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Die Erfindung betrifft eine diagnostische Vorrichtung zur Analyse von Körperflüssigkeiten, bei der ein Fluoreszenzlicht mit zumindest einem Teil der von einer Lichtquelle emittierten Lichts auf den Fluoreszenzstandard trifft. Eine Sensoreinheit erfasst zumindest einen Teil des vom Fluoreszenzstandard emittierten Lichts.
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Es ist bekannt, Fluoreszenzstandards in diagnostischen Vorrichtungen zur Analyse von Körperflüssigkeiten als internen Referenzstandard, Kalibrierstandard und/oder Qualitätssicherungsstandard einzusetzen. Bei bekannten Messvorrichtungen wird die Körperflüssigkeit selbst, vorzugsweise versetzt mit einer zusätzlichen Reagenz mit sogenannten Markern zur Markierung ausgewählter Stoffe in der Körperflüssigkeit, oder auf Messstreifen aufgebrachte Körperflüssigkeit mit dem von einer Lichtquelle emittierten Licht bestrahlt und das von der zu untersuchenden Flüssigkeit oder dem Teststreifen reflektierte Licht mit Hilfe eines fotometrischen Sensors erfasst. In der Messvorrichtung kann mindestens eine Referenzkurve hinterlegt sein, die eine Beziehung zwischen dem erfassten, von der Probe abgestrahlten Licht und den daraus ableitbaren gesuchten Analysewerten oder medizinisch aussagekräftigen Werten angibt. Eine solche Referenzkurve stellt beispielsweise die Beziehung zwischen den Emissionswerten und einer bestimmten Substratkonzentration in der untersuchten Flüssigkeit her. Die ermittelten Messwerte hängen jedoch stark vom Zustand der Messvorrichtung, insbesondere von der Verschmutzung der Lichtquelle und der Messeinrichtung aber auch von den Eigenschaften ggf. verwendeter Teststreifen ab. Alternativ oder zusätzlich zur Referenzkurve kann ein interner Referenzstandard vorgesehen sein, der gleichzeitig oder sequentiell zur zu untersuchenden Probe mit Licht der Lichtquelle bestrahlt und das vom internen Referenzstandard abgestrahlte Licht mit Hilfe der Messvorrichtung erfasst wird. Dann wird das Messergebnis der Probe im Verhältnis zum Messergebnis des internen Referenzstandards angegeben. Alternativ oder zusätzlich kann ein sogenannter Kalibrierstandard mit vorbekannten Eigenschaften genutzt werden, um einen internen Standard und/oder die Referenzkurve der Messvorrichtung zu kalibrieren.
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Ferner kann ein Standard als sogenannter Qualitätssicherungsstandard genutzt werden, um die ermittelten Messergebnisse mit den bekannten Eigenschaften des Qualitätssicherungsstandards zu vergleichen und dabei die Genauigkeit der Messergebnisse der Messvorrichtung zu überprüfen. Der Qualitätssicherungsstandard wird vorzugsweise anstatt einer zu untersuchenden Probe in die Messvorrichtung eingesetzt.
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Die erwähnten bekannten Messvorrichtungen können zur quantitativen Bestimmung der Konstellation von Fluorophoren mindestens einer Substanz in einer Probe eingesetzt werden. Die erwähnte Lichtquelle dient dabei als Anregungslichtquelle, die Licht mit einer Anregungswellenlänge abstrahlt. Die Probe wird mit dem Licht der Anregungslichtquelle bestrahlt. Die Intensität des von der Probe ausgehenden Fluoreszenzlichts einer Emissionswellenlänge wird mittels eines Empfangselements, wie einem photometrischen Sensor, gemessen. Üblicherweise wird zum Kalibrieren eines gemessenen Intensitätswerts des Fluoreszenzlichts ein sogenannter Fluoreszenzstandard verwendet, der bei der Einstrahlung des Anregungslichts vorgegebener Wellenlänge und Intensität Fluoreszenzlicht mit einer bekannten Wellenlängenverteilung und Intensität abstrahlt. Die Langzeitstabilität von Fluoreszenzstandards dieser Art ist aber im allgemeinen ungenügend, da diese organische Substanzen umfassen, die insbesondere bei Licht- und Temperatureinwirkung Alterungsprozessen unterliegen. Ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen der Fluoreszenz eines Testmusters sind beispielsweise aus dem Dokument
EP 0 237 363 A2 bekannt.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Analyse von Körperflüssigkeiten anzugeben, die einen Fluoreszenzstandard umfasst, der eine relativ hohe Langzeitstabilität aufweist und relativ einfach herzustellen ist.
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Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.
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Durch die Verwendung von Quantenpunkten als Fluorophore im Fluoreszenzstandard der Vorrichtung wird gegenüber organischen Fluorophoren eine erhebliche verbesserte Kurz- und Langzeitstabilität des Fluoreszenzstandards und somit der Vorrichtung erreicht.
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Der polymere Kunststoff ermöglicht in einem breiten Wellenlängenbereich den Durchtritt von einfallendem Licht auf die Quantenpunkte und den Austritt des von den Quantenpunkten abgestrahlten Lichts. Somit wird eine ungewollte Filterung bestimmter Wellenlängenbereiche vermieden.
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Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Quantenpunkte im Kunststoff im Wesentlichen homogen verteilt sind. Dadurch hat der Fluoreszenzstandard über seine räumliche Ausdehnung im Wesentlichen gleiche fluoreszierende Eigenschaften.
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Weiterhin ist es vorteilhaft, als polymeren Kunststoff Polymethylmethacrylat (PMMA) zu verwenden. Es wurde herausgefunden, dass polymerer Kunststoff, insbesondere PMMA, sowohl im ultravioletten als auch im sichtbaren Bereich ein geeignetes Transmissionsspektrum hat. Insbesondere sind alle polymeren Kunststoffe geeignet, die Licht im Ultraviolettbereich zwischen 360 nm und 370 nm sowie im sichtbaren Bereich zwischen 600 nm und 630 nm durchlassen, da sowohl geeignete, in den zu untersuchenden Proben enthaltene Farbstoffe als auch die Quantenpunkte im Fluoreszenzstandard mit UV-Licht im Bereich zwischen 360 nm und 370 nm angeregt und Licht im sichtbaren Bereich zwischen 600 nm und 630 nm abstrahlen. Bei der Auswahl anderer Fluoreszenzstoffe bzw. anderer geeigneter Quantenpunkte können jedoch auch andere Wellenlängen des Anregungslichts und des Fluoreszenzlichts vorgesehen werden. Auch für diese Fluoreszenzstoffe ist ein polymerer Kunststoff als Matrixmaterial zur räumlichen Anordnung der Quantenpunkte sowie deren Abschottung gegenüber Umgebungseinflüssen geeignet, da polymere Kunststoffe, insbesondere PMMA, Licht in breiten Wellenlängenbereichen relativ ungehindert hindurchtreten lässt. Der Transmissionsgrad von PMMA im Bereich zwischen 300 und 800 nm liegt nach Untersuchungen im Bereich von größer 70%. Insbesondere der relativ konstante Transmissionsgrad der polymeren Kunststoffe und besonders des PMMA führen zu einer besonderen Eignung dieser Stoffe als Matrixmaterial. Besonders eignen sich Quantenpunkte, die bei einer Bestrahlung mit Anregungslicht im UV-Bereich Licht im sichtbaren Bereich abstrahlen. Diese Eigenschaften der Quantenpunkte können über eine entsprechende Dimensionierung der Quantenpunkte bei deren Herstellung beeinflusst werden. Vorzugsweise werden Quantenpunkte genutzt, deren Wellenlängen des Anregungslichts und des abgestrahlten Fluoreszenzlichts etwa den jeweiligen Wellenlängen der in der Probe genutzten Farbmarker zur Sichtbarmachung von in der Probe vorhandenen Substanzen entsprechen.
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Ein Quantenpunkt ist eine nanoskopische Materialstruktur, meist aus Halbleitermaterial. Bei Quantenpunkten sind die Ladungsträger, d. h. Elektronen und Löcher, in ihrer Beweglichkeit in alle drei Raumrichtungen soweit eingeschränkt, dass ihre Energie nicht mehr kontinuierliche sondern nur noch diskrete Werte annehmen kann. Die Form der Quantenpunkte, ihre Größe und/oder die Anzahl von Elektronen kann bei ihrer Herstellung beeinflusst werden. Dadurch können elektronische und optische Eigenschaften der Quantenpunkte gezielt beeinflusst und dadurch Quantenpunkte mit gewünschten vorgegebenen Eigenschaften hergestellt werden. Insbesondere eine Heterostruktur der Quantenpunkte, die die Beweglichkeit der Kristallelektronen in allen drei Raumrichtungen einschränkt, sind die Energien in alle drei Raumrichtungen quantisiert. Quantenpunkte können beispielsweise durch eine Mikrostrukturierung von Quantenköpfen hergestellt werden. Eine andere Möglichkeit ist das chemische Ausfällen von Halbleitern in Flüssigkeiten oder Gelen. Damit sind zwar Strukturen in Kugelform herstellbar, wobei jedoch Schwankungen im Durchmesser von größer +/–10% auftreten. Ein Quantenpunkt wird auch als Quantum-Dot bezeichnet.
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Die Eigenschaften der Quantenpunkte können somit geplant und an die Anwendung angepasst werden. Übliche Quantenpunkte sind 3 nm bis 12 nm große Kristalle aus Halbmaterial, die Licht in einem schmalen definierten Wellenlängenbereich abgeben. Der Wellenlängenbereich ist abhängig von der Zusammensetzung der Quantenpunkte und ihrer Größe.
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Vorzugsweise erfolgt die Polymerisation eines Monomers nach dem Mischen des Monomers mit Quantenpunkten. Der durch die Polymerisation erzeugte Kunststoffblock kann anschließend durch eine mechanische Bearbeitung auf eine gewünschte Größe des Fluoreszenzstandards gebracht werden. Der polymere Kunststoff mit den dann eingeschlossenen Quantenpunkten kann einfach mechanisch bearbeitet werden, beispielsweise durch Sägen, Fräsen auf eine gewünschte Dimension gebracht werden. Durch Schleifen und Polieren kann eine gewünschte Oberfläche des Fluoreszenzstandards mit geeigneten optischen Eigenschaften erzeugt werden. Die vom polymeren Kunststoff umschlossenen Quantenpunkte sind langzeitstabil und haben nur vernachlässigbare oder keine Bleicheffekte.
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Für die Qualität des Fluoreszenzstandards ist es wesentlich, dass die fluoreszierenden Eigenschaften der Quantenpunkte während der Polymerisation nicht beeinträchtigt werden bzw. nur die fluoreszierenden Eigenschaften einer sehr geringen Anzahl von Quantenpunkten beeinträchtigt wird. Dazu ist es vorteilhaft, eine sehr geringe Polymerisationstemperatur im Bereich zwischen 60°C und 80°C, vorzugsweise im Bereich zwischen 73°C und 78°C, zu wählen. Ferner ist es vorteilhaft, bei der Polymerisatian auf das Gemisch aus Monomer und Quantenpunkten bzw. auf das Gemisch aus Monomer, Starter und Quantenpunkten, Ultraschall auszuüben. Durch den Ultraschall wird das Gemisch während der Polymerisation entgast, durchmischt und/oder der Start und der Verlauf der Polymerisation begünstigt. Vorzugsweise wird das Gemisch über ein Wasserbad erwärmt, über das auch der Ultraschall übertragen wird. Durch den Ultraschall wird insbesondere eine homogene Verteilung der Quantenpunkte im Kunststoff erreicht. Die homogene Verteilung und Entgasung des Gemischs während der Polymerisation kann jedoch auch auf andere geeignete Art und Weise, beispielsweise durch ein Rührwerk, erfolgen.
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Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Quantenpunkte eine polare funktionelle Gruppe, z. B. eine Carboxylgruppe aufweisen und mit dem Monomer zu einem Gemisch gemischt werden. Dadurch lässt sich auf einfache Art und Weise durch einfaches Rühren oder mit Hilfe von Ultraschall ein homogenes Gemisch aus Quantenpunkten und Monomer erzeugen.
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Vorteilhaft ist es, die Vorrichtung derart auszubilden, dass der Fluoreszenzstandard als interner Referenzstandard der Vorrichtung dient, als Kalibrierstandard zum Kalibrieren der Vorrichtung und/oder als Qualitätssicherungsstandard zum Überprüfen der Messergebnisse der Vorrichtung eingesetzt wird. Dabei können auch mehrere Fluoreszenzstandards in der Vorrichtung vorgesehen sein oder nur ein Fluoreszenzstandard als interner Referenzstandard, als Kalibrierstandard und/oder Qualitätssicherungsstandard in der Vorrichtung vorhanden sein.
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Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, die die Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Figuren anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
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Es zeigen:
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1 eine schematische Darstellung einer Messvorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren einer Substanz in einer Probe mit einem internen Referenzstandard;
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2 die Messvorrichtung nach 1 mit einem Qualitätssicherungsstandard;
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3 eine Anordnung zum Herstellen eines Fluoreszenzstandards; und
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4 einen Ablaufplan mit Verfahrensschritten zum Herstellen eines Fluoreszenzstandards mit Hilfe der Vorrichtung nach 3.
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In 1 ist eine Messvorrichtung 10 zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren einer Substanz in einer Probe mit Hilfe eines internen Referenzstandards 24 schematisch dargestellt. Eine erste Lichtquelle 12 dient als Anregungslichtquelle und sendet Licht mit einer Anregungswellenlänge λex aus. Das von der Lichtquelle 12 ausgesendete Licht passiert ein Filter 14, durch das ein relativ schmalbandiges Anregungslicht auf den zu untersuchenden Messstreifen 16 auftrifft. Auf dem Messstreifen 16 ist eine zu analysierende Körperflüssigkeit aufgebracht worden. Der Probestreifen enthält Farbmarker, die sich an eine zu erfassende Substanz, die sich in der als Probe zu untersuchenden Körperflüssigkeit befindet, anlagern. Diese Farbmarker haben eine fluoreszierende Eigenschaft, durch die sie bei einer Bestrahlung mit Anregungslicht der Wellenlänge λex Emissionslicht einer Wellenlänge λem abstrahlen, wobei die Wellenlänge λem von der Wellenlänge λex verschieden ist. Die Lichtquelle 12 und das Filter 14 bilden einen Senderzweig. Das von dem Messstreifen 16 abgestrahlte Fluoreszenzlicht λem passiert ein Filter 20 und trifft auf der Sensorfläche eines Sensorelements 22 auf. Das Sensorelement 22 und das Filter 20 bilden einen Empfangszweig.
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Abhängig von der vom Sensorelement 22 erfassten Lichtmenge bei der Bestrahlung des Probestreifens 16 mit dem Anregungslicht λex kann auf die Quantität der Fluorophore und somit auf die Quantität einer Substanz in der auf dem Messstreifen 16 befindlichen Körperflüssigkeit geschlossen werden. Die Messvorrichtung 10 enthält einen Fluoreszenzstandard, der als interner Referenzstandard 24 dient. Der Referenzstandard 24 kann durch eine Bewegung der Auflage 18 in Richtung des Pfeils P1 anstatt des Messstreifens 16 mit Anregungslicht λex bestrahlt werden. Der Referenzstandard 24 emittiert bei Bestrahlung mit Anregungslicht λex Fluoreszenzlicht λem, das im Empfangszweig zum Sensorelement 22 geleitet wird. Dadurch kann das Verhältnis der Fluorophore in der Probe des Messstreifens 16 relativ zu dem Referenzstandard 24 ermittelt und davon ausgehend auf die Quantität der Substanz in der Probe geschlossen werden. Alternativ kann eine Referenzkurve in der Messvorrichtung 10 hinterlegt sein, mit deren Hilfe ausgehend von der mit Hilfe des Sensorelements 22 ermittelten Lichtmenge des erfassten Emissionslichts λem der quantitative Anteil der Substanz in der Probe der auf dem Messstreifen 16 aufgebrachten Körperflüssigkeit ermittelt wird.
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In 2 ist die Messvorrichtung nach 1 dargestellt, wobei dort ein Fluoreszenzstandard 24a als Qualitätssicherungsstandard genutzt wird.
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Der Qualitätssicherungsstandard 24a wird nicht wie der interne Referenzstandard 24 bei jeder Messung als Vergleichsstandard herangezogen. Vielmehr wird der Qualitätssicherungsstandard 24a lediglich zu bestimmten Zeitpunkten, beispielsweise bei jeder Inbetriebnahme der Messvorrichtung 10, anstelle des Messstreifens 16 in die Messvorrichtung 10 eingelegt und die Lichtmenge des vom Qualitätssicherungsstandard 24a emittierten Lichts λem erfasst und mit einem bekannten, dem Qualitätssicherungsstandard 24a zugeordneten Referenzwert verglichen.
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Bei der Messvorrichtung 10 kann zusätzlich eine nicht dargestellte Monitordiode zum Einstellen der Intensität der von der Lichtquelle 12 abgestrahlten Lichtmenge des Anregungslichts λex vorgesehen werden. Die Monitordiode wird beispielsweise zwischen dem Filter 14 und dem Messstreifen 16 bzw. dem Filter 14 und dem Standard 24, 24a im Sendezweig angeordnet. Abhängig vom Signal der Monitordiode wird die Intensität der Lichtquelle 12 eingestellt. Ferner kann das Licht von der Lichtquelle 12 über einen Lichtleiter zum Filter 14 und/oder vom Filter 14 zum Probestreifen 16 bzw. zum Standard 24, 24a geleitet werden. Mit Hilfe des Lichtleiters kann das Anregungslicht λex homogenisiert werden. Ferner kann die Messvorrichtung 10 auch als scannendes System ausgebildet sein, bei dem mehrere Punkte des Messstreifens 16 nacheinander mit Anregungslicht λex bestrahlt werden und das von dem Messstreifen 16 emittierte Fluoreszenzlicht λem mit Hilfe des Sensorelements 22 erfasst werden. Alternativ zu einem scannenden System kann auch ein zweidimensionaler Sensor 22 eingesetzt und der Messstreifen 16 mit Licht der Lichtquelle 12 flächig beleuchtet werden. Alternativ oder zusätzlich zu den Filtern 14, 20 können Optiken zum Einstellen des Anregungslichts λex auf den Probestreifen 16 bzw. auf den Standard 24, 24a und/oder des Emissionslichtes λem auf das Sensorelement vorgesehen sein. Die Lichtquelle 12 kann als LED-Lichtquelle ausgeführt sein. Die Filtercharakteristik des Filters 14 ist vorzugsweise so gewählt, dass Filter 14 kein Licht mit der Wellenlänge λem passieren lässt. Das Filter 20 hat vorzugsweise eine Filtercharakteristik, durch die das Filter 20 kein Licht der Anregungslichtwellenlänge λex passieren lässt. Dadurch kann wirksam verhindert werden, dass mit Hilfe des Sensorelements 22 Licht erfasst wird, das vom Messstreifen 16 bzw. vom Standard 24, 24a reflektiert wird.
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In 3 ist eine Anordnung zum Herstellen eines Gemischs aus einem Polymethylmethacrylat (PMMA) und Quantenpunkten dargestellt. In einem Polymerisationsbehälter 52, der in ein Wasserbad 54 eingesetzt ist, ist ein Gemisch 68 aus einem Monomer, einem Starter zum Starten der Polarisation und Quantenpunkten enthalten. Das Wasserbad 54 umfasst ein Heizelement 60 und zwei Ultraschallelemente 56, 58, die über das Wasser 66 des Wasserbads 54 Ultraschall auf das Gemisch 68 applizieren. Mit Hilfe des Heizelements 60 wird das Wasser 66 auf eine Temperatur von in diesem Ausführungsbeispiel 75°C gebracht und über mehrere Stunden während des Polymerisationsprozesses zur Polymerisation des Monomers mit Hilfe einer Steuereinheit 62 konstant gehalten. Mit der Steuereinheit 62 ist ein nicht dargestellter Temperatursensor verbunden, der die Temperatur des Wassers 66 und/oder des Gemischs 68 erfasst und die Heizleistung des Heizelements 60 steuert. Ferner steuert die Steuereinheit 62 die Ultraschallelemente 56, 58, durch die über das Wasser 66 Ultraschall auf das Gemisch 68 appliziert wird. Durch diesen Ultraschall wird das Gemisch 68 während der Polymerisation durchmischt, sodass eine homogene Verteilung der Quantenpunkte im polymeren Kunststoff erreicht wird. Ferner erfolgt mit Hilfe des Ultraschalls eine Entgasung des Gemischs 68 während des Polymerisationsprozesses. Ferner kann durch den Ultraschall sowohl der Start der Polymerisation als auch der Polymerisationsprozess zumindest begünstigt werden. Alternativ oder zusätzlich zum Ultraschall kann auch ein Rührwerk vorgesehen sein, durch das das Gemisch 68 gemischt und/oder entgast wird. Mit Hilfe der Anordnung 50 wird somit ein polymerer Kunststoff mit darin enthaltenen Quantenpunkten erzeugt. Dieser polymere Kunststoff kann nach Abschluss der Polymerisation mechanisch zu einem Fluoreszenzstandard weiterverarbeitet werden. Beispielsweise kann dieser polymere Kunststoff einfach mechanisch bearbeitet, insbesondere gesägt, gefräst und geschnitten werden. Dadurch kann ein Fluoreszenzstandard gewünschter Abmessung erzeugt werden. Eine günstige Abmessung eines solchen Standards ist beispielsweise 1 mm × 1 mm × 5 mm. Ein solcher Standard kann einfach in vorhandene Messgeräte als Referenzstandard, Qualitätssicherungsstandard oder Kalibrierstandard eingesetzt werden.
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In 4 sind Ablaufschritte zur Herstellung eines Fluoreszenzstandards schematisch dargestellt. Im Schritt S1 wird der Ablauf gestartet. Anschließend wird im Schritt S2 ein Monomer, vorzugsweise ein Gemisch aus zwei Komponenten, in einen Polymerisationsbehälter 52 eingebracht. Anschließend wird im Schritt S3 ein Starter hinzugefügt und ein Gemisch aus dem Monomer und dem Starter erzeugt. Anschließend wird im Schritt S4 ein Fluorophor in Form von Quantenpunkten hinzugefügt und ein Gemisch aus Monomer, Starter und Fluorophor erzeugt. Es wird darauf hingewiesen, dass bei anderen Ausführungsformen die Schritte S2, S3 und S4 in anderer beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden können.
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Anschließend wird im Schritt S5 die Polymerisation durch Aufheizen des Gemischs, beispielsweise im Wasserbad 54 gestartet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird zusätzlich zum Aufheizen des Gemischs Ultraschall auf das Gemisch appliziert, durch den das Gemisch durchmischt und/oder die Polymerisation zumindest begünstigt wird. Anschließend wird im Schritt S6 gewartet, bis der Polymerisationsprozess beendet ist. Nachfolgend wird der polymere Kunststoff mit den darin enthaltenen Quantenpunkten in geeignete Stücke geschnitten, die dann als Fluoreszenzstandard in diagnostischen Vorrichtungen zur Analyse von Körperflüssigkeiten eingesetzt werden können. Im Schritt S8 ist der Ablauf beendet.
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Die Quantenpunkte im Fluoreszenzstandard sind vorzugsweise in der Art designt, dass sie bei einem Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 365 nm Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge von 625 nm emittieren. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die an eine Substanz der Probe angelagerten Marker ebenfalls bei einem Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 365 nm Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge von 625 nm emittieren.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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