-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein durch abfallende Wellen
(evanescent waves) angeregtes Fluoreszenznachweisverfahren, insbesondere
auf ein durch abfallende Wellen angeregtes Fluoreszenznachweisverfahren,
bei dem viele wechselwirkende Substanzen auf der vorderen Oberflächenseite
einer lichtdurchlässigen
Platte festgelegt sind, die fähig
sind, abfallende Wellen auf der vorderen Oberfläche zu erzeugen, und wobei
die Fluoreszenzniveaus in den Wechselwirkungen zwischen den wechselwirkenden
Substanzen und einer fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz in
einer Flüssigkeitsschicht
nachgewiesen werden.
-
Es
sind Verfahren und Vorrichtungen bekannt, bei denen abfallende Wellen
(Nahfeldlicht), die auf einer totalen Lichtreflexionsoberfläche erzeugt
werden und mit zunehmendem Abstand scharf abfallen, verwendet werden,
um eine die Testsubstanz kennzeichnende fluoreszierende Substanz
anzuregen, und das Fluoreszenzniveau zum Messen der Wechselwirkung
der Testsubstanz etc. nachgewiesen wird.
-
Es
gibt Patentdokumente, die sich auf ein Probenchip-Analyse-Verfahren
oder eine Vorrichtung zum Analysieren der Genexpressionsmoden von
Zellen oder lebendem Gewebe oder zum Analysieren von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen
beziehen.
-
Beispielsweise
beschreibt das U.S.-Patent Nr. 6 787 364 ein Verfahren und eine
Vorrichtung, wobei Licht auf eine Wellenleiterplatte an einer Endfläche der
Wellenleiterplatte gestrahlt wird, die fähig ist, einfallendes Licht
total zu reflektieren und zu leiten; die abfallenden Wellen, die
erzeugt werden, wenn das Licht total reflektiert wird, werden verwendet,
um die fluoreszierende Substanz anzuregen, die die zu analysierenden Proben
kennzeichnet; und die gebildeten fluoreszierenden Abbildungen werden
verwendet, um die zu analysierenden Proben zu analysieren.
-
Ferner
beschreibt die japanische Patentanmeldung Nr. JP2003-172701 eine
Probenchip-Analysevorrichtung mit ersten und zweiten sich bewegenden
Vorrichtungen, die jeweils fähig
sind, ein einen Probenchip haltendes Probenchiphalteelement zu bewegen,
das viele auf einem Substrat festgelegte Proben aufweist, die fähig sind,
einfallendes Licht in der Längsrichtung
des Probenchips und in der Richtung senkrecht zu der Längsrichtung
zu leiten; einer weißen
Lichtquelle; einem Filterelement an der Ausgangsseite zum Auswählen des
Lichts mit einer Wellenlänge
zum Anregen der fluoreszierenden Substanz, die eine Testprobe kennzeichnet,
die dazu gebracht wird, mit den Proben des Probenchips zu reagieren;
einem optischen Faserbündel
zum Einführen
von durchgelassenem Licht in jeweilige Lichtbestrahlungselemente;
einem Filterelement auf der Lichtempfangsseite zum selektiven Durchlassen
des von der angeregten fluoreszierenden Substanz emittierten Lichts,
das die Testprobe kennzeichnet, die mit den Proben des Probenchips
reagiert hat, der bereitgestellt wird, um den Probenchip zwischen
einem Paar der Licht einstrahlenden Elemente gegenüberzuliegen;
und eine Lichtempfangsvorrichtung zum Liefern eines elektrischen
Signals in Abhängigkeit
von dem emittierten Licht jedes vorbestimmten Bereichs, der Licht
durchgelassen hat.
-
Bei
den oben erwähnten
Verfahren, die die Schritte des Anregens einer fluoreszierenden
Substanz durch abfallende Wellen und des Nachweisens einer Fluoreszenz
umfassen, treten in dem Fall, in dem die Wechselwirkungen zwischen
Sonden, die auf der vorderen Oberflächenseite einer lichtdurchlässigen Platte
installiert werden und fähig
sind, abfallende Wellen auf der Oberfläche zu erzeugen, und wenn eine
fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz direkt in einer Flüssigkeitsschicht
nachgewiesen wird, die folgenden Probleme auf.
-
In
dem Fall, in dem die Flüssigkeitsschicht
auf der vorderen Oberflächenseite
der lichtdurchlässigen Platte
existiert, die fähig
ist, abfallende Wellen auf der vorderen Oberfläche zu erzeugen, regen die
von der lichtdurchlässigen
Platte auf die vordere Oberfläche
austretenden abfallenden Wellen nicht nur die fluoreszierende Substanz,
die die Testsubstanz kennzeichnet und die mit den Proben reagiert
hat, sondern ebenfalls die fluoreszierende Substanz, die die Testsubstanz
kennzeichnet und in der Flüssigkeitsschicht
nahe der lichtdurchlässigen
Platte ohne Wechselwirkung mit den Sonden schwebt, an, um Fluoreszenz
zu erzeugen, und außerdem
arbeitet die von der Testsubstanz per se erzeugte Selbstfluoreszenz
als Störlicht,
das die Lichtintensität
des Hintergrundrauschen steigert und die Nachweisempfindlichkeit
und den Rauschabstand verringert.
-
Bei
den herkömmlichen
Techniken, einschließlich
der in den Patentdokumenten beschriebenen oben erwähnten Erfindungen,
wurde keine Gegenmaßnahme
gegen derartige Probleme berücksichtigt.
-
Außerdem benötigen die
herkömmlichen
Verfahren einen Gel-Filtrations-Reinigungsschritt, um einen Überschuss
des Fluoreszenzfarbstoff zu entfernen, der zum Kennzeichnen der
Testsubstanz verwendet wird, bevor die Wechselwirkungen zwischen
der fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz und den Proben durchgeführt werden.
-
Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die oben erwähnten Probleme
zu lösen.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Um
die oben erwähnten
Probleme zu lösen,
schlägt
diese Erfindung ein durch abfallende Wellen angeregtes Fluoreszenznachweisverfahren
vor, bei dem viele wechselwirkende Substanzen auf der vorderen Oberflächenseite
einer lichtdurchlässigen
Platte festgelegt sind, die fähig
sind, abfallende Wellen auf der vorderen Oberfläche zu erzeugen, und wobei
die Fluoreszenzniveaus in den Wechselwirkungen zwischen den wechselwirkenden
Substanzen und einer fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz in
einer Flüssigkeitsschicht
nachgewiesen werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein schwarzes
Farbmittel zu der Flüssigkeitsschicht
hinzugefügt
wird.
-
Außerdem schlägt diese
Erfindung, wie oben beschrieben, vor, dass das schwarze Farbmittel
nach den Wechselwirkungen zwischen den wechselwirkenden Substanzen
und der fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz oder gleichzeitig
mit oder vor dem Start der Wechselwirkungen zwischen den wechselwirkenden
Substanzen und der fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz hinzugefügt wird.
-
Außerdem kann
bei dieser Erfindung, wie oben beschrieben, das schwarze Farbmittel
ein pigmentbasiertes Farbmittel sein, das hauptsächlich feine Teilchen aus beispielsweise
Kohlenstoffschwarz enthält,
und als das pigmentbasierte Farbmittel kann Bokuju (das hauptsächlich aus
Ruß und
Leim besteht auch Indische Tusche oder Chinesische Tusche genannt)
verwendet werden.
-
Außerdem schlägt diese
Erfindung, wie oben beschrieben, vor, dass eine Platte zur Verhinderung
der Trocknung der Flüssigkeitsschicht,
die nicht fähig
ist, Licht durchzulassen, auf der vorderen Oberflächenseite der
lichtdurchlässigen
Platte installiert wird.
-
Gemäß der Erfindung,
wie oben beschrieben, kann, da die Flüssigkeitsschicht durch das
hinzugefügte schwarze
Farbmittel schwarz gefärbt
ist, Hintergrundrauschen verringert und der Rauschabstand erhöht werden.
-
Daher
ist es möglich,
den Gel-Filtrations-Reinigungsschritt, der ansonsten zum Entfernen
des Fluoreszenzfarbstoff-Überschusses
notwendig ist, der zum Kennzeichnen der Testsubstanz vor den Wechselwirkungen
zwischen der fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz und den wechselwirkenden
Substanzen verwendet wird, wegzulassen.
-
In
dem Fall kann, in dem die Platte, die eine Trocknung der Flüssigkeitsschicht
verhindert, an der vorderen Oberflächenseite der lichtdurchlässigen Platte
installiert ist, da die Platte, die eine Trocknung der Flüssigkeitsschicht
verhindert, ausgeführt
ist, so dass sie kein Licht durchlässt, beispielsweise in dem
sie gefärbt ist,
das Eindringen von Störlicht
durch die Platte, die eine Trocknung der Flüssigkeitsschicht verhindert,
verhindert und der Rauschabstand weiter verbessert werden.
-
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 ist
eine schematische Ansicht, die typischerweise eine Vorrichtung zum
Analysieren basierend auf dem Nachweis der durch abfallende Wellen
angeregten Fluoreszenz zeigt, auf die diese Erfindung angewendet
wird.
-
2 veranschaulicht
CCD-Kamerabilder, die experimentelle Ergebnisse 3 zeigen.
-
3 veranschaulicht
CCD-Kamerabilder, die experimentelle Ergebnisse 4 und 5 zeigen.
-
4 veranschaulicht
CCD-Kamerabilder, die experimentelle Ergebnisse 6 zeigen.
-
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORM
DER ERFINDUNG
-
Diese
Erfindung wird nachstehend detailliert mit Bezug auf die Zeichnungen
erläutert,
die Beispiele zeigen.
-
In 1 bezeichnet
das Symbol 1 eine lichtdurchlässige Platte, wie beispielsweise
ein Objektträgerglas.
Lichteinstrahlende Abschnitte 2 sind angeordnet, so dass
sie den Endflächen
der lichtdurchlässigen
Platte 1 gegenüberliegen.
Das Symbol 3 bezeichnet eine weiße Lichtquelle, und das von
der weißen
Lichtquelle 3 emittierte weiße Licht läuft durch ein Anregungslichtfilter 4 und
fällt auf
optische Fasern 5. Das Licht läuft durch die optischen Fasern 5 und
erreicht die lichteinstrahlenden Abschnitte 2.
-
Auf
der vorderen Oberflächenseite
der lichtdurchlässigen
Platte 1 sind seitliche Wände 6 installiert,
so dass eine Flüssigkeitsschicht 7 gehalten
werden kann, und über
den seitlichen Wänden 6 kann
eine Glasabdeckung 8 als eine Platte, die eine Trocknung
der Flüssigkeitsschicht
verhindert, angebracht werden. Die Glasabdeckung 8 und
die seitlichen Wände 6 sind
ausgeführt,
so dass sie kein Licht durchlassen, indem sie beispielsweise schwarz
gefärbt
sind.
-
Andererseits
ist an der hinteren Oberflächenseite
der lichtdurchlässigen
Platte 1 eine CCD-Kamera 11 zum Nachweis von Fluoreszenz
mit einer Objektivlinse 9 und einem Lichtempfangsfilter 10 angeordnet.
-
Bei
dem obigen Aufbau werden viele wechselwirkende Substanzen 12 vorher
auf der vorderen Oberflächenseite
der lichtdurchlässigen
Platte 1 festgelegt, und eine fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz 13 wird
dazu gebracht, mit den wechselwirkenden Substanzen 12 in
der Flüssigkeitsschicht 7 zusammen
mit einem Puffer wechselzuwirken.
-
Nach
Ablauf einer vorbestimmten Wechselwirkungszeit wird somit die lichtdurchlässige Platte 1 mit Anregungslicht
von den lichteinstrahlenden Abschnitten 2 bestrahlt, und
die Fluoreszenz-Luminanzwerte der Fluoreszenzkennzeichnung, die
durch auf der vorderen Oberflächenseite
der lichtdurchlässigen
Platte 1 durch Totalreflexion erzeugten abfallenden Wellen
angeregt wurde, werden auf der hinteren Oberflächenseite der lichtdurchlässigen Platte 1 durch
die CCD-Kamera 11 durch die Objektivlinse 9 und
das Lichtempfangsfilter 10 gemessen. Bei dieser Erfindung
wird in diesem Fall ein schwarzes Farbmittel zu der Flüssigkeitsschicht 7 hinzugefügt, um diese
zu färben.
-
Somit
schwärzt
bei dieser Erfindung das hinzugefügte schwarze Farbmittel die
Flüssigkeitsschicht,
um das Hintergrundrauschen zu verringern und den Rauschabstand zu
verbessern. Somit werden experimentelle Ergebnisse, die die Wirkung
dieser Erfindung zeigen, nachstehend als Beispiele erläutert.
-
BEISPIEL 1
-
Als
Experimente zum Analysieren einer Zuckerkettenstruktur wurde ein
Mikroarray vorbereitet, das viele Lektine als wechselwirkende Substanzen
aufweist, die auf einem Objektträgerglas
festgelegt wurden, das als die lichtdurchlässige Platte 1 verwendet
wird, und die Fluoreszenzniveaus bei den Wechselwirkungen zwischen
einem fluoreszierend Kennzeichnungs-Glykoprotein und den Lektinen
wurden in einer Flüssigkeitsschicht
mit der oben erwähnten
Analysevorrichtung nachgewiesen.
-
Experimentelle Ergebnisse
1
-
Zuerst
wurde 10 Vol% Bokuju (Flüssigtusche)
zu einer Wechselwirkungslösung
hinzugefügt,
die fluoreszierend Kennzeichnungs-Glykoprotein enthält, und
das Gemisch wurde auf ein Objektträgerglas aufgebracht, um Wechselwirkungen
auszuführen.
In diesem Fall wurde der Luminanzwert des Hintergrunds, bei dem
kein Lektin auf dem Glas existierte, d.h. das Hintergrundrauschen
gemessen. Außerdem
wurde der Luminanzwert des Abschnitts, der die Menge jedes Lektins
und des Glykoproteins, die aneinander gebunden sind, reflektiert,
ebenfalls gemessen. Bei diesem Experiment wurde Bokuju hinzugefügt, wenn
die Wechselwirkungen zwischen den wechselwirkenden Substanzen und
der fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz gestartet wurde.
-
Wie
oben beschrieben, ist es bei jedem herkömmlichen Verfahren notwendig,
eine Gel-Filtrations-Reinigung für
den Zweck des Entfernens eines zum Kennzeichnen der Testsubstanz
verwendeten Farbmittelüberschusses
auszuführen,
bevor die Wechselwirkungen zwischen der fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz
13 und
den wechselwirkenden Substanzen
12 durchgeführt werden.
So wurde bei diesem Experiment eine Messung in zwei Fällen durchgeführt, wobei
der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt benutzt bzw. nicht benutzt
wurde, in Kombination mit zusätzlichen
zwei Fällen,
bei denen Bokuju hinzugefügt
bzw. nicht hinzugefügt wurde.
Tabelle 1 zeigt die Werte, die zwei Stunden nach dem Start der Wechselwirkungen
gemessen wurden, und Tabelle 2 zeigt die Werte, die 20 Stunden nach
dem Start der Wechselwirkungen gemessen wurden. Die in Tabellen
1 und 2 und in der später
beschriebenen Tabelle 3 angegebenen Hintergrundluminanzwerte zeigen Hintergrundrauschwerte. TABELLE
1
- *: Jede Nettointensität bezieht sich auf einen Wert,
der durch Subtrahieren des Hintergrundluminanzwerts von dem gemessenen
Luminanzwert erhalten wurde.
TABELLE
2 - *: Jede Nettointensität bezieht sich auf einen Wert,
der durch Subtrahieren des Hintergrundluminanzwerts von dem gemessenen
Luminanzwert erhalten wurde.
-
Aus
den in Tabelle 1 und 2 gezeigten Messergebnissen ist das folgende
ersichtlich.
-
FÜR TABELLE 1 (2 Stunden nach
dem Start der Wechselwirkung):
-
- a. In dem Fall, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
ausgeführt
und kein Bokuju hinzugefügt
wurde, fiel das Hintergrundrauschen auf etwa 11/100 ab, und in dem
Fall, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt nicht ausgeführt und
Bokuju hinzugefügt
wurden, fiel er stark auf etwa 3/100, verglichen mit dem Fall ab,
in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
nicht ausgeführt
und kein Bokuju hinzugefügt
wurde.
- b. In dem Fall, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
ausgeführt
und Bojuku hinzugefügt
wurde, stieg das Verhältnis
des Luminanzwerts des Abschnitts, der die Menge jedes Lektins und
des Mikroproteins, die aneinander gebunden sind, reflektiert, zu
dem Hintergrundrauschen (Rauschabstand) auf das 7,4-fache beim Maximum
(197,03/26,49, wenn 0,125 mg/mL von Lektin 2 verwendet wurde) verglichen
mit dem Fall, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt ausgeführt und
kein Bokuju hinzugefügt
wurde.
- c. In dem Fall, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
nicht ausgeführt
und Bokuju hinzugefügt
wurde, stieg das Verhältnis
des Luminanzwerts des Abschnitts, der die Menge jedes Lektins und
des Glykoproteins, die aneinander gebunden sind, reflektiert, zu
dem Hintergrundrauschen (Rauschabstand) auf das 27-fache beim Maximum
(127,68/4,73, wenn 0,25 mg/mL von Lektin 2 verwendet wurde) verglichen
mit dem Fall an, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt nicht
ausgeführt
und kein Bokuju hinzugefügt
wurde.
-
FÜR TABELLE 2 (20 Stunden nach
dem Start von Wechselwirkungen)
-
- a. In dem Fall, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
ausgeführt
und kein Bokuju hinzugefügt
wurde, fiel das Hintergrundrauschen auf 14/100 ab, und in dem Fall,
in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt nicht ausgeführt und
Bokuju hinzugefügt
wurde, fiel er stark auf 5/100 verglichen mit dem Fall ab, in dem der
Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
nicht ausgeführt
und kein Bokuju hinzugefügt
wurde.
- b. In dem Fall, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
ausgeführt
und Bokuju hinzugefügt
wurde, stieg das Verhältnis
des Luminanzwerts des Abschnitts, der die Menge jedes Lektins und
des Glykoproteins, die aneinandergebunden sind, reflektiert, zu
dem Hintergrundrauschen (Rauschabstand) um das 5,6-fache (152,66/27,38,
wenn 0,5 mg/mL von Lektin 2 verwendet wurde) verglichen mit dem
Fall an, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
ausgeführt
und kein Bokuju hinzugefügt
wurde.
- c. In dem Fall, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
nicht ausgeführt
und Bokuju hinzugefügt
wurde, stieg das Verhältnis
des Luminanzwerts des Abschnitts, der die Menge jedes Lektins und
des Glykoproteins, die aneinander gebunden sind, reflektiert, zu
dem Hintergrundrauschen (Rauschabstand) um das 21-fache beim Maximum
(79,89/3,79, wenn 0,5 mg/mL von Lektin 2 verwendet wird) verglichen
mit dem Fall an, in dem der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt nicht
ausgeführt
und kein Bokuju hinzugefügt
wurde.
-
Aus
den oben erwähnten
Messergebnissen ist das folgende ersichtlich.
- a.
In beiden Fällen,
in denen der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
ausgeführt
bzw. nicht ausgeführt
wird, kann das zu der Flüssigkeitsschicht
hinzugefügte
Bokuju das Hintergrundrauschen stark verringern und den Rauschabstand
vergrößern. Damit
ist sogar bei den Wechselwirkungen, bei denen die Leistung für die Bindung
jedes Lektins und eines Glykoproteins aneinander niedrig ist, der
Nachweis möglich.
- b. Die Verringerung von Hintergrundrauschen und die Verbesserung
des Rauschabstands sind besonders in dem Fall bemerkenswert, in
dem die Gel-Filtrations-Reinigung nicht ausgeführt wird. So kann bei dieser Erfindung
der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
weggelassen werden. Daher kann der Betrieb vereinfacht und Messungen
können
unter gröberen
Bedingungen durchgeführt
werden. So kann beispielsweise das Verfahren dieser Erfindung auf
eine geringe Menge einer Testsubstanz angewendet werden, deren Reinigung
schwierig ist. D.h., das Verfahren dieser Erfindung kann für einen
sehr weiten Bereich von Anwendungen verwendet werden.
- c. Da ene schwächere
Bindung nachgewiesen werden kann, wie es aus den obigen a und b
ersichtlich ist, kann beispielsweise die Änderung der Luminanz mit dem
Ablauf der Zeit einfacher gemessen werden, und Wechselwirkungszustände können genauer
in Echtzeit analysiert werden.
-
Experimentelle Ergebnisse
2
-
Im
Gegensatz zu dem in Tabelle 1 und 2 gezeigten Experiment wurde bei
diesem Experiment Bokuju nicht vor dem Start der Wechselwirkungen
zwischen den wechselwirkenden Substanzen und der fluoreszierend
Kennzeichnungstestsubstanz hinzugefügt. Stattdessen wurden 1 bis
50 Vol%, insbesondere 1 Vol%, 10 Vol% oder 50 Vol% von Bokuju zu
der Flüssigkeitsschicht
nach den Wechselwirkungen und direkt vor der Messung hinzugefügt. In diesem
Fall wurde der Luminanzwert des Hintergrunds gemessen, an dem kein
Lektin auf dem Objektträgerglas
existierte, d.h. das Hintergrundrauschen wurde gemessen, und der
Luminanzwert des Abschnitts, der die Menge jedes Lektins und des
Glykoproteins, die aneinander gebunden sind, reflektiert, wurde
ebenfalls gemessen. Bei diesem Experiment wurde der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt
ausgeführt.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE
3
- *: Jede Nettointensität bezieht sich auf einen Wert,
der durch Subtrahieren des Hintergrundluminanzwerts von dem gemessenen
Luminanzwert erhalten wird.
-
Aus
den in Tabelle 3 gezeigten Messergebnissen ist in dem Fall, in dem
Bokuju nach den Wechselwirkungen hinzugefügt wird, das folgende ersichtlich.
- a. Das Hintergrundrauschen nahm progressiv
auf 43/100, 41/100 und 36/100 jeweils bei 1%, 10% und 50% von Bokuju
ab, und der Rauschabstand wurde progressiv im Verhältnis damit
verbessert.
- b. Sogar wenn die hinzugefügte
Menge von Bokuju so klein wie 1% war, konnte die Wirkung des Verringerns
des Hintergrundrauschens erhalten werden.
- c. Daten, die erhalten wurden, nachdem ermöglicht wurde, dass die Flüssigkeit,
zu der 50% Bokuju hinzugefügt
wurde, für
24 Stunden stehen konnte, zeigten, dass die Wirkung des 20 verringerten
Hintergrundrauschens nicht nachteilig sogar nach Ablauf einer langen
Zeit beeinflusst wurde.
-
Experimentelle Ergebnisse
3
-
Die
Probe, bei der der zum Etikettieren des Glykoproteins verwendete
Fluoreszenzfarbstoff nicht spezifisch an Verunreinigungen bei dem
oben erwähnten
Experiment gebunden war, wurde verwendet, und 50% Bokuju wurde hinzugefügt oder
nicht hinzugefügt,
um Abbildungen zu erhalten, die mit einer CCD-Kamera genommen wurden
und in 2 gezeigt sind. Das Foto (a) zeigt den Fall, in
dem kein Bokuju hinzugefügt
wurde, und das Foto (b) zeigt den Fall, in dem Bokuju hinzugefügt wurde.
-
Experimentelle Ergebnisse
4
-
Wenn
Proben, bei denen der fluoreszierende Farbstoff nicht spezifisch
an Verunreinigungen gebunden war, verwendet wurden, traten helle
Punkte, die durch die Verunreinigung verursacht wurden, zusätzlich zu den
Punkten der zu messenden Lektine in Erscheinung, um die Messung
zu stören,
wie in 2 gezeigt ist. Es ist jedoch ersichtlich, dass
in dem Fall, in dem Bokuju hinzugefügt wurde, das Rauschen dieser
hellen Punkte verschwand, um eine genaue Messung zu ermöglichen.
-
Bei
diesen experimentellen Ergebnissen 2 bis 4 wurde, sogar in dem Fall,
in dem Bokuju nach den Wechselwirkungen hinzugefügt wurde, das Hintergrundrauschen
verringert, während
der Rauschabstand zur Zeit der Messung verbessert wurde, um mehr
quantitative Analyse der Wechselwirkungen zu ermöglichen.
-
BEISPIEL 2
-
Experimentelle Ergebnisse
5
-
Rohextrakte,
die aus den Organen von einer Maus hergeleiteten Glykoproteine enthalten,
wurden als Proben verwendet, und ein Experiment wurde mit einem
Lektinarray ausgeführt,
das auf einem Objektträgerglas
zum umfassenden Analysieren der Zuckerkettenstruktur festgelegt
war. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt.
Bei diesem Experiment wurden die Wechselwirkungen zwischen den Lektinen
und den fluoreszierend etikettierten Proben, wobei 5% Bokuju hinzugefügt wurde,
und ohne Durchführen
des Gel-Filtrations-Reinigungsschritts
ausgeführt,
und andererseits wurden die Wechselwirkungen zwischen den Lektinen
und den fluoreszierend etikettierten Proben ohne Hinzufügen von
Bokuju und mit dem Gel-Filtrations-Reinigungsschritt, der wie bei
jedem herkömmlichen
Verfahren durchgeführt
wurde, ausgeführt.
Die Messergebnisse der jeweiligen Fälle wurden verglichen.
-
Bei
diesem Experiment, da 5% von Bokuju zu den Proben hinzugefügt wurde,
ermöglichten
die Wechselwirkungen zwischen den Lektinen und den fluoreszierend
etikettierten Proben, die ohne Durchführen des Gel-Filtrations-Reinigungsschritts
ausgeführt
wurden, eine Messung mit einer Empfindlichkeit, die der von gereinigten
Proben äquivalent
oder überlegen
war, obwohl die entsprechenden Wechselwirkungen, die ohne Durchführen des
Gel-Filtrations-Reinigungsschritts bei dem herkömmlichen Verfahren durchgeführt wurden, eine
geringe Messung aufgrund des hohen Hintergrundrauschens. Aus dem
Ergebnis ist ersichtlich, dass, wenn diese Erfindung angewendet
wird, ein Rohextrakt, das eine geringe Menge einer vitalen Probe
enthält, mit
einem hohen Durchsatz analysiert werden kann.
-
BEISPIEL 3
-
Experimentelle Ergebnisse
6
-
Die
in 1 gezeigte Analysevorrichtung wurde verwendet,
während
eine Wechselwirkungslösung, die
Zuckerketten enthält,
als die fluoreszierend etikettierte Testsubstanz verwendet wurde,
und die Wechselwirkungen zwischen der Testsubstanz und den Lektinen
wurden in einer Flüssigkeitsschicht
gemessen. Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt.
Fluoreszierend etikettierte Zuckerketten neigen dazu, verglichen
mit fluoreszierend etikettierten Glykoproteinen sehr niedrig in
der Nachweisempfindlichkeit zu sein, und bei jedem herkömmlichen
Verfahren ist sogar wenn der Gel-Filtrations-Reinigungsschritt durchgeführt wird,
der Nachweis schwierig. So muss für die quantitative Messung
die Wechselwirkungslösung
die Zuckerketten mit einer hohen Konzentration enthalten, wobei
jedoch in diesem Fall das Hintergrundrauschen ebenfalls zur gleichen Zeit
ansteigt. So ist Messung unmöglich.
-
Bei
den Ergebnissen dieses Experiments wurden in einer Wechselwirkungslösung, die
Zuckerketten mit einer hohen Konzentration von 200 nM enthält, da die
Luminanzwerte den höchsten
messbaren Wert bei dem herkömmlichen
Verfahren überschritten,
die erhaltenen Bilder reines Weiß, was nicht ermöglichte,
dass Punkte bestätigt
werden konnten. Wenn jedoch eine Wechselwirkungslösung, die
durch Hinzufügen
von 10 Vol% von Bokuju erhalten wurde, verwendet wurde, konnten
der Luminanzwert, der die Menge jedes Lektins and von Zuckerketten,
die aneinander gebunden sind, reflektiert, gemessen werden. Aus
den experimentellen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Analyse über Zeit
mit Zuckerketten mit niedriger Empfindlichkeit ebenfalls einfach
wird, wenn Bokuju zu einer hochkonzentrierten Wechselwirkungslösung hinzugefügt wird.
-
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
-
Gemäß dieser
Erfindung werden, wie oben beschrieben ist, viele wechselwirkende
Substanzen auf der vorderen Oberflächenseite einer lichtdurchlässigen Platte
unbeweglich gemacht, die fähig
sind, abfallende Wellen auf der vorderen Oberfläche zu erzeugen, und die Fluoreszenzniveaus
bei den Wechselwirkungen zwischen den wechselwirkenden Substanzen
und einer fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz werden in einer
Flüssigkeitsschicht
nachgewiesen, und bei diesem Verfahren wird ein schwarzes Farbmittel
zu der Flüssigkeitsschicht
hinzugefügt.
So kann das Hintergrundrauschen verringert und der Rauschabstand
erhöht
werden.
-
Daher
ist es nicht erforderlich, den Gel-Filtrations-Reinigungsschritt durchzuführen, der
ansonsten notwendig ist, um einen Fluoreszenzfarbstoff-Überschuss
zu entfernen, der zum Kennzeichnen einer Testsubstanz verwendet
wird, bevor die Wechselwirkungen zwischen der fluoreszierend Kennzeichnungstestsubstanz und
wechselwirkenden Testsubstanzen durchgeführt werden, und der Prozess
kann vereinfacht werden.
-
Außerdem kann
aufgrund des obigen der Betrieb vereinfacht und die Messung in groben
Bedingungen durchgeführt
werden. So kann beispielsweise das Verfahren dieser Erfindung auf
eine geringe Menge einer Testsubstanz angewendet werden, deren Reinigung
schwierig ist. D.h., dass das Verfahren dieser Erfindung für einen
sehr breiten Bereich von Anwendungen verwendet werden kann.
-
Außerdem kann
in dem Fall, in dem die Platte, die eine Trocknung der Flüssigkeitsschicht
verhindert, darüber
an der vorderen Oberflächenseite
der lichtdurchlässigen
Platte installiert ist, da die Platte, die eine Trocknung der Flüssigkeitsschicht
verhindert, ausgeführt
wird, unfähig
zu sein, Licht zu durchzulassen, indem sie beispielsweise gefärbt ist,
das Eindringen von Störlicht
durch die Platte, die eine Trocknung der Flüssigkeitsschicht verhindert,
verhindert und der Rauschabstand weiter verbessert werden.
-
Mit
Blick auf das obige umfassen die Anwendungen dieser Erfindung die
Messung mit einer geringen Menge einer vitalen Probe, die Analyse
einer Zuckerketten enthaltenden Probe, etc. Wenn diese und weitere Anwendungen
betrachtet werden, ist diese Erfindung industriell sehr anwendbar.
