DE102010016801A1

DE102010016801A1 - Fluoreszenz-Detektionseinheit für eine Flüssigchromatographie-Einrichtung

Info

Publication number: DE102010016801A1
Application number: DE201010016801
Authority: DE
Inventors: Stephan Landgraf
Original assignee: Technische Universitaet Graz; Forschungsholding TU Graz GmbH
Current assignee: TECHNISCHE UNIVERSITAET GRAZ, AT
Priority date: 2010-05-05
Filing date: 2010-05-05
Publication date: 2011-11-10

Abstract

Es werden eine Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) für eine Flüssigchromatographie-Einrichtung und ein zugehöriges Detektionsverfahren beschrieben. Die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) umfasst mindestens eine Halbleiterlichtquelle (12) zum Erzeugen von Fluoreszenz-Anregungslicht (24) sowie eine Stromquelle (14, 16), die geeignet ist, der Halbleiterlichtquelle (12) einen gepulsten oder zeitlich modulierten Strom zuzuführen. Die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) umfasst ferner eine Durchflusszelle (18), die mit einer Flüssigchromatographie-Einrichtung derart verbunden oder verbindbar ist, dass sie von dessen mobiler Phase durchlaufen werden kann, und einen Detektor, insbesondere Photomultiplier (32), zum Empfangen einer Fluoreszenz-Emission (26) von einem in der mobilen Phase enthaltenen Analyten. Schließlich umfasst die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) eine Auswerteeinheit (36) zum Ermitteln der Intensität der Fluoreszenzemission und der Lebensdauer des angeregten Zustandes des Analyten mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung bei gepulstem bzw. mittels Modulationsfluorometrie bei modulierter Stromzufuhr.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Flüssigchromatographie und insbesondere der HPLC-Technik (High-Performance-Liquid-Chromatography) und betrifft speziell eine Fluoreszenz-Detektionseinheit hierfür.
VERWANDTER STAND DER TECHNIK
Die Flüssigchromatographie ist ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem die zu untersuchende Substanz zusammen mit einem Laufmittel, dem sogenannten „Elutionsmittel” oder „Eluent” als mobile Phase durch eine Trennsäule gepumpt wird. In der Trennsäule befindet sich ferner eine stationäre Phase. Je stärker ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz mit der stationären Phase wechselwirkt, desto später tritt sie am Ende der Trennsäule aus, wo sie dann mit einem geeigneten Detektor nachgewiesen werden kann. Die Verzögerung des Austritts der zu untersuchenden Substanz wird als Retentionszeit bezeichnet und kann zur Trennung oder Charakterisierung von Analyten verwendet werden.
Die Retentionszeit wird ermittelt, indem man das Auftreten der Substanz am Ende der Trennsäule in Abhängigkeit von der Zeit detektiert, beispielsweise durch Fluoreszenzdetektion. Dabei wird die Substanz durch Licht mit geeigneter Wellenlänge angeregt und nachfolgend das bei der Relaxation des angeregten Zustandes emittierte Fluoreszenzlicht detektiert. Ein Peak in der Intensität des Fluoreszenzlichtes weist dann auf eine erhöhte Konzentration der Substanz am Ausgang der Trennsäule hin.
Durch Vergleich der Retentionszeit der unbekannten Substanz mit derjenigen eines Standards, d. h. derjenigen einer bekannten Substanz für die betreffende Flüssigchromatographie-Einrichtung, können Substanzen grundsätzlich anhand ihrer Retentionszeit identifiziert werden. Ein Problem dabei ist jedoch, dass unterschiedliche Substanzen sehr ähnliche Retentionszeiten haben können. Um diese noch messbar auflösen zu können werden dann sehr lange Trennsäulen benötigt, so dass die absoluten Retentionszeiten erhöht und damit Unterschiede in der Retentionszeit besser messbar werden. Dies hat jedoch den Nachteil, dass der Durchsatz der Analyse verringert wird. Ferner wird bei einer größeren Trennsäule mehr Elutionsmittel benötigt, was sowohl hinsichtlich der Kosten als auch der Umweltbelastung nachteilig ist.
Zur Unterstützung der Analysegenauigkeit kann ein weiterer Detektor oder eine weitere Detektionsmodalität vorgesehen sein. Beispielsweise kann zusätzlich zur Fluoreszenz-Intensität das Fluoreszenzspektrum analysiert und mit demjenigen bekannter Analyten abgeglichen werden. Zur Aufzeichnung eines Fluoreszenzspektrums ausreichender Qualität darf jedoch die Konzentration des Analyten nicht zu gering sein, und sie muss regelmäßig deutlich oberhalb der Konzentration der Nachweisgrenze für einfache Fluoreszenz-Intensitätsmessungen liegen. Daher ist die Identifikation über das Fluoreszenzspektrum für den Nachweis geringer Analytenkonzentrationen nicht geeignet.
Weitere Detektoren, die bei der HPLC zur Anwendung kommen können, sind Lichtstreudetektoren, Brechungsindexdetektoren, Massenspektrometer, Leitfähigkeitsdetektoren, elektrochemische Detektoren und Radioaktivitätsdetektoren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung für eine Flüssigchromatographie-Einrichtung anzugeben, die einen Nachweis auch geringer Analytenkonzentrationen bei moderater Trennsäulenlänge und somit kurzer Analysezeit gestattet. Ferner soll die Detektionsvorrichtung geeignet sein, bei kommerziell erhältlichen HPLC-Einrichtungen zum Einsatz zu kommen, die routinemäßig in Analyselabors eingesetzt werden können und keine besonderen Anforderungen an Bedienung und Wartung stellen.
Diese Aufgabe wird durch eine Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung nach Anspruch 1 und ein Verfahren nach Anspruch 13 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß umfasst die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung mindestens eine Halbleiterlichtquelle zum Erzeugen von Fluoreszenz-Anregungslicht, bei der es sich insbesondere um eine Laserdiode (LD) oder eine Leuchtdiode (LED) handeln kann. Ferner umfasst sie eine Stromquelle, die gemäß einer ersten Ausführungsform geeignet ist, der Halbleiterlichtquelle einen gepulsten Strom zuzuführen. Gemäß einer zweiten Ausführungsform ist die Stromquelle dazu ausgelegt, der Halbleiterlichtquelle einen zeitlich modulierten Strom zuzuführen. Die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung umfasst ferner eine Durchflusszelle, die mit einer Flüssigchromatographie-Einrichtung derart verbunden oder verbindbar ist, dass sie von dessen mobiler Phase durchlaufen werden kann, und einen Detektor, insbesondere Photomultiplier, zum Empfangen einer Fluoreszenz-Emission von einem in der mobilen Phase enthaltenen Analyten. Schließlich umfasst die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung eine Auswerte-Einheit zum Ermitteln der Intensität der Fluoreszenz-Emission und der Lebendauer des angeregten Zustandes des Analyten, und zwar gemäß der ersten Ausführungsform mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung (time-correlated single photon counting, TCSPC) bzw. gemäß der zweiten Ausführungsform mittels Modulations-Fluorometrie.
Die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung der Erfindung eröffnet also im Zuge ein und derselben Messung einen zweiten Informationskanal, nämlich Information bezüglich der Lebensdauer des angeregten Zustandes, zusätzlich zur Information bezüglich der Intensität der Fluoreszenz-Emission. Wie unten anhand eines Ausführungsbeispieles erläutert wird, gestattet diese zusätzliche Information eine Unterscheidung und Charakterisierung von Analyten, die bei einer reinen Fluoreszenz-Intensitätsmessung nicht unterschieden werden können.
Man beachte, dass in älteren wissenschaftlichen Publikationen bereits die Kombination von Lebensdauermessungen und Flüssigchromatographie erwogen wurde, beispielsweise in den Arbeiten von M. B. Smalley et al., Anal. Chem. 1993, 65, 3466–3472; 1995, 67, 1371–1376, oder von T. E. Johnston, Anal. Chem. 1995, 67, 2835–2841. Darin wurden phasenfluorometrische Messungen unter Verwendung eines modulierten HeCd-Lasers durchgeführt. Hierbei handelte es sich jedoch um einen wissenschaftlichen Versuchsaufbau, der sich nicht für Standarduntersuchungen im Analyselabor einsetzen lässt. Der apparative Aufwand, die Baugröße des Lasers, die Empfindlichkeit, die komplizierte Bedienung, die benötigte Hochspannungsversorgung etc. sind nur einige Gründe, weshalb derartige Experiment-Aufbauten niemals für kommerzielle Flüssigkeitschromatographie-Einrichtungen in Erwägung gezogen wurden, die routine- und standardmäßig im Analyselabor verwendet werden sollen. Ähnliche, für den Routineeinsatz ungeeignete Vorarbeiten findet man beispielsweise in der Veröffentlichung von M. A. Dvorak et al., Anal. Chem. 1997, 69, 3458–3564, in der ein Nd-YAG-Laser mit 10 ns Pulsdauer verwendet wurde.
Die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung der Erfindung hingegen verwendet mindestens eine Halbleiterlichtquelle, also typischerweise Laserdiode oder Leuchtdiode zur Erzeugung von Fluoreszenz-Anregungslicht in Kombination mit einer zugehörigen gepulsten oder modulierten Stromquelle. Derartige Halbleiterlichtquellen sind robust genug, um wartungsfrei im Analyselabor zur Anwendung zu kommen. Ferner sind sie klein und kompakt genug, um ohne Neukonstruktion mit herkömmlichen Flüssigchromatographie-Einrichtungen kombiniert zu werden. Stattdessen hat sich gezeigt, dass die Größe der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung der Erfindung diejenige üblicher Detektionsvorrichtungen nicht übersteigt und daher eine Nachrüstung von handelsüblichen Flüssigchromatographie-Einrichtungen gestattet.
Der Erfinder hat in früheren Veröffentlichungen den erfolgreichen Einsatz von Halbleiterlichtquellen für zeitaufgelöste Messungen demonstriert, vgl. S. Landgraf, „Application of laser diodes and ultrabright light emitting diodes for static and time-resolved optical methods in physical chemistry", in H. S. Nalwa und L. S. Rohwer (Eds.), Handbook of Luminescence, Display Materials and Devices, 2003, vol. 3, Chapter 9, 371–398, ISBN:1-58883-032-2; S. Landgraf, „Semiconductor Lights Sources in Modulation Fluorometry using Digital Storage Oscilloscopes", Reviews in Fluorescence, C. D. Geddes, J. R. Lakowicz (Eds.), 2004, Vol. 1, Chapter 15, 341–363, ISBN:0-306-48460-9; S. Landgraf, „Use of ultrabright LEDs for the Determination of Static and Timeresolved Fluorescence Information of Liquid and Solid Crude Oil Samples", J. Biochem. Biophys. Meth., 2004, 61(1–2), 125–134. Allerdings bezogen sich diese Vorarbeiten sämtlich auf stationäre Proben, die beliebig lange gemessen werden konnten. Im Gegensatz hierzu steht man bei der Fluoreszenz-Detektion in der Flüssigchromatographie vor dem Problem, dass der zu untersuchende Analyt nur in einem sehr kurzen Zeitfenster in der Durchflusszelle zur Verfügung steht, und man im typischen Fall einer unbekannten Probe nicht vorhersagen kann, zu welchem Zeitpunkt die tatsächlich vorhandenen Analyten auftauchen und wieder verschwinden. Überraschenderweise konnte der Erfinder jedoch feststellen, dass der erfindungsgemäße Aufbau es tatsächlich gestattet, selbst geringe Konzentrationen von Analyten sowohl hinsichtlich der Fluoreszenz-Intensität als auch der Lebensdauer zu charakterisieren. Ferner konnte der Erfinder feststellen, dass der „zweite Informationskanal”, nämlich die Lebensdauer, in der Tat geeignet ist, Analyten zu unterscheiden, die mit einer reinen Intensitätsmessung mit derselben Flüssigchromatographie-Einrichtung nicht unterscheidbar wären, wie unten anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels nachgewiesen wird.
Vorzugsweise beträgt die Frequenz der Pulse in der Stromzufuhr mindestens 10 MHz, vorzugsweise mindestens 20 MHz und besonders vorzugsweise mindestens 40 MHz. Vorzugsweise ist die Pulsfrequenz dabei einstellbar. Anschaulich gesprochen entspricht jeder Puls einer Fluoreszenzmessung, die einen Beitrag zur Intensität des Fluoreszenzsignals liefert. Gleichzeitig gibt der zeitliche Abstand zwischen dem Anregungspuls und der Fluoreszenz-Emission Aufschluss über die Lebensdauer des angeregten Zustandes. Die Relaxation des angeregten Zustandes ist jedoch ein statistischer Prozess, der im einfachsten Fall durch eine exponentielle Relaxation mit einer einzigen Relaxationsrate charakterisiert ist. Diese Rate muss aus einer Vielzahl von Messungen individueller Lebensdauern rekonstruiert werden, wobei jeder Anregungspuls (maximal) einen Datenpunkt liefert. Gleichzeitig muss eine ausreichende Anzahl an Datenpunkten in der kurzen Zeit gesammelt werden, zu der der Analyt durch die Durchflusszelle strömt. Der Erfinder konnte jedoch feststellen, dass mit Pulsfrequenzen in dem oben genannten Bereich ausreichend viele Datenpunkte gesammelt werden können, um eine Relaxationsrate und somit die Lebensdauer zu ermitteln.
Falls die Lebensdauer alternativ mit Hilfe der Modulations-Fluorometrie ermittelt wird, liegt die Modulationsfrequenz vorzugsweise in einem Bereich von 100 bis 200 MHz, vorzugsweise in einem Bereich von 50 bis 400 MHz. Vorzugsweise ist die Modulationsfrequenz dabei einstellbar. Dies gestattet es, die Modulationsfrequenz so an die Lebensdauer eines zu einer bestimmten Retentionszeit erwarteten Analyten anzupassen, dass die Lebensdauer mit einer hohen Genauigkeit bestimmt werden kann. Im einfachsten Fall einer monoexponentiellen Relaxation entspricht die Lebensdauer dem tangens der Phase zwischen Anregungslicht und Fluoreszenz-Emission, geteilt durch die Winkelfrequenz der Modulation. Dies bedeutet, dass bei kürzeren Lebensdauern eine entsprechend höhere Modulationsfrequenz angelegt werden sollte, um einen gut messbaren Phasenunterschied zu erhalten. Damit die Detektionsvorrichtung für eine Vielzahl von Analyten mit typischerweise sehr unterschiedlich langen Lebensdauern einsetzbar ist, bietet sich der oben beschriebene Einstellbereich für die Modulationsfrequenz an.
Eine Fluoreszenz-Emission tritt selbstverständlich nur dann auf, wenn der Analyt mit einer Wellenlänge angeregt wird, die vom Analyten auch absorbiert werden kann. Je nach Analyt können die geeigneten Anregungswellenlängen im Nahinfraroten (NIR) Bereich, im sichtbaren Bereich oder im UV-Bereich liegen. Beispielsweise kann man polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH, Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) mit vier Ringen mit Wellenlängen von 400 nm anregen, während man für solche mit drei Ringen bereits Wellenlängen von ca. 360 nm und für solche mit zwei Ringen Wellenlängen von nur 310 nm benötigt. Die Anregung von Fettsäuren macht noch kürzeres Anregungslicht erforderlich, etwa im Bereich von 290 nm.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung daher mindestens zwei, vorzugsweise mindestens vier und besonders vorzugsweise mindestens sechs Halbleiterlichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen und eine Schalteinrichtung, durch die die Halbleiterquellen selektiv mit der Stromquelle verbindbar sind. Durch diesen Aufbau kann einfach zwischen unterschiedlichen Anregungswellenlängen umgeschaltet werden. In einem Messprotokoll kann dann zu jeder bestimmten Retentionszeit, zu der ein möglicher Analyt auftauchen kann, die dazu passende Wellenlänge eingestellt werden.
Man beachte, dass bei herkömmlichen HPLC-Einrichtungen eine starke Lichtquelle und zugehörige Farbfilter eingesetzt würden, die in einem Filterrad oder ähnlichem untergebracht sind. Abgesehen davon, dass derartige herkömmliche HPLC-Einrichtungen nicht zu einer zeitaufgelösten Fluoreszenz-Detektion in der Lage sind, treten durch die Verwendung der Filter hohe Verluste auf, und eine rasche Änderung der Anregungswellenlänge ist aufgrund der mechanischen Trägheit des Filterrades schwierig. Im Gegensatz hierzu gestattet es diese Weiterbildung der Erfindung, elektronisch zwischen unterschiedlichen Anregungswellenlängen umzuschalten. Da Halbleiterlichtquellen wie LEDs und LDs sehr klein und kompakt sind, können ohne Weiteres zwei, vier, sechs oder noch mehr von ihnen in einer Detektionsvorrichtung untergebracht werden, die immer noch so kompakt ausgebildet ist, dass sie sich mit herkömmlichen HPLC-Einrichtungen kombinieren lassen. Dies ist mit einer Mehrzahl herkömmlicher Laser offensichtlich nicht möglich.
Vorzugsweise sind mindestens zwei der Halbleiterlichtquellen auf unterschiedlichen, vorzugsweise gegenüberliegenden Seiten der Durchflusszelle angeordnet. In einer vorteilhaften Weiterbildung sind Lichtleiter vorgesehen, um Anregungslicht von einer Halbleiterlichtquelle zu einer Einstrahlposition in die Durchflusszelle zu leiten. Auf diese Weise können mehrere Halbleiterlichtquellen selektiv von derselben Seite in die Durchflusszelle einstrahlen. Selbst bei kleinen Durchflusszellen ist es möglich, mehrere Lichtleiter nebeneinander von einer Seite einzukoppeln.
In einer vorteilhaften Weiterbildung ist die mindestens eine Halbleiterlichtquelle austauschbar in der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung angeordnet. Dies bedeutet, dass die identische Detektionsvorrichtung für völlig unterschiedliche Klassen von Analysten verwendet werden kann, indem die geeigneten Halbleiterlichtquellen eingesetzt werden. Dazu ist vorzugsweise ein Satz von Halbleiterlichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen vorgesehen, dessen Anzahl die maximale Anzahl von gleichzeitig in der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung verwendbaren Halbleiterlichtquellen übersteigt. Wenn beispielsweise vier Halbleiterlichtquellen gleichzeitig in die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung einsetzbar (und selektiv ansteuerbar) sind, so könnte die Vorrichtung dennoch über einen Satz von acht oder zehn Halbleiterlichtquellen verfügen, von denen je nach zu untersuchender Probe vier passende ausgewählt werden, mit denen alle zu detektierenden Analyte abgedeckt werden. Das Auswechseln der Halbleiterlichtquellen ist einfach und justagefrei und kann von jedem Laboranten routinemäßig durchgeführt werden.
Vorzugsweise ist zwischen der Durchflusszelle und dem Detektor eine Langpassfiltereinrichtung angeordnet. Die Langpassfiltereinrichtung dient dazu, gestreutes kurzwelligeres Anregungslicht abzublocken und das Fluoreszenzlicht durchzulassen. Der Langpassfilter hat somit eine Durchlassschwelle für Wellenlängen, unterhalb derer er Licht abblockt und oberhalb derer er es durchlässt. Diese Durchlassschwelle muss zwischen der Wellenlänge des Anregungslichtes und derjenigen des Fluoreszenzlichtes liegen.
Wenn Lichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlangen zum Einsatz kommen, wird es in vielen Fällen nötig sein, den Langpassfilter entsprechend anzupassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Langpassfilter Bereiche, in denen die jeweilige Durchlassschwelle bei unterschiedlichen Wellenlängen liegt, und ist die Langpassfiltereinrichtung derart mechanisch verstellbar, dass unterschiedliche Bereiche in den Lichtweg der Fluoreszenz-Emission gebracht werden können.
Die Bereiche mit unterschiedlichen Durchlassschwellen können beispielsweise in einem herkömmlichen Filterrad angeordnet sein. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform kommt jedoch eine Langpassfiltereinrichtung zum Einsatz, bei der sich die Wellenlänge der Durchlassschwelle entlang einer räumlichen Achse der Langpassfiltereinrichtung ändert, und die entlang dieser Achse verschiebbar angeordnet ist. Der Vorteil dieser Anordnung gegenüber einem Filterrad besteht darin, dass die Bewegung aufgrund eines geringeren Trägheitsmomentes schneller ausführbar ist, und dass sich sogar eine stufenlose und damit optimale Anpassung der Durchlassschwelle an das verwendete Anregungslicht und die Fluoreszenzwellenlänge des erwarteten Analyten erreichen lässt.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Volumen der Durchflusszelle zwischen 10 und 50 μl, besonders vorzugsweise zwischen 15 und 35 μl. Der Erfinder hat festgestellt, dass sich bei diesen Abmessungen besonders gute Messresultate ergeben. Ein größeres Volumen der Durchflusszelle wird gegenwärtig als nachteilig angesehen, weil dadurch eine räumliche Durchmischung und somit Verfälschung der Retentionszeit hervorgerufen werden kann.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Blockdiagramm, das schematisch den Aufbau und das Messprinzip der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung nach einer Weiterbildung der Erfindung zeigt;
2 zeigt eine Anordnung von Halbleiterlichtquellen in Bezug auf eine Durchflusszelle;
3 ist eine Tabelle mit Eigenschaften eines untersuchten PAH-Cocktails;
4 zeigt die Strukturformeln der PAHs des untersuchten Cocktails;
5 ist eine Tabelle mit weiteren PAHs, die mit der Ausführungsform von 1 detektierbar sind;
6 zeigt in dem oberen Diagramm die Intensität der Fluoreszenz-Emission und in dem unteren Diagramm die Lebensdauer des angeregten Zustandes in Abhängigkeit von der Retentionszeit;
7 zeigt dieselben Diagramme wie 6, jedoch bei 10-fach verdünnter Probe;
8 ist eine Tabelle mit Ergebnissen der Lebensdauermessung;
9 ist eine Tabelle mit Ergebnissen der Intensitätsmessung;
10 zeigt das Ergebnis der Lebensdauermessung für einzelne PAHs;
11 ist eine Tabelle, die die Sensitivität und Nachweisgrenze für die untersuchten Analyte in der Intensitätsmessung zeigt;
12 ist eine Tabelle, die die Sensitivität und Nachweisgrenze für die untersuchten Analyte in der Lebensdauermessung zeigt;
13 ist ein Diagramm, das die Spektren aktuell erhältlicher UV-LEDs zeigt.
BESCHREIBUNG DES BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELS
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird im Folgenden auf das in den Zeichnungen dargestellte bevorzugte Ausführungsbeispiel Bezug genommen, das anhand spezifischer Terminologie beschrieben ist. Es seit jedoch darauf hingewiesen, dass der Schutzumfang der Erfindung dadurch nicht eingeschränkt werden soll, da derartige Veränderungen und weitere Modifizierungen an der gezeigten Vorrichtung und dem Verfahren sowie derartige weitere Anwendungen der Erfindung, wie sie darin aufgezeigt sind, als übliches derzeitiges oder künftiges Fachwissen eines zuständigen Fachmanns angesehen werden.
1 ist ein Blockdiagramm, das schematisch den Aufbau der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung 10 nach einer Weiterbildung der Erfindung zeigt. Die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung 10 von 1 umfasst eine Halbleiterlichtquelle 12, bei der es sich um eine Laserdiode (LD) oder eine Leuchtdiode (LED) handeln kann. Obwohl in 1 nur eine Halbleiterlichtquelle 12 gezeigt ist, kann die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung 10 in einer vorteilhaften Weiterbildung auch mehrere Halbleiterlichtquellen 12 mit unterschiedlichen Wellenlängen umfassen, die selektiv ansteuerbar sind.
Ferner umfasst die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung 10 eine Stromquelle, um die Halbleiterlichtquelle 12 mit Strom zu versorgen. In dem Blockdiagramm von 1 sind zwei alternative Ausführungsformen zusammengefasst. Bei der ersten Ausführungsform ist die Stromquelle ein Pulserzeuger 14, der geeignet ist, der Halbleiterlichtquelle 12 einen gepulsten Strom zuzuführen. Die Pulsfrequenz des Pulserzeugers ist zwischen 10 MHz und 40 MHz einstellbar. In einer alternativen Ausführungsform ist die Stromquelle durch einen Modulator 16 gebildet, der die Halbleiterlichtquelle 12 mit einem Strom versorgt, der zusammengesetzt ist aus einem Gleichstrom einer bestimmten Stärke und einer zusätzlichen Sinus-Modulation. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Modulationsfrequenz des Modulators 16 in einem Bereich von 50 bis 400 MHz einstellbar.
Weiter umfasst die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung 10 eine Durchflusszelle 18, die in der bevorzugten Ausführungsform aus Quarzmaterial besteht, eine geringe Eigenlumineszenz hat und durch geschwärzte Wände gut abgeschirmt ist. Vorzugsweise hat die Durchflusszelle 18 einen Volumen von 25 μl, ist aber nicht auf diese Ausführungsform beschränkt. Die Durchflusszelle 18 ist mit einer Flüssigchromatographie-Einrichtung (nicht gezeigt) verbunden oder verbindbar. Die erfindungsgemäße Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung kann somit Teil einer Flüssigchromatographie-Einrichtung sein, oder eine Komponente bilden, mit der eine Flüssigchromatographie-Einrichtung nachgerüstet oder ergänzt werden kann. Durch die Durchflusszelle 18 fließt auf herkömmliche Weise die mobile Phase der Flüssigchromatographie-Einrichtung, die in 1 durch Pfeile 20 symbolisch dargestellt ist.
Die Durchflusszelle 18 hat eine erste Seite 22a, in die Anregungslicht 24, welches von der Halbleiterlichtquelle 12 erzeugt wird, eingekoppelt wird. Wenn ein passender Analyt in der mobilen Phase 20 enthalten ist, wird dieser durch das Anregungslicht 24 angeregt. Bei der Relaxation aus dem angeregten Zustand emittiert der Analyt Fluoreszenzlicht 26, das an einer zweiten Seite 28 aus der Durchflusszelle 18 ausgekoppelt wird, durch einen Langpassfilter 30 hindurch tritt und auf einen Photomultiplier-Detektor 32 auftrifft. Der Langpassfilter 30 hat eine Durchlassschwelle für Licht mit bestimmten Wellenlängen. Licht mit Wellenlängen, die unterhalb der Durchlassschwelle liegen, wird im wesentlichen geblockt, während Licht mit Wellenlängen oberhalb der Durchlassschwelle im wesentlichen durchgelassen wird. Die Durchlassschwelle liegt oberhalb der Wellenlänge des Anregungslichtes 24, aber unterhalb derjenigen der Fluoreszenz-Emission 26 des Analyten. Auf diese Weise kann verhindert werden, dass das vom Photomultiplier-Detektor 32 (PMT, Photomultiplier tube) detektierte Fluoreszenzsignal 26 durch gestreutes Anregungslicht 24 verfälscht wird. Man beachte, dass der Lichtweg für das detektierte Fluoreszenzlicht in einem Winkel von etwa 90° zu der Einstrahlrichtung des Anregungslichtes 24 liegt.
An den Photomultiplier 32 schließt ein Verstärker 34 an, der die Signale des Photomultipliers 32 verstärkt. Mit dem Photomultiplier 32 und dem anschließenden Signalverstärker 34 werden einzelne Photonen des Fluoreszenzlichtes 26 detektiert.
Schließlich enthält die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung 10 eine Auswerteeinheit 36, die dazu ausgelegt ist, aus den detektierten Photonen sowohl die Intensität der Fluoreszenz-Emission als auch die Lebensdauer des angeregten Zustandes des Analyten zu ermitteln. Dazu umfasst die Auswerteeinheit 36 in dem gezeigten Ausführungsbeispiel einen Zähler 38, mit dem detektierte Photonen gezählt werden, deren Anzahl ein Maß für die Intensität des Fluoreszenzlichtes 26 ist.
Zur Bestimmung der Lebensdauer des angeregten Zustandes des Analyten sind erfindungsgemäß zwei verschiedene Ausführungsformen vorgesehen. Die erste Ausführungsform ist eine Einrichtung zur zeitkorrelierten Einzelphotonen-Zählung (TCSPC, Time Correlated Single Photon Counting). Mit der TCSPC wird eine Zeit zwischen dem Anregungspuls und der Relaxation gemessen. Traditionell wird dies dadurch erreicht, dass der Anregungspuls aufgespalten wird und der eine Teil zu einem PMT und der andere zu der Probe gesendet wird. Wenn der erste Teilpuls von dem PMT-Detektor detektiert wird, aktiviert dieser eine Zeit-Amplituden-Wandlerschaltung. Diese Schaltung beginnt, einen Kondensator aufzuladen, der erst dann entladen wird, wenn der PMT-Detektor ein weiteres Photon, nämlich die Fluoreszenz-Emission empfängt. Je länger die Zeit zwischen Anregung und Fluoreszenz ist, desto größer ist das Spannungssignal der Zeit-Amplituden-Schaltung.
Abweichend von dieser traditionellen TCSPC-Technik wird bei der ersten Ausführungsform der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung der Anregungspuls allerdings nicht aufgeteilt. Vielmehr kann der Zeitpunkt des Anregungspulses direkt durch die Elektronik, die auch den Pulser 14 steuert, bereitgestellt werden.
Die TCSPC-Einrichtung misst also eine Vielzahl von Zeitintervallen zwischen Anregung und Fluoreszenzsignal, aus denen dann ein PC 42 die Lebensdauer des angeregten Zustandes berechnen kann. Für weitere Details wird auf die obengenannte Veröffentlichung des Erfinders „Application of laser diodes and ultrabright light emitting diodes for static and time-resolved optical methods in physical chemistry", in H. S. Nalwa und L. S. Rohwer (Eds.), Handbook of Luminescence, Display Materials and Devices, 2003, vol. 3, Chapter 9, 371–398, ISBN:1-58883-032-2 verwiesen.
In der zweiten Ausführungsform werden die detektierten Photonen mit einem digitalen Speicheroszilloskop 44 (DSO) aufgezeichnet. Die Lebensdauer des angeregten Zustandes kann durch eine Phasenverschiebung zwischen dem modulierten Anregungs- und dem zugehörigen Fluoreszenzsignal oder durch die Demodulation berechnet werden. Für eine genauere Erläuterung der Modulation-Fluorometrie wird auf den oben zitierten Artikel des Erfinders sowie die darin zitierten Referenzen verwiesen.
Im Folgenden wird das Messverfahren unter Verwendung der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung 10 gemäß der ersten Ausführungsform (TCSPC) beschrieben. Während die mobile Phase durch die Durchflusszelle 18 fließt, wird die Halbleiterlichtquelle 12 kontinuierlich durch den Pulserzeuger 14 betrieben, so dass kontinuierlich kurze Lichtpulse des Anregungslichtes 24 in die Durchflusszelle 18 eingekoppelt werden. Innerhalb eines jeden Messzeitintervalls von etwa 0,1 bis 1 s wird mit Hilfe des Zählers 38 die Intensität und mit Hilfe der TCSPC-Einrichtung 40 und dem PC 42 die Lebensdauer des fluoreszierenden Analyten durch eine entsprechende Anzahl Pulse (Größenordnung 10⁶) für dieses Zeitintervall ermittelt. Auf diese Weise wird also der zeitliche Verlauf der Intensität der Fluoreszenz und der Lebensdauer des fluoreszierenden Analyten aufgezeichnet. Durch die unterschiedlichen Retentionszeiten unterschiedlicher Analyten treten nur zu bestimmten Zeiten Analyten in die Durchflusszelle ein, und nur zu diesen für den Analyten charakteristischen Retentionszeiten entsteht ein Fluoreszenzsignal. Die Messintervalle sollten so kurz sein, dass unterschiedliche Analyte, d. h. unterschiedlichen Retentionszeiten aufgelöst werden können. Dies ist bei Messintervallen unterhalb einer Sekunde gegeben.
Durch Vergleichsmessungen ist bekannt, zu welchen Retentionszeiten bestimmte Analyten zu erwarten sind. Durch einen Peak in der Fluoreszenzintensität zu der charakteristischen Retentionszeit kann daher der Analyt nachgewiesen werden. Ebenso kann das Auftreten eines Analyten durch die Messung einer bestimmten Lebensdauer festgestellt werden. Wie unten anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert wird, können Analyten durch die kombinierte Information mit größerer Trennschärfe und Zuverlässigkeit detektiert und differenziert werden.
Man beachte, dass selbstverständlich nur dann ein Fluoreszenzsignal zu erwarten ist, wenn der betreffende Analyt den Anregungspuls 24 überhaupt absorbieren kann. Unterschiedliche Analyten absorbieren bei unterschiedlichen Wellenlängen. In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist es vorgesehen, dass eine Mehrzahl von Halbleiterlichtquellen 12 vorgesehen sind, die mit unterschiedlichen Wellenlängen emittieren. Zu einer bestimmten Retentionszeit, zu der ein potentiell vorhandener Analyt auftaucht, wird dann die zu diesem Analyten passende Halbleiterlichtquelle angesteuert (in 1 nicht gezeigt). Dies ist im Rahmen der Erfindung leicht möglich, da die verwendeten Halbleiterlichtquellen sehr klein sind, sodass die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung 10 eine Mehrzahl von ihnen aufnehmen kann und trotzdem ohne Weiteres in eine Flüssigchromatographie-Einrichtung integriert werden kann. Wenn Halbleiterlichtquellen 12 mit unterschiedlichen Wellenlängen zum Einsatz kommen, muss in der Regel auch die Durchlassschwelle des Langpassfilters 30 an die Wellenlänge des Anregungspulses 24 angepasst werden.
2(a) zeigt eine Anordnung von zwei Halbleiterlichtquellen 12a, 12b relativ zur Durchflusszelle 18. Obwohl dies in 2 nicht gezeigt ist, können beide Halbleiterlichtquellen 12a, 12b selektiv von dem Pulser 14 bzw. Modulator 16 mit Strom versorgt werden, um Licht mit der passenden Wellenlänge zu erzeugen. Die Halbleiterlichtquellen 12a, 12b sind auf gegenüberliegenden Seiten 22a, 22b der Durchflusszelle 18 angeordnet, und ihre Einstrahlrichtung ist senkrecht zum Lichtweg des Fluoreszenzlichts 26 zum PMT. Dadurch wird erreicht, dass nur verhältnismäßig wenig Anregungslicht 24 in Richtung des PMT-Detektors gestreut wird.
2(b) zeigt eine Ausführungsform, bei der vier Halbleiterlichtquellen 12a–12d vorgesehen sind. In diesem Fall ist es schwierig, zwei Halbleiterlichtquellen ohne weitere Hilfsmittel von jeweils einer Seite in die Durchflusszelle 18 einstrahlen zu lassen. Stattdessen sind Lichtleiter 46 vorgesehen, über die Licht von den jeweiligen Halbleiterlichtquellen 12a–12d in die Durchflusszelle 18 eingekoppelt werden kann. Der in 2(b) gezeigte Aufbau lässt sich auf sechs oder sogar acht Halbleiterlichtquellen erweitern. Mit anderen Worten kann die Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung durch Verwendung einer Mehrzahl von Halbleiterlichtquellen zwischen beispielsweise 2,4 oder sogar 8 Anregungslichtwellenlängen umschalten und somit ein äußerst vielfältiges Spektrum an Analyten abdecken.
Um die Funktionsfähigkeit und Leistungsfähigkeit der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung 10 von 1 zu demonstrieren, wurde mit dieser eine Analyse eines speziellen Cocktails aus sechs polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAH) untersucht. In 3 ist eine Tabelle gezeigt, die sämtliche Analyten aus dem Cocktail zusammenfasst. Dabei handelt es sich um das „PAH-Mix 1” in Methanol nach Dr. Ehrensdorfer Reference Materials, Augsburg, welches auch als WHO-6 bekannt ist. 3 zeigt die Strukturformeln der jeweiligen PAHs.
Die zweite Spalte der Tabelle von 3 gibt die „Eluierungsreihenfolge” an, d. h. die Reihenfolge, in der die Analyten am Ende der Trennsäule auftreten werden. Die vorletzte Spalte der Tabelle gibt die Nomenklatur der PAHs nach dem Standard U. S. EPA-16 an. Dieser bezeichnet die 16 wichtigsten PAHs, die von der United States Environmental Protection Agency (U. S. EPA) festgelegt wurden. Die letzte Spalte gibt die Chemical Abstract System Registration Number (CASRN) des betreffenden Analyten an.
Die Auswahl des PAH-Mix wurde so getroffen, dass sämtliche sechs Analyten mit ein und derselben Lichtquelle angeregt werden können, nämlich mit einer gepulsten Laserdiode mit einem Emissionsmaximum bei ca. 374 nm. Diese gepulste Laserdiode wurde mit einen 10 nm Interferenzfilter, der bei 375 nm zentriert war, aufbereitet. Die optische Pulsbreite betrug ca. 70 psec.
Die Tabelle von 5 listet fünf weitere PAHs gemäß U. S. EPA-16 auf, die mit derselben Lichtquelle hätten detektiert werden können, in dem PAH-Mix jedoch nicht enthalten waren.
Die verbleibenden fünf PAHs gemäß U. S. EPA-16 benötigen kurzwelligeres Anregungslicht. Diese könnten jedoch mit einer gemäß 2b weitergebildeten Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung erfasst werden, bei der neben der im tatsächlichen Experiment verwendeten 375 nm-LDs LEDs mit Wellenlängen von 340, 310 und 290 nm verwendet würden, die mittlerweile kommerziell erhältlich sind.
Die Versuche wurden mit einer verhältnismäßig kurzen Trennsäule durchgeführt, so dass das gesamte Experiment in etwa 12 Minuten abgeschlossen werden konnte, die tatsächliche Messdauer betrug jedoch 20 Minuten. Das PAH-Mix wurde mit einem gleichförmigen Laufmittel (96% Methanol, Rest Wasser) durchgeführt.
In 6 zeigt der obere Graph die Ergebnisse der Intensitätsmessung und der untere Graph die Ergebnisse der Lebensdauermessung in Abhängigkeit von der Zeit. Jeder Datenpunkt entspricht dem mittleren Intensitätswert bzw. dem mittleren Lebensdauerwert aus einem Messintervall von einer zehntel Sekunde. Selbst eine Zeitauflösung mit Messintervallen von 1 Sekunde wäre jedoch für Zwecke der Analyse noch ausreichend gewesen.
Obwohl sechs Analyten in der Probe vorhanden waren, zeigt das Intensitätsdiagramm von 6 (oberer Graph) lediglich vier Peaks. Dies bedeutet, dass die Flüssigchromatographie mit einer derart kurzen Trennsäule und zeitlich konstantem Laufmittel bereits an ihre Grenzen stößt. Insbesondere ist es in dieser sehr schneien Messung anhand des Intensitätsdiagramms nicht möglich, im Bereich von 350–450 s genau zuzuordnen, welcher Analyt präsent ist. Hierüber gibt jedoch die Messkurve in der Lebensdauerdarstellung (6 unten) unmittelbar Aufschluss.
Wie aus dem unteren Diagramm von 6 zu erkennen ist, liegen in diesem Bereich drei Analyten vor, die durch unterschiedliche Lebensdauern gekennzeichnet sind. Dies weist deutlich darauf hin, dass die Analyseschärfe durch den weiteren Informationskanal, nämlich die Lebensdauermessung, gesteigert werden kann.
Allerdings lassen sich die Analyten 15 und 16 nach U. S. EPA-16, d. h. die beiden als letztes aus der Trennsäule austretenden Analyten weder in der Intensitätsdarstellung allein noch in der Lebensdauerdarstellung allein unmittelbar voneinander trennen. Beide Analyten scheinen gleichzeitig bei etwa 610 Sekunden aufzutreten. Jedoch ist es möglich, durch die kombinierte Information (Intensität und Lebensdauer) und geeignete Mustererkennung festzustellen, dass tatsächlich zwei Analyten vorliegen. Der Informationsgehalt, der sich aus der kombinierten Messung mit zwei Informationskanälen erhalten lässt, übersteigt denjenigen der einzelnen Informationskanäle. Aus diesem Grund geht es bei der Erfindung auch nicht darum, die Intensitätsmessung durch eine Lebensdauermessung zu ersetzen, sondern beide Messungen zeitgleich auszuführen und bei der Identifizierung von Analyten vorteilhaft zu verarbeiten.
Bei einer ausreichend hohen Konzentration erreicht der Messwert der Lebensdauer für jeden Analyten einen Plateaubereich. Über diese Lebensdauer, die für den Analyten charakteristisch ist, lässt dieser sich weiter identifizieren, d. h. neben der Retentionszeit wird durch die Lebensdauer ein weiteres Charakteristikum zum Identifizieren von Analyten bereitgestellt.
Bei einer sehr geringen Konzentration des Analyten verkürzt sich jedoch die gemessene Lebensdauer (die tatsächliche Lebensdauer bleibt selbstverständlich dieselbe) und nähert sich langsam dem Hintergrund an, der in den vorgestellten Experimenten 2–3 ns beträgt. Dieser Effekt ist konzentrationsabhängig und lasst sich kalibrieren. Die Konzentrationsabhängigkeit des Lebensdauermesswertes ergibt sich bei diesem Aufbau aus dem geringen Abstand zwischen der Anregungs- und Emissionswellenlänge. Ramanstrahlung und unspezifische Lumineszenz der optischen Komponenten überlagern das Fluoreszenzsignal mit einer schnellen Komponente (kleiner als 2 ns), die sich nicht vollständig durch Filter in der Apparatur bzw. das Auswertungsprogramm eliminieren lassen, und zu einer Verfälschung des Lebensdauermesswertes führt, die bei abnehmender Konzentration mehr und mehr zum Tragen kommt.
7 zeigt die gleiche Messung wie 6, jedoch bei zehnfach verdünnter Probe. Man erkennt, dass in dem Intensitätsdiagramm der Peak bei 195 Sekunden praktisch verschwunden ist, d. h. hier ist bereits die Nachweisgrenze für die Intensitätsmessung erreicht. Im Gegensatz hierzu ist das Lebensdauersignal bei 195 Sekunden bei derselben geringen Konzentration sehr gut zu erkennen und sogar immer noch der höchste Peak in dem Signal. Dies weist darauf bin, dass die Nachweisgrenze für Analyten in der Lebensdauermessung wesentlich tiefer liegt als für die Intensitätsmessung, was die Vorteile der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung und des Verfahrens der Erfindung weiter demonstriert.
8 fasst die Ergebnisse der Lebensdauermessung für die höhere Konzentration
und die um eine Faktor 10 verringerte Konzentration
in einer Tabelle zusammen. Aus dieser Tabelle wird deutlich, dass lediglich die Analyten 15 und 16 nach U. S. EPA-16 durch die Lebensdauermessung allein nicht unterschieden werden können.
Die Tabelle von 9 fasst die Messergebnisse der Intensitätsmessung zusammen. Wie oben erwähnt können bei der Intensitätsmessung sowohl die Analyten 11 und 12 als auch die Analyten 15 und 16 gemäß U. S. EPA-16 nicht unterschieden werden.
Durch die kombinierte Information und geeignete Mustererkennung können jedoch sämtliche Analyten, d. h. auch die Analyten 15 und 16 unterschieden werden.
In einer weiteren Messung wurden die Lebensdauern für die einzelnen PAHs aus dem PAH-Mix 1 (WHO-6) untersucht. Die Ergebnisse sind in 10 zusammengefasst und zeigen, dass die Interpretation der Lebensdauerdigramme von 6 und 2 zutreffend war.
Ferner wurde durch Variation der Konzentration die Sensitivität (in counts/ng) ermittelt. Dazu wurden die gemessenen Werte für die Intensität bzw. die Lebensdauer gegen die Menge des Analyten aufgetragen. Die Ergebnisse für die ermittelten Sensitivitäten und Nachweisgrenzen für die Intensität bzw. Lebensdauer sind in 11 bzw. 12 zusammengefasst. Der Begriff „Grenzlebensdauer” in der Tabelle von 12 bezeichnet den Grenzwert für hohe Konzentrationen. Durch Vergleich der 11 und 12 wird deutlich, dass die Nachweisgrenze der Lebensdauermessung tendenziell wesentlich unterhalb derjenigen der Intensitätsmessung liegt.
Selbstverständlich werden die gemessenen Lebensdauern in der HPLC von Anlage zu Anlage variieren, beispielsweise in Abhängigkeit von den verwendeten Laufmitteln, durch die Verwendung eines Entgasers (im vorliegenden Experiment nicht verwendet) etc.
Aus dem obigen Beispiel wird bereits die Leistungsfähigkeit der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung und des Messverfahrens der Erfindung deutlich. Der in der beschriebenen Untersuchung verwendete Testaufbau war noch nicht für die Sensitivität optimiert. Nach gegenwärtigen Abschätzungen geht der Erfinder davon aus, dass die Nachweisgrenze für die Lebensdauermessung um einen Faktor von 30 und für die Intensitätsmessung um einen Faktor von 100 gesteigert werden kann. Damit erreicht die Methode einer Sensitivität, wie sie bisherige, nicht zeitaufgelöste Detektoren besitzen.
Die Detektionsvorrichtung und das Verfahren der Erfindung sind sowohl im Hinblick auf die verringerte Messzeit bei gleicher Analyseschärfe als auch auf die verhältnismäßig geringen apparativen Kosten sehr vorteilhaft. Moderne Halbleiterlichtquellen im UV- und im sichtbaren Bereich sind klein, schnell, preiswert, verbrauchen wenig Energie und sind sehr langlebig und zuverlässig. Die moderne Elektronik erlaubt den Einbau in der Größe heute üblicher HPLC-Komponenten. Zur Bedienung ist kein Abgleich und keine Justage erforderlich. Auf diese Weise ist die Detektionsvorrichtung der Erfindung auf ideale Weise für den routinemäßigen Gebrauch in einem Analyselabor durch nicht speziell geschultes Personal geeignet.
Die Methode und die Vorrichtung ist grundsätzlich unabhängig von den verwendeten Halbleiterlichtquellen. Es können mehrere Halbleiterlichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen gleichzeitig vorgesehen sein (siehe 2a und 2b), die selektiv angesteuert werden. Somit kann für jeden erwarteten Analyten die passende Wellenlänge bereitgestellt werden. Auch ist es möglich, die Detektionsvorrichtung durch Austausch von Halbleiterlichtquellen umzurüsten, um für unterschiedliche Analyten einsetzbar zu werden. Insbesondere sind die Detektionsvorrichtung und das Verfahren der Erfindung für die Analyse von Fettsäuren oder für die Kontrolle und Qualitätssicherung im Lebensmittelbereich vorteilhaft einsetzbar.
13 zeigt die relative Intensität von gegenwärtig erhältlichen UV-LEDs, die unter der Marke „UVTOP” von der Sensor Electronic Technology, Inc. erhältlich sind. Bereits mit diesen kommerziell erhältlichen LEDs mit Wellenlängen zwischen 270 und 340 nm lasst sich eine Vielzahl von Analyten zur Fluoreszenz anregen. Ferner sind für Wellenlängen zwischen 370 nm und 485 nm, sowie im roten und NIR-Bereich Laserdioden erhältlich, die aufgrund ihrer Intensität und guten Fokussierbarkeit für das Detektionsverfahren nach der Erfindung auf ideale Weise einsetzbar sind.
Obgleich in den Zeichnungen und in der vorhergehenden Beschreibung ein bevorzugten Ausführungsbeispiel aufgezeigt und detailliert beschrieben ist, sollte dies als rein beispielhaft und die Erfindung nicht einschränkend angesehen werden. Es wird darauf hingewiesen, dass nur das bevorzugte Ausführungsbeispiel dargestellt und beschrieben ist und sämtliche Veränderungen und Modifizierungen, die derzeit und künftig im Schutzumfang der Ansprüche liegen, geschützt werden sollen. Die gezeigten Merkmale können in beliebiger Kombination von Bedeutung sein.
Bezugszeichenliste

10: Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung
12: Halbleiterlichtquelle
14: Pulserzeuger
16: Modulator
18: Durchflusszelle
20: mobile Phase der Flüssigchramatographie-Einrichtung
22a: erste Seite der Durchflusszelle 18
22b: dritte Seite der Durchflusszelle 18
24: Anregungslicht
26: Fluoreszenzlicht
28: zweite Seite der Durchflusszelle 18
30: Langpassfilter
32: Photomultiplier-Detektor
34: Verstärker
36: Auswerteeinheit
38: Zähler
40: TCSPC Einrichtung
42: PC
44: digitales Speicheroszilloskop

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Standard U. S. EPA-16 [0055]
U. S. EPA-16 [0057]
U. S. EPA-16 [0058]
U. S. EPA-16 [0063]
U. S. EPA-16 [0067]
U. S. EPA-16 [0068]

Claims

Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) für eine Flüssigchromatographie-Einrichtung, umfassend: mindestens eine Halbleiterlichtquelle (12, 12a–12d), insbesondere Laserdiode oder Leuchtdiode, zum Erzeugen von Fluoreszenzanregungslicht (24), eine Stromquelle (14, 16), die geeignet ist, der Halbleiterlichtquelle (12, 12a–12d) einen gepulsten oder zeitlich modulierten Strom zuzuführen, eine Durchflusszelle (18), die mit einer Flüssigchromatographie-Einrichtung derart verbunden oder verbindbar ist, dass sie von dessen mobiler Phase (20) durchlaufen werden kann, einen Detektor, insbesondere Photomultiplier (32), zum Empfangen einer Fluoreszenz-Emission von einem in der mobilen Phase enthaltenen Analyten, und eine Auswerteeinheit (36) zum Ermitteln – der Intensität der Fluoreszenzemission (26), und – der Lebensdauer des angeregten Zustandes des Analyten mittels zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung bei gepulster bzw. mittels Modulationsfluorometrie bei modulierter Stromzufuhr.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach Anspruch 1, bei der die Frequenz der Pulse mindestens 10 MHz, vorzugsweise mindestens 20 MHz und besonders vorzugsweise mindestens 40 MHz beträgt und/oder die Pulsfrequenz einstellbar ist.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach Anspruch 1, bei der die Modulationsfrequenz einstellbar ist, insbesondere mindestens in einem Bereich von 100 bis 200 MHz, vorzugsweise mindestens in einem Bereich von 50 bis 400 MHz.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die mindestens zwei, vorzugsweise mindestens vier und besonders vorzugsweise mindestens sechs Halbleiterlichtquellen (12a–12d) mit unterschiedlichen Wellenlängen und eine Schalteinrichtung umfasst, durch die die Halbleiterlichtquellen (12a–12d) selektiv mit der Stromquelle (14, 16) verbindbar sind.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach Anspruch 4, bei der mindestens zwei der Halbleiterlichtquellen (12a–12d) auf unterschiedlichen, vorzugsweise gegenüberliegenden Seiten (22a, 22b) der Durchflusszelle (18) angeordnet sind.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der Lichtleiter (46) vorgesehen sind, um Anregungslicht (24) von einer Halbleiterlichtquelle (12, 12a–12d) zu einer Einstrahlposition in die Durchflusszelle (18) zu leiten.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die mindestens eine Halbleiterlichtquelle (12, 12a–12d) austauschbar in der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) angeordnet ist.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach Anspruch 7, in Kombination mit einem Satz von Halbleiterlichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen, deren Anzahl die maximale Anzahl von gleichzeitig in der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) verwendbaren Halbleiterlichtquellen übersteigt.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der zwischen der Durchflusszelle (18) und dem Detektor (34) eine Langpassfiltereinrichtung (30) angeordnet ist.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach Anspruch 9, bei der die Langpassfiltereinrichtung (30) Bereiche aufweist, bei denen die jeweilige Durchlassschwelle bei unterschiedlichen Wellenlängen liegt, und bei dem die Langpassfiltereinrichtung (30) derart mechanisch verstellbar ist, dass unterschiedliche Bereiche derselben in den Lichtweg der Fluoreszenzemission (26) gebracht werden können.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach Anspruch 10, bei dem sich die Wellenlänge der Durchlassschwelle der Langpassfiltereinrichtung (30) entlang einer Achse der Langpassfiltereinrichtung (30) ändert und die Langpassfiltereinrichtung (30) entlang dieser Achse verschiebbar angeordnet ist.
Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Volumen der Durchflusszelle (18) zwischen 10 μl und 50 μl, vorzugsweise zwischen 15 μl und 35 μl beträgt.
Verfahren zur Fluoreszenz-Detektion in der Flüssigchromatographie, mit den folgenden Schritten: – Erzeugen von Fluoreszenz-Anregungslicht (24), indem einer Halbleiterlichtquelle (12, 12a–12d), insbesondere einer Laserdiode oder Leuchtdiode, ein gepulster oder zeitlich modulierter Strom zugeführt wird, – Detektieren von Fluoreszenzemission (26) von einem Analyten, der in der mobilen Phase einer Flüssigchromatographie-Einrichtung enthalten ist und durch das Fluoreszenz-Anregungslicht (24) angeregt wurde, und – Auswerten der Detektionssignale, um folgendes zu ermitteln: die Intensität der Fluoreszenzemission (26), und die Lebensdauer des angeregten Zustandes des Analyten, wobei die Lebensdauer im Falle einer gepulsten Stromzufuhr durch zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung bzw. im Falle einer modulierten Stromzufuhr durch Modulationsfluorometrie ermittelt wird.