EP1893720A1 - Hydrophile nanoteilchen mit funktionellen oberflächengruppen, deren herstellung und verwendung - Google Patents

Hydrophile nanoteilchen mit funktionellen oberflächengruppen, deren herstellung und verwendung

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EP1893720A1
EP1893720A1 EP06743079A EP06743079A EP1893720A1 EP 1893720 A1 EP1893720 A1 EP 1893720A1 EP 06743079 A EP06743079 A EP 06743079A EP 06743079 A EP06743079 A EP 06743079A EP 1893720 A1 EP1893720 A1 EP 1893720A1
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EP
European Patent Office
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nanoparticles
hydrophilic surface
surface according
inorganic nanoparticles
inorganic
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06743079A
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French (fr)
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Werner Hoheisel
Karlheinz Hildenbrand
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Bayer Intellectual Property GmbH
Original Assignee
Bayer Technology Services GmbH
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Publication date
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    • C08K9/00—Use of pretreated ingredients
    • C08K9/04—Ingredients treated with organic substances

Definitions

  • Hydrophilic nanoparticles with functional surface groups their preparation and use
  • the present invention relates to nanoparticles with a hydrophilic surface coating and to processes for their preparation and their use in biological, molecular biological, biochemical and medical applications.
  • nanoparticles which have a hydrophilic surface in order to be used in biological environments, i. to disperse in an aqueous medium.
  • the nanoparticles should be monoparticulate or monodisperse, i. are not agglomerated, on the one hand to prevent unwanted sedimentation and / or on the other hand, the dynamics or kinetics of biochemical or biomolecular processes or movements as little as possible to influence.
  • the nanoparticles should ideally have functional, reactive chemical groups that allow coupling of functional molecules.
  • Functional molecules can e.g. biological macromolecules such as e.g. Oligonucleotides (e.g., DNA or RNA) or polyeptides (e.g., proteins or antibodies), biological coupling molecules such as e.g. Biotin or streptavidin, or other organic molecules.
  • biological macromolecules such as e.g. Oligonucleotides (e.g., DNA or RNA) or polyeptides (e.g., proteins or antibodies), biological coupling molecules such as e.g. Biotin or streptavidin, or other organic molecules.
  • fluorescent, inorganic nanoparticles are semiconductor nanoparticles consisting of II-VI or m-V semiconductors, which usually have a core-shell structure.
  • U.S. 6,322,901, U.S. Pat. No. 6,576,291 and U. S.: 6,423,551 describe these particles whose inorganic core is less than 10 nm in size and are also known by the name "quantum dots.” Due to their production, they often have an organic shell consisting of trioctylphosphine.
  • Another class of fluorescent, inorganic nanoparticles are phosphorescent nanoparticles composed of nonconductive materials doped with rare earth and / or subgroup-type ions.
  • nanophosphors WO 04/046035 A1, WO 02/020695 A1, K. Koempe; H. Borchert; J. Storz; A. Arun; S. Adam; T. Moeller; M. Haase; Angewandte Chemie, International Edition (2003), 42 (44), 5513-5516) so-called down-converting nanophosphors are described in which the emission wavelength is greater than that of the excitation, and in S. Heer; O. Lehmann; M. Haase; H. Guedel; Angewandte Chemie, International Edition (2003), 42 (27), 3179-3182 so-called up-converting phosphors, where the emission wavelength is smaller than that of the excitation.
  • WO 01/86299 A1 also describe the use of such nanophosphors as biolabels.
  • WO 02/020695 A1 describes nanophores of CePO 4 : Tb and their preparation in, for example, tris-ethylhexyl phosphate (TEHP) to give particles containing surface-adherent TEHP.
  • Tributyl phosphate or other hydrophobic derivatives of the phosphates can be used instead of the TEHP. While nanoparticles prepared in this way are not dispersible in water, they can be dispersed in organic solvents, ie converted into monoparticulate suspensions.
  • hydrophilic surface of the nanophosphors is an indispensable prerequisite.
  • Hydrophilization of nanoparticles having a hydrophobic surface is known in principle as described in WO 02/055186 (Quantum Dot Corp.).
  • amphiphilic dispersants which are prepared for example by partial reaction of polyacrylic acid with octylamine.
  • the hydrophobic octylamide side chains interact with the hydrophobic surface of the nanoparticles, while the free acrylic acid groups of the amphiphilic dispersant are oriented toward the aqueous phase. Oriented in this way, further molecules, for example proteins or other biological macromolecules, can be bound to the acrylic acid residues via covalent bonds.
  • the amphiphilic dispersant serves as a link.
  • a disadvantage of this process is the relatively complicated preparation of the hydrophobized polyacrylic acid derivatives used as amphiphilic dispersants in reproducible quality and the relatively large space required by the hydrophobic interaction of the hydrophobic surface of the nanoparticles with the octylamide groups of the amphiphilic polymeric dispersant.
  • Such modified nanoparticles have, compared to the unmodified primary particles, even in the case of a monoparticulate dispersion, a greatly increased average particle size.
  • This increase in volume is disadvantageous for various biological applications in which, for example, the labeled molecules are to penetrate biomembranes (eg cell wall) or diffuse through channel proteins. It is particularly disadvantageous for use in homo-. Assays in which a (fluorescence) resonant energy transfer, (F) RET, plays a role for a spatially close (F) RET partner for optical evaluation.
  • the task of providing inorganic nanoparticles with a hydrophilic surface, without the average particle diameter increases greatly, preferably having reactive functional chemical groups, and thus allow a coupling of functional molecules and for biological, molecular biological, biochemical and medical eg for diagnostic and therapeutic applications, in particular in homogeneous biological assays based on resonant energy transfer processes, can be used, and are inexpensive and easy to manufacture.
  • the nanoparticles according to the invention are nanoparticles which have an average particle size of from 1 nm to 500 nm, preferably 1 nm to 100 nm, particularly preferably 1 nm to, of inorganic, luminescent or magnetic or electromagnetic radiation scattering or absorbing, in particular enhanced by the excitation of a plasmon resonance 40 nm, very particularly preferably 1 to below 20 nm.
  • the nanoparticles according to the invention are provided with a hydrophilic surface coating containing at least one polymer and characterized in that the surface coating has a small thickness of 0.5 nm to 7 nm, preferably 0.5 to 4 nm, more preferably 0.5 to 2 nm.
  • nanoparticles of the invention modified with the inventive polymers are significantly lower than that obtainable via the "hydrophobic coating process" mentioned in WO 02/055186, which is advantageous for many applications
  • Nanoparticles act as a partner for (fluorescence) resonant energy transfer, and / or those in which the nanoparticles are subjected to transport processes.
  • the nanoparticles according to the invention have, in addition to their thin shell, the additional advantage of exhibiting high stability against temperature, salt and pH influences ,
  • Materials suitable for the purposes of the invention for the nanoparticles are those which contain inorganic nuclei whose crystal lattice (host material) is doped with foreign ions.
  • These include, in particular, all materials and classes of materials that are used as so-called phosphors, for example in fluorescent screens (eg for cathode ray tubes) or as coating material in fluorescent lamps (for gas discharge lamps), as used, for example, in Ulimann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, 7 " 1 edition, 2004 Electronic Release, Chapter”
  • Luminescent Materials 1. Inorganic Phosphors ".
  • the off-converting phosphors which emit lower-energy light than they absorb, it is also possible to use on-converting phosphors, which emit higher-energy light than they absorb.
  • the foreign ions serve as activators for the emission of fluorescent light upon excitation by UV, visible or IR light, X-rays or gamma rays or electron beams.
  • several species of foreign ions are also incorporated into the host lattice to produce activators for emission and to make the excitation of the particle system more efficient or to adjust the absorption wavelength by displacement to the wavelength of a given excitation light source (so-called sensitizers).
  • sensitizers the incorporation of several types of foreign ions can also serve to selectively target a particular combination of fluorescent bands to be emitted from a nanoparticle.
  • Materials suitable for the purposes of the invention for the nanoparticles are also those which have a layered structure (core-shell structure with one or more shells) of suitable materials.
  • foreign ions are incorporated in the host lattice in at least one part, core or at least one shell.
  • the host material of the nanoparticles on which the nanoparticles according to the invention are based preferably consists of compounds of the XY type.
  • X is a cation of elements of the main groups Ia, 2a, 3a, 4a of the subgroups 2b, 3b, 4b, 5b, 6b, 7b or the lanthanides of the Periodic Table. In some cases, X may also be a combination or mixture of the named elements.
  • Y may be a polyatomic anion containing one or more element (s) of main groups 3a, 4a, 5a, subgroups 3b, 4b, 5b, 6b, 7b and / or 8b and elements of main groups 6a and / or 7a.
  • Y can also be a monatomic anion from main group 5a, 6a or 7a of the periodic table.
  • the host material of the nanoparticles according to the invention based lad nanoparticles can also consist of an element of the main group 4a of the periodic table.
  • elements of the main groups Ia, 2a or from the group comprising Al, Cr, Tl, Mn, Ag, Cu, As, Nb, Nd, Ni, Ti, In, Sb, Ga, Si, Pb, Bi, Zn, Co and / or elements of the lanthanides serve.
  • combinations of two or more of these elements may serve as doping material in different relative concentrations to each other.
  • the concentration of the doping material in the host lattice is between 10 "5 mol% and 50 mol%, preferably between 0.01 mol% and 30 mol%, particularly preferably between 0.1 mol% and 20 mol%.
  • the Doping material is chosen so that the decay time of the fluorescence induced by it is long (> 100 ns).
  • sulfides Preference is given to sulfides, selenides, sulfoselenides, oxysulfides, borates, aluminates, gallates, silicates, germanates, phosphates, halophosphates, oxides, arsenates, vanadates, niobates, tantalates, sulfates, tungstates, Molybdate, alkali halides, fluorides and other halides or nitrides as host materials used for the nanoparticles.
  • LiLEu; NaIrTl; CsLTl; CsLNa; LiF: Mg; LiF: Mg, Ti; LiF: Mg, Na; KMgF 3 : Mn; Al 2 O 3 : Eu; BaFChEu; BaFChSm; BaFBnEu; BaFCIo 15 Br 0 ⁇ Sm; BaY 2 F 8 : A (A Pr, Tm, Er, Ce); BaSi 2 O 5 : Pb;
  • MgAl 1 1 O 19 ICe 3 Tb; MgF2: Mn; MgS: Eu; MgS: Ce; MgS: Sm; MgS: (Sm, Ce); (Mg, Ca) S: Eu;
  • MgSiO 3 Mn; 3.5MgO 0.5MgF 2 GeO 2 : Mn; MgW04: Sm; MgWO4: Pb; 6MgO As 2 O 5 : Mn; (Zn, Mg) F2: Mn; (Zn4Be) SO4: Mn; Zn 2 SiO 4: Mn; Zn2Si ⁇ 4: Mn, As; ZnOrZn; ZnO: Zn, Si, Ga;
  • LiSrAlF 6 Ce
  • La x Ce y Tb 2 PO 4 (x + y + z 1); La x EUi
  • those having a cubic lattice structure of the host lattice are particularly selected, since the number of individual fluorescent bands becomes minimal in these materials.
  • Materials suitable for the purposes of the invention for the nanoparticles are also those which consist of non-doped, semiconducting materials. These preferably include those of the 4th main group (e.g., Si) and binary compounds AB in which A is a 2nd subgroup element and B is an element of the 6th main group of the Periodic Table (e.g., ZnS, CdS, or CdSe). These also preferably include those binary compounds AB in which A is an element of the 3rd main group and B is an element of the 5th main group of the Periodic Table (for example InAs, InP, GaAs, GaP or GaN).
  • the 4th main group e.g., Si
  • binary compounds AB in which A is a 2nd subgroup element and B is an element of the 6th main group of the Periodic Table e.g., ZnS, CdS, or CdSe
  • the size of the inorganic nanocorner suitable for the nanoparticles according to the invention is in the range between 1 nm and 500 nm, preferably between 1 nm and 100 nm and particularly preferably between 1 nm and 40 nm, very particularly preferably between 1 and below 20 nm.
  • FRET fluorescence resonant energy transfer or Förster transfer
  • hydrophilic polymers which are contained in the coating of the nanoparticles according to the invention are preferably hydrophilic linear or branched homopolymers or copolymers having functional groups such as amino, carboxyl or their salts, hydroxyl, thiol, Acid anhydride, acid chloride and / or isocyanate groups, which allow a covalent or adsorptive, such as electrostatic or ionic bond with the functional groups of biomolecules to be coupled.
  • the functional, possibly also adsorptive, groups of the corresponding polymers may be in the repeating unit, such as, for example, polyacids, poly-acid anhydrides, polyalcohols, polythiols or polyamines or polyheterocycles, as in the case of polyacrylic acid and / or salts thereof, polymethacrylic acid and / or or their salts, poly (meth) acrylamides, polymaleic acid and / or salts thereof, polyaspartic acid and / or salts thereof, polymaleic anhydrides, polyethyleneimines, polyhydroxyethyimethacrylates (PHEMA), polydimethylaminoethyl methacrylates and / or its salts, polyvinylpyrrolidones, the polyvinyl alcohols, Polyvinalyacetals or polyvinyl ethers or polyethers.
  • polyacids such as, for example, polyacids, poly-acid anhydrides, polyalcohols, poly
  • Suitable aminic polymers are, for example, polyallylamine, polyvinylamine, linear or branched polyethyleneimines, polylysine, polymers containing chitosamines and also polydiallyldimethylammonium chloride and / or polyvinylpyridine or their acid adducts as homopolymers or copolymers
  • All named polymers can be used for the preparation of the nanoparticles according to the invention as homopolymers or else as copolymers with one another and with further monomers. Also conceivable are copolymers of acrylic acid with vinylpyrrolidone, maleic anhydride with methyl vinyl ether, vinylpyrrolidone with dimethylaminoethyl methacrylate, vinylimidazole with vinylpyrrolidone and methacrylic acid with vinylpyrrolidone.
  • polystyrene resin e.g., polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrenethacrylate, polystyrene resin, polystyrene resin, polystyrene resin,
  • polymers having functional groups in the repeat unit particularly preferably the polyacids, and very particularly preferably polyacrylic acids or polymethacrylic acids and / or salts thereof.
  • reactive polymers such as polymaleic anhydrides or polysuccinimides, which in the course of further processing react to form the abovementioned polyelectrolytes, namely polyacrylic acid or polyaspartic acid.
  • the nanoparticles of the invention whose shell polymethacrylic acid, polyaspartic acid (PASP), polymaleic acid, copolymers containing, for example, of acrylic acid.
  • PASP polyaspartic acid
  • copolymers containing, for example, of acrylic acid are offered, and / or salts thereof, preferably their sodium salts.
  • the molecular weight of the "cladding polymer” can be variable, preferably it is at a M w from 1000 to 100,000 gmol '1, preferably from 1000 to 25,000 gmol' 1, more preferably from 5000 to 12,000 gmol "1, and most preferably between 7000 and
  • the hydrophilic surface shell of the nanoparticles according to the invention may also have certain properties required for the particular application which complement those of the inorganic nanocarbons, e.g. fluorescent, electromagnetic radiation scattering or absorbing, magnetic (caused by atomic nuclei or electron shells) or others, depending on their purpose. They can also be used as partners in resonant energy transfer processes (forest transfer).
  • nanoparticles according to the invention which contain CePO.sub.Tb as inorganic nanocore and have a hydrophilic surface coating containing the sodium salt of polyacrylic acid.
  • These are characterized by a high stability against relatively high electrolyte concentrations. For example, even in 2 molar NaCl solutions, sufficient suspension stability could still be observed.
  • monovalent ions should not exceed concentrations of one mole and for polyvalent ions, such as MgCl 2, 0.5 moles.
  • the nanoparticle suspensions of the invention are characterized by a high temperature stability.
  • a CePO 4 : Tb nanoparticle suspension coated with polyacrylic acid Na salt could be treated with boiling water for half a day without losing the suspension stability.
  • the nanoparticle suspensions according to the invention may preferably be treated once or several times for 3 to 5 hours at 95 ° C. without appreciable drops in hot water. This fulfills the general conditions for, for example, qPCR detection methods.
  • laser light scattering or preferably the use of analytical ultracentrifugation (AUC) is suitable.
  • the AUC is known to the person skilled in the art, as described, for example, in Colloid & Polymer Science 267: 1113-1116 by HG Müller.
  • gel electrophoresis For determining the surface charge, gel electrophoresis has proven its worth, the bases of which are described, for example, by R. Westermeier “Electrophoresis in Practice” Wiley-VCH.
  • Zeta potential determination for example, Hiemenz and Rajagopalan, Principles of Colloid and Surface Chemistry, 3rd edition New York: Dekker 1997 describes used.
  • the layer thickness of the polymer shell can be determined, which is 0.5 nm to 7 nm, preferably 0.5 to 4 nm, particularly preferably 0.5 to 2 nm.
  • the layer thickness of the polymer shell can be observed directly when using the transmission electron microscopy, but this can give only a first clue because of the known in the art problems of typical for the transmission electron microscopy preparation artifacts.
  • ESCA With the help of ESCA, it is possible to check whether signals of the inorganic core of the coated nanoparticle can still be detected, which indicates layer thicknesses below about 5 nm.
  • the polymer shell In the TGA, the polymer shell can be thermally desorbed from the nanoparticles and their absolute and relative to the nanoparticles relative mass can be determined. With knowledge of the size of the inorganic portion of the nanoparticle, which can be determined by transmission electron microscopy, its density and the density of the polymer can thus be calculated, the average polymer shell.
  • CePO 4 Tb nanoparticles having an inorganic particle size of 7 nm and a density of 5.2 g / cm, which are coated with a layer of polyacrylic acid having a density of 1.1 g / cm 3 in such a way in that a relative weight loss of 20% occurs with a TGA, the shell thickness is 1.0 nm.
  • the invention is a process for preparing the nanoparticles according to the invention.
  • Many types of nanoparticles have a hydrophobic surface due to their production, for example due to their synthesis in hydrophobic solvents.
  • the inventive method for the preparation of monodisperse, aqueous dispersions, starting from hydrophobic nanoparticle agglomerates involves at least partial dealkylation of the hydrophobic starting products by annealing in high-boiling, water-miscible solvents and closing enclosure with hydrophilic polymers by reacting the nanoparticles annealed as described with suitable polymers, which preferably have functional, reactive groups, in water-miscible solvents optionally using solubilizers.
  • hydrophilic polymeric dispersants for the hydrophobic nanoparticles to be hydrophilized, the latter must be completely or at least partially dehydrophobized.
  • TEHP tris-ethylhexyl phosphate
  • tributyl phosphate by simple tempering in at least one high-boiling, preferably water-miscible, solvent such as N-methylpyrrolidone (NMP ), Dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMAc), dimethyl sulfoxide (DMSO) triethyl phosphate or diethyl phosphite, or in mixtures of these solvents, preferably in pure NMP can be achieved.
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • DMF Dimethylformamide
  • DMAc dimethylacetamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Dehydrophobicization done by several hours, preferably 2 to 3 -stailedes heating to boiling point in close, preferably at 180 to 250 0 C, particularly preferably to 200 0 C.
  • the polymer sheath following the dehydrophobization can, in principle, be carried out in any desired, preferably in the same solvent (dehydrophobicating solvent).
  • solubilizers such as ethylene glycol, glycerol or low molecular weight oligoethylene glycols or their monomethyl ethers, preferably low molecular weight ethylene glycols, most preferably ethylene glycol in some weight percentages up to equal amounts.
  • solubilizers such as ethylene glycol, glycerol or low molecular weight oligoethylene glycols or their monomethyl ethers, preferably low molecular weight ethylene glycols, most preferably ethylene glycol in some weight percentages up to equal amounts.
  • a particularly preferred solvent system consists, as described in Ex. 2, of equal proportions by weight of NMP and ethylene glycol.
  • the polymer coating can be done by stirring for several hours or rolling at RT.
  • the dehydrophobizing solution is mixed with about equal amounts of ethylene glycol and an approximately 1% aqueous solution of the polymer to be coated, and preferably stirred overnight, or continuously moved on a roll bar.
  • an object of the process according to the invention is the work-up of the reaction products.
  • the separation of the coated nanoparticles from their by-products can be carried out by ultracentrifugation or a membrane process, preferably ultrafiltration (UF).
  • UF ultrafiltration
  • Tb nanoparticles prepared here membranes of polyethersulfone with an exclusion limit of 100 000 D. In this case, the nanoparticles are retained, while the excess by-products such as polymers or organic solvents permeate.
  • the appropriate size of the membrane exclusion limit can vary and depends on the size of the nanoparticles to be coated and the molecular weight of the polymer used. However, it can be easily limited by those skilled in the art.
  • chemical reactions such as, for example, coupling of functional molecules to the hydrophilic surface coating, and / or derivatives of the nanoparticles of the invention which are accessible to physical processes and / or in the surface coating.
  • the hydrophilic surface coating of the nanoparticles of the invention e.g. on CePO4: Tb
  • dyes such as fluorescein or rhodamine (eg Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany), Bodipy, Alexa 546 (Molecular Probes, Eugene, USA), Cy3 (Amersham Bioscience, General Electric HealthCare), Atto 532, Atto 550 (Atto-Tec GmbH, Siegen, Germany) or other known to the expert fluorescent dyes.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • ideally such dyes are used which, when used as acceptors, have the greatest possible overlap between absorption cross section of the dye and the emission bands of the nanoparticle used as emitter.
  • molecules that are acceptors that quench the fluorescence of the donor without self-fluorescing are also useful as acceptors.
  • Black Hole Quencher BHQ-I (BIOSEARCH Technologies, Novato, USA).
  • extinguishing molecules are used which have the greatest possible overlap between the absorption cross section of the quenching molecule and the emission bands of the nanoparticle, which is used as an emitter.
  • the wavelength of at least one emission maximum of the fluorescent bands of the nanoparticle be in the range of the major absorption of the dye, the wavelength limits of the main absorption being defined by the 37% value of the absorption maximum.
  • the nanoparticles act as acceptors and the dyes as donors.
  • the information on the position of the absorption and emission bands is analogous to the above.
  • the energy transfer can be measured once by the nanoparticle sensitized fluorescence of the dye.
  • the nanoparticle is excited with a flash lamp that realizes a flash duration of a few microseconds or shorter, while the emission spectrum is measured after a delay time after which the excitation light pulse has decayed.
  • the length of the delay time depends essentially on the lighting duration of the excitation flash lamp and is i.a. 20 - 50 microseconds.
  • the energy transfer can be determined by comparing the fluorescence lifetime of the inorganic nanocores with and without coupled dye. From the ratio of the lifetime and taking into account the finite size of the nanoparticles (and thus taking into account the spatial distribution of the emitter ions) the skilled person can easily determine the efficiency of the energy transfer and thus close to the thickness of the polymer layer to the nanoparticles.
  • a functional molecule such as a general organic molecule or biological macromolecules such as e.g. Antibodies or other proteins, peptides, enzymes, oligonucleotides or other nucleic acid molecules or nucleic acid-like molecules, such as PNAs or morpholinos, oligo- or polysaccharides, haptens such as biotin or digoxin or low molecular weight synthetic or natural antigens or epitopes or coupling molecules such as avidin, streptavidin or Neutravidin available nanoparticles.
  • a general organic molecule or biological macromolecules such as e.g. Antibodies or other proteins, peptides, enzymes, oligonucleotides or other nucleic acid molecules or nucleic acid-like molecules, such as PNAs or morpholinos, oligo- or polysaccharides, haptens such as biotin or digoxin or low molecular weight synthetic or natural antigens or epitopes or
  • Physical processes in the hydrophilic surface coating may be couplings of suitable ions via complex formation, such as e.g. paramagnetic ions (e.g., iron) that allow for further analytical techniques. But also a physical crosslinking by intramolecular complex formation and thus stabilization of the hydrophilic polymers containing surface cladding is possible.
  • suitable ions such as paramagnetic ions (e.g., iron) that allow for further analytical techniques.
  • paramagnetic ions e.g., iron
  • the functional groups of the enveloping polymers can be crosslinked with bi- or higher functional low molecular weight molecules, e.g. With di-, tri-, tetra-, penta- or polyfunctional reagents such as lysine, ethylene diamine diacetate (EDDA).
  • EDDA ethylene diamine diacetate
  • the polyacrylate shell polymer located on the inorganic nanocores was cross-linked by reaction with lysine, a difunctional reagent (Example 7) ).
  • Interparticle crosslinking may also occur to a limited extent, which is observed on the basis of larger average particle diameters in comparison to those of the starting materials.
  • lysine crosslinked, fluorescein-modified CePO 4 : Tb nanoparticles with sodium polyacrylate in the hydrophilic surface cladding show particularly strong donor and acceptor properties for fluorescence resonant energy transfer (FRET).
  • the nanoparticles according to the invention and / or their derivatives as biolabels in heterogeneous or homogeneous biological assays, for example the presence of biological macromolecules to be detected, such as antibodies or other proteins, peptides, oligonucleotides or other nucleic acid molecules or nucleic acid-like molecules such as PNAs or morpholinos, oligo- or polysaccharides, haptens qualitatively and / or quantitatively.
  • Such assays may be, for example, immunoassays in the formats known to the person skilled in the art or else quantitative PCR assays may also be in the formats known to the person skilled in the art (eg molecular beacon, Taqman, Dual Hybridization or Scorpions format).
  • assay formats in which the recognition of the target molecule by an induced agglomeration of the nanoparticles and an associated turbidity or change in the intensity or wavelength of the absorption, the light scattering or the fluorescent light can be realized with the nanoparticles according to the invention. The excitation of the nanoparticles can take place via a single or multiphoton process.
  • the nanoparticles of the invention are markers or labels in molecular and / or cell biology or in medical diagnostics or therapeutics.
  • the presence or absence of an analyte can be measured, cell sections can be stained, or biological molecules or biologically active molecules labeled with the nanoparticles according to the invention can be monitored in vivo or in vitro.
  • nanoparticles according to the invention can also find use as fillers or additives in polymers, in particular as an additive in organic or inorganic paint or coating systems, or as additives in inks.
  • the solvent was exchanged by continuous permeation with water, whereby a total permeate volume of about 850 ml was achieved.
  • the corresponding concentrate (retentate) consisted of 15 ml of a 0.75% clear, colorless nanoparticulate suspension having the following properties:
  • GEP Gel electrophoresis
  • the reaction was carried out in a 15 ml Falcon tube (PP). To 1.5 ml of the above-mentioned polyacrylic acid-Na-coated nanophosphors was added 70 mg of EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, Aldrich) dissolved in 1.5 ml of phosphate buffer (0.1M, pH : 6.0). After vortexing, the reaction mixture was rolled on the roll-bench for 30 min at room temperature to give a pH of 6.5. To this reaction mixture was added 5 mg fluoresceinamine (Fluka) dissolved in 7.5 ml borate buffer (0.1 M, pH 8.3). After vortexing, the reaction mixture was rolled overnight with exclusion of light, with a pH of 8.3 in the yellow reaction medium.
  • EDC EDC
  • phosphate buffer 0.1M, pH : 6.0
  • the workup was carried out by ultrafiltration (PES membrane 100 000D, about 3 bar) with water as a permeant. After a permeation volume of 350 ml, after an initially yellow, an absolutely colorless permeate was obtained.
  • the concentrate (product) was a bright yellow, transparent nanoparticulate suspension with the following properties:
  • Nanoparticles concentration 0.5% by weight
  • the energy transfer was determined by comparing the fluorescence lifetime of the CePO ⁇ Tb nanophosphors at a wavelength of 542 nm with and without coupled fluorescecene. It resulted in a reduction of the lifetime by up to 90%. Taking into account that several fluorescein molecules were coupled, this result shows the high FRET efficiency of the system presented here, which is only possible if the distance between nanophosphorus and dye is significantly smaller than the critical distance for a FRET ("Förster"). Radius "), which is about 5 nm.
  • the final product (0.8 ml) was a 1.2% clear nanoparticulate suspension
  • the dispersion was diluted in PBS buffer at pH 8 to 800 ⁇ g / l and added to a dispersion (800 ⁇ g / l) with strepatavidin-coated magnetic polymer beads (Sera-Mag® Strepatavidin, Serva, Heidelberg). Subsequently, the polymer beads were 10 min. withdrawn with a permanent bar magnet and measured the fluorescence of the supernatant. There was no fluorescence, whereas prior to the addition of the polymer beads a clear fluorescence of the nanophosphors was detectable. This experiment demonstrates the good coupling of the biotin to the nanophosphors.
  • streptavidin Sigma S4762
  • streptavidin Sigma S4762
  • 0.2 M borate buffer pH 9.2.
  • PES MWCO 100,000 D membrane The detection of streptavidin binding is analogous to the detection of biotin binding in Example 5, except that the position of streptavidin and biotin was reversed.
  • Nanophosohore (1.1% suspension) coated in PASNa described in Example 2 were added 170 mg of EDC dissolved in 5 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 6.0. While mixing on a roll bar, the batch was incubated for 30 minutes at RT.
  • the intraparticle cross-linking could be detected by IR spectroscopy using the amide groups.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberflächenbeschichtung sowie Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung in biologischen, molekularbiologischen, biochemischen und medizinischen Anwendungen.

Description

Hydrophile Nanoteilchen mit funktionellen Oberflächengruppen, deren Herstellung und Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberflächenbeschichtung sowie Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung in biologischen, molekular- biologischen, biochemischen und medizinischen Anwendungen.
Der Einsatz von Nanoteilchen in der in vivo oder in vitro Diagnostik, in der Therapie, in der Embryologie und allgemein in vielen molekularbiologischen oder biochemischen Anwendungen sowie auch in der Wirkstofffindung gewinnt seit einigen Jahren eine immer größere Bedeutung. Hierzu sind in den meisten Anwendungen Nanoteilchen notwendig, die eine hydrophile Oberfläche besitzen, um sie in biologischen Umgebungen, d.h. in wässrigem Milieu zu dispergieren. Idealerweise sollten die Nanoteilchen monopartikulär bzw. monodispers, d.h. nicht agglomeriert vorliegen, um einerseits ungewollte Sedimentation zu verhindern und/oder um andererseits die Dynamik oder Kinetik von biochemischen oder biomolekularen Vorgängen oder Bewegungsabläufen so wenig wie möglich zu beeinflussen. Weiterhin sollten die Nanoteilchen idealerweise funktionelle, reaktive chemische Gruppen aufweisen, die eine Ankopplung von funktionellen Molekülen erlauben. Funktionelle Moleküle können z.B. biologische Makromoleküle wie z.B. Oligonukleotide (z.B. DNA oder RNA) oder Polyeptide (z.B. Proteine oder Antikörper), biologische Kopplungsmoleküle wie z.B. Biotin oder Streptavidin, oder andere organische Moleküle sein.
Die Herstellung von fluoreszierenden, anorganischen Nanoteilchen erfolgt häufig in organischen Lösemitteln, wobei hydrophobe Endprodukte erhalten werden. Die am häufigsten verwendeten fluoreszierenden, anorganischen Nanoteilchen sind Halbleiter-Nanoteilchen bestehend aus II- VI- oder m-V-Halbleitern, die meist eine Kern-Hüllenstruktur aufweisen. U.S. 6,322,901, U.S. 6,576,291 und U.S: 6,423,551 beschreiben diese Teilchen, deren anorganischer Kern dabei eine Größe von unter 10 nm besitzt, und die auch unter der Bezeichnung „Quantum Dots" bekannt sind. Herstellungsbedingt besitzen sie häufig eine organische Hülle bestehend aus Trioctylphosphin.
Eine weitere Klasse von fluoreszierenden, anorganischen Nanoteilchen sind phosphoreszierende Nanoteilchen, die aus nichtleitendenden Materialien bestehen, und mit Ionen der Seltenen Erden und/oder der Nebengruppenelemente dotiert sind.
Diese werden auch als Nanophosphore bezeichnet, wobei in WO 04/046035 Al, WO 02/020695 Al, K. Koempe; H. Borchert; J. Storz; A. Arun; S. Adam; T. Moeller; M. Haase; Angewandte Chemie, International Edition (2003), 42(44), 5513-5516) so genannte down-converting Nanophosphore beschrieben sind, bei denen die Emissionswellenlänge größer als die der Anregung ist, und in S. Heer; O. Lehmann; M. Haase; H. Guedel; Angewandte Chemie, International Edition (2003), 42(27), 3179-3182 so genannte up-converting Phosphore, bei denen die Emissionswellenlänge kleiner als die der Anregung ist.
WO 01/86299 Al, WO 03/040024 Al beschreiben den Einsatz solcher Nanophosphore auch als Biolabel.
WO 02/020695 Al beschreibt Nanophosphore aus CePO4:Tb und ihre Herstellung in beispielsweise Tris-Ethylhexylphosphat (TEHP), wobei Teilchen erhalten werden, die an der Oberfläche anhaftendes TEHP enthalten. Anstelle des TEHP können auch Tributylphosphat oder andere hydrophobe Derivate der Phosphate verwendet werden. Während derartig hergestellte Nano- teilchen in Wasser nicht dispergierbar sind, können sie in organischen Lösemitteln dispergiert, d. h. in monopartikuläre Suspensionen überfuhrt werden.
Für die angestrebte Anwendung in biologischen Systemen ist jedoch eine hydrophile Oberfläche der Nanophosphore unabdingbare Voraussetzung. Die Hydrophilisierung von Nanoteilchen mit einer hydrophoben Oberfläche ist vom Prinzip her, wie in WO 02/055186 (Quantum Dot Corp.) beschrieben, bekannt. Dort erfolgt die Hydrophilisierung der hydrophoben Nanoteilchen mit Hilfe von amphiphilen Dispergatoren, die beispielsweise durch partielle Umsetzung von Polyacrylsäure mit Octylamin hergestellt werden.
In wässriger Phase kommt es zur Wechselwirkung der hydrophoben Octylamid Seitenketten mit der hydrophoben Oberfläche der Nanoteilchen, während die freien Acrylsäuregruppen des amphi- philen Dispergators zur wässrigen Phase hin orientiert sind. So ausgerichtet können an die Acryl- säurereste über kovalente Bindungen weitere Moleküle, beispielsweise Proteine oder andere biologische Makromoleküle, angebunden werden. Der amphiphile Dispergator dient hierbei als Bindeglied.
Nachteilig bei diesem Verfahren ist die relativ aufwändige Herstellung der als amphiphile Disper- gatoren genutzten hydrophobierten Polyacrylsäurederivate in reproduzierbarer Qualität sowie der relativ große Raumbedarf, der durch die hydrophobe Wechselwirkung der hydrophoben Oberfläche der Nanoteilchen mit den Octylamid-Gruppen des amphiphilen polymeren Dispergators zustande kommt. Derartig modifizierte Nanoteilchen haben, im Vergleich zu den nicht modifizierten Primärteilchen, auch im Falle einer monopartikulären Dispersion, eine stark erhöhte mittlere Teilchengröße. Diese Volumenerhöhung ist nachteilig für verschiedene biologische Applikationen, bei denen z.B. die markierten Moleküle Biomembranen (z.B. Zellwand) durchdringen oder durch Kanalproteine diffundieren sollen. Sie ist besonders nachteilig für den Einsatz in homo- . genen Assays, bei denen ein (Fluoreszenz) resonanter Energietransfer, (F)RET, zu einem räumlich in der Nähe liegenden (F)RET-Partner für die optische Auswertung eine Rolle spielt.
Es stellt sich damit, ausgehend vom benannten Stand der Technik, die Aufgabe, anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche bereitzustellen, ohne dass sich der mittlere Teilchendurchmesser stark vergrößert, die vorzugsweise reaktive, funktionelle chemische Gruppen aufweisen, und damit eine Ankopplung von funktionellen Molekülen erlauben und die für biologische, molekularbiologische, biochemische und medizinische so z.B. für diagnostische und therapeutische Anwendungen, insbesondere in homogenen biologischen Assays basierend auf reso- nanten Energietransfer-Prozessen, einsetzbar sind, und dabei kostengünstig und einfach herzustellen sind.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen gelöst. Die erfϊndungsgemäßen Nanoteilchen sind anorganische, lumineszierende oder magnetische oder elektromagnetische Strahlung streuende oder absorbierende, insbesondere durch die Anregung einer Plasmonenresonanz verstärkt streuende oder absorbierende Nanoteilchen mit einer mittlere Teilchengröße von 1 nm bis 500 nm, bevorzugt 1 nm bis 100 nm, besonders bevorzugt 1 nm bis 40 nm, ganz besonders bevorzugt 1 bis unter 20 nm. Die erfindungsgemäßen Nanoteilchen sind mit einer hydrophilen, mindestens ein Polymer enthaltenden Oberflächenbeschichtung ausgestattet und dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächenbeschichtung eine geringe Dicke von 0,5 nm bis 7 nm, bevorzugt 0,5 bis 4 nm, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 nm aufweist.
Ein entscheidender Unterschied dieser polymeren Dispergatoren im Vergleich zu denen, die in WO 02/055186 Al beschrieben werden, ist, dass sie keine hydrophoben Seitenketten besitzen, die über hydrophobe Wechselwirkungen die Nanophosphore umhüllen. Dadurch ist der mittlere Teilchendurchmesser der mit den erfϊndungsgemäßen Polymeren modifizierten erfindungsgemäßen Nanoteilchen im Vergleich zu denen über das in WO 02/055186 genannte „hydrophoben Umhüllungsverfahren" zugänglichen deutlich geringer, was für viele Anwendungen von Vorteil ist. Solche Anwendungen umfassen z.B. solche, bei denen die Nanoteilchen als Partner für (Fluoreszenz) resonanten Energietransfer agieren, und/oder solche, bei denen die Nanoteilchen Transportprozessen unterworfen sind. Die erfindungsgemäßen Nanoteilchen haben neben ihrer dünnen Hülle den zusätzlichen Vorteil, eine hohe Stabilität gegen Temperatur-, Salz- und pH- Einflüsse aufzuweisen.
Im Sinne der Erfindung geeignete Materialien für die Nanoteilchen sind solche, die anorganische Kerne enthalten, deren Kristallgitter (Wirtsmaterial) mit Fremdionen dotiert sind. Hierunter zählen insbesondere alle Materialien und Materialklassen, die als sogenannte Phosphore z.B. in Leuchtschirmen (z.B. für Elektronenstrahlröhren) oder als Beschichtungsmaterial in Fluoreszenzlampen (für Gasentladungslampen) Verwendung finden, wie sie zum Beispiel in Ulimann 's Encyclopedia of Industrial Chemistry, WILEY-VCH, 7"1 edition, 2004 Electronic Release, Kapitel „Luminescent Materials: 1. Inorganic Phosphors" genannt sind. Neben den ab-convertierenden Phosphoren, die energieärmeres Licht emittieren als sie absorbieren, können auch auf-convertierende Phosphore, die energiereicheres Licht emittieren als sie absorbieren, Verwendung finden. In allen diesen Materialien dienen die Fremdionen als Aktivatoren für die Emission von Fluoreszenzlicht nach Anregung durch UV-, sichtbares oder IR-Licht, Röntgen- oder Gammastrahlen oder Elektronenstrahlen. Bei einigen Materialien werden auch mehrere Sorten von Fremdionen in das Wirtsgitter eingebaut, um einerseits Aktivatoren für die Emission zu erzeugen und um andererseits die Anregung des Teilchensystems effizienter zu gestalten oder um die Absorptionswellenlänge durch Verschiebung an die Wellenlänge einer gegebenen Anregungslichtquelle anzupassen (sogenannte Sensitizer). Der Einbau mehrerer Sorten von Fremdionen kann auch dazu dienen, gezielt eine bestimmte Kombination von Fluoreszenzbanden, die von einem Nanoteilchen emittiert werden sollen, einzustellen.
Im Sinne der Erfindung geeignete Materialien für die Nanoteilchen sind auch solche, die einen geschichteten Aufbau (Kern-Hüllen-Struktur mit einer oder mehreren Hüllen) von geeigneten Materialien aufweisen. Dabei sind in mindestens einem Teil, Kern oder mindestens einer Hülle Fremdionen in das Wirtsgitter eingebaut. Das Wirtsmaterial der den erfindungsgemäßen Nanoteilchen zugrunde liegenden lad-Nanoteilchen besteht vorzugsweise aus Verbindungen des Typs XY. Dabei ist X ein Kation aus Elementen der Hauptgruppen Ia, 2a, 3a, 4a der Nebengruppen 2b, 3b, 4b, 5b, 6b, 7b oder der Lanthaniden des Periodensystems. In einigen Fällen kann X auch eine Kombination bzw. Mischung aus den genannten Elementen sein. Y kann ein mehratomiges Anion, enthaltend ein oder mehrere Element(e) der Hauptgruppen 3a, 4a, 5a, der Nebengruppen 3b, 4b, 5b, 6b, 7b und/oder 8b sowie Elemente der Hauptgruppen 6a und/oder 7a, sein. Y kann aber auch ein einatomiges Anion aus der Hauptgruppe 5a, 6a oder 7a des Periodensystems sein. Das Wirtsmaterial der den erfindungsgemäßen Nanoteilchen zugrunde liegenden lad-Nanoteilchen kann auch aus einem Element der Hauptgruppe 4a des Periodensystems bestehen. Als Dotierung können Elemente der Hauptgruppen Ia, 2a oder aus der Gruppe enthaltend Al, Cr, Tl, Mn, Ag, Cu, As, Nb, Nd, Ni, Ti, In, Sb, Ga, Si, Pb, Bi, Zn, Co und/oder Elemente der Lanthaniden dienen. Auch Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Elemente können in unterschiedlichen relativen Konzentrationen zueinander als Dotierungsmaterial dienen. Die Konzentration des Dotierungsmaterials im Wirtsgitter beträgt zwischen 10"5 mol-% und 50 mol-%, bevorzugt zwischen 0,01 mol-% und 30 mol-%, besonders bevorzugt zwischen 0,1 mol-% und 20 mol-%. Das Dotierungsmaterial wird so gewählt, dass die Zerfallszeit der durch es induzierten Fluoreszenz lang ist (> 100 ns). Bevorzugt werden Sulfide, Selenide, Sulfoselenide, Oxysulfide, Borate, Aluminate, Gallate, Silikate, Germanate, Phosphate, Halophosphate, Oxide, Arsenate, Vanadate, Niobate, Tantalate, Sulfate, Wolframate, Molybdate, Alkalihalogenide, Fluoride sowie andere Halogenide oder Nitride als Wirtsmaterialien für die Nanoteilchen verwendet. Auch Mischgitter aus einer Kombination der erwähnten Materialklassen werden bevorzugt verwendet. Beispiele für diese Materialklassen sind zusammen mit den entsprechenden Dotierungen in der folgenden Liste angegeben (Materialien des Typs B:A mit B = Wirtsmaterial und A = Dotierungsmaterial, wobei A auch Mischungen der angegebenen Materialien sein können):
LiLEu; NaIrTl; CsLTl; CsLNa; LiF:Mg; LiF:Mg,Ti; LiF:Mg,Na; KMgF3:Mn; Al2O3:Eu; BaFChEu; BaFChSm; BaFBnEu; BaFCIo15Br0^Sm; BaY2F8:A (A = Pr, Tm, Er, Ce); BaSi2O5:Pb;
BaMg2Ali6θ27:Eu; BaMgAl 14O23.ΕU; BaMgAl1 QOi 7 :Eu; BaMgAl2O3:Eu; Ba2P2θ7:Ti;
(Ba,Zn,Mg)3Si207:Pb; Ce(Mg5Ba)Al1 1O19- Ce0565Tb0535MgAl1 !O19=Ce-Tb;
MgAl1 1O19ICe3Tb; MgF2:Mn; MgS:Eu; MgS:Ce; MgS:Sm; MgS:(Sm,Ce); (Mg,Ca)S:Eu;
MgSiO3:Mn; 3,5MgO 0,5MgF2-GeO2:Mn; MgW04:Sm; MgWO4:Pb; 6MgO As2O5 :Mn; (Zn,Mg)F2:Mn; (Zn4Be)SO4:Mn; Zn2Siθ4:Mn; Zn2Siθ4:Mn,As; ZnOrZn; ZnO:Zn,Si,Ga;
Zn3(PO4)2:Mn; ZnSrA (A = Ag, Al, Cu); (Zn,Cd)S:A (A = Cu, Al, Ag, Ni); CdB04:Mn;
CaF2:Mn; CaF2:Dy; CaSrA (A = Lanthanide, Bi); (Ca5Sr)SrBi; CaWO4:Pb; CaW04:Sm; CaSO4:A
(A = Mn5 Lanthanide); 3Ca3(Pθ4)2-Ca(F,Cl)2:Sb,Mn; CaSiO3:Mn5Pb; Ca2Al2Si2O7=Ce;
(Ca5Mg)SiO3 :Ce; (Ca5Mg)SiO3 :Ti; 2SrO-6(B2O3) SrF2:Eu; 3Sr3(Pθ4)2-CaCl2:Eu; A3(PO4)2-ACl2:Eu (A = Sr, Ca, Ba); (Sr5Mg^O7 :Eu; (Sr5Mg)3 (PO4)2: Sn; SrSrCe; SrSrSm3Ce;
SrSrSm; SrSrEu; SrSrEu5Sm; SrSrCu3Ag; Sr2P2θ7:Sn; Sr2P2O7:Eu; Sr4Al14θ25:Eu; SrGa2S4:A
(A = Lanthanide, Pb); SrGa2S4=Pb; Sr3Gd2Si6OiSrPb5Mn; YF3=Yb5Er; YF3:Ln (Ln = Lanthanide);
YLiF4:Ln (Ln = Lanthanide); Y3Al5O^=Ln (Ln = Lanthanide); YAl3(BO4)3:Nd,Yb;
(Y,Ga)BO3:Eu; (Y5Gd)BO3:Eu; Y2Al3Ga20i2:Tb; Y2SiO5:Ln (Ln = Lanthanide); Y2θ3rLn (Ln = Lanthanide); Y2θ2S:Ln (Ln = Lanthanide); YV04:A (A = Lanthanide, In); YVO4=A5 Bi (A =
Lanthanide, In); Y(PxV1-x)04:Eu (O <= x <= 1); Y(PxVi.x)O4:Eu5 Bi (O <= x <= l);YTaO4:Nb;
YA103:A (A = Pr5 Tm, Er, Ce); YOCIrYb5Er; LnlPO4:Ln2 (LnI, Ln2 = Lanthanide oder
Mischungen von Lanthaniden); Ax(PO4)y:Ln (A = Erdalkali, Ln = Lanthanide) LuV04:Eu;
GdVO4:Eu; Gd2θ2S:Tb; GdMgB5Oi0:Ce,Tb; LaOBrrTb; La2θ2S:Tb; LaF3:Nd,Ce; BaYb2F8=Eu; NaYF4:A (A = Yb, Er, Tm5 Ho); NaGdF4:Yb,Er; NaLaF4:Yb5Er; LaF3: Yb5Er5Tm; BaYF5:Yb,Er;
Ga2O3:Dy; GaNrA (A = Pr5 Eu, Er, Tm); Bi4Ge3Oi2; LiNbO3=Nd5Yb; LiNbO3=Er; LiCaAlF6=Ce;
LiSrAlF6=Ce; LiLuF4=A (A = Pr5 Tm5 Er5 Ce); Li2B4O7=Mn5 SiOx=Er5Al (O < x < 2).
Besonders bevorzugt werden folgende Materialien verwendet: LaxCeyTb2PO4 (x+y+z=l); LaxEUi-
JPO4, LaxSmi.xPO4i LaxDyi-xPO4> LaxNdi-xPO4 (O <= x < 1); LaxCeyLnzPO4, (Ln = Lanthaniden, x+y+z=l); MVO4:Ln (M = Y, Gd; Ln = Lanthaniden); MV04:Bi,Ln (M = Y, Gd; Ln = Lanthaniden);MPO4:Ln (M = Y, Gd; Ln = Lanthaniden); YxGdi-xVyPy-1O4:Ln (0 <= x <= 1; 0 <= y <= 1; Ln = Lanthaniden); YxGd1-xVyPy-1θ4:Bi,Ln (0 <= x <= 1; 0 <= y <= 1; Ln = Lanthaniden)MSO4:Eu (M = Ca, Sr, Ba); MSO4:Eu,Mn (M = Ca, Sr, Ba); NaYF4:A (A = Yb, Er, Tm, Ho); ZnS:Tb, ZnSiTbF3, ZnSiEu, ZnSiEuF3, Y2O3:Eu, Y2O2SiEu, Y2Si05:Eu, SiO2:Dy, SiO2:Al, Y2O3:Tb, CdSrMn, ZnSrTb, ZnSrAg, ZnSrCu. Unter den besonders bevorzugten Materialien werden insbesondere diejenigen ausgewählt, die eine kubische Gitterstruktur des Wirtsgitters besitzen, da bei diesen Materialien die Zahl der einzelnen Fluoreszenzbanden minimal wird. Beispiele hierfür sind: M^rMn^ ZnSrMn, ZnSrAg, ZnSrCu, CaSiO3:Ln, CaSrLn, CaOrLn, ZnSrLn, Y2O3:Ln, oder MgF2:Ln (Ln = Lanthaniden).
Im Sinne der Erfindung geeignete Materialien für die Nanoteilchen sind auch solche, die aus nicht dotierten, halbleitenden Materialien bestehen. Dazu gehören bevorzugt solche der 4. Hauptgruppe (z.B. Si) und binäre Verbindungen AB, bei denen A ein Element der 2. Nebengruppe und B ein Element der 6. Hauptgruppe des Periodensystems ist (z.B. ZnS, CdS oder CdSe). Dazu gehören bevorzugt auch solche binären Verbindungen AB, bei denen A ein Element der 3. Hauptgruppe und B ein Element der 5. Hauptgruppe des Periodensystems ist (z.B. InAs, InP, GaAs, GaP oder GaN).
Die Größe der für die erfindungsgemäße Nanoteilchen geeigneten anorganischen Nanokerne liegt im Bereich zwischen 1 nm und 500 nm, bevorzugt zwischen 1 nm und 100 nm und besonders bevorzugt zwischen 1 nm und 40 nm, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und unter 20 nm.
Die anorganischen Nanokerne können dabei bestimmte, für die jeweilige Anwendung benötigte Eigenschaften haben, z.B. lumineszierende, elektromagnetische Strahlung streuende oder absorbierende, wobei Streuung oder Absorption durch die Anregung einer Plasmonenresonanz verstärkt werden kann, magnetische (hervorgerufen durch Atomkerne oder Elektronenhüllen), mechanische Eigenschaften oder andere, je nach deren Einsatzzweck. Sie können auch als Partner in resonanten Energietransfer-Prozessen (FRET = Fluoreszenz resonanten Energietransfer oder Förstertransfer) eingesetzt werden, wie sie. beispielsweise in „Principles of Fluorescence Spectroscopy"; J.R. Lakowicz, 2nd edition, Kluwer Academic, New York 1999, Seiten 367 - 442 beschrieben werden.
Bei den hydrophilen Polymeren, die in der Umhüllung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen enthalten sind, handelt es sich vorzugsweise um hydrophile lineare oder verzweigte Homo- oder Copolymere, mit funktionellen Gruppen wie Amino-, Carboxyl-, bzw. deren Salze, Hydroxyl-, Thiol-, Säureanhydrid, Säurechlorid und/oder Isocyanatgruppen, die eine kovalente oder adsorptive, so z.B. elektrostatische oder ionische Bindung mit den funktionellen Gruppen der anzukoppelnden Biomoleküle ermöglichen. Dabei können die funktionellen, eventuell auch adsorptiv wirkenden Gruppen der entsprechenden Polymere sich in der Wiederholungseinheit befinden, wie beispielsweise bei Polysäuren, PoIy- säureanhydriden, Polyalkoholen, Polythiolen oder Polyaminen oder Polyheterocyclen, so im Falle der Polyacrylsäure und/oder deren Salzen, Polymethacrylsäure und/oder deren Salzen, PoIy- (meth)acrylamide, Polymaleinsäure und/oder deren Salzen, Polyasparaginsäure und/oder deren Salzen, der Polymaleinsäureanhydride, der Polyethylenimine, der Polyhydroxyethyimethacrylate (PHEMA), der Polydimethylaminoethylmethacrylate und/oder dessen Salzen, der Polyvinyl- pyrrolidone, der Polyvinylalkohole, Polyvinalyacetals oder Polyvinylethers oder der Polyether.
Als aminische Polymere kommen beispielsweise Polyallylamin, Polyvinylamin, lineare oder ver- zweigte Polyethylenimine, Polylysin, Polymere enthaltend Chitosamine sowie Polydiallyldimethyl- ammoniumchlorid und/oder Polyvinylpyridin bzw. deren Säureaddukte als Homo- oder Copoly- merisate in Frage
Alle benannten Polymere können für die Darstellung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen als Homo- oder auch als Copolymere untereinander sowie mit weiteren Monomeren eingesetzt werden. Ebenfalls denkbar sind Copolymerisate aus Acrylsäure mit Vinylpyrrolidon, Maleinsäureanhydrid mit Methylvinylether, Vinylpyrrolidon mit Dimethylaminoethylmethacrylat, Vinyl- imidazol mit Vinylpyrrolidon und Methacrylsäure mit Vinylpyrrolidon.
Weiterhin geeignete Polymere sind solche, deren funktionelle Gruppen in den Endgruppen lokalisiert sind, wie beispielsweise im Falle der Amino-/Carboxy-/Thio-/ Isocyanat- oder ander- weitig endgruppenfunktionalisierten Polyether, so z.B. bei aminofunktionelle Oligo- oder PoIy- ethylenglykole (Jeffamine) oder OH terminierten Polyethylenoxiden.
Bevorzugt sind Polymere mit funktionellen Gruppen in der Wiederholungseinheit, besonders bevorzugt die Polysäuren, und dabei ganz besonders bevorzugt Polyacrylsäuren oder Polymeth- acrylsäuren und/oder deren Salze.
In einer weiteren Ausfuhrungsform können auch reaktive Polymere, wie Polymaleinsäureanhydride oder Polysuccinimide, die im Laufe der weiteren Verarbeitung zu den oben erwähnten Polyelektrolyten, nämlich Polyacrylsäure bzw. Polyasparaginsäure abreagieren, eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen enthält deren Hülle Polymethacrylsäure, Polyasparaginsäure (PASP), Polymaleinsäure, Copolymerisate von Acryl- säure bspw. mit Maleinsäure, die unter den Produktnamen Sokalane® von der Firma BASF angeboten werden und/oder Copolymerisate von Acrylsäure mit Maleinsäure und Vinylether, die von der Firma SKW Polymers unter dem Namen Melpers® angeboten werden, und/oder deren Salze, bevorzugt deren Natriumsalze.
Besonders bevorzugt ist die Anwesenheit von Natriumpolyacrylaten in der Hülle der erfindungsgemäßen Nanoteilchen.
Das Molekulargewicht des „Umhüllungspolymers" kann variabel sein, vorzugsweise liegt es bei einem Mw von 1000 bis 100 000 gmol'1, bevorzugt zwischen 1000 und 25 000 gmol'1, besonders bevorzugt zwischen 5000 und 12 000 gmol"1 und ganz besonders bevorzugt zwischen 7000 und
So wurde beispielsweise gefunden, dass mit Natriumpolyacrylaten im Molekulargewichtsbereich Mw von ca. 8000 gmol"1 bessere Ergebnisse erzielt werden können als mit den entsprechend höhermolekularen Analogen, mit beispielsweise einem Molekulargewicht von 50 000 gmol"1.
Die hydrophile Oberflächenhülle der erfindungsgemäßen Nanoteilchen kann dabei auch bestimmte, für die jeweilige Anwendung benötigte Eigenschaften haben, die sich mit denen der anorganischen Nanokerne ergänzt, so z.B. fluoreszierende, elektromagnetische Strahlung streuende oder absorbierende, magnetische (hervorgerufen durch Atomkerne oder Elektronenhüllen) oder andere, je nach deren Einsatzzweck. Sie können auch als Partner in resonanten Energietransfer- Prozessen (Förstertransfer) eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Nanoteilchen, die CePO^Tb als anorganischen Nanokern enthalten und eine das Natriumsalz der Polyacrylsäure enthaltende hydrophile Oberflächenumhüllung aufweisen. Diese zeichnen sich durch eine hohe Stabilität gegen relativ hohe Elektrolytkonzentrationen aus. Beispielsweise konnte selbst in 2 molaren NaCl Lösungen noch eine ausreichende Suspensionsstabilität beobachtet werden. Vorzugsweise sollten jedoch bei einwertigen Ionen Konzentrationen von einem Mol und bei mehrwertigen Ionen, wie MgCl2 0.5 Mol nicht überschritten werden.
Außerdem weisen sich die erfindungsgemäßen Nanopartikelsuspensionen durch eine hohe Temperaturstabilität aus. So konnte eine mit Polyacrylsäure Na Salz umhüllte CePO4:Tb Nano- partikelsuspension über einen halben Tag mit kochendem Wasser behandelt werden ohne dass die Suspensionsstabilität verloren ging. Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Nanopartikelsuspensionen ein- oder mehrere Male für 3 bis fünf Stunden bei 95°C ohne nennenswerte Ein- büßen mit heißem Wasser behandelt werden. Damit sind die Rahmenbedingungen für beispielsweise qPCR Nachweismethoden erfüllt. Zur Bestimmung der Partikelgröße und für den Nachweis der Monodispersität der erfindungsgemäßen Nanoteilchen ist die Laserlichtstreuung oder bevorzugt der Einsatz der Analytischen Ultrazentrifugation (AUZ) geeignet. Die AUZ ist dem Fachmann bekannt, wie bspw. in Colloid & Polymer Science 267: 1113-1116 von H. G. Müller beschrieben.
Zur Bestimmung der Oberflächenladung hat sich vor allem die Gelelektrophorese bewährt, deren Grundlagen bspw. von R. Westermeier „Electrophoresis in Practice" Wiley-VCH beschrieben sind.
Als weitere Methode zur Oberflächencharakterisierung wird die Zeta-Potenzialbestimmung, die bspw. Hiemenz und Rajagopalan, Principles of Colloid and Surface Chemistry, 3. Aufl. New York: Dekker 1997 beschreiben, eingesetzt.
Durch eine kombinierte Anwendung von Transmissionselektronenmikroskopie, Elektronenspektroskopie für die chemische Analyse (ESCA) und Thermogravimetrie (TGA) kann die Schichtdicke der Polymerhülle ermittelt werden, die 0,5 nm bis 7 nm, bevorzugt 0,5 bis 4 nm, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 nm beträgt.
Die Schichtdicke der Polymerhülle kann dabei bei Verwendung der Transmissionselektronenmikroskopie direkt beobachtet werden, was aber wegen der dem Fachmann bekannten Probleme von für die Transmissionselektronenmikroskopie typischen Präparationsartefakte nur einen ersten Anhaltspunkt geben kann. Mit Hilfe von ESCA kann geprüft werden, ob noch Signale des anorganischen Kerns des umhüllten Nanoteilchens nachweisbar sind, was auf Schichtdicken von unter ca. 5 nm hinweist. Bei der TGA kann die Polymerhülle von den Nanoteilchen thermisch desorbiert werden und deren absolute und auch zum Nanoteilchen relative Masse bestimmt werden. Bei Kenntnis der Größe des anorganischen Anteils des Nanoteilchens, bestimmbar mit der Transmissionselektronenmikroskopie, dessen Dichte sowie der Dichte des Polymers kann somit die mittlere Polymerhülle berechnet werden. Verwendet man zum Beispiel CePO4:Tb-Nano- teilchen mit einer anorganischen Teilchengröße von 7 nm und einer Dichte von 5,2 g/cm , die mit einer Schicht aus Polyacrylsäure mit einer Dichte von 1,1 g/cm3 derart umhüllt sind, dass bei einer TGA ein relativer Gewichtsverlust von 20 % auftritt, ergibt sich eine Hüllendicke von 1,0 nm.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nanopartikel. Viele Typen von Nanoteilchen besitzen herstellungsbedingt, z.B. aufgrund ihrer Synthese in hydrophoben Lösemitteln, eine hydrophobe Oberfläche. Das erfmdungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monodispersen, wässerigen Dispersionen, ausgehend von hydrophoben Nanopartikel-Agglomeraten, beinhaltet eine zumindest teilweise Dealkylierung der hydrophoben Ausgangsprodukte durch Tempern in hochsiedenden, wassermischbaren Lösungsmitteln und an- schließende Umhüllung mit hydrophilen Polymeren durch Umsetzung der wie beschrieben getemperten Nanoteilchen mit geeigneten Polymeren, die vorzugsweise funktionelle, reaktive Gruppen besitzen, in wassermischbaren Lösungsmitteln optional unter Verwendung von Lösungsvermittlern.
Um die Affinität der oben beschriebenen hydrophilen polymeren Dispergatoren zu den zu hydro- philierenden hydrophoben Nanoteilchen zu ermöglichen, müssen letztere ganz oder zumindest teilweise dehydrophobiert werden.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die Dehydrophobierung bzw. teilweise Dehydro- phobierung von beispielsweise mit Tris-Ethylhexylphosphat (TEHP) oder Tributylphosphat modi- fϊzierten Nanophosphore durch einfaches Tempern in mindestens einem hochsiedenden, vorzugsweise mit Wasser mischbaren Lösemitteln, wie beispielsweise N-Methylpyrrolidon (NMP), Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid (DMAc), Dimethylsulfoxid (DMSO) Triethyl- phosphat oder Diethylphosphit, bzw. in Gemischen dieser Lösemittel, bevorzugt in reinem NMP erreicht werden kann.
Die Dehydrophobierung erfolgt durch mehrstündiges, vorzugsweise 2- bis 3 -stündiges Erhitzen bis in Siedepunktsnähe, bevorzugt, auf 180 bis 2500C, besonders bevorzugt auf 2000C.
Die auf die Dehydrophobierung folgende Polymerumhüllung kann im Prinzip in beliebigen, vorzugsweise im selben Lösemittel (Dehydrophobierungslösemittel) erfolgen.
Diesen Lösemitteln können vorzugsweise sog. Lösungsvermittler, wie Ethylenglykol, Glyzerin oder niedermolekulare Oligoethylenglykole bzw. deren Monomethylether, bevorzugt niedermolekulare Ethylenglykole, ganz besonders bevorzugt Ethylenglykol in einigen Gewichtsprozenten bis zu gleichen Mengen zugesetzt werden. Ein besonders bevorzugtes Lösemittelsystem besteht, wie in Bsp. 2 beschrieben aus gleichen Gewichtsanteilen NMP und Ethylenglykol.
Während die Dehydrophobierung, wie beschrieben, bei hohen Temperaturen erfolgt, kann die Polymerumhüllung durch mehrstündiges Rühren oder Rollen bei RT erfolgen.
Wie in Bsp. 2 beschrieben, wird die Dehydrophobierungslösung mit etwa gleichen Mengen Ethylenglykol und einer ca. 1 %igen wässerigen Lösung des zu umhüllenden Polymers versetzt und vorzugsweise über Nacht gerührt, bzw. auf einer Rollbank kontinuierlich bewegt.
Ebenfalls Gegenstand des erfrndungsgemäßen Verfahrens ist die Aufarbeitung der Umsetzungs- produkte. Die Trennung der umhüllten Nanoteilchen von ihren Nebenprodukten kann über Ultra- zentrifugation oder ein Membranverfahren, vorzugsweise Ultrafiltration (UF) erfolgen. So eignet _ _
sich beispielsweise für die Isolierung der hier hergestellten CePO4:Tb Nanoteilchen Membranen aus Polyethersulfon mit einer Ausschlussgrenze von 100 000 D. In diesem Fall werden die Nanoteilchen zurückgehalten, während die überschüssigen Nebenprodukte, wie Polymere oder organische Lösemittel permeieren. Die geeignete Größe der Membranen-Ausschlussgrenze kann variieren und hängt von der Größe der zu beschichtenden Nanoteilchen und dem Molekulargewicht des verwendeten Polymers ab. Sie kann aber von dem Fachmann auf dem Gebiet leicht eingegrenzt werden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind durch chemische Reaktionen, so beispielsweise eine An- kopplung von funktionellen Molekülen an die hydrophile Oberflächenbeschichtung, und/oder durch physikalische Prozesse an und/oder in der Oberflächenbeschichtung zugängliche Derivate der erfindungsgemäßen Nanoteilchen.
So können an die hydrophile Oberfiächenumhüllung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen, so z.B. an CePO4:Tb, beispielsweise Farbstoffe wie Fluorescein oder Rhodamin (z.B. Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland), Bodipy, Alexa 546 (Molecular Probes, Eugene, USA), Cy3 (Amersham Bioscience, General Electric HealthCare), Atto 532, Atto 550 (Atto-Tec GmbH, Siegen, Deutschland) oder andere dem Fachmann bekannten Fluoreszenzfarbstoffe angebunden werden. Zur Ausnutzung eines Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) werden dabei idealerweise solche Farbstoffe verwendet, die bei Verwendung als Akzeptor einer möglichst großen Überlappung zwischen Absorptionsquerschnitt des Farbstoffes und den Emissionsbanden des Nanoteilchens, der als Emitter eingesetzt ist, aufweisen. Es eignen sich aber auch Moleküle als Akzeptoren, die die Fluoreszenz des Donors löschen, ohne selbst zu fluoreszieren, wie z.B. Black Hole Quencher BHQ-I (BIOSEARCH Technologies, Novato, USA). Auch in diesem Fall werden solche Löschmoleküle verwendet, die eine möglichst große Überlappung zwischen Absorptionsquerschnitt des Löschmoleküls und den Emissionsbanden des Nanoteilchens, der als Emitter eingesetzt ist, aufweisen. Bezüglich der Überlappung sollte bevorzugt die Wellenlänge von mindestens einem Emissionsmaximum der Fluoreszenzbanden des Nanoteilchens im Bereich der Hauptabsorption des Farbstoffs liegen, wobei die Wellenlängengrenzen der Hauptabsorption durch den 37 %-Wert des Absorptionsmaximums definiert sind. In Fällen, bei denen die Emissionswellenlängen der Farbstoffe mit Absorptionsbanden des Nanoteilchens überlappen, agieren die Nanoteilchen als Akzeptoren und die Farbstoffe als Donoren. Um einen möglichst effektiven FRET zu erzielen, gelten die Angaben zur Lage der Absorptions- und Emissionsbanden analog zu den obigen.
Mit Hilfe der so modifizierten erfindungsgemäßen Nanoteilchen lässt sich so eine weitere Aussage über den Abstand zwischen anorganischem Nanokern und dem Farbstoff und somit indirekt über die Dicke der Polymere enthaltenden hydrophilen Oberflächenumhüllung mit Hilfe eines resonanten Energietransfers (Förster-Transfer) von den anorganischen Nanokernen auf den Farbstoff machen (Beispiel 3).
Der Energietransfer kann einmal durch die vom Nanoteilchen sensibilisierte Fluoreszenz des Farbstoffs gemessen werden. Dazu wird das Nanoteilchen mit einer Blitzlampe, die eine Blitzdauer von einigen Mikrosekunden oder kürzer realisiert, angeregt, während das Emissionsspektrum nach einer Verzögerungszeit gemessen wird, nach welcher der Anregungslichtpuls abgeklungen ist. Die Länge der Verzögerungszeit hängt im wesentlichen von der Leuchtdauer der Anregungsblitzlampe ab und beträgt i.a. 20 - 50 Mikrosekunden. Durch dieses Messprinzip wird die Lichtemission des direkt angeregten Farbstoffs oder eine eventuell auftretende Hintergrundfluoreszenz nahezu vollständig eliminiert. In solchen Spektren sieht man die durch den Energietransfer reduzierte Fluoreszenz des Donors überlagert von der sensibilisierten Fluoreszenz des Akzeptors. Bei einem anderen Messprinzip kann der Energietransfer durch Vergleich der Fluoreszenzlebensdauer der anorganischen Nanokerne mit und ohne angekoppeltem Farbstoff bestimmt werden. Aus dem Verhältnis der Lebensdauer und unter Berücksichtigung der endlichen Größe der Nanoteilchen (und somit unter Berücksichtigung der räumlichen Verteilung der Emitter-Ionen) kann der Fachmann leicht die Effizienz des Energietransfers bestimmen und somit auf die Dicke der Polymerschicht um die Nanoteilchen schließen. Die je nach Anzahl der angekoppelten Farbstoffmoleküle ermittelte Reduktion der Fluoreszenzlebensdauer um bis zu 90 % zeigt die hohe Energie- transfer-Effizienz der im Beispiel beschriebenen Systeme. Dies ist nur möglich, wenn der Abstand zwischen anorganischem Nanokern und Farbstoff deutlich kleiner als der kritische Abstand für einen Energietransfer („Förster-Radius") ist, der bei ca. 5 nm liegt. Dieses Ergebnis ist ein weiterer deutlicher Hinweis auf die geringe Schichtdicke der Polymere enthaltenden Oberflächenumhüllung der erfϊndungsgemäßen Nanoteilchen.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind die durch eine zusätzliche Ankopplung von mindestens einem funktionellen Molekül wie z.B. einem allgemeinen organischen Molekül oder biologischen Makromolekülen wie z.B. Antikörpern oder anderen Proteinen, Peptiden, Enzymen, Oligo- nukleotiden oder anderen Nukleinsäuremolekülen oder nukleinsäureähnlichen Molekülen, wie PNAs oder Morpholinos, Oligo- oder Polysacchariden, Haptenen, wie Biotin oder Digoxin oder niedermolekularen synthetischen oder natürlichen Antigenen oder Epitopen oder Kopplungsmolekülen wie Avidin, Streptavidin oder Neutravidin erhältlichen Nanoteilchen.
Bevorzugt ist eine Ankopplung von Oligonukleotiden (Beispiel 4), Biotin, Avidin und/oder Streptavidin (Beispiele 5 und 6) an die erfϊndungsgemäßen Nanoteilchen. _ .
Physikalische Prozesse in der hydrophilen Oberflächenbeschichtung können Ankopplungen von geeigneten Ionen über Komplexbildung sein, wie z.B. paramagnetische Ionen (z.B. Eisen), die weitere Methoden der Analytik ermöglichen. Aber auch eine physikalische Vernetzung durch intramolekulare Komplexbildung und damit Stabilisierung der hydrophilen Polymere enthaltenden Oberflächenumhüllung ist möglich.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die funktionellen Gruppen der Umhüllungspolymeren mit bi- oder höherfunktionellen niedermolekularen Molekülen quervernetzt werden, so z.B. mit di-, tri-, tetra-, penta- oder polyfunktionellen Reagenzien wie Lysin, Ethylen- diamindiacetat (EDDA).Beispielsweise wurde das auf den anorganischen Nanokernen befind- liehen Polyacrylat Umhüllungspolymer durch Umsetzen mit Lysin, einem bifunktionellen Reagenz, quervernetzt (Beispiel 7). Dabei kann es in geringem Umfang auch zu interpartikulärer Vernetzung kommen, was anhand größerer mittlerer Teilchendurchmesser im Vergleich zu denen der Ausgangsstoffe beobachtet wird.
Besonders bevorzugt sind die Lysin vernetzten, Fluorescein modifizierten CePO4:Tb Nanoteilchen mit Natriumpolyacrylat in der hydrophilen Oberflächenumhüllung. Diese zeigen besonders starke Donor- bzw. Akzeptoreigenschaften für Fluoreszenz resonanten Enrgietransfer (FRET).
Chemische Reaktionen, die zur Derivatisierung der Oberflächenumhüllung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen verwandt werden, und/oder physikalische Prozesse in der Oberflächenumhüllung sind dem Fachmann bekannt und werden in Standardwerken der Organischen Chemie, bzw. der Biochemie beschrieben.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen und/oder ihrer Derivate als Biolabel in heterogenen oder homogenen biologischen Assays, um z.B. die Präsenz von nachzuweisenden biologischen Makromolekülen wie z.B. Antikörpern oder anderen Proteinen, Peptiden, Oligonukleotiden oder anderen Nukleinsäuremolekülen oder nuklein- säureähnlichen Molekülen, wie PNAs oder Morpholinos, Oligo- oder Polysacchariden, Haptenen qualitativ und/oder quantitativ anzuzeigen. Solche Assays können z.B. Immunoassays in den für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Formaten sein oder auch Assays der quantitativen PCR ebenfalls in den für den Fachmann bekannten Formaten sein (z.B. Molecular Beacon-, Taqman-, Dual Hybridization- oder Scorpions-Format). Auch Assay-Formate, bei denen die Erkennung des Zielmoleküls durch eine induzierte Agglomeration der Nanoteilchen und einer damit verbundenen Trübung oder Änderung der Intensität oder Wellenlänge der Absorption, der Lichtstreuung oder des Fluoreszenzlichts können mit den erfindungsgemäßen Nanoteilchen realisiert werden. Die Anregung der Nanoteilchen kann dabei über einen Ein- oder auch Mehrphotonen-Prozess erfolgen. Zusätzlich ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanoteilchen als Marker oder Label in der Molekular- und/oder Zellbiologie oder in der medizinischen Diagnostik oder Therapeutik möglich. Dabei kann die An- oder Abwesenheit eines Analyten gemessen werden, Zellschnitte angefärbt werden oder es können mit den erfindungsgemäßen Nanoteilchen markierte biologische Moleküle oder biologisch wirksame Moleküle in vivo oder in vitro verfolgt werden.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nanoteilchen auch Verwendung als Füllstoffe oder Zusatzstoffe in Polymeren, insbesondere als Zusatzstoff in organischen oder anorganischen Lackoder Coatingsystemen oder als Zusatzstoffe in Tinten finden.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der Beispiele näher erläutert ohne sie jedoch auf diese zu beschränken.
Beispiele
Herstellen einer hydrophoben nanopartikulären Suspension
1,9 g hydrophobe CePO4:Tb Nanopartikel wurden in 19.0 g NMP (N-Methylpyrrolidon) suspendiert. Diese Suspension wurde in einem Glaskolben mit Magnetrührer und Rückflusskühler unter Rühren 2 h auf 2000C erhitzt. Dabei entstand eine braune, transparente nanopartikuläre Suspension (20,9 g einer 9,1 %igen Suspension). Mittels analytischer Ultrazentrifugation (AUC) wurde für diese NMP/Nanopartikel Suspension eine mittlere Teilchengrössenverteilung von 5,4 nm (d50 Wert) ermittelt. Für die folgende Polymerumhüllung wurde durch NMP Zugabe eine 1 %ige Suspension hergestellt.
Umhüllung der hydrophoben Suspension mit Polyacrylsäure Natriumsalz (PASNa)
10,0 ml der 1 %igen, hydrophoben NMP Nanopartikel Suspension wurden in einem 50 ml Falcon Röhrchen (aus PP mit Schraubdeckel) mit 10,0 ml Ethylenglykol (EG) versetzt. Dazu wurden 20,0 g eines PASNa/EG Gemisches (10,0 g 1 %ige PASNa Lösung MW: 8000 D, Aldrich und 10,0 g EG) gegeben. Durch Rollen des Falcon Röhrchens über Nacht wurde diese nanopartikuläre Suspension gemischt. Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches erfolgte mittels Ultrafiltration (UF) bei ca. 3 bar in einer 50 ml Millipore Rührzelle mit einer Polyethersulfon (PES) Membran, deren cut-off bei 100 000 D lag. Der Lösungsmittelaustausch erfolgte durch kontinuierliche Per- meation mit Wasser wobei insgesamt ein Permeatvolumen von ca. 850 ml erzielt wurde. Das entsprechende Konzentrat (Retentat) bestand aus 15 ml einer 0,75 %igen klaren, farblosen nano- partikulären Suspension mit den folgenden Eigenschaften:
• pH: 7.0;
• Teilchengrößenverteilung (ermittelt mit der AUC): d50: 5,9 nm;
• Gelelektrophorese (GEP): Bei der Gelelektrophorese (Agarose Gel in Trisacetat EDTA Puffer) wanderten die mit PASNa umhüllten Nanopartikel zur Anode, während die nicht umhüllten, wasserunlöslichen Ausgangsprodukte keine elektrophoretische Beweglichkeit besaßen.
• Spektroskopische Untersuchung: Bei Anregung bei 280 nm ergaben sich die für die Lichtemission von Terbium-Ionen typischen Fluorezenzmaxima bei 487 nm, 542 nm (Hauptmaximum), 583 nm und 620 nm. Die Halbwertzeiten dieser Emissionsmaxima lagen bei 1,35 ms. -
• Stabilität gegen Salzfrachten: Die mit PASNa umhüllten Nanophosphore erwiesen sich als sehr stabil gegen Salzkonzentrationen. Bis zu einer Konzentration von 2000 mmol/1 NaCl und bis 5 mmol/1 MgCl2 kam es zu keinen Agglomerationen.
• Stabilität gegen pH- Wert-Variationen: Die mit PASNa umhüllten Nanophosphore erwiesen sich als sehr stabil gegen pH- Wert-Änderungen im Bereich zwischen pH 4 und mindestens pH
9.
• Temperaturstabilität: Die mit PASNa umhüllten Nanophosphore erwiesen sich als sehr stabil gegen hohe Temperaturen. Die Dispersionen konnten mehr als 6 Stunden bei über 900C gehalten werden, ohne wesentliche Veränderung der Teilchengrößenverteilung oder der optischen Eigenschaften.
Kopplung von Fluorescein an die mit PASNa umhüllten Nanophosphore
Die Reaktion wurde in einem 15 ml Falcon Röhrchen (PP) durchgeführt. Zu 1,5 ml der oben genannten mit Polyacrylsäure-Na umhüllten Nanophosphore wurden 70 mg EDC (l-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) Carbodiimid Hydrochlorid, Aldrich), gelöst in 1,5 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH: 6,0) pipettiert. Nach Vortex-Behandlung wurde das Reaktionsgemisch 30 Min. auf der Rollbank bei Raumtemperatur gerollt, wobei sich ein pH-Wert von 6,5 einstellte. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 5 mg Fluoresceinamin (Fluka), gelöst in 7,5 ml Boratpuffer (0,1 m, pH: 8.3) gegeben. Nach Vortex-Behandlung wurde das Reaktionsgemisch unter Lichtausschluss über Nacht gerollt, wobei sich in dem gelben Reaktionsmedium ein pH- Wert von 8.3 eingestellt hatte.
Die Aufarbeitung erfolgte durch Ultrafϊltration (PES Membran 100 000D, ca. 3 bar) mit Wasser als Permeationsmittel. Nach einem Permeationsvolumen von 350 ml wurde, nach einem anfanglich gelben, ein absolut farbloses Permeat erhalten. Das Konzentrat (Produkt) war eine leuchtend gelbe, transparente nanopartikuläre Suspension mit folgenden Eigenschaften:
• Volumen: 2,2 ml
• Nanopartikel Konzentration: 0.5 Gew.-%
• Teilchengrößenverteilung (AUC): d50: 8,4 nm
• Spektroskopische Untersuchung (Jobin Yvon, Fluorolog FL3 - 22 mit Phosphoreszenz- Option): Dazu wurden die Teilchendispersionen auf eine Konzentration von 0,002 Gew.-% verdünnt und mit einer Xe-Blitzlampe bei 280 nm angeregt. Der Energietransfer wurde zum einen durch die von den CePO4 :Tb-Nanophosporen sensibilisierte Fluoreszenz des Fluoresceins gemessen. Dazu wurde das Fluoreszenzspektrum nach einer Verzögerungszeit von 40 μs nach dem Anregungslichtpuls aufgenommen, um die Lichtemission des direkt angeregten Farbstoffs oder eine eventuell auftretende Hintergrundfluoreszenz nahezu voll- ständig zu eliminieren. Es zeigten sich die für die Lichtemission von Terbium-Ionen typischen
Fluorezenzmaxima bei 487 nm, 542 nm (Hauptmaximum), 583 ran und 620 nm mit einem breiten Untergrundmaximum mit einem Zentrum bei 523 nm, der die sensibilisierte Fluoreszenz des Fluoresceins anzeigt. Zum anderen wurde der Energietransfer durch Vergleich der Fluoreszenzlebensdauer der CePO^Tb-Nanophospore bei einer Wellenlänge von 542 nm mit und ohne angekoppeltem Fluorecscein bestimmt. Es ergab sich eine Reduktion der Lebensdauer um bis zu 90 %. Auch unter Berücksichtigung, dass mehrere Fluorescein-Moleküle angekoppelt waren, zeigt dieses Ergebnis die hohe FRET-Effizienz des hier vorgestellten Systems, was nur möglich ist, wenn der Abstand zwischen Nanophosphor und Farbstoff deutlich kleiner als der kritische Abstand für einen FRET („Förster-Radius") ist, der bei ca. 5 nm liegt.
In Kontrollversuchen, in denen die Fluorescein-Moleküle ohne Ankopplung an die Nanophos- phore zugegeben wurden, konnte keine zeitverzögerte Emission des Fluorescein- bei 523 nm beobachtet werden. Ebenso änderte sich die Halbwertzweit nicht gegenüber den Messungen, bei denen die mit Polyacrylsäure-Na umhüllten Nanophosphore allein vorlagen.
Kopplung von Oligonukleotiden an die mit PASNa umhüllten Nanophosphore
Zu 0.8 ml der in Bsp. 2 beschriebenen Nanophosphor/PASNa Partikelsuspension wurden 65 mg EDC gelöst in 0.5 m Phosphatpuffer, pH 6.0 gegeben. Es wurde Ih bei Raumtemperatur (RT) gemischt, wobei sich ein pH Wert von 6,2 eingestellt hatte.
Zu den so aktivierten Nanophosphoren wurden 1,9 mg der folgende NH-Oligosequenz (Thermo Electron, Ulm), gelöst in 0.4 ml Boratpuffer 0.2 m, pH: 9 gegeben: 5' GGC AGC AAC GCG ACG CGC ACC-3' (5' Aminolink C6/MMT).
Nach einer 4-stündigen Inkubation unter Rühren bei RT wurde der Ansatz über Nacht bei 4°C gelagert und danach mittels Ultrafiltration mit einer Vivaspin Zelle (Fa. VivaScience, PES Membran MWCO 50 000D) aufgereinigt.
Das Endprodukt (0.8 ml) war eine 1,2 %ige klare nanopartikuläre Suspension
Dieses Endprodukt wurde um einen Faktor 5 verdünnt und mit der 6-fachen molaren Konzentration der komplementären Sequenz 5' GGT GCG CGT CGC GTT GCT GCC 3' (3' TAMRA; TAMRA = Rhodamin-Derivat, Thermo Electron, Ulm), zusammen mit 1,5 mM MgCl2 inkubiert. Anschließend wurde die Fluoreszenzlebensdauer der Lichtemission der Nanophosphore bei einer Wellenlänge von 542 nm analog zu Beispiel 3 gemessen. Es ergab' sich eine Verkürzung der Lebensdauer um 70 %, die durch den FRET von dem Nanophosphor auf den Farbstoff TAMRA hervorgerufen wurde.
Kopplung von Biotin an die mit PASNa umhüllten Nanophosphore (HIE 13 024)
24 mg EDC wurden in 0,04 ml 0.5 m Phosphatpuffer pH 6.0 gelöst und zu 0.09 ml PASNa umhüllte Nanophosphore (Produkt aus Bsp. 2) gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 h bei RT wurden dazu 3,745 mg Biotin-(PEO)3-amin (Bioscience 00215) gelöst in 0,05 ml 0,2 m Boratpuffer pH 9,2 gegeben. Nach einer 6 stündigen Reaktionszeit unter Rühren, wurde der Ansatz über Nacht bei 4°C gelagert und danach mittels Ultrafiltration (Vivaspin MWCO 50 000 PES Membran) aufgereinigt.
Zum Nachweis Biotin-Kopplung wurde die Dispersion in PBS-Puffer bei pH 8 auf 800 μg/1 verdünnt und zu einer Dispersion (800 μg/1) mit Strepatavidin-umhüllten magnetischen Polymerbeads (Sera-Mag® Strepatavidin, Serva, Heidelberg) gegeben. Anschließend wurden die Polymerbeads 10 min. mit einem Dauer-Stabmagneten abgezogen und die Fluoreszenz des Überstands vermessen. Es zeigte sich keine Fluoreszenz, während vor der Zugabe der Polymerbeads eine deutliche Fluoreszenz der Nanophosphore nachweisbar war. Dieses Experiment zeigt die gute Kopplung des Biotins an die Nanophosphore.
Kopplung von Streptavidin an die mit PASNa umhüllten Nanophosphore
Zu 0.3 ml einer 6 %ige PASNa modifizierte Nanophosphor-Suspension (Produkt aus Bsp. 2) wurden 40 mg EDC und 30 mg SulfoNHS (N-Hydroxysuccinimid), gelöst in 0.5 m Phosphatpuffer, pH 6.0, gegeben. Es wurde unter Mischen eine Stunde bei RT inkubiert. Danach wurden die aktivierten Nanophosphore mittels Ultrafiltration (PES Membran MWCO: 100 000 D) isoliert. Als Retentat wurde eine leicht opake Suspension mit dem pH Wert 5,7 erhalten.
Zu 1 ml dieser Partikelsuspension wurden 5,0 mg Streptavidin (Sigma S4762), gelöst in 0,2 m Boratpuffer, pH 9,2, gegeben. Nach einer 4-stündigen Inkubation und Lagerung bei 4°C über Nacht, wurde das Endprodukt durch Ultrafiltration (PES Membran MWCO 100 000 D) aufgereinigt, wobei als Retentat eine 1.3 %ige, klare Lösung mit dem pH Wert 8,3 erhalten wurde. Der Nachweis der Streptavidin-Bindung erfolgt analog zu dem Nachweis der Biotin-Bindung in Beispiel 5, nur dass die Position des Streptavidin und Biotin vertauscht wurde. .
Quervernetzung der mit PASNa umhüllten Nanophosphore mit Lysin
Zu 5 ml der in Bsp. 2 beschriebenen PASNa umhüllten Nanophosohore (1,1 %ige Suspension) wurden 170 mg EDC, gelöst in 5 ml 0,1 m Phosphatpuffer pH 6.0, gegeben. Unter Mischen auf einer Rollbank wurde der Ansatz 30 Minuten bei RT inkubiert.
Anschließend wurden 4.34 mg L-Lysin, gelöst in 2,5 ml 0,2 m Boratpuffer pH 9.0, gegeben.
Nach einer Inkubationszeit von 24 h bei RT, wurde der Ansatz über Nacht bei 4°C gelagert und danach mittels Ultrafiltration (PES Membran 100 000 MWCO) aufgereinigt.
Die intrapartikuläre Quervernetzung konnte über IR Spektroskopie anhand der Amidgruppen nachgewiesen werden.

Claims

. -Patentansprüche:
1. Anorganische lumineszierende oder magnetische oder elektromagnetische Strahlung streuende oder absorbierende, insbesondere durch die Anregung einer Plasmonenresonanz verstärkt streuende oder absorbierende Nanoteilchen mit einer mittlere Teilchengröße von 1 nm bis 500 nm, und mit einer hydrophilen, mindestens ein Polymer enthaltenden
Oberflächenbeschichtung, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächenbeschichtung eine geringe Dicke von 0,5 nm bis 7 nm aufweist.
2. Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Kristallgitter mit Fremdionen dotiert ist.
3. Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie Donor- bzw. Akzeptoreigenschaften für Fluoreszenz resonanten Energietransfer aufweisen.
4. Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den in der Hülle enthaltenen Polymeren um mindestens eines aus der Reihe der Polyacrylsäuren oder Polymethacrylsäuren und/oder deren Salze oder Copolymere handelt.
5. Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass an die hydrophile Oberflächenhülle über chemische oder physikalische Reaktion mindestens ein funktionelles Molekül oder ein Biomolekül angelagert ist.
6. Anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Oberflächenhülle durch chemische oder physikalische Reaktion vernetzt ist.
7. Verfahren zur Herstellung der anorganischen Nanoteilchen mit hydrophiler Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass hydrophobe Nanoteilchen in mindestens einem hochsiedenden, mit Wasser mischbaren Lösemittel getempert und mit einer Lösung mindestens eines hydrophilen Polymeren in demselben oder mindestens einem weiteren wassermischbaren Lösungsmittel umgesetzt werden.
8. Verwendung von anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 als Biolabel in heterogenen oder homogenen biologischen Assays, insbesondere Lnmunoassays, 201m qualitativen oder quantitativem Nachweis von Biomolekülen, insbesondere der quantitativen PCR.
9. Verwendung von anorganische Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 als Marker oder Label in der Molekular- und/oder Zellbiologie, in der medizinischen Diagnostik oder Therapeutik.
10. Verwendung von anorganischen Nanoteilchen mit einer hydrophilen Oberfläche gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 als Füllstoff oder Zusatzstoff in Polymeren, als Zusatzstoff in organischen oder anorganische Lack- oder Coatingsystemen, und/oder als Zusatzstoffe in Tinten.
EP06743079A 2005-06-09 2006-05-27 Hydrophile nanoteilchen mit funktionellen oberflächengruppen, deren herstellung und verwendung Withdrawn EP1893720A1 (de)

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