CN101238196A - 具有官能性表面基团的亲水性纳米颗粒，其制造及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有亲水性表面涂层的纳米颗粒，涉及其制造方式及其在生物学、分子生物学、生化学和医学应用中的用途。

Description

具有官能性表面基团的亲水性纳米颗粒，其制造及用途
本发明涉及具有亲水性表面涂层的纳米颗粒、其制造方法以及其在生物学、分子生物学、生化学和医学应用中的用途。
近年来，纳米颗粒在体内或体外诊断学、治疗学、胚胎学和通常在许多分子生物学的或者生化学应用以及活性物质筛选中的使用越来越重要。为此，大多数应用需要具有亲水性表面的纳米颗粒以将它们分散在生物环境(即含水环境)中。所述纳米颗粒应该理想地以单颗粒或单分散的，即非聚集的形式，以一方面预防不期望的沉降和/或另一方面尽可能少地影响生化或生物分子过程或运动的动态特性或动力学。而且，所述纳米颗粒应该理想地具有使得官能分子能够偶联到该纳米颗粒的官能性的反应性化学基团。官能性分子可以是例如，生物大分子如低聚核苷酸(例如DNA或RNA)或多肽(例如蛋白质或抗体)、生物偶联分子例如生物素或链霉抗生物素、或者其它有机分子。
荧光的无机纳米颗粒常常在有机溶剂中制备，导致疏水的最终产品。最常用的荧光无机纳米颗粒是由II-VI或者III-V半导体组成的半导体纳米颗粒，其通常具有芯-壳结构。U.S.6,322,901、U.S.6,576,291和U.S.6,423,551描述了其无机芯体大小小于10nm的这些颗粒，其也称为“量子点(Quantum Dots)”。取决于它们的制备，它们常常具有由三辛基膦组成的有机壳。
另一类别的荧光无机纳米颗粒是由非导体的材料组成的磷光纳米颗粒并且其掺杂有稀土和/或副族元素的离子。
它们也被称为纳米无机发光材料(Nanophosphor)，WO04/046035A1、WO02/020695A1，K.Koempe；H.Borchert；J.Storz；A.Arun；S.Adam，T.Moeller；M.Haase；Angewandte Chemie，InternationalEdition(2003)，42(44)，5513-5516描述了发射波长比激发波长更长的“向下转换(down-converting)纳米无机发光材料”，而在S.Heer；O.Lehmann；M.Haase；H.Guedel；Angewandte Chemie，International Edition(2003)，42(27)，3179-3182中描述了发射波长比激发波长短的“向上转换(up-converting)无机发光材料”。
WO01/86299A1、W003/040024A1描述了这样的纳米无机发光材料也作为生物标记的用途。
WO02/020695 A1描述了由CePO4:Tb制成的纳米无机发光材料和它们的制备，例如在磷酸三乙基己基酯(TEHP)中，产生包括附着到颗粒表面的TEHP的颗粒。也可以使用磷酸三丁酯或磷酸酯的其它疏水衍生物替代TEHP。尽管这样制造的纳米颗粒不能分散在水中，但是它们可以分散在有机溶剂中，即变为单颗粒(monopartikulr)悬浮体。
但是，纳米无机发光材料的亲水性表面对于在生物系统中的预定应用是绝对的先决条件。具有疏水性表面的纳米颗粒的亲水化原则上是已知的，如WO02/055186(Quantum Dot Corp.)中所述。其中，疏水纳米颗粒的亲水化在两亲分散剂的帮助下进行，该分散剂例如通过聚丙烯酸与辛胺部分反应制备。
在水相中，辛酰胺侧链与纳米颗粒的疏水性表面相互作用，而两亲分散剂的游离丙烯酸基团的取向朝向水相。可以经由共价键向以此方式取向的丙烯酸残基连接其它分子如蛋白质或其它生物大分子。两亲分散剂在这里充当连接剂(Bindeglied)。
该方法的缺点是以可复现的品质制备作为两亲分散剂使用的疏水化的聚丙烯酸衍生物相对复杂，以及由于纳米颗粒的疏水性表面与两亲聚合物分散剂的辛酰胺基团的疏水性相互作用而需要的相对大空间。这样改性的纳米颗粒与未改性的初始颗粒相比(甚至在单颗粒分散体的情况下)具有大大提高的中值粒径。该体积增加对于多种生物应用(其中，例如标记分子应当穿透生物膜(例如细胞壁)或通过通道蛋白质扩散)是不利的。其对于在均相测定(其中，(F)RET向空间上相邻的(F)RET配对体(partner)(荧光)共振能量转移用于光学评价)中使用尤其不利。
基于上述现有技术，因此本发明的目的是提供具有亲水性表面而不会大大增加中值粒径的纳米颗粒，该纳米颗粒优选具有反应性的官能性化学基团，从而使得官能性分子能够偶联至该纳米颗粒，并且该纳米颗粒可以用于生物学、分子生物学、生化学的和医学的应用，例如用于诊断和治疗的应用，特别是在基于共振能量转移过程的均相生物测定中，且该纳米颗粒同时是便宜的并可以容易地制备。
该目的通过提供本发明的纳米颗粒实现。本发明的纳米颗粒是中值粒径为1nm至500nm的无机纳米颗粒，优选1nm至100nm，特别优选1nm至40nm，非常特别优选1到小于20nm，所述纳米颗粒是发光的、磁性的或散射或吸收电磁辐射，特别地以通过细胞质基因组共振激发增强的方式散射或吸收电磁辐射。本发明的纳米颗粒具有包括至少一种聚合物的亲水性表面涂层，且特征在于所述表面涂层具有0.5nm至7nm的低厚度，优选0.5至4nm，特别优选0.5至2nm。
这些聚合物分散剂与WO 02/055186A1中所述的那些相比关键的区别是它们不具有经由疏水性相互作用包封纳米无机发光材料的任何疏水侧链。结果，用本发明聚合物改性的本发明纳米颗粒的中值粒径明显地小于WO02/055186中提到经由“疏水包封方法”得到的那些颗粒，这对于许多应用是有利的。这样的应用包括例如，其中纳米颗粒充当(荧光)共振能量转移配对体的那些，和/或其中纳米颗粒经历运送过程的那些。除了它们的薄壳以外，本发明的纳米颗粒另外具有拥有对抗温度、盐和pH的影响的高稳定性优点。
根据本发明适合用于纳米颗粒的材料是包括无机芯体的那些，其晶格(基质材料(Wirtsmaterial))被外来离子掺杂。这些特别地包括用作所谓“无机发光材料”的所有材料和材料类别，例如在荧光屏(例如用于电子管)中或作为荧光灯(用于气体放电灯)涂料，例如在Ullmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry，WILEY-VCH，第7版，2004Electronic Release，章节“Luminescent Materials：1.Inorganic Phosphors”中所述。除了向下转换无机发光材料(其发射的光具有比它们所吸收的更低的能量)以外，还可以使用上转换无机发光材料(其发射的光比它们所吸收的具有更高的能量)。在所有的这些材料中，外来离子充当通过紫外光、可见光或红外光、X射线或γ射线或电子束激发之后发射荧光的激活剂。在一些材料中，还将多种类型的外来离子引入主体晶格，以一方面产生发射激活剂和另一方面使得颗粒体系的激发更加有效或通过迁移给定激发光源的波长而调节吸光率波长(所谓敏化剂)。多种类型的外来离子的引入还可以用来有目的地调节通过纳米颗粒设定的荧光谱带的特定组合。
根据本发明适合用于所述纳米颗粒的材料还有具有适当材料的层状结构(具有一层或多层壳的芯-壳结构)的那些。这包括将外来离子引入主体晶格中的至少一部分中，也即芯体或至少一个壳中。lad纳米颗粒的基质材料(本发明的纳米颗粒基于该lad纳米颗粒)优选由XY型的化合物组成。在这里，X是周期表主族1a、2a、3a、4a，副族2b、3b、4b、5b、6b、7b或镧系元素的元素的阳离子。在有些情况中，X还可以是所述元素的组合或混合物。Y可以是多原子阴离子，其包括主族3a、4a、5a，副族3b、4b、5b、6b、7b和/或8b的一种或多种元素以及主族6a和/或7a的元素的一个或多个原子。但是，Y还可以是周期表主族5a、6a或7a的单原子阴离子。lad纳米颗粒的基质材料(本发明的纳米颗粒基于该1ad纳米颗粒)还可以由周期表主族4a的元素组成。主族1a、2a的元素或包括Al、Cr、Tl、Mn、Ag、Cu、As、Nb、Nd、Ni、Ti、In、Sb、Ga、Si、Pb、Bi、Zn、Co的族的元素和/或镧系元素的元素可以用于掺杂。两种或更多种这些元素以彼此不同的相对浓度的组合也可以用作掺杂材料。掺杂材料在主体晶格中的浓度为10-5mol％至50mol％，优选0.01mol％至30mol％，特别优选0.1mol％至20mol％。选择掺杂材料使得由其引起的荧光具有长的衰减时间(＞100ns)。
优选使用硫化物、硒化物、硫硒化物、硫氧化物、硼酸盐、铝酸盐、镓酸盐、硅酸盐、锗酸盐、磷酸盐、卤代磷酸盐、氧化物、砷酸盐、钒酸盐、铌酸盐、钽酸盐、硫酸盐、钨酸盐、钼酸盐、碱性卤化物、氟化物及其它卤化物或氮化物作为基质材料用于纳米颗粒。优选使用包括提及的材料类别的组合的混合晶格。这些材料类别连同相应掺杂的实例在以下列表中给出(B:A型的材料，其中B＝基质材料以及A＝掺杂材料，其中A也可以是所列材料的混合物)：
LiI:Eu、NaI:Tl、CsI:Tl、CsI:Na、LiF:Mg、LiF:Mg，Ti、LiF:Mg，Na、KMgF3:Mn、Al2O3:Eu、BaFCl:Eu、BaFCl:Sm、BaFBr:Eu、BaFCl0,5Br0,5:Sm、BaY2F8:A(A＝Pr，Tm，Er，Ce)、BaSi2O5:Pb、BaMg2Al16O27:Eu、BaMgAl14O23:Eu、BaMgAl10O17:Eu、BaMgAl2O3:Eu、Ba2P2O7:Ti、(Ba，Zn，Mg)3Si2O7:Pb、Ce(Mg，Ba)Al11O19、Ce0,65Tb0,35MgAl11O19:Ce，Tb、MgAl11O19:Ce，Tb、MgF2:Mn、MgS:Eu、MgS:Ce、MgS:Sm、MgS:(Sm，Ce)、(Mg，Ca)S:Eu、MgSiO3:Mn、3,5MgO·0,5MgF2·GeO2:Mn、MgWO4:Sm、MgWO4:Pb、6MgO·As2O5:Mn、(Zn，Mg)F2:Mn、(Zn4Be)SO4:Mn、Zn2SiO4:Mn、Zn2SiO4:Mn，As、ZnO:Zn、ZnO:Zn，Si，Ga、Zn3(PO4)2:Mn、ZnS:A(A＝Ag，Al，Cu)、(Zn，Cd)S:A(A＝Cu，Al，Ag，Ni)、CdBO4:Mn、CaF2:Mn、CaF2:Dy、CaS:A(A＝镧系元素，Bi)、(Ca，Sr)S:Bi、CaWO4:Pb、CaWO4:Sm、CaSO4:A(A＝Mn，镧系元素)、3Ca3(PO4)2·Ca(F，Cl)2:Sb，Mn、CaSiO3:Mn，Pb、Ca2Al2Si2O7:Ce、(Ca，Mg)SiO3:Ce、(Ca，Mg)SiO3:Ti、2SrO·6(B2O3)·SrF2:Eu、3Sr3(PO4)2·CaCl2:Eu、A3(PO4)2·ACl2:Eu(A＝Sr，Ca，Ba)、(Sr，Mg)2P2O7:Eu、(Sr，Mg)3(PO4)2:Sn、SrS:Ce、SrS:Sm，Ce、SrS:Sm、SrS:Eu、SrS:Eu，Sm、SrS:Cu，Ag、Sr2P2O7:Sn、Sr2P2O7:Eu、Sr4Al14O25:Eu、SrGa2S4:A(A＝镧系元素，Pb)、SrGa2S4:Pb、Sr3Gd2Si6O18:Pb，Mn、YF3:Yb，Er、YF3:Ln(Ln＝镧系元素)、YLiF4:Ln(Ln＝镧系元素)、Y3Al5O12:Ln(Ln＝镧系元素)、YAl3(BO4)3:Nd，Yb、(Y，Ga)BO3:Eu、(Y，Gd)BO3:Eu、Y2Al3Ga2O12:Tb、Y2SiO5:Ln(Ln＝镧系元素)、Y2O3:Ln(Ln＝镧系元素)、Y2O2S:Ln(Ln＝镧系元素)、YVO4:A(A＝镧系元素，In)、YVO4:A，Bi(A＝镧系元素，In)、Y(PxVl-x)O4:Eu(0＜＝x＜＝1)、Y(PxVl-x)O4:Eu，Bi(0＜＝x＜＝1)；YTaO4:Nb、YAlO3:A(A＝Pr，Tm，Er，Ce)、YOCl:Yb，Er、Ln1PO4:Ln2(Ln1，Ln2＝镧系元素或镧系元素的混合物)、Ax(PO4)y:Ln(A＝碱土元素，Ln＝镧系元素)LuVO4:Eu、GdVO4:Eu、Gd2O2S:Tb、GdMgB5O10:Ce，Tb、LaOBr:Tb、La2O2S:Tb、LaF3:Nd，Ce、BaYb2F8:Eu、NaYF4:A(A＝Yb、Er、Tm、Ho)、NaGdF4:Yb，Er、NaLaF4:Yb，Er、LaF3:Yb，Er，Tm、BaYF5:Yb，Er、Ga2O3:Dy、GaN:A(A＝Pr、Eu、Er、Tm)、Bi4Ge3O12、LiNbO3:Nd，Yb、LiNbO3:Er、LiCaAlF6:Ce、LiSrAlF6:Ce、LiLuF4:A(A＝Pr、Tm、Er、Ce)、Li2B4O7:Mn，SiOx:Er，Al(0≤x≤2)。
特别优选的是使用以下材料：LaxCeyTbzPO4(x+y+z＝1)；LaxEu1-xPO4、LaxSm1-xPO4.LaxDy1-xPO4.LaxNd1-xPO4(0＜＝x＜1)；LaxCeyLnzPO4、(Lr＝镧系元素、x+y+z＝1)；MVO4:Ln(M＝Y、Gd；Ln＝镧系元素)；MVO4:Bi，Ln(M＝Y、Gd；Ln＝镧系元素)；MPO4:Ln(M＝Y、Gd；Ln＝镧系元素)；YxGd1-xVyPy-1O4:Ln(0＜＝x＜＝1；0＜＝y＜＝1；Ln＝镧系元素)；YxGd1-xVyPy-1O4:Bi，Ln(0＜＝x＜＝1；0＜＝y＜＝1；Ln＝镧系元素)MSO4:Eu(M＝Ca、Sr、 Ba)；MSO4:Eu，Mn(M＝Ca、Sr、Ba)；NaYF4:A(A＝Yb、Er、Tm、Ho)；ZnS:Tb、ZnS:TbF3、ZnS:Eu、ZnS:EuF3、Y2O3:Eu、Y2O2S:Eu、Y2SiO5:Eu、SiO2:Dy、SiO2:Al、Y2O3:Tb、CdS:Mn、ZnS:Tb、ZnS:Ag、ZnS:Cu。在特别优选的材料特别是选自主体晶格具有立方晶格结构的那些材料，因为这些材料导致最小数目的单独荧光谱带。这些的实例为：MgF2:Mn；ZnS:Mn、ZnS:Ag、ZnS:Cu、CaSiO3:Ln、CaS:Ln、CaO:Ln、ZnS:Ln、Y2O3:Ln、或MgF2:Ln(Ln＝镧系元素)。
根据本发明适合用于纳米颗粒的材料还有由无掺杂的半导电材料组成的那些。它们优选包括第4主族的那些(例如Si)和二元化合物AB，其中A是第2副族的元素而B是周期表第6主族的元素(例如ZnS、CdS或CdSe)。它们还优选包括二元化合物AB，其中A是第3主族的元素而B是周期表第5主族的元素(例如InAs、InP、GaAs、GaP或GaN)。
适用于本发明纳米颗粒的无机纳米芯体的尺寸为在1nm至500nm，优选1nm至100nm且特别优选1nm至40nm，非常特别优选1至小于20nm。
所述无机纳米芯体可具有用于特定应用所需的特定性质，例如是发光的，散射或吸收光学、电磁辐射，所述散射或吸收可以根据使用目的通过细胞质基因组共振激发提高，磁性的(由原子核或电子壳层所引起)，机械性能或其它性质。它们也可以在共振能量转移过程(FRET＝荧光共振能量转移或Frster转移)过程中用作配对体，例如在“Principlesof Fluorescence Spectroscopy”；J.R.Lakowicz，第二版，KluwerAcademic，New York 1999，第367-442页中所述。
本发明所述纳米颗粒的外壳中所含的亲水聚合物优选是亲水的线性或支化的均聚物或共聚物，所述均聚物或共聚物带有官能团如氨基、羧基或其盐、羟基、巯基、酸酐、酰基氯和/或异氰酸酯基，所述官能团使得能够共价或者吸引性地(例如静电或者离子键)与待偶联的生物分子的官能团连接。
关于这点，相应聚合物的所述官能性(也许还是吸引性的)活性基团可以以重复单元存在，例如以聚酸类、聚酸酐、聚醇、聚硫醇或聚胺或聚杂环，例如聚丙烯酸和/或其盐、聚甲基丙烯酸类和/或其盐、聚(甲基)丙烯酰胺、聚马来酸和/或其盐、聚天冬氨酸和/或其盐、聚马来酐、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和/或其盐、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇乙缩醛或聚乙烯醚或聚醚。
适合作为均聚物或共聚物的胺类聚合物的实例是聚烯丙胺、聚乙烯胺、线性的或支化的聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、包含壳糖胺的聚合物以及聚二烯丙基二甲基氯化铵和/或聚乙烯基吡啶或它们的酸加合物。
所提及的所有聚合物都可作为均聚物或作为彼此间的以及和其它单体的共聚物用于制备本发明的纳米颗粒。同样可考虑的是丙烯酸与乙烯基吡咯烷酮、马来酐与甲基乙烯基醚、乙烯基吡咯烷酮与甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、乙烯基咪唑与乙烯基吡咯烷酮以及甲基丙烯酸与乙烯基吡咯烷酮的共聚物。
其它适合的聚合物是其官能团位于末端基团中的聚合物，例如在聚醚(其末端基团通过氨基/羧基/硫代/异氰酸酯等官能化)的情况下，例如氨基官能性低聚乙二醇或聚乙二醇(Jeffamine)或OH封端的聚环氧乙烷。
优选的是官能团在重复单元中的聚合物，特别优选聚酸类，并且在这里非常特别优选聚丙烯酸类或聚甲基丙烯酸类和/或它们的盐。
在另一实施方案中，还可以使用反应性聚合物如聚马来酐或聚琥珀酰亚胺，其在进一步加工的过程中反应以产生上述的聚电解质，即分别为聚丙烯酸和聚天冬氨酸。
在本发明所述纳米颗粒一个优选的实施方案中，它们的壳包括聚甲基丙烯酸类、聚天冬氨酸(PASP)、聚马来酸、丙烯酸与例如马来酸的共聚物，其由BASF公司以产品名称Sokalane供应，和/或丙烯酸与马来酸和乙烯醚的共聚物，其由SKW Polymers公司以名称Melpers供应，和/或它们的盐，优选它们的钠盐。
特别优选的是存在本发明纳米颗粒的壳中聚丙烯酸钠。
“包封聚合物”的分子量(MW)可以改变，并且优选为1000至100000gmol-1，更优选1000至25000gmol-1，特别优选5000至12000gmol-1，且非常特别优选7000至10000gmol-1。
因此，发现分子量范围MW为大约8000gmol-1的聚丙烯酸钠产生比相应分子量为例如50000gmol-1的分子量更高的类似物更好的结果。
本发明纳米颗粒的亲水性表面壳也可以具有用于各种应用所需的、补充无机纳米芯体性质的特别性质，例如散射或吸收荧光辐射、电磁辐射的性质、磁性(由原子核或电子壳所引起)或其它性质，具体取决于它们的用途目的。它们还可以在共振能量转移过程中用作配对体(Frster转移)。
特别优选本发明的纳米颗粒包括CePO4:Tb作为无机纳米芯体并具有包括聚丙烯酸类的钠盐的亲水性表面外壳。所述纳米颗粒的特征在于对于相对高的电解质浓度的高稳定性。因此，例如甚至在2摩尔NaCl溶液中也观察到充分的悬浮体稳定性。但优选，对于一价离子来说不应该超过1mol的浓度以及对于多价离子如MgCl2来说不应该超过0.5mol的浓度。
此外本发明的纳米颗粒悬浮体具有高温稳定性。因此可以由沸水以半天处理通过聚丙烯酸钠盐包封的CePO4:Tb纳米颗粒悬浮体，而不会损失悬浮体稳定性。优选地，本发明的纳米颗粒悬浮体可以用热水在95℃处理一次或若干次达3到5小时，而没有显著的损失。这满足了对于例如qPCR检测方法的基本条件。
为了确定粒径和检测本发明纳米颗粒的单分散性，适宜使用激光散射或优选地使用分析超离心(AUC)。AUC是本领域技术人员公知的，如例如H.G.Müller在Colloid & Polymer Science 267：1113-1116中所述。
确定表面电荷的方法经证实特别有利的是凝胶电泳法，其基本原则例如通过R.Westermeier“Electrophoresis in Practice”Wiley-VCH所述。
用于表面表征的另一方法是ζ-电位测定，例如由Hiemenz和Rajagopalan，Principles of Colloid and Surface Chemistry，第3版，NewYork：Dekker 1997所述。
聚合物壳层的厚度可以由透射电子显微术、用于化学分析的光电子能谱法(ESCA)和热重分析法(TGA)确定并且为0.5nm到7nm，优选0.5到4nm，特别优选0.5到2nm。
当使用透射电子显微术时，聚合物壳层的厚度可以直接地观察到，但是由于本领域技术人员公知的对于透射电子显微术的典型制备人工制品问题，这只能给出最初指示(Anhaltspunkt)。ESCA可以用于确定包封的纳米颗粒的无机芯体的信号是否仍然可以检测到，这表明小于大约5nm的层厚度。在TGA过程中，聚合物壳可以从纳米颗粒热解吸出来并可以确定其绝对质量及其相对于纳米颗粒的质量。如果纳米颗粒无机部分的尺寸(其可以由透射电子显微术确定)、其密度和聚合物的密度是已知的，则因此能计算出平均聚合物壳。例如，如果CePO4:Tb纳米颗粒的无机粒度为7nm并且密度为5.2g/cm3，其由密度为1.1g/cm3的聚丙烯酸类组成的层包封，且包封方式使得在TGA期间发生20％的相对重量损失，那么壳厚度为1.0nm。
本发明的主题还在于制备本发明所述纳米颗粒的方法。取决于它们的制备，例如由于它们在疏水溶剂中合成，许多类型的纳米颗粒具有疏水性表面。本发明从疏水性纳米颗粒聚集体开始制备单分散水分散体的方法包括疏水起始产物通过在高沸点的、可与水混溶溶剂中加热至少部分脱烷基化，以及随后通过所述已加热的纳米颗粒与合适的聚合物(其优选具有官能性的反应基团)在可与水混溶的溶剂中、任选借助于增溶剂反应而用亲水性聚合物包封。
为了使得上述亲水聚合物分散剂对于待亲水化的疏水性纳米颗粒具有亲合力，后者必须完全或至少部分地去疏水化(dehydrophobieren)。
令人惊讶地发现，例如由磷酸三乙基己基酯(TEHP)或磷酸三丁酯改性的纳米无机发光材料的去疏水化或部分去疏水化可以通过在至少一种高沸点溶剂中简单加热而实现，所述高沸点溶剂优选可与水混溶，例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAc)、二甲亚砜(DMSO)、磷酸三乙酯或亚磷酸二乙酯，或在这些溶剂的混合物中，优选在纯NMP中简单加热。
去疏水化通过加热到接近于沸点，优选加热到180-250℃，特别优选加热到200℃，加热进行若干小时，优选2-3小时。
去疏水化之后的聚合物包封原则上可以在任何溶剂，优选相同的溶剂(去疏水化溶剂)中进行。
优选地，可以向这些溶剂添加少许重量百分数直至相等量的所谓增溶剂，例如乙二醇、甘油或低分子量寡聚乙二醇或它们的单甲基醚，优选低分子量乙二醇，非常特别优选乙二醇。特别优选的溶剂体系由相等重量比的NMP和乙二醇组成，如实施例2中所述。
尽管如前所述，去疏水化可以在高温下进行，但聚合物包封也可以通过在室温搅拌或翻滚若干小时进行。
如实施例2中所述，去疏水化溶液与近似相等量的乙二醇和大约1％的待包封聚合物的水溶液混合，并优选搅拌过夜，或在滚动台(Rollbank)上连续移动过夜。
本发明的主题还在于反应产物的后处理(Aufarbeitung)。包封的纳米颗粒可以通过超离心或膜法，优选超滤(UF)而与它们的副产物分离。例如，截留值为100 000D的聚醚砜膜适合于分离这里制备的CePO4:Tb纳米颗粒。在这种情况下，纳米颗粒得到保留，而额外的副产物如聚合物或有机溶剂透过。膜截留值的适当大小可以改变并取决于待涂覆的纳米颗粒的尺寸和所用聚合物的分子量。但是，所述大小可以通过本领域技术人员容易地缩减。
本发明的主题还在于本发明所述纳米颗粒的衍生物，其可以通过化学反应实现，例如官能性分子对亲水性表面涂层的偶联，和/或通过表面涂层之上和/或之中的物理过程实现。
因此，可以向本发明所述纳米颗粒的亲水性表面外壳(例如向CePO4:Tb)附着例如染料如荧光素或若丹明(例如Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国)，Bodipy，Alexa 546(Molecular Probes，Eugene，USA)，Cy3(Amersham Bioscience，General Electric HealthCare)，Atto 532，Atto550(Atto-Tec GmbH，Siegen，德国)或本领域技术人员公知的其它荧光染料。为了利用荧光共振能量转移(FRET)，当用作受体时，在这里理想的是使用在染料的吸收剖面(Absorptionsquerschnitt)和用作发射体的纳米颗粒的发射谱带之间具有尽可能高重叠的那些染料。但是，合适的作为受体的分子还有熄灭给体荧光而不会自己发出荧光的那些，例如Black Hole Quencher BHQ-1(BIOSEARCH Technologies，Novato，USA)。在这样的情况下，使用这样的熄灭剂分子(Lschmolekül)，其在熄灭剂分子的吸收剖面和用作发射体的纳米颗粒的发射谱带之间具有尽可能大的重叠。关于所述重叠，纳米颗粒的荧光谱带的至少一个发射峰的波长应该优选在染料主吸收的范围之内，其中所述主吸收的波长范围(Wellenlngengrenze)定义为吸收峰值37％的值。在其中染料的发射波长与纳米颗粒的吸收谱带重叠的情况下，所述纳米颗粒充当受体且染料充当给体。为了尽可能有效地实现FRET，与吸收谱带和发射谱带位置有关的信息同上所述。
因此，可以借助这样改性的本发明的纳米颗粒进一步获得关于无机纳米芯体和染料之间的距离的信息并因此在从所述无机纳米芯体到所述染料的共振能量转移(Frster转移)的帮助下间接地获得关于包含聚合物的亲水性表面外壳的厚度(实施例3)。
所述能量转移可以首先通过由纳米颗粒敏化的染料荧光测量。为此，纳米颗粒由闪光灯(其产生几微秒或更短的闪光)激发，而在一段延迟时间后测量发射光谱，在这段延迟时间之后激发光脉冲已经逐渐消失。所述延迟时间的长度主要取决于激发闪光灯的照明时间并通常是20-50微秒。由于该测量原理，直接激发的染料的光发射或者可能发生的背景荧光几乎被完全除去。在这样的光谱中，观察到由于能量转移而减少的给体荧光为由敏化的受体荧光所覆盖。在不同的测量原理情况下，能量转移可以通过在有和没有偶联至无机纳米芯体的染料的情况下比较所述无机纳米芯体的荧光寿命来确定。本领域技术人员可以从所述寿命的比率并考虑到纳米颗粒的最终大小(并由此考虑到发射体离子的空间分布)容易地确定能量转移的效率，并从而推断围绕所述纳米颗粒的聚合物层的厚度。根据偶联的染料分子数目确定的高达90％的染料寿命的降低显示了实施例中所述体系的高能量转移效率。这只有当无机纳米芯体和染料之间的距离明显比能量转移的临界距离(“Frster半径”)(其为大约5nm)更短时才可能出现。该结果是本发明纳米颗粒的包含聚合物的表面外壳厚度低的另一明显标志。
本发明的主题还在于可通过另外偶联至少一种官能性分子获得的纳米颗粒，所述官能性分子例如一般的有机分子或者生物大分子如抗体或其它蛋白质、肽、酶、低聚核苷酸或者其它核酸分子或核酸样分子，例如PNAs或者吗啉代、寡糖或聚糖，半抗原，如生物素或异羟基洋地黄毒苷原，或者低分子量合成的或天然的抗原或抗原决定簇或者偶联分子如抗生物素蛋白、链霉抗生物素或Neutravidin。
优选将寡核苷酸(实施例4)、生物素、抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素(实施例5和6)偶联至本发明的纳米颗粒。
亲水性表面涂覆中的物理过程可以是经由络合物形成如顺磁离子(例如铁)偶联合适的离子，这使得其它的分析方法成为可能。但是，以分子内络合物形成的方式形成的物理交联和由此稳定化包含亲水聚合物的表面外壳也是可行的。
在本发明的另一实施方案中，外壳聚合物的官能团可以与双或更高官能度的低分子量分子交联，例如与二、三、四、五或多官能度试剂如赖氨酸、乙二胺二乙酸酯(EDDA)。例如，位于无机纳米芯体上的聚丙烯酸盐或酯外壳通过与赖氨酸、双官能试剂反应而交联(实施例7)。还可以颗粒间交联至低的程度，这借助于与起始物质相比更大的中值粒径而观察到。
特别优选的是在亲水性表面外壳中具有聚丙烯酸钠的赖氨酸交联的、荧光素改性的CePO4:Tb纳米颗粒。这些纳米颗粒显示出对于荧光共振能量转移(FRET)来说特别强的给体和受体性质。
用于衍生本发明纳米颗粒的表面外壳的化学反应和/或所述表面外壳中的物理过程是本领域技术人员公知的并且在有机化学或生物化学的标准手册中有所描述。
本发明的主题还在于本发明纳米颗粒和/或它们的衍生物在多相的和均相的生物测定中作为生物标记的用途，例如为了定量和/或定性地显示待检测的生物大分子的存在，例如抗体或其它蛋白质、肽、寡核苷酸或其它核酸分子或核酸样分子如PNAs或吗啉代、寡或聚糖、半抗原。这样的测定可以是例如以本领域技术人员公知形式的免疫测定或其它定量的PCR测定，后者同样以本领域技术人员公知的形式(例如Molecular Beacon-，Taqman-，Dual Hybridization-或Scorpions-Format)。其中通过纳米颗粒和混浊度引起的结块或吸收、光散射或荧光强度或波长的改变而识别目标分子的测定形式也可以使用本发明的纳米颗粒实施。在这里纳米颗粒可以经由一个光子或多个光子过程激发。
还可以使用本发明的纳米颗粒在分子和/或细胞生物学以及在医学诊断或治疗学中作为标记或标签。在这里，可以测量分析物的存在或缺少，着色细胞片段或者体内或体外监测由本发明的纳米颗粒标记的生物分子或生物活性分子。
另外，本发明的纳米颗粒也可以在聚合物中用作填料或者添加剂，特别地在有机或无机漆料或涂料体系中作为添加剂或者在油墨中作为添加剂。
本发明以下根据实施例更详细地说明，但并不限于所述实施例。
实施例
疏水性纳米颗粒化的悬浮体的制备
将1.9g疏水性CePO4:Tb纳米颗粒悬浮在19.0g的NMP(N-甲基吡咯烷酮)中。该悬浮体在玻璃烧瓶中由磁性搅拌子和回流冷凝器在搅拌下加热至200℃达2h。产生褐色透明的纳米颗粒悬浮体(20.9g 9.1％浓度的悬浮体)。对于该NMP/纳米颗粒悬浮体通过分析超离心(AUC)测得5.4nm(d50值)的中值粒径分布。通过添加NMP产生用于以下聚合物包封的1％浓度悬浮体。
由聚丙烯酸钠盐(PASNa)包封疏水性悬浮体
在50ml Falcon管(由PP制成，带有螺旋瓶盖)中将10.0ml 1％浓度、疏水性NMP纳米颗粒悬浮体与10.0ml乙二醇(EG)相混合。向其中添加20.0g PASNa/EG混合物(10.0g的1％浓度PASNa溶液，MW：8000D，Aldrich和10.0g EG)。该纳米颗粒悬浮体通过翻滚所述Falcon管过夜混合。反应混合物通过超滤(UF)在大约3巴下于50ml微孔(Millipore)搅拌池中由截留值为100000 D的聚醚砜(PES)膜后处理。溶剂通过连续渗透与水交换，总渗透量为大约850ml。相应的浓缩物(渗余物(retentate))包含15ml的0.75％浓度的澄清无色纳米颗粒悬浮体，其具有以下性质：
·pH：7.0；
·粒径分布(由AUC确定)：d50：5.9nm；
·凝胶电泳(GEP)：在凝胶电泳(三乙酸盐EDTA缓冲液中的琼脂糖凝胶)中，PASNa包封的纳米颗粒迁移到阳极，而未包封的、不溶于水的起始产物不具有电泳迁移性。
·光谱研究：在280nm激发产生铽离子在487nm、542nm(主峰)、583nm和620nm处的光发射的典型荧光峰。这些发射峰的半衰期是1.35ms。
·对于盐负荷的稳定性：PASNa包封的纳米无机发光材料被证明对于盐浓度(Saltkonzentration)是很稳定的。在高达2000mmol/l NaCl和高达5mmol/l MgCl2的浓度下没有产生附聚。
·对于pH变化的稳定性：PASNa包封的纳米无机发光材料被证明对于pH4到至少pH9范围内的pH改变是很稳定的。
·温度稳定性：PASNa包封的纳米无机发光材料被证明对于高温是很稳定的。所述分散体能够维持在超过90℃多于6小时而没有发生粒径分布或光学性质的实质改变。
荧光素对PASNa包封的纳米无机发光材料的偶联
反应在15ml的Falcon管(PP)中进行。将1.5ml上述聚丙烯酸钠包封的纳米无机发光材料与70mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物，Aldrich)混合，由移液管溶于1.5ml的磷酸盐缓冲液(0.1m，pH：6.0)中。涡流处理之后，反应混合物在滚动台上在室温下翻滚30分钟，产生6.5的pH。向该反应混合物添加溶于7.5ml硼酸盐缓冲液(0.1m，pH：8.3)中的5mg氨基荧光素(Fluoresceinamin)(Fluka)。经涡流处理之后，反应混合物在黑暗中翻滚过夜，由此在黄色反应介质中得到8.3的pH。
后处理通过由水作为渗透剂进行超滤(PES膜100000D，大约3巴)。渗透350ml的体积之后，在最初的黄色渗透液后获得完全无色的渗透液。浓缩物(产物)是亮黄色透明的纳米颗粒悬浮体，其具有以下性质：
·体积：2.2ml
·纳米颗粒浓度：0.5重量％
·粒径分布(AUC)：d50：8.4nm；
·光谱研究(Jobin Yvon，Fluorolog FL3-22，带有磷光选项)：为此，将颗粒分散体稀释互0.002重量％的浓度并在280nm由氙闪光灯激发。能量转移首先通过CePO4:Tb纳米无机发光材料敏化的荧光素荧光测量。为此，在激发光脉冲之后的40μs延迟以后记录荧光光谱，以几乎完全除去直接激发染料的光发射或可能出现的背景荧光。出现铽离子在487nm、542nm(主峰)、583nm和620nm处的光发射的典型荧光峰，带有中心在523nm的宽的背景峰，这表示敏化的荧光素荧光。其次，通过在542nm波长、有和没有偶联荧光素下比较CePO4:Tb纳米无机发光材料的荧光寿命来测得能量转移。这导致寿命高达90％的减少。即使考虑到若干荧光素分子是偶联的，该结果也表明本发明所述体系的高FRET效率，这只有当纳米无机发光材料和染料之间距离明显地小于大约5nm的FRET临界距离(“Frster半径”)时才是可能的。
在对照实验中，添加荧光素分子而没有偶联至纳米无机发光材料，没有在523nm观察到时间延迟的荧光素发射。同样，半衰期与其中聚丙烯酸钠包封的纳米无机发光材料单独存在的测量相比较没有变化。
寡核苷酸对PASNa包封的纳米无机发光材料的偶联
向0.8ml实施例2中所述的纳米无机发光材料/PASNa颗粒悬浮体中添加溶于0.5m磷酸盐缓冲液(pH6.0)中的65mg EDC。其随后在室温(RT)下混合1h，这产生6.2的pH。
向由此活化的纳米无机发光材料添加1.9mg的溶于0.4ml硼酸盐缓冲液(0.2m，pH：9)中的下列NH-寡序列(Oligosequenz)(ThermoElectron，Ulm)：5’GGC AGC AAC GCG ACG CGC ACC-3’(5’氨基连接臂C6/MMT)。
在通过搅拌在室温培养4小时之后，该批料在4℃存储过夜并随后使用Vivaspin Zell(VivaScience公司，PES膜MWCO 50000D)由超滤的方式提纯。
最终产品(0.8ml)是1.2％浓度的澄清纳米颗粒悬浮体。
该最终产品稀释5倍并由6倍摩尔浓度的如下互补序列连同1.5mM的MgCl2培养：5’GGT GCG CGT CGC GTT GCT GCC 3’(3’TAMRA；TAMRA＝若丹明衍生物，Thermo Electron，Ulm)。纳米无机发光材料在542 nm波长下光发射的荧光寿命随后类似于实施例3测量。结果是寿命缩短70％，这是由从纳米无机发光材料到TAMRA染料的FRET所引起。
生物素向PASNa包封的纳米无机发光材料(HIE13024)的偶联
将24mg EDC溶于0.04ml的0.5m磷酸盐缓冲液(pH6.0)中并添加到0.09ml的PASNa包封的纳米无机发光材料(实施例2的产物)中。在室温培养1h之后，添加溶于0.05ml的0.2m硼酸盐缓冲液(pH9.2)中的3745mg生物素-(PEO)3-胺(Bioscience 00215)。在搅拌条件下反应6小时之后，该批料在4℃存储过夜并随后由超滤的方式提纯(VivaspinMWCO 50000 PES膜)。
通过如下检测生物素偶联：将pH为8的PBS缓冲液中的分散体稀释至800μg/l并将其添加至包含Strepatavidin包封的磁性聚合物珠粒的分散体(800μg/l)(Sera-MagStrepatavidin，Serva，Heidelberg)。随后使用永磁棒磁体吸引(abziehen)聚合物珠粒10分钟并测量上层清液的荧光。没有可见的荧光，而在添加聚合物珠粒前检测到纳米无机发光材料的显著荧光。该实验表明生物素对纳米无机发光材料好的偶联。
链霉抗生物素对PASNa包封的纳米无机发光材料的偶联
向0.3ml的6％浓度PASNa改性的纳米无机发光材料悬浮体(实施例2的产物)中添加溶于pH6.0的0.5m磷酸盐缓冲液中的40mg的EDC和30mg的SulfoNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)。在混合条件下于室温培育一小时。随后活化的纳米无机发光材料通过超滤(PES膜MWCO：100000D)的方式分离。获得的渗余物是稍微不透明的悬浮体，pH为5.7。
向1ml的该颗粒悬浮体中添加溶于pH9.2的0.2m硼酸盐缓冲液中的5.0 mg链霉抗生物素(Sigma S4762)。培养4小时并在4℃存储过在以后，最终产物通过超滤(PES膜MWCO 100000D)提纯，产生pH为8.3的1.3％浓度透明溶液作为渗余物。类似于实施例5中的检测的生物素结合(binding)，检测到链霉抗生物素结合，区别在于链霉抗生物素和生物素的位置发生了交换。
PASNa包封的纳米无机发光材料通过赖氨酸的交联
向5ml实施例2中所述的PASNa包封的纳米无机发光材料(1.1％浓度的悬浮体)中，添加溶于5ml的0.1m磷酸盐缓冲液(pH6.0)中的170mg EDC。在滚动台上进行混合的条件下在室温培养该批料30分钟。
随后添加溶于2.5ml的0.2m硼酸盐缓冲液(pH9.0)中的4.34mg L赖氨酸。
在室温下培育24h以后，将该批料在4℃存储过夜并随后通过起滤(PES膜100000 MWCO)的方式提纯。
经由红外光谱分析基于酰氨基检测到颗粒内交联。

Claims (10)

1.无机纳米颗粒，其中值粒径为1nm-500nm，并具有包括至少一种聚合物的亲水性表面涂层，该纳米颗粒是发光的、磁性的或者散射或吸收电磁辐射，特别是通过细胞质基因组共振激发增强的方式散射或吸收，其特征在于，所述表面涂层具有0.5nm-7nm的低厚度。
2.根据权利要求1所述的具有亲水性表面的无机纳米颗粒，其特征在于，该无机纳米颗粒的晶格掺杂有外来离子。
3.根据权利要求1或2所述的具有亲水性表面的无机纳米颗粒，其特征在于，该无机纳米颗粒具有用于荧光共振能量转移的给体或受体性质。
4.根据权利要求1-3任何一项所述的具有亲水性表面的无机纳米颗粒，其特征在于，壳中含有的聚合物涉及聚丙烯酸类或聚甲基丙烯酸类和/或它们的盐或共聚物的至少之一。
5.根据权利要求1-4中任何一项所述的具有亲水性表面的无机纳米颗粒，其特征在于，至少一种官能性分子或生物分子经化学或物理反应连接至亲水性表面壳。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的具有亲水性表面的无机纳米颗粒，其特征在于，所述亲水性表面壳通过化学或物理反应而交联。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的具有亲水性表面的无机纳米颗粒的制备方法，其特征在于，疏水性纳米颗粒在至少一种高沸点的可与水混溶溶剂中加热并与在相同的溶剂或至少一种其它可与水混溶的溶剂中的至少一种亲水性聚合物的溶液反应。
8.权利要求1-6中任何一项所述的具有亲水性表面的无机纳米颗粒在多相或均相生物测定、特别是免疫测定中的用途，以用于定性的或定量的生物分子检测，特别是定量的PCR。
9.权利要求1-6中任何一项所述的具有亲水性表面的无机纳米颗粒的用途，其在分子和/或细胞生物学中、在医学诊断或治疗中用作标记或标签。
10.权利要求1-6中任何一项所述的具有亲水性表面的无机纳米颗粒的用途，其在聚合物中用作填料或添加剂，在有机或无机漆料或涂料体系中用作添加剂，和/或在油墨中用作添加剂。
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