DE19735144C2

DE19735144C2 - Reflexionsfluorimeter

Info

Publication number: DE19735144C2
Application number: DE19735144A
Authority: DE
Inventors: Wolfram Bohnenkamp
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2000-02-24
Anticipated expiration: 2017-08-14
Also published as: US6252657B1; DE19735144A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Reflexionsfluorimeter mit einer Kapillare als Lichtleiter, einer einen Fluoreszenzfarbstoff enthaltenden und auf der Kapillarinnenwand angeordneten Beschichtung, einer Anregungslichtquelle, und mit mindestens einem lichtempfindlichen Sensor, der an einer Stirnseite der Kapillare für den Empfang des aus dem Reflexionsfluorimeters austretenden Fluoreszenzlichtes angeordnet ist, wobei das Licht der Anregungslichtquelle durch eine zylindrische oder prismatische Einstrahlungsoptik auf die Mantelfläche der Kapillare gerichtet ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Reflexionsfluorimeter ge mäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, wie aus trends in analytical chemistry, vol. 15, 1996, Seiten 225-232, bekannt.

Derartige Reflexionsfluorimeter verwenden einen ka pillarförmigen Lichtleiter zur Aufnahme von verschie denen Analyten in der Kapillare des Lichtleiters. Dabei kann die Konzentration verschiedener Analyten durch Fluoreszenzanregung mit mindestens einem licht empfindlichen Sensor, der an einer Stirnseite für den Empfang des aus dem Lichtleiter austretenden Fluores zenzlichtes angeordnet ist, bestimmt werden.

Auf diesem Gebiet ist es bekannt, daß für den Fall, daß Licht aus einem Medium mit geringerem Brechungs index auf eine Oberfläche eines Mediums mit einem größeren Brechungsindex trifft, das auftreffende Licht zum größten Teil reflektiert wird, wenn der Einfallswinkel größer als der kritische Winkel ist. Wird jedoch Licht in der Grenzschicht, dem evaneszen ten Feld, des optisch dünneren Mediums, dessen geome trische Dicke geringer als die entsprechende Licht wellenlänge ist, erzeugt, z. B. durch Fluoreszenz, so kann das Licht auch dann in das optisch dichtere Me dium eintreten, wenn der kritische Winkel überschrit ten ist.

Eine ähnliche Vorrichtung ist in WO 93/18405 A1 be schrieben. Dabei wird Licht einer Lichtquelle durch einen transparenten Körper auf eine Küvette gerich tet, an deren Innenseite Fluoreszenz angeregt wird. Aus dem Bereich des evaneszenten Feldes kann die Fluo reszenz in den transparenten Körper wieder einkoppeln und wird von dort über eine geneigte Stirnfläche auf einen Detektor gerichtet, um das Fluoreszenzlicht zu erfassen. Diese Anordnung hat insbesondere den Nach teil, daß eine sehr kleine Lichtausbeute des durch Fluoreszenz angeregten Lichtes erhalten werden kann und demzufolge die Empfindlichkeit entsprechend klein ist.

Aus US 4,716,121 ist ein Aufbau für die Durchführung von Fluoreszenztests und insbesondere für Immunoas says beschrieben. Dabei wird ein Lichtleiter verwen det, der in seiner gesamten Länge von einem kammer förmigen Gebilde umschlossen ist, in das eine jewei lige zu untersuchende Probe eingefüllt werden kann. Das Anregungslicht muß hierbei in eine Stirnseite des Lichtleiters eingekoppelt werden, und demzufolge ist die Energiedichte des Anregungslichtes klein, und entsprechend klein ist auch das Fluoreszenzlicht, das durch den Lichtleiter an dieser Stirnseite wieder ausgesendet und empfangen werden kann, was selbstver ständlich ebenfalls die Meßempfindlichkeit beein trächtigt.

Ähnlich wird bei dem in der EP 0 470 982 B1 beschrie benen Reflexionsfluorimeter gearbeitet, da auch dort das Licht an einer Stirnseite des Lichtleiters einge koppelt wird, und auch das angeregte Fluoreszenzlicht an dieser Stirnseite wieder austritt. Demzufolge tre ten auch die aus US 4,716,121 bekannten Nachteile weiter auf.

Von Otto S. Wolfbeis ist im Artikel "Capillary wave guide sensors"; trends in analytical chemistry, vol. 15, 1996, Seiten 225 bis 232, ein kapillarer Wellen leitersensor, bei dem eine Kapillare mit einer che misch-sensitiven inneren Beschichtung verwendet wird, beschrieben. Die sich infolge des Einflusses von Ana lyten ändernden optischen Eigenschaften der inneren Beschichtung können dabei gemessen werden. Unter an derem wird auch ein evaneszentes Feld für die Anre gung von Lumineszenz genutzt, wobei das Lumineszenz licht mit einem lichtempfindlichen Sensor gemessen werden kann.

In DE 36 30 351 A1 ist eine optische Vorrichtung be schrieben, bei der in einer optischen Wellenleiter anordnung ebenfalls eine totale Innenreflexion einer Erregerstrahlung an der Fläche zwischen dem Wellen leiter und einer umgebenden flüssigen Phase mit nied rigerem Brechungsindex genutzt wird.

Aus DE 42 27 678 A1 ist ein Analyseelement zur Be stimmung eines Analyten in Form eines lichtleitenden Stäbchens mit einer Mantelfläche und zwei im wesent lichen parallelen Stirnflächen bekannt. Eine dieser Stirnflächen trägt ein Reagenz, dessen optisch de tektierbare Reaktion auf die Anwesenheit eines Ana lyten erfaßt werden kann.

Photometrische Instrumente, deren Verwendung in opti schen Analysemethoden und hierzu verwendbares Zubehör sind in AT-E 41 526 B beschrieben. Dabei soll eine optische Analyse einer zumindest teilweise in einer flüssigen Phase vorliegenden Probe durchgeführt wer den. Im Probenmaterial sollen lichtabsorbierende, streuende, fluoreszierende, phosphoreszierende oder lumineszierende Eigenschaftsänderungen ausgenutzt werden. Für die optische Auswertung wird ebenfalls ein transparenter Wellenleiter verwendet, in dessen Innerem Licht unter Ausnutzung der Totalreflexion den Wellenleiter durchläuft. Für die Erreichung der To talreflexion müssen die entsprechenden Brechungsindi ces der Wellen des Wellenleitermaterials und der an grenzenden Flüssigkeit berücksichtigt werden.

Auf Möglichkeiten zur Verwendung faseroptischer Sen soren in Fluoreszenzimmunassays ist von Bruce J. Tromberg und Michael J. Sepaniak im Artikel "Fiber- Optic Chemical Sensors for Competitive Binding Fluo roimmunoassay"; Analytical Chemistry, 59, 1987, Sei ten 1226 bis 1230, hingewiesen, wobei das Fluores zenzlicht an der Spitze der optischen Faser gemessen wird.

Aus DE 35 32 563 C2 ist eine Vorrichtung zur fluores zenzoptischen Messung der Konzentration von Komponen ten einer Probe bekannt. Dabei wird die Anregungs strahlung oder die Fluoreszenzstrahlung unter den Bedingungen der Totalreflexion verwendet, wobei auch hier die entsprechenden Brechungsindices für die Ein haltung dieser Bedingung berücksichtigt werden müs sen. Es wird eine Indikatorschicht verwendet, deren Fluoreszenzverhalten durch die Konzentration der zu bestimmenden Probe beeinflußbar ist. Hierbei kann es sich um das bekannte Phänomen der Fluoreszenzlöschung handeln.

In DE 43 08 202 C2 ist ein Mikro-Küvettensystem für die Absorptionsphotometrie beschrieben. Dabei wird die Probe durch ein Küvettenrohr geführt und Licht auf das Küvettenrohr gerichtet. Küvettenrohr und Pro benflüssigkeit sind brechzahlmäßig so abgestimmt, daß sie für die Strahlung als Wellenleiter wirken. Die auf die Außenwandung des Küvettenrohres gerichtete Lichtstrahlung erfährt eine mehrfache Totalreflexion, so daß die Probenflüssigkeit von der Strahlung mehr fach durchsetzt wird und das Absorptionsverhalten berücksichtigt wird.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Möglichkeit vorzugeben, mit der angeregte Fluoreszenzen mit höhe rer Empfindlichkeit zur Bestimmung von Konzentratio nen verschiedener Analyte gemessen werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Ausge staltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich mit den in den untergeordneten Ansprü chen genannten Merkmalen.

Das erfindungsgemäße Reflexionsfluorimeter verwendet eine Kapillare als Lichtleiter zur Aufnahme von einem oder mehreren verschiedenen Analyten, deren Konzen tration durch Fluoreszenzanregung mit mindestens ei nem lichtempfindlichen Sensor, der an einer Stirnsei te der Kapillaren angeordnet ist, bestimmt wird. Die Fluoreszenzanregung erfolgt mit einer Lichtquelle über eine Einstrahlungsoptik in der Form, daß das Licht auf die äußere Mantelfläche der transparenten Kapillare gerichtet wird. Die Kapillare besteht dabei selbstverständlich aus einem für das Anregungslicht der Lichtquelle transparenten Material, sie kann in bestimmten Fällen auch für nicht sichtbares Licht, wie z. B. infrarotes, transparent sein.

Die Einstrahlungsoptik ist so ausgebildet, daß die entsprechenden Winkel und der Brechungsindex des Ma terials der Optik so ausgewählt sind, daß Anregungs licht nur an der der Mantelfläche der Kapillare ge genüberliegenden Seite austritt. Die Einstrahlungs optik kann dabei im direkten Kontakt mit der äußeren Mantelfläche der Kapillare stehen. Die Winkel der Keilflächen der Optik stehen unter Berücksichtigung des Brechungsindexes in einem Verhältnis zueinander, daß das Licht der Lichtquelle zur Fluoreszenzanregung nur an der schmalen Seite, also an der Seite, die zur Kapillare weist, austreten kann. Dies bedeutet, daß das aus der Lichtquelle austretende Licht an den äu ßeren Flächen der Einstrahlungsoptik mehrfach reflek tiert und dann auf die Mantelfläche der Kapillare gerichtet wird. Dabei soll vermieden werden, daß ein Teil des eingestrahlten Lichtes so reflektiert wird, daß es an der Fläche wieder austritt, in die es ein gestrahlt worden ist. Dies tritt dann auf, wenn der Einstrahlungswinkel zu flach auf die Einstrahlungs fläche trifft oder der Brechungsindex der Einstrah lungsoptik zu groß ist.

Bevorzugt wird für die zu verwendende Optik ein keil förmiges Reflexionstrapezoid, das seitlich an den Lichtleiter heranreicht, eingesetzt.

Die Erfindung kann ebenfalls weitergebildet werden, wenn an der anderen Stirnseite, also gegenüber dem lichtempfindlichen Sensor, eine Kopplungsvorrichtung angeordnet ist. Diese hat einmal den Vorteil, daß an dieser Seite der Kapillare nur ein geringer Anteil an Licht austreten kann, und weiter kann die Kopp lungsvorrichtung zur Fixierung der Kapillare verwen det werden. Dabei kann an dieser Stirnseite der Ka pillare eine Verformung (z. B. eine seitliche Ausbuch tung) vorhanden sein, in die ein Positionieransatz zur Einhaltung einer bestimmten zirkulären Position formschlüssig eingreifen kann. Dadurch kann der ver wendete Lichtleiter mit der Kapillare mehrmals in der gleichen zirkulären Position eingesetzt werden, und verschiedene Untersuchungen können in dieser Form durchgeführt werden, so daß die Reproduzier- und Ver gleichbarkeit der Meßergebnisse verbessert sind.

Bei dem erfindungsgemäßen Reflexionsfluorimeter kann günstigerweise das Licht der Lichtquelle intermittie rend auf die Kapillare gerichtet werden, um zeitauf gelöste Messungen durchführen zu können. Dafür kann die Lichtquelle mit einer entsprechenden Frequenz ein- bzw. ausgeschaltet werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, sogenannte Chopper in bekannter Wei se vor der Lichtquelle anzuordnen bzw. an der gleichen Stelle elektromechanische Schnellverschlüsse einzusetzen.

Mögliche Lichtquellen sind beispielsweise bekannte Glüh- und Blitzlampen oder Laser. Als lichtempfindli che Sensoren können Photomultiplier oder Diodenarrays allein oder in Kombination verwendet werden. Dabei sind die Photomultiplier für Messungen mit niedrigem Signalniveau geeigneter, und die Diodenarrays können günstig eingesetzt werden, wenn eine schnellere Da tenerfassung und -verarbeitung erforderlich wird.

Durch die Anordnung von optischen Gittern oder die Verwendung von Spektrometern vor den lichtempfindli chen Sensoren kann eine wellenlängenaufgelöste Mes sung durchgeführt werden. Dies hat den Vorteil, daß bei einer Messung gleichzeitig verschiedene Fluores zenzen und demzufolge auch Analyte bestimmt werden können.

Das erfindungsgemäße Reflexionsfluorimeter kann au ßerdem verbessert werden, indem mindestens ein Hilfs sensor zur Messung des von der Lichtquelle emittier ten oder anderen reflektierten Lichtes vorhanden ist, um eine Kompensation und Meßwertkorrektur durchzufüh ren zu können.

Selbstverständlich können auch weitere Fehler, wie z. B. Justiermängel der Kapillare oder die Schwankun gen der Leistung der Lichtquelle berücksichtigt und die so hervorgerufenen Fehler kompensiert werden. Alle Meßwerte, auch die Korrekturwerte, werden in einer datei- und rechnergestützten Datenverarbei tungsanlage erfaßt, und eine Auswertung führt zu ana lytischen und diagnostischen Aussagen.

Vorteilhaft werden Kapillaren verwendet, die ein gro ßes Verhältnis von innerer Oberfläche in der Kapilla re und Kapillarenvolumen aufweisen, um die Empfind lichkeit und die Nachweisgrenzen zu erhöhen. Das Vo lumen-Oberflächenverhältnis in der Kapillare sollte im Bereich zwischen 1 : 3 bis 1 : 10 µl/mm², bevorzugt bei 1 : 5 µl/mm², liegen. Dadurch kann im Gegensatz zu bekannten Mikrowells in einer Mikrotiterplatte ein mehr als fünffach höheres Verhältnis erreicht werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Reflexionsfluorimeter konnte gegenüber den bekannten Meßanordnungen eine mehr als tausendfach erhöhte Empfindlichkeit bei Ver wendung wesentlich einfacherer optischer und elektro nischer Komponenten erreicht werden.

So konnten bei Durchführung einer Fluoreszein-Verdün nungsreihe als kleinste Konzentration 1,33 pmol/l mit einem Signal-Rauschverhältnis von mehr als zwei be stimmt werden (siehe Fig. 3). Begrenzend ist hier vor allem die Hintergrundfluoreszenz der verwendeten Ma terialien.

Bei Untersuchungen mit sehr verdünnten Lösungen ist es von Vorteil, daß die innere Oberfläche der Kapil lare zur Konzentration des Analyten genutzt wird, indem die Kapillare sensibilisiert wird und dann ein größeres Volumen hindurchfließen kann. Es besteht also die Möglichkeit, mehr Analyte an der inneren Oberfläche der Kapillare zu immobilisieren bzw. zu binden. Bei Immunoassays kann der sogenannte "Hook- Effekt" durch Verdünnen umgangen werden und im An schluß daran durch, Konzentration in der Kapillare wieder eine höhere Signalstärke erreicht werden.

Bei Messungen an mit Avidin beschichteten Kapillaren und mit Biotin gekoppelten Reagenzien konnte die Ver besserung, die erreicht werden kann, nachgewiesen werden. Bei der Messung können sogenannte Mikrobeads mit Fluoreszenz-Farbstoff und Biotin eingesetzt wer den. Diese binden an die mit Avidin beschichtete In nenwand der Kapillare und konnten auch durch mehrfa ches Spülen mit einem Puffer nicht entfernt werden. Dadurch konnte eine lineare Konzentration-Fluores zenz-Beziehung nachgewiesen werden, die über zwei Zehnerpotenzen reicht (siehe Fig. 4). Das Aufbringen der Beschichtung kann mit physiologischer Salzlösung erfolgen, wobei die über schüssigen Valenzen mit inerten Proteinen abgesättigt werden können.

Die Fluoreszenz-Farbstoffe können an biologische Mo leküle oder an sogenannte Mikrobeads gebunden sein. Mit dem erfindungsgemäßen Reflexionsfluorimeter kön nen auch Antigen- und Antikörperreaktionen untersucht bzw. nachgewiesen werden. Die Untersuchung von DNA/RNA kann zusätzlich mit Hilfe von intercalieren den Farbstoffen, z. B. Ethidiumbromid, durchgeführt werden. Außerdem können auch Untersuchungen an größe ren (Zell-)Kompartimenten oder ganzen Zellen durch geführt werden.

Nachfolgend soll die Erfindung an einem Beispiel nä her beschrieben werden. Dabei zeigen:

Fig. 1 eine Draufsicht auf ein Reflexionsfluorime ter, und

Fig. 2 eine Seitenansicht des in Fig. 1 darge stellten Reflexionsfluorimeters.

In den Figuren ist dargestellt, wie Licht der Anre gungslichtquelle 2 auf die äußere Mantelfläche über die gesamte Länge einer Kapillare 1 gerichtet wird. Dabei wird das Licht, wie dies die Strahlen verdeut lichen, durch eine Anregungsoptik 6 auf die Kapillare 1 gerichtet. Die Anregungsoptik 6 ist bevorzugt ein keilförmiges Reflexionstrapezoid, dessen Geometrie- und Brechnungsindex sichern, daß nahezu der gesamte Lichtanteil des von der Anregungslichtquelle 2 abgestrahlten Lichtes auf die Oberfläche der Kapillare 1 trifft und zur Anregung ausgenutzt werden kann.

In der Kapillare 1 kann mindestens ein Analyt enthal ten sein, der durch Fluoreszenz-Anregung mit bekann ten Verfahren aus der Chemie und Biochemie auch quan titativ bestimmt werden kann.

Das angeregte Fluoreszenzlicht tritt aus einer Stirn seite der Kapillare 1 aus, wie mit den Pfeilen kennt lich gemacht, und kann mit lichtempfindlichen Senso ren 4 bestimmt werden. Dabei ist es günstig, zur Un terdrückung des Streulichteinflusses vor den licht empfindlichen Sensor 4 ein optisches Filter 5 anzu ordnen.

Anstelle des optischen Filters 5 kann aber auch für wellenlängenaufgelöste Messungen ein optisches Gitter oder ein Spektrometer verwendet werden, wobei dann der lichtempfindliche Sensor in Form eines entspre chend angeordneten und dimensionierten Diodenarrays ausgebildet ist.

An der anderen Seite der Kapillare 1 ist eine Kopp lungsvorrichtung 3 vorhanden, um die Kapillare 1 zu fixieren und zu positionieren.

An dieser Seite kann ein Positionieransatz 7 an der Kapillare 1 ausgebildet werden, der sicherstellt, daß diese in einer ganz bestimmten zirkulären Position gehalten wird, so daß die Kapillare 1 auch für nach folgende Untersuchungen in reproduzierbarer Form er neut fixiert werden kann.

Claims

1. Reflexionsfluorimeter mit einer Kapillare als Lichtleiter für das im Bereich des evaneszenten Feldes angeregten Fluoreszenzlichtes zur Auf nahme von einem oder mehreren Analyten, einer einen Fluoreszenzfarbstoff enthaltenden und auf der Kapillarinnenwand angeordneten Beschichtung, einer Anregungslichtquelle, die zur Fluoreszenz anregung in der Beschichtung so angeordnet ist, daß Anregungslicht auf die äußere Mantelfläche der Kapillare trifft und ein Teil des Anregungs lichtes die Kapillare durchstrahlt, und mit min destens einem lichtempfindlichen Sensor, der an einer Stirnseite der Kapillare für den Empfang des aus dem Reflexionsfluorimeter austretenden Fluoreszenzlichtes angeordnet ist,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Licht der Anregungslichtquelle (2) durch eine zylindrische oder prismatische Einstrah lungsoptik (6) auf die Mantelfläche der Kapilla re (1) gerichtet ist, wobei
die Winkel und der Brechungsindex der Einstrah lungsoptik (6) so ausgewählt sind, daß An regungslicht nur an ihrer der Mantelfläche der Kapillare gegenüberliegenden Seite austritt.

2. Reflexionsfluorimeter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an der dem Sensor gegenüberliegenden Stirnseite der Kapillare (1) eine mechanische Kopplungsvorrichtung (3) ange ordnet ist.

3. Reflexionsfluorimeter nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Einstrahlungs optik (6) ein keilförmiges Reflexionstrapezoid ist.

4. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungs lichtquelle (2) eine intermittierende Licht quelle ist.

5. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der lichtempfind liche Sensor (4) ein Photomultiplier oder ein Diodenarray ist.

6. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem licht empfindlichen Sensor (4) ein optisches Filter (5) angeordnet ist.

7. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem licht empfindlichen Sensor (4) ein optisches Gitter oder ein Spektrometer angeordnet ist.

8. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Hilfssensor zur Messung des emittierten Lichtes der Anregungslichtquelle (2) oder des reflek tierten Lichtes vorhanden ist.

9. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare (1) ein Volumen-Oberflächenverhältnis von 1 : 3 bis 1 : 10 µl/mm² aufweist.

10. Reflexionsfluorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß an dem dem Sensor (4) gegenüberliegenden Ende der Kapillare (1) ein Positionieransatz (7) zur Einhaltung einer bestimmten zirkulären Position ausgebildet ist.