Ag; Sr₂P₂O₇:Sn; Sr₂P₂O₇:Eu; Sr₄Al₁₄O₂₅:Eu; SrGa₂S₄:A (A = Lanthanide, Pb); SrGa₂S₄:Pb; Sr₃Gd₂Si₆O₁₈:Pb,Mn; YF₃:Yb,Er; YF₃:Ln (Ln = Lanthanide); YLiF₄:Ln (Ln = Lanthanide); Y₃Al₅O₁₂:Ln (Ln = Lanthanide); YAl₃(BO₄)₃:Nd,Yb; (Y,Ga)BO₃:Eu; (Y,Gd)BO₃:Eu; Y₂Al₃Ga₂O₁₂:Tb; Y₂SiO₅:Ln (Ln = Lanthanide); Y₂O₃:Ln (Ln = Lanthanide); Y₂O₂S:Ln (Ln = Lanthanide); YVO₄:A (A = Lanthanide, In); YVO₄:A, Bi (A = Lanthanide, In); Y(P_xV_1-x)O₄:Eu (0 <= x <= 1); Y(P_xV_1-x)O₄:Eu, Bi (0 <= x <= 1);YTaO₄:Nb; YAlO₃:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); YOCl:Yb,Er; Ln1PO₄:Ln2 (Ln1, Ln2 = Lanthanide oder Mischungen von Lanthaniden); A_x(PO₄)_y:Ln (A = Erdalkali, Ln = Lanthanide) LuVLO₄:Eu; GdVO₄:Eu; Gd₂O₂S:Tb; GdMgB₅O₁₀:Ce,Tb; LaOBr:Tb; La₂O₂S:Tb; LaF₃:Nd,Ce; BaYb₂F₈:Eu; NaYF₄:Yb,Er; NaGdF₄:Yb,Er; NaLaF₄:Yb,Er; LaF₃:Yb,Er,Tm; BaYF₅:Yb,Er; Ga₂O₃:Dy; GaN:A (A = Pr, Eu, Er, Tm); Bi₄Ge₃O₁₂; LiNbO₃:Nd,Yb; LiNbO₃:Er; LiCaAlF₆:Ce; LiSrAlF₆:Ce; LiLuF₄:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); Li₂B₄O₇:Mn, SiO_x:Er,Al (0 ≤ x ≤ 2).
Besonders bevorzugt werden folgende Materialien verwendet: La_xCe_yTb_zPO₄ (x + y + z = 1); La_xEu_1-x PO₄, La_xSm_1-xPO₄, La_xDy_1-xPO₄, La_xNd_1-xPO₄ (0 <= x < 1); La_xCe_y,Ln_zPO₄, (Ln = Lanthaniden, x + y + z = 1); MVO₄:Ln (M = Y, Gd; Ln = Lanthaniden); MVO₄:Bi,Ln (M = Y, Gd; Ln = Lanthaniden); MPO₄:Ln (M = Y, Gd; Ln = Lanthaniden); Y_xGd_1-xV_yP_y-1O₄:Ln (0 <= x <= 1; 0 <= y <= 1; Ln = Lanthaniden); Y_xGd_1-xV_yP_y-1O₄:Bi,Ln (0 <= x <= 1; 0 <= y <= 1; Ln = Lanthaniden) MSO₄:Eu (M = Ca, Sr, Ba); MSO₄:Eu,Mn (M = Ca, Sr, Ba); ZnS:Tb, ZnS:TbF₃, ZnS:Eu, ZnS:EuF₃, Y₂O₃:Eu, Y₂O₂S:Eu, Y₂SiO₅:Eu, SiO₂:Dy, SiO₂:Al, Y₂O₃:Tb, CdS:Mn, ZnS:Tb, ZnS:Ag, ZnS:Cu. Unter den besonders bevorzugten Materialien werden insbesondere diejenigen ausgewählt, die eine kubische Gitterstruktur des Wirtsgitters besitzen, da bei diesen Materialien die Zahl der einzelnen Fluoreszenzbanden minimal wird. Beispiele hierfür sind: MgF₂:Mn; ZnS:Mn, ZnS:Ag, ZnS:Cu, CaSiO₃:Ln, CaS:Ln, CaO:Ln, ZnS:Ln, Y₂O₃:Ln, oder MgF₂:Ln (Ln = Lanthaniden).
Im Sinne der Erfindung geeignete Materialien für die Nanoteilchen sind auch solche, die aus nicht dotierten, halbleitenden Materialien bestehen. Dazu gehören bevorzugt solche der 4. Hauptgruppe (z.B. Si) und binäre Verbindungen AB, bei denen A ein Element der 2. Nebengruppe und B ein Element der 6. Hauptgruppe des Periodensystems ist (z.B. ZnS, CdS oder CdSe). Dazu gehören bevorzugt auch solche binären Verbindungen AB, bei denen A ein Element der 3. Hauptgruppe und B ein Element der 5. Hauptgruppe des Periodensystems ist (z.B. InAs, InP, GaAs, GaP oder GaN).
Die Größe der für die erfindungsgemäße Nanoteilchen geeigneten anorganischen Nanokerne liegt im Bereich zwischen 1 nm und 500 nm, bevorzugt zwischen 1 nm und 100 nm und besonders bevorzugt zwischen 1 nm und 40 nm, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und unter 20 nm.
Die anorganischen Nanokerne können dabei bestimmte, für die jeweilige Anwendung benötigte Eigenschaften haben, z.B. lumineszierende, elektromagnetische Strahlung streuende oder absorbierende, wobei Streuung oder Absorption durch die Anregung einer Plasmonenresonanz verstärkt werden kann, magnetische (hervorgerufen durch Atomkerne oder Elektronenhüllen), mechanische Eigenschaften oder andere, je nach deren Einsatzzweck. Sie können auch als Partner in resonanten Energietransfer-Prozessen (FRET = Fluoreszenz resonanten Energietransfer oder Förstertransfer) eingesetzt werden, wie sie beispielsweise in „Principles of Fluorescence Spectroscopy"; J.R. Lakowicz, 2^nd edition, Kluwer Academic, New York 1999, Seiten 367-442 beschrieben werden.
Bei den hydrophilen Polymeren, die in der Umhüllung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen enthalten sind, handelt es sich vorzugsweise um hydrophile lineare oder verzweigte Homo- oder Copolymere, mit funktionellen Gruppen wie Amino-, Carboxyl-, bzw. deren Salze, Hydroxyl-, Thiol-, Säureanhydrid, Säurechlorid und/oder Isocyanatgruppen, die eine kovalente oder adsorptive, so z.B. elektrostatische oder ionische Bindung mit den funktionellen Gruppen der anzukoppelnden Biomoleküle ermöglichen.
Dabei können die funktionellen, eventuell auch adsorptiv wirkenden Gruppen der entsprechenden Polymere sich in der Wiederholungseinheit befinden, wie beispielsweise bei Polysäuren, Polysäureanhydriden, Polyalkoholen, Polythiolen oder Polyaminen oder Polyheterocyclen, so im Falle der Polyacrylsäure und/oder deren Salzen, Polymethacrylsäure und/oder deren Salzen, Poly(meth)acrylamide, Polymaleinsäure und/oder deren Salzen, Polyasparaginsäure und/oder deren Salzen, der Polymaleinsäureanhydride, der Polyethylenimine, der Polyhydroxyethylmethacrylate (PHEMA), der Polydimethylaminoethylmethacrylate und/oder dessen Salzen, der Polyvinylpyrrolidone, der Polyvinylalkohole, Polyvinalyacetals oder Polyvinylethers oder der Polyether.
Als aminische Polymere kommen beispielsweise Polyallylamin, Polyvinylamin, lineare oder verzweigte Polyethylenimine, Polylysin, Polymere enthaltend Chitosamine sowie Polydiallyldimethylammoniumchlorid und/oder Polyvinylpyridin bzw. deren Säureaddukte als Homo- oder Copolymerisate in Frage Alle benannten Polymere können für die Darstellung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen als Homo- oder auch als Copolymere untereinander sowie mit weiteren Monomeren eingesetzt werden. Ebenfalls denkbar sind Copolymerisate aus Acrylsäure mit Vinylpyrrolidon, Maleinsäureanhydrid mit Methylvinylether, Vinylpyrrolidon mit Dimethylaminoethylmethacrylat, Vinylimidazol mit Vinylpyrrolidon und Methacrylsäure mit Vinylpyrrolidon.
Weiterhin geeignete Polymere sind solche, deren funktionelle Gruppen in den Endgruppen lokalisiert sind, wie beispielsweise im Falle der Amino-/Carboxy-/Thio-/Isocyanat- oder anderweitig endgruppenfunktionalisierten Polyether, so z.B. bei aminofunktionelle Oligo- oder Polyethylenglykole (Jeffamine) oder OH terminierten Polyethylenoxiden.
Bevorzugt sind Polymere mit funktionellen Gruppen in der Wiederholungseinheit, besonders bevorzugt die Polysäuren, und dabei ganz besonders bevorzugt Polyacrylsäuren oder Polymethacrylsäuren und/oder deren Salze.
In einer weiteren Ausführungsform können auch reaktive Polymere, wie Polymaleinsäureanhydride oder Polysuccinimide, die im Laufe der weiteren Verarbeitung zu den oben erwähnten Polyelektrolyten, nämlich Polyacrylsäure bzw. Polyasparaginsäure abreagieren, eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen enthält deren Hülle Polymethacrylsäure, Polyasparaginsäure (PASP), Polymaleinsäure, Copolymerisate von Acrylsäure bspw. mit Maleinsäure, die unter den Produktnamen Sokalane^® von der Firma BASF angeboten werden und/oder Copolymerisate von Acrylsäure mit Maleinsäure und Vinylether, die von der Firma SKW Polymers unter dem Namen Melpers^® angeboten werden, und/oder deren Salze, bevorzugt deren Natriumsalze.
Besonders bevorzugt ist die Anwesenheit von Natriumpolyacrylaten in der Hülle der erfindungsgemäßen Nanoteilchen.
Das Molekulargewicht des „Umhüllungspolymers" kann variabel sein, vorzugsweise liegt es bei einem M_w von 1000 bis 100 000 gmol^–1, bevorzugt zwischen 1000 und 25 000 gmol^–1, besonders bevorzugt zwischen 5000 und 12 000 gmol^–1 und ganz besonders bevorzugt zwischen 7000 und 10 000 gmol^–1.
So wurde beispielsweise gefunden, dass mit Natriumpolyacrylaten im Molekulargewichtsbereich M_w von ca. 8000 gmol^–1 bessere Ergebnisse erzielt werden können als mit den entsprechend höhermolekularen Analogen, mit beispielsweise einem Molekulargewicht von 50 000 gmol^–1.
Die hydrophile Oberflächenhülle der erfindungsgemäßen Nanoteilchen kann dabei auch bestimmte, für die jeweilige Anwendung benötigte Eigenschaften haben, die sich mit denen der anorganischen Nanokerne ergänzt, so z.B. fluoreszierende, elektromagnetische Strahlung streuende oder absorbierende, magnetische (hervorgerufen durch Atomkerne oder Elektronenhüllen) oder andere, je nach deren Einsatzzweck. Sie können auch als Partner in resonanten Energietransfer-Prozessen (Förstertransfer) eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Nanoteilchen, die CePO₄:Tb als anorganischen Nanokern enthalten und eine das Natriumsalz der Polyacrylsäure enthaltende hydrophile Oberflächenumhüllung aufweisen. Diese zeichnen sich durch eine hohe Stabilität gegen relativ hohe Elektrolytkonzentrationen aus. Beispielsweise konnte selbst in 2 molaren NaCl Lösungen noch eine ausreichende Suspensionsstabilität beobachtet werden. Vorzugsweise sollten jedoch bei einwertigen Ionen Konzentrationen von einem Mol und bei mehrwertigen Ionen, wie MgCl₂ 0.5 Mol nicht überschritten werden.
Außerdem weisen sich die erfindungsgemäßen Nanopartikelsuspensionen durch eine hohe Temperaturstabilität aus. So konnte eine mit Polyacrylsäure Na Salz umhüllte CePO₄:Tb Nanopartikelsuspension über einen halben Tag mit kochendem Wasser behandelt werden ohne dass die Suspensionsstabilität verloren ging. Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Nanopartikelsuspensionen ein- oder mehrere Male für 3 bis fünf Stunden bei 95°C ohne nennenswerte Einbußen mit heißem Wasser behandelt werden. Damit sind die Rahmenbedingungen für beispielsweise qPCR Nachweismethoden erfüllt.
Zur Bestimmung der Partikelgröße und für den Nachweis der Monodispersität der erfindungsgemäßen Nanoteilchen ist die Laserlichtstreuung oder bevorzugt der Einsatz der Analytischen Ultrazentrifugation (AUZ) geeignet. Die AUZ ist dem Fachmann bekannt, wie bspw. in Colloid & Polymer Science 267:1113-1116 von H. G. Müller beschrieben.
Zur Bestimmung der Oberflächenladung hat sich vor allem die Gelelektrophorese bewährt, deren Grundlagen bspw. von R. Westermeier „Electrophoresis in Practice" Wiley-VCH beschrieben sind.
Als weitere Methode zur Oberflächencharakterisierung wird die Zeta-Potenzialbestimmung, die bspw. Hiemenz und Rajagopalan, Principles of Colloid and Surface Chemistry, 3. Aufl. New York: Dekker 1997 beschreiben, eingesetzt.
Durch eine kombinierte Anwendung von Transmissionselektronenmikroskopie, Elektronenspektroskopie für die chemische Analyse (ESCA) und Thermogravimetrie (TGA) kann die Schichtdicke der Polymerhülle ermittelt werden, die 0,5 nm bis 7 nm, bevorzugt 0,5 bis 4 nm, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 nm beträgt.
Die Schichtdicke der Polymerhülle kann dabei bei Verwendung der Transmissionselektronenmikroskopie direkt beobachtet werden, was aber wegen der dem Fachmann bekannten Probleme von für die Transmissionselektronenmikroskopie typischen Präparationsartefakte nur einen ersten Anhaltspunkt geben kann. Mit Hilfe von ESCA kann geprüft werden, ob noch Signale des anorganischen Kerns des umhüllten Nanoteilchens nachweisbar sind, was auf Schichtdicken von unter ca. 5 nm hinweist. Bei der TGA kann die Polymerhülle von den Nanoteilchen thermisch desorbiert werden und deren absolute und auch zum Nanoteilchen relative Masse bestimmt werden. Bei Kenntnis der Größe des anorganischen Anteils des Nanoteilchens, bestimmbar mit der Transmissionselektronenmikroskopie, dessen Dichte sowie der Dichte des Polymers kann somit die mittlere Polymerhülle berechnet werden. Verwendet man zum Beispiel CePO₄:Tb-Nanoteilchen mit einer anorganischen Teilchengröße von 7 nm und einer Dichte von 5,2 g/cm³, die mit einer Schicht aus Polyacrylsäure mit einer Dichte von 1,1 g/cm³ derart umhüllt sind, dass bei einer TGA ein relativer Gewichtsverlust von 20 % auftritt, ergibt sich eine Hüllendicke von 1,0 nm.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nanopartikel. Viele Typen von Nanoteilchen besitzen herstellungsbedingt, z.B. aufgrund ihrer Synthese in hydrophoben Lösemitteln, eine hydrophobe Oberfläche. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monodispersen, wässerigen Dispersionen, ausgehend von hydrophoben Nanopartikel-Agglomeraten, beinhaltet eine zumindest teilweise Dealkylierung der hydrophoben Ausgangsprodukte durch Tempern in hochsiedenden, wassermischbaren Lösungsmitteln und an schließende Umhüllung mit hydrophilen Polymeren durch Umsetzung der wie beschrieben getemperten Nanoteilchen mit geeigneten Polymeren, die vorzugsweise funktionelle, reaktive Gruppen besitzen, in wassermischbaren Lösungsmitteln optional unter Verwendung von Lösungsvermittlern.
Um die Affinität der oben beschriebenen hydrophilen polymeren Dispergatoren zu den zu hydrophilierenden hydrophoben Nanoteilchen zu ermöglichen, müssen letztere ganz oder zumindest teilweise dehydrophobiert werden.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die Dehydrophobierung bzw. teilweise Dehydrophobierung von beispielsweise mit Tris-Ethylhexylphosphat (TEHP) oder Tributylphosphat modifizierten Nanophosphore durch einfaches Tempern in mindestens einem hochsiedenden, vorzugsweise mit Wasser mischbaren Lösemitteln, wie beispielsweise N-Methylpyrrolidon (NMP), Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid (DMAc), Dimethylsulfoxid (DMSO) Triethylphosphat oder Diethylphosphit, bzw. in Gemischen dieser Lösemittel, bevorzugt in reinem NMP erreicht werden kann.
Die Dehydrophobierung erfolgt durch mehrstündiges, vorzugsweise 2- bis 3-stündiges Erhitzen bis in Siedepunktsnähe, bevorzugt. auf 180 bis 250°C, besonders bevorzugt auf 200°C.
Die auf die Dehydrophobierung folgende Polymerumhüllung kann im Prinzip in beliebigen, vorzugsweise im selben Lösemittel (Dehydrophobierungslösemittel) erfolgen.
Diesen Lösemitteln können vorzugsweise sog. Lösungsvermittler, wie Ethylenglykol, Glyzerin oder niedermolekulare Oligoethylenglykole bzw. deren Monomethylether, bevorzugt niedermolekulare Ethylenglykole, ganz besonders bevorzugt Ethylenglykol ineinigen Gewichtsprozenten bis zu gleichen Mengen zugesetzt werden. Ein besonders bevorzugtes Lösemittelsystem besteht, wie in Bsp. 2 beschrieben aus gleichen Gewichtsanteilen NMP und Ethylenglykol.
Während die Dehydrophobierung, wie beschrieben, bei hohen Temperaturen erfolgt, kann die Polymerumhüllung durch mehrstündiges Rühren oder Rollen bei RT erfolgen.
Wie in Bsp. 2 beschrieben, wird die Dehydrophobierungslösung mit etwa gleichen Mengen Ethylenglykol und einer ca. 1%igen wässerigen Lösung des zu umhüllenden Polymers versetzt und vorzugsweise über Nacht gerührt, bzw. auf einer Rollbank kontinuierlich bewegt.
Ebenfalls Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Aufarbeitung der Umsetzungsprodukte. Die Trennung der umhüllten Nanoteilchen von ihren Nebenprodukten kann über Ultrazentrifugation oder ein Membranverfahren, vorzugsweise Ultrafiltration (UF) erfolgen. So eignet sich beispielsweise für die Isolierung der hier hergestellten CePO₄:Tb Nanoteilchen Membranen aus Polyethersulfon mit einer Ausschlussgrenze von 100 000 D. In diesem Fall werden die Nanoteilchen zurückgehalten, während die überschüssigen Nebenprodukte, wie Polymere oder organische Lösemittel permeieren. Die geeignete Größe der Membranen-Ausschlussgrenze kann variieren und hängt von der Größe der zu beschichtenden Nanoteilchen und dem Molekulargewicht des verwendeten Polymers ab. Sie kann aber von dem Fachmann auf dem Gebiet leicht eingegrenzt werden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind durch chemische Reaktionen, so beispielsweise eine Ankopplung von funktionellen Molekülen an die hydrophile Oberflächenbeschichtung, und/oder durch physikalische Prozesse an und/oder in der Oberflächenbeschichtung zugängliche Derivate der erfindungsgemäßen Nanoteilchen.
So können an die hydrophile Oberflächenumhüllung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen, so z.B. an CePO₄:Tb, beispielsweise Farbstoffe wie Fluoreszein oder Rhodamin (z.B. Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland), Bodipy, Alexa 546 (Molecular Probes, Eugene, USA), Cy3 (Amersham Bioscience, General Electric HealthCare), Atto 532, Atto 550 (Atto-Tec GmbH, Siegen, Deutschland) oder andere dem Fachmann bekannten Fluoreszenzfarbstoffe angebunden werden. Zur Ausnutzung eines Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) werden dabei Idealerweise solche Farbstoffe verwendet, die bei Verwendung als Akzeptor einer möglichst großen Überlappung zwischen Absorptionsquerschnitt des Farbstoffes und den Emissionsbanden des Nanoteilchens, der als Emitter eingesetzt ist, aufweisen. Es eignen sich aber auch Moleküle als Akzeptoren, die die Fluoreszenz des Donors löschen, ohne selbst zu fluoreszieren, wie z.B. Black Hole Quencher BHQ-1 (BIOSEARCH Technologies, Novato, USA). Auch in diesem Fall werden solche Löschmoleküle verwendet, die eine möglichst große Überlappung zwischen Absorptionsquerschnitt des Löschmoleküls und den Emissionsbanden des Nanoteilchens, der als Emitter eingesetzt ist, aufweisen. Bezüglich der Überlappung sollte bevorzugt die Wellenlänge von mindestens einem Emissionsmaximum der Fluoreszenzbanden des Nanoteilchens im Bereich der Hauptabsorption des Farbstoffs liegen, wobei die Wellenlängengrenzen der Hauptabsorption durch den 37 %-Wert des Absorptionsmaximums definiert sind. In Fällen, bei denen die Emissionswellenlängen der Farbstoffe mit Absorptionsbanden des Nanoteilchens überlappen, agieren die Nanoteilchen als Akzeptoren und die Farbstoffe als Donoren. Um einen möglichst effektiven FRET zu erzielen, gelten die Angaben zur Lage der Absorptions- und Emissionsbanden analog zu den obigen.
Mit Hilfe der so modifizierten erfindungsgemäßen Nanoteilchen lässt sich so eine weitere Aussage über den Abstand zwischen anorganischem Nanokern und dem Farbstoff und somit indirekt über die Dicke der Polymere enthaltenden hydrophilen Oberflächenumhüllung mit Hilfe eines resonanten Energietransfers (Förster-Transfer) von den anorganischen Nanokernen auf den Farbstoff machen (Beispiel 3).
Der Energietransfer kann einmal durch die vom Nanoteilchen sensibilisierte Fluoreszenz des Farbstoffs gemessen werden. Dazu wird das Nanoteilchen mit einer Blitzlampe, die eine Blitzdauer von einigen Mikrosekunden oder kürzer realisiert, angeregt, während das Emissionsspektrum nach einer Verzögerungszeit gemessen wird, nach welcher der Anregungslichtpuls abgeklungen ist. Die Länge der Verzögerungszeit hängt im wesentlichen von der Leuchtdauer der Anregungsblitzlampe ab und beträgt i.a. 20-50 Mikrosekunden. Durch dieses Messprinzip wird die Lichtemission des direkt angeregten Farbstoffs oder eine eventuell auftretende Hintergrundfluoreszenz nahezu vollständig eliminiert. In solchen Spektren sieht man die durch den Energietransfer reduzierte Fluoreszenz des Donors überlagert von der sensibilisierten Fluoreszenz des Akzeptors. Bei einem anderen Messprinzip kann der Energietransfer durch Vergleich der Fluoreszenzlebensdauer der anorganischen Nanokerne mit und ohne angekoppeltem Farbstoff bestimmt werden. Aus dem Verhältnis der Lebensdauer und unter Berücksichtigung der endlichen Größe der Nanoteilchen (und somit unter Berücksichtigung der räumlichen Verteilung der Emitter-Ionen) kann der Fachmann leicht die Effizienz des Energietransfers bestimmen und somit auf die Dicke der Polymerschicht um die Nanoteilchen schließen. Die je nach Anzahl der angekoppelten Farbstoffmoleküle ermittelte Reduktion der Fluoreszenzlebensdauer um bis zu 90 % zeigt die hohe Energietransfer-Effizienz der im Beispiel beschriebenen Systeme. Dies ist nur möglich, wenn der Abstand zwischen anorganischem Nanokern und Farbstoff deutlich kleiner als der kritische Abstand für einen Energietransfer („Förster-Radius") ist, der bei ca. 5 nm liegt. Dieses Ergebnis ist ein weiterer deutlicher Hinweis auf die geringe Schichtdicke der Polymere enthaltenden Oberflächenumhüllung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind die durch eine zusätzliche Ankopplung von mindestens einem funktionellen Molekül wie z.B. einem allgemeinen organischen Molekül oder biologischen Makromolekülen wie z.B. Antikörpern oder anderen Proteinen, Peptiden, Enzymen, Oligonukleotiden oder anderen Nukleinsäuremolekülen oder nukleinsäureähnlichen Molekülen, wie PNAs oder Morpholinos, Oligo- oder Polysacchariden, Haptenen, wie Biotin oder Digoxin oder niedermolekularen synthetischen oder natürlichen Antigenen oder Epitopen oder Kopplungsmolekülen wie Avidin, Streptavidin oder Neutravidin erhältlichen Nanoteilchen.
Bevorzugt ist eine Ankopplung von Oligonukleotiden (Beispiel 4), Biotin, Avidin und/oder Streptavidin (Beispiele 5 und 6) an die erfindungsgemäßen Nanoteilchen.
Physikalische Prozesse in der hydrophilen Oberflächenbeschichtung können Ankopplungen von geeigneten Ionen über Komplexbildung sein, wie z.B. paramagnetische Ionen (z.B. Eisen), die weitere Methoden der Analytik ermöglichen. Aber auch eine physikalische Vernetzung durch intramolekulare Komplexbildung und damit Stabilisierung der hydrophilen Polymere enthaltenden Oberflächenumhüllung ist möglich.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die funktionellen Gruppen der Umhüllungspolymeren mit bi- oder höherfunktionellen niedermolekularen Molekülen quervernetzt werden, so z.B. mit di-, tri-, tetra-, penta- oder polyfunktionellen Reagenzien wie Lysin, Ethylendiamindiacetat (EDDA). Beispielsweise wurde das auf den anorganischen Nanokernen befindlichen Polyacrylat Umhüllungspolymer durch Umsetzen mit Lysin, einem bifunktionellen Reagenz, quervernetzt (Beispiel 7). Dabei kann es in geringem Umfang auch zu interpartikulärer Vernetzung kommen, was anhand größerer mittlerer Teilchendurchmesser im Vergleich zu denen der Ausgangsstoffe beobachtet wird.
Besonders bevorzugt sind die Lysin vernetzten, Fluorescein modifizierten CePO₄:Tb Nanoteilchen mit Natriumpolyacrylat in der hydrophilen Oberflächenumhüllung. Diese zeigen besonders starke Donor- bzw. Akzeptoreigenschaften für Fluoreszenz resonanten Enrgietransfer (FRET).
Chemische Reaktionen, die zur Derivatisierung der Oberflächenumhüllung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen verwandt werden, und/oder physikalische Prozesse in der Oberflächenumhüllung sind dem Fachmann bekannt und werden in Standardwerken der Organischen Chemie, bzw. der Biochemie beschrieben.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen und/oder ihrer Derivate als Biolabel in heterogenen oder homogenen biologischen Assays, um z.B. die Präsenz von nachzuweisenden biologischen Makromolekülen wie z.B. Antikörpern oder anderen Proteinen, Peptiden, Oligonukleotiden oder anderen Nukleinsäuremolekülen oder nukleinsäureähnlichen Molekülen, wie PNAs oder Morpholinos, Oligo- oder Polysacchariden, Haptenen qualitativ und/oder quantitativ anzuzeigen. Solche Assays können z.B. Immunoassays in den für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Formaten sein oder auch Assays der quantitativen PCR ebenfalls in den für den Fachmann bekannten Formaten sein (z.B. Molecular Beacon-, Taqman-, Dual Hybridization- oder Scorpions-Format). Auch Assay-Formate, bei denen die Erkennung des Zielmoleküls durch eine induzierte Agglomeration der Nanoteilchen und einer damit verbundenen Trübung oder Änderung der Intensität oder Wellenlänge der Absorption, der Lichtstreuung oder des Fluoreszenzlichts können mit den erfindungsgemäßen Nanoteilchen realisiert werden. Die Anregung der Nanoteilchen kann dabei über einen Ein- oder auch Mehrphotonen-Prozess erfolgen.
Zusätzlich ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen als Marker oder Label in der Molekular- und/oder Zellbiologie oder in der medizinischen Diagnostik oder Therapeutik möglich. Dabei kann die An- oder Abwesenheit eines Analyten gemessen werden, Zellschnitte angefärbt werden oder es können mit den erfindungsgemäßen Nanoteilchen markierte biologische Moleküle oder biologisch wirksame Moleküle in vivo oder in vitro verfolgt werden.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nanoteilchen auch Verwendung als Füllstoffe oder Zusatzstoffe in Polymeren, insbesondere als Zusatzstoff in organischen oder anorganischen Lack- oder Coatingsystemen oder als Zusatzstoffe in Tinten finden.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der Beispiele näher erläutert ohne sie jedoch auf diese zu beschränken.
Beispiele
Herstellen einer hydrophoben nanopartikulären Suspension
1,9 g hydrophobe CePO₄:Tb Nanopartikel wurden in 19.0 g NMP (N-Methylpyrrolidon) suspendiert. Diese Suspension wurde in einem Glaskolben mit Magnetrührer und Rückflusskühler unter Rühren 2 h auf 200°C erhitzt. Dabei entstand eine braune, transparente nanopartikuläre Suspension (20,9 g einer 9,1%igen Suspension). Mittels analytischer Ultrazentrifugation (AUC) wurde für diese NMP/Nanopartikel Suspension eine mittlere Teilchengrössenverteilung von 5,4 nm (d₅₀ Wert) ermittelt. Für die folgende Polymerumhüllung wurde durch NMP Zugabe eine 1%ige Suspension hergestellt.
Umhüllung der hydrophoben Suspension mit Polyacrylsäure Natriumsalz (PASNa)
10,0 ml der 1%igen, hydrophoben NMP Nanopartikel Suspension wurden in einem 50 ml Falcon Röhrchen (aus PP mit Schraubdeckel) mit 10,0 ml Ethylenglykol (EG) versetzt. Dazu wurden 20,0 g eines PASNa/EG Gemisches (10,0 g 1%ige PASNa Lösung MW: 8000 D, Aldrich und 10,0 g EG) gegeben. Durch Rollen des Falcon Röhrchens über Nacht wurde diese nanopartikuläre Suspension gemischt. Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches erfolgte mittels Ultrafiltration (UF) bei ca. 3 bar in einer 50 ml Millipore Rührzelle mit einer Polyethersulfon (PES) Membran, deren cut-off bei 100 000 D lag. Der Lösungsmittelaustausch erfolgte durch kontinuierliche Permeation mit Wasser wobei insgesamt ein Permeatvolumen von ca. 850 ml erzielt wurde. Das entsprechende Konzentrat (Retentat) bestand aus 15 ml einer 0,75%igen klaren, farblosen nanopartikulären Suspension mit den folgenden Eigenschaften:

• pH: 7.0;
• Teilchengrößenverteilung (ermittelt mit der AUC): d₅₀: 5,9 nm;
• Gelelektrophorese (GEP): Bei der Gelelektrophorese (Agarose Gel in Trisacetat EDTA Puffer) wanderten die mit PASNa umhüllten Nanopartikel zur Anode, während die nicht umhüllten, wasserunlöslichen Ausgangsprodukte keine elektrophoretische Beweglichkeit besaßen.
• Spektroskopische Untersuchung: Bei Anregung bei 280 nm ergaben sich die für die Lichtemission von Terbium-Ionen typischen Fluorezenzmaxima bei 487 nm, 542 nm (Hauptmaximum), 583 nm und 620 nm. Die Halbwertzeiten dieser Emissionsmaxima lagen bei 1,35 ms.
• Stabilität gegen Salzfrachten: Die mit PASNa umhüllten Nanophosphore erwiesen sich als sehr stabil gegen Salzkonzentrationen. Bis zu einer Konzentration von 2000 mmol/l NaCl und bis 5 mmol/l MgCl₂ kam es zu keinen Agglomerationen.
• Stabilität gegen pH-Wert-Variationen: Die mit PASNa umhüllten Nanophosphore erwiesen sich als sehr stabil gegen pH-Wert-Änderungen im Bereich zwischen pH 4 und mindestens pH 9.
• Temperaturstabilität: Die mit PASNa umhüllten Nanophosphore erwiesen sich als sehr stabil gegen hohe Temperaturen. Die Dispersionen konnten mehr als 6 Stunden bei über 90°C gehalten werden, ohne wesentliche Veränderung der Teilchengrößenverteilung oder der optischen Eigenschaften.

Kopplung von Fluorescein an die mit PASNa umhüllten Nanophosphore
Die Reaktion wurde in einem 15 ml Falcon Röhrchen (PP) durchgeführt. Zu 1,5 ml der oben genannten mit Polyacrylsäure-Na umhüllten Nanophosphore wurden 70 mg EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimid Hydrochlorid, Aldrich), gelöst in 1,5 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH: 6,0) pipettiert. Nach Vortex-Behandlung wurde das Reaktionsgemisch 30 Min. auf der Rollbank bei Raumtemperatur gerollt, wobei sich ein pH-Wert von 6,5 einstellte. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 5 mg Fluoresceinamin (Fluka), gelöst in 7,5 ml Boratpuffer (0,1 m, pH: 8.3) gegeben. Nach Vortex-Behandlung wurde das Reaktionsgemisch unter Lichtausschluss über Nacht gerollt, wobei sich in dem gelben Reaktionsmedium ein pH-Wert von 8.3 eingestellt hatte.
Die Aufarbeitung erfolgte durch Ultrafiltration (PES Membran 100 000D, ca. 3 bar) mit Wasser als Permeationsmittel. Nach einem Permeationsvolumen von 350 ml wurde, nach einem anfänglich gelben, ein absolut farbloses Permeat erhalten. Das Konzentrat (Produkt) war eine leuchtend gelbe, transparente nanopartikuläre Suspension mit folgenden Eigenschaften:

• Volumen: 2,2 ml
• Nanopartikel Konzentration: 0.5 Gew.-%
• Teilchengrößenverteilung (AUC): d₅₀: 8,4 nm
• Spektroskopische Untersuchung (Jobin Yvon, Fluorolog FL3 – 22 mit Phosphoreszenz-Option): Dazu wurden die Teilchendispersionen auf eine Konzentration von 0,002 Gew.-% verdünnt und mit einer Xe-Blitzlampe bei 280 nm angeregt. Der Energietransfer wurde zum einen durch die von den CePO₄:Tb-Nanophosporen sensibilisierte Fluoreszenz des Fluoresceins gemessen. Dazu wurde das Fluoreszenzspektrum nach einer Verzögerungszeit von 40 μs nach dem Anregungslichtpuls aufgenommen, um die Lichtemission des direkt angeregten Farbstoffs oder eine eventuell auftretende Hintergrundfluoreszenz nahezu vollständig zu eliminieren. Es zeigten sich die für die Lichtemission von Terbium-Ionen typischen Fluorezenzmaxima bei 487 nm, 542 nm (Hauptmaximum), 583 nm und 620 nm mit einem breiten Untergrundmaximum mit einem Zentrum bei 523 nm, der die sensibilisierte Fluoreszenz des Fluoresceins anzeigt. Zum anderen wurde der Energietransfer durch Vergleich der Fluoreszenzlebensdauer der CePO₄:Tb-Nanophospore bei einer Wellenlänge von 542 nm mit und ohne angekoppeltem Fluorecscein bestimmt. Es ergab sich eine Reduktion der Lebensdauer um bis zu 90 %. Auch unter Berücksichtigung, dass mehrere Fluorescein-Moleküle angekoppelt waren, zeigt dieses Ergebnis die hohe FRET-Effizienz des hier vorgestellten Systems, was nur möglich ist, wenn der Abstand zwischen Nanophosphor und Farbstoff deutlich kleiner als der kritische Abstand für einen FRET („Förster-Radius") ist, der bei ca. 5 nm liegt.

In Kontrollversuchen, in denen die Fluorescein-Moleküle ohne Ankopplung an die Nanophosphore zugegeben wurden, konnte keine zeitverzögerte Emission des Fluorescein bei 523 nm beobachtet werden. Ebenso änderte sich die Halbwertzweit nicht gegenüber den Messungen, bei denen die mit Polyacrylsäure-Na umhüllten Nanophosphore allein vorlagen.
Kopplung von Oligonukleotiden an die mit PASNa umhüllten Nanophosphore
Zu 0.8 ml der in Bsp. 2 beschriebenen Nanophosphor/PASNa Partikelsuspension wurden 65 mg EDC gelöst in 0.5 m Phosphatpuffer, pH 6.0 gegeben. Es wurde 1h bei Raumtemperatur (RT) gemischt, wobei sich ein pH Wert von 6,2 eingestellt hatte.
Zu den so aktivierten Nanophosphoren wurden 1,9 mg der folgende NH-Oligosequenz (Thermo Electron, Ulm), gelöst in 0.4 ml Boratpuffer 0.2 m, pH: 9 gegeben: 5' GGC AGC AAC GCG ACG CGC ACC-3' (5' Aminolink C6/MMT).
Nach einer 4-stündigen Inkubation unter Rühren bei RT wurde der Ansatz über Nacht bei 4°C gelagert und danach mittels Ultrafiltration mit einer Vivaspin Zelle (Fa. VivaScience, PES Membran MWCO 50 000D) aufgereinigt.
Das Endprodukt (0.8 ml) war eine 1,2%ige klare nanopartikuläre Suspension Dieses Endprodukt wurde um einen Faktor 5 verdünnt und mit der 6-fachen molaren Konzentration der komplementären Sequenz 5' GGT GCG CGT CGC GTT GCT GCC 3' (3' TAMRA; TAMRA = Rhodamin-Derivat, Thermo Electron, Ulm), zusammen mit 1,5 mM MgCl₂ inkubiert. Anschließend wurde die Fluoreszenzlebensdauer der Lichtemission der Nanophosphore bei einer Wellenlänge von 542 nm analog zu Beispiel 3 gemessen. Es ergab sich eine Verkürzung der Lebensdauer um 70 %, die durch den FRET von dem Nanophosphor auf den Farbstoff TAMRA hervorgerufen wurde.
Kopplung von Biotin an die mit PASNa umhüllten Nanophosphore (HIE 13 024)
24 mg EDC wurden in 0,04 ml 0.5 m Phosphatpuffer pH 6.0 gelöst und zu 0.09 ml PASNa umhüllte Nanophosphore (Produkt aus Bsp. 2) gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 h bei RT wurden dazu 3,745 mg Biotin-(PEO)3-amin (Bioscience 00215) gelöst in 0,05 ml 0,2 m Boratpuffer pH 9,2 gegeben. Nach einer 6 stündigen Reaktionszeit unter Rühren, wurde der Ansatz über Nacht bei 4°C gelagert und danach mittels Ultrafiltration (Vivaspin MWCO 50 000 PES Membran) aufgereinigt.
Zum Nachweis Biotin-Kopplung wurde die Dispersion in PBS-Puffer bei pH 8 auf 800 μg/l verdünnt und zu einer Dispersion (800 μg/l) mit Strepatavidin-umhüllten magnetischen Polymerbeads (Sera-Mag^® Strepatavidin, Serva, Heidelberg) gegeben. Anschließend wurden die Polymerbeads 10 min. mit einem Dauer-Stabmagneten abgezogen und die Fluoreszenz des Überstands vermessen. Es zeigte sich keine Fluoreszenz, während vor der Zugabe der Polymerbeads eine deutliche Fluoreszenz der Nanophosphore nachweisbar war. Dieses Experiment zeigt die gute Kopplung des Biotins an die Nanophosphore.
Kopplung von Streptavidin an die mit PASNa umhüllten Nanophosphore
Zu 0.3 ml einer 6%ige PASNa modifizierte Nanophosphor-Suspension (Produkt aus Bsp. 2) wurden 40 mg EDC und 30 mg SulfoNHS (N-Hydroxysuccinimid), gelöst in 0.5 m Phosphatpuffer, pH 6.0, gegeben. Es wurde unter Mischen eine Stunde bei RT inkubiert. Danach wurden die aktivierten Nanophosphore mittels Ultrafiltration (PES Membran MWCO: 100 000 D) isoliert. Als Retentat wurde eine leicht opake Suspension mit dem pH Wert 5,7 erhalten.
Zu 1 ml dieser Partikelsuspension wurden 5,0 mg Streptavidin (Sigma S4762), gelöst in 0,2 m Boratpuffer, pH 9,2, gegeben. Nach einer 4-stündigen Inkubation und Lagerung bei 4°C über Nacht, wurde das Endprodukt durch Ultrafiltration (PES Membran MWCO 100 000 D) aufgereinigt, wobei als Retentat eine 1.3%ige, klare Lösung mit dem pH Wert 8,3 erhalten wurde. Der Nachweis der Streptavidin-Bindung erfolgt analog zu dem Nachweis der Biotin-Bindung in Beispiel 5, nur dass die Position des Streptavidin und Biotin vertauscht wurde.
Quervernetzung der mit PASNa umhüllten Nanophosphore mit Lysin
Zu 5 ml der in Bsp. 2 beschriebenen PASNa umhüllten Nanophosohore (1,1%ige Suspension) wurden 170 mg EDC, gelöst in 5 ml 0,1 m Phosphatpuffer pH 6.0, gegeben. Unter Mischen auf einer Rollbank wurde der Ansatz 30 Minuten bei RT inkubiert.
Anschließend wurden 4.34 mg L-Lysin, gelöst in 2,5 ml 0,2 m Boratpuffer pH 9.0, gegeben.
Nach einer Inkubationszeit von 24 h bei RT, wurde der Ansatz über Nacht bei 4°C gelagert und danach mittels Ultrafiltration (PES Membran 100 000 MWCO) aufgereinigt.
Die intrapartikuläre Quervernetzung konnte über IR Spektroskopie anhand der Amidgruppen nachgewiesen werden.

Claims

Anorganische lumineszierende oder magnetische oder elektromagnetische Strahlung streuende oder absorbierende, insbesondere durch die Anregung einer Plasmonenresonanz verstärkt streuende oder absorbierende Nanoteilchen mit einer mittlere Teilchengröße von 1 nm bis 500 nm, und mit einer hydrophilen, mindestens ein Polymer enthaltenden Oberflächenbeschichtung, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächenbeschichtung eine geringe Dicke von 0,5 nm bis 7 nm aufweist.
Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Kristallgitter mit Fremdionen dotiert ist.
Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie Donor- bzw. Akzeptoreigenschaften für Fluoreszenz resonanten Energietransfer aufweisen.
Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den in der Hülle enthaltenen Polymeren um mindestens eines aus der Reihe der Polyacrylsäuren oder Polymethacrylsäuren und/oder deren Salze oder Copolymere handelt.
Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass an die hydrophile Oberflächenhülle über chemische oder physikalische Reaktion mindestens ein funktionelles Molekül oder ein Biomolekül angelagert ist.
Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Oberflächenhülle durch chemische oder physikalische Reaktion vernetzt ist.
Verfahren zur Herstellung der anorganischen Nanoteilchen mit hydrophiler Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass hydrophobe Nanoteilchen in mindestens einem hochsiedenden, mit Wasser mischbaren Lösemittel getempert und mit einer Lösung mindestens eines hydrophilen Polymeren in demselben oder mindestens einem weiteren wassermischbaren Lösungsmittel umgesetzt werden.
Verwendung von anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 als Biolabel in heterogenen oder homogenen biologischen Assays, insbesondere Immunoassays, zum qualitativen oder quantitativem Nachweis von Biomolekülen, insbesondere der quantitativen PCR.
Verwendung von anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 als Marker oder Label in der Molekular- und/oder Zellbiologie, in der medizinischen Diagnostik oder Therapeutik.
Verwendung von anorganischen Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 als Füllstoff oder Zusatzstoff in Polymeren, als Zusatzstoff in organischen oder anorganische Lack- oder Coatingsystemen, und/oder als Zusatzstoffe in Tinten.