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Technisches
Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Probensubstrate, wie Platten, Objekträger bzw. Deckgläschen und
Zellen, zur Verwendung bei der Untersuchung, beim Anzeigen, Analysieren
oder Identifizieren von fluoreszenten Probenmaterialien, z. B. markierten
molekularbiologischen Proben, und sie betrifft insbesondere derartige
Probenträger
bzw. Probenhalter, deren optische Strukturen zur Verstärkung der Fluoreszenzdetektion
und -bilderzeugung angepasst sind.
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Fachlicher
Hintergrund
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Fluoreszenzmikroskopie wird häufig auf
den Gebieten der Molekularbiologie; Biochemie und anderen Lebenswissenschaften
zum Analysieren biologischer Moleküle, einschließlich Nukleinsäuren (DNA,
RNA) und Proteinen (Enzyme, Antigene etc.), welche mit fluoreszenten
Sonden gekennzeichnet bzw. markiert worden sind, angewandt. Eine
derartige Anwendung besteht in der DNA-Diagnostik, wie für Gendetektion,
wobei eine DNA-Probe auf ein Glassubtstrat abgeschieden und an selbiges
gebunden wird mittels eines chemischen Bindungsmittels, wie einem
Aminosilan, welches auf der Substratoberfläche vorhanden ist, und eines
Reagenzes, wie einem Carbodümid-Dampf.
Die gebundene DNA auf dem Substrat kann dann durch Fluoreszenz abgebildet
werden. Die Fluoreszenz einer Probe wurde ursprünglich durch visuelle Betrachtung
durch ein herkömmliches
Mikroskop eingeschätzt,
aber dieses manuelle Verfahren hat sich als zeitaufwendig und kostspielig
erwiesen. Viele verschiedene automatisierte Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzbildgebungssysteme
sind jetzt verfügbar.
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Ein wichtiges Kennzeichen der Eignung
für Fluoreszenzdetektion
und Messinstrumente ist die Empfindlichkeit, welche hauptsächlich durch
das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis
(SNR, Singal-to-noiseratio) des optischen Bilderzeugungssystems
des Instrumentes bestimmt wird. Ein gut-entworfenes Bildgebungssystem
besitzt ein Signal-zu-Rauschen-Verhältnis, welches durch sein Lichteinfangvermögen und
nicht durch interne Rauschquellen beschränkt wird. Das theoretische
SNR eines derartigen Systems wird begrifflich als die Anzahl von
Photoelektronen an der Kathode bei Verwendung eines Photomulitplier-Rohres (PMT) ausgedrückt, welche
ihrerseits im wesentlichen von der Anzahl von Photonen, welche den
Detektor aus dem Gebiet von Interesse auf dem Probensubstrat erreichen,
der Quanteneffizienz des Detektors und der Anzahl dunkler Elektronen, welche
vom Detektor erzeugt wird, abhängt.
SNR = S/[S + 2B]1/2 worin
B das Gesamthintergrundrauschen ist, und S das gemessene Signal
abzüglich
B ist. Ein offensichtliches Vorgehen zur Erhöhung der SNR, und dadurch zur
Verbesserung der Empfindlichkeit, besteht darin, das Hintergrundrauschen
zu reduzieren. Quellen des Hintergrundrauschens schließen die
spiegelglänzende
oder diffuse Reflexion des fluoreszenzstimulierenden Laserslichts
aus der Probe, Autofluoreszenz des Substrates, welches die Probe
trägt,
Autofluoreszenz aus der Optik im Lichtweg des optischen Bildgebungssystems,
Streulicht und den Dunkelstrom des Detektors ein. Streulicht welches
den Detektor erreicht, kann signifikant durch die geeignete Größe und Plazierung
von Öffnungen
bzw. Spalten im Bilderzeugungssystem verringert werden. Sowohl Streulicht
als auch vieles des reflektierten Laserlichtes können abgewiesen werden, während das
fluoreszente Licht hindurchgelassen wird, durch Verwenden von dichroitischen
und anderen spektralen Filtern und Strahlenteilern im System. Die
Autofluoreszenz der optischen Elemente kann durch Vermeiden der
Verwendung von Linsenklebstoffen im Lichtweg, unter Verwendung von
Glas anstatt von Polymer-Linsen, oder unter Verwendung gekrümmter Spiegel
anstelle von Linsen, wo immer möglich,
verringert werden. Die Autofluoreszenz des Substrates kann durch Verwenden
von Niedrigfluoreszenz-Materialien verringert werden, wie einem
ultradünnen
oder opaken Glassubstrat. Beispielsweise offenbart Strongin im U.S.-Patent
Nr. 5 095 213 einen Kunstoffobjekträger, welcher mit einer Menge
an schwarzem Kohlenstoffpulver in dem Kunstoff opak und im wesentlichen nicht-fluoreszent
gemacht wird. Ein anderer Weg zur Behandlung der Autofluoreszenz
besteht in der Verwendung einer gepulsten oder modulierten Anregung,
und darin, einen Vorteil aus den Unterschieden in den Emissionszerfallsraten
zwischen der Hintergrundfluoreszenz und der Probenfluoreszenz zu
ziehen, wie offenbart in den U.S.-Patenten Nr. 4 877 965 von Dandiker
et al., und 5 091 653 von Creager et al.
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In der U.S. 5 394 268 beschreiben
Lani et al. ein verbessertes optisches Mikroskop zur lumineszenten
(fluoreszenten oder phosphoreszenten) Detektion einer Probe. Dies
wird durch die Bewegung der Schwingungsbauch-Ebenen der stehenden
Welle mit der Probe erzielt. Die Bewegung kann entweder durch Bewegen
der Lichtstrahlen durch steile Winkel oder durch Bewegen der Probe
erzielt werden. Eine Reihe von Bildern kann dann kombiniert werden,
um das letztendliche Signal zu erzeugen.
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Im U.S.-Patent Nr. 5 552 272 offenbart
Bogart ein Assaysystem und ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart
oder Menge eines Analyten von Interesse. Es beinhaltet ein Testsubstrat
mit einer optisch aktiven Oberfläche,
welche den Farbkontrast verstärkt,
d. h. Unterschiede in der beobachteten Wellenlänge (oder Kombination von Wellenlängen) des
Lichtes von der Oberfläche
zwischen dem Vorhandensein und der Abwesenheit des Analyten in einer
Probe, welche auf das Testsubstrat aufgetragen wurde. Insbesondere
kann das Substrat einen reflektierenden festen optischen Träger, wie
einen Siliziumwafer oder eine metallische (z. B. Aluminium) Grundlage
mit einer darauf befindlichen optischen Dünnfilm-Beschichtung umfassen. Die Beschichtung kann
mehrere Schichten umfassen, einschließlich beispielsweise einer
Anheftungsschicht auf der oberen Oberfläche des Trägers und einer Empfängerschicht
auf der oberen Oberfläche
der Anheftungschicht des Trägers,
enthaltend einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten von Interesse.
Die Gesamtbeschichtungdicke wird ausgewählt, um zu verursachen, dass
einfallendes Licht einer Dünnfilm-Indifferenz
nach Reflektion unterliegt, so dass eine spezifische Farbe erzeugt
wird. Spezifisch sollte das/die Beschichtungsmaterial(en) eine Gesamtdicke
von einer Viertelwelle der unerwünschten
Farbe, welche attenuiert werden soll, aufweisen, so dass eine destruktive
Interferenz dieser Farbe stattfinden wird. Das Substrat besitzt
deshalb eine besondere Hintergrundfarbe, welche dann als eine Vergleichsreferenz
gegen eine unterschiedliche beobachtete Farbe verwendet werden kann,
wenn ein Analyt von Interesse vorhanden ist. Sowohl qualitative
visuelle Inspektion als auch quantitative instrumentelle Messung
werden vorgeschlagen. Auch Polarisationskontrast mittels eines Ellipsometers
wird vorgeschlagen.
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Ein Beispiel der Anwendung, zu welcher
die Erfindung von Bogart durch Biostar, Inc. of Boulder, Colorado,
den Patentinhaber bzw. Rechtsnachfolger des zuvor erwähnten Patentes,
gebracht worden ist, ist ein optischer Immunoassay(OIA)-Diagnose-Screeningtest
für- die
rasche Detektion (in weniger als 30 Minuten) des Vorhandenseins
spezifischer Antigene von infektiösen Patogenen in einer Probe, welche
auf aus einem Patienten abgenommen wurde. Kommerzielle Produkte
schließen
Testkits für Streptokokken
der Gruppe A und Gruppe B und für Chlamydia
trachomatis ein. Diese besonderen Assays sind als Beispiele in dem
Bogart-Patent angegeben, werden in den Packungsbeilagen für die entsprechenden
Biostar-Produkte
beschrieben und werden ebenfalls in einer Reihe von veröffentlichten
Artikeln in medizinischen Fachzeitschriften beschrieben. Kurz gesagt,
beruhen sie alle auf der direkten visuellen Detektion einer Änderung
in der Farbe der Lichtreflektion, welche von dem Testsubstrat ausgeht,
aufgrund einer physikalischen Änderung
in der optischen Dicke eines molekularen Dünnfilmüberzugs auf der Substratoberfläche, welche
aus Bindungsreaktionen zwischen einem immobilisiertem Antikörper auf
der Testoberfläche
und einem spezifischen Antigen resultiert, welches in einem Tropfen
Probenflüssigkeit
vorhanden sein kann, der auf die Testoberfläche aufgetragen wird. Die ursprüngliche
blanke Testoberfläche
besitzt eine Dünnfilmdicke
welche zu einer vorherrschenden sichtbaren goldenen Hintergrundfarbe
führt,
wenn weißes
Licht von der Oberfläche
reflektiert wird. Die Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion, welche
auftritt, wenn das spezifische Antigen von Interesse in der aufgetragenen
Probe vorhanden ist, führt
zu einem Anstieg der Dünnfilmdicke,
welcher eine konospondierende Änderung
in der Farbe der Testoberfläche
von Gold zur Purpur verursacht. Wenn andererseits das Antigen in
der Probe nicht vorhanden ist, findet keine Bindung stattf die ursprüngliche
Dünnfilmdicke
bleibt unverändert,
und die Testoberfläche
behählt
ihre ursprüngliche
goldenen Farbe, was ein negatives Resultat anzeigt. Dieses diagnostische
Assay-Werkzeug ist
sehr empfindlich und ist leicht zu interpretieren.
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Bogart offenbart in einer anderen
Ausführungsform
seiner Erfindung (17 des zuvor erwähnten Patentes)
ferner die Verwendung dieser Substrate zur verstärkten Fluoreszenzdetektion. Nachdem
der Analyt von Interesse an die Oberfläche durch Reaktion mit dem
spezifischen Bindungspartner in der Empfängerschicht der Substratbeschichtung
gebunden hat, können
fluoreszente Markierungsmoleküle
an den Analyt angeheftet werden. Insbesondere können die fluoreszenten Moleküle an jedwedes
geeignet selektive und spezifische Empfängermaterial oder-Reagenz,
wie einen sekundären Antikörper, angeheftet und
auf die Oberfläche
aufgebracht werden. Die fluoreszenten Markierungen werden somit
an den Analyt von Interesse auf der Oberfläche gebunden, falls vorhanden,
und über
die Analyt-Brücke
an der Oberfläche
immobilisiert. Das Lenken von Licht einer Anregungswellenlänge auf
die Oberfläche
stimuliert die Fluoreszenz von einer Beliebigen der an die Oberfläche gebundenen
Markierungen, wodurch das Vorhandensein des Analyts von Interesse
gezeigt wird. Weil die Maximum-Fluoreszenzwellenlänge nicht
weit genug von der Anregungswellenlänge verschoben sein kann, um
unterschieden zu werden, kann das reflektierende Substrat eine Anti-Reflexions-Schicht
aufweisen, deren Dicke gewählt
ist, um die Reflexion der Anregungswellenlänge zu unterdrücken, wodurch
das Hintergrundrauschen, welches den Detektor erreicht, verringert
wird. Bogart gibt an, dass die Fluoreszenzsignalerzeugung nicht
von der Filmdicke abhängig
ist.
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Selbst wenn das Hintergrundrauschen
minimiert wird (und selbst wenn das Substrat so konstruiert ist,
dass das reflektierte oder fluoreszierende Probensignal sich kontrastmäßig deutlicher
gegen den Hintergrund des Substrates abhebt), ist das maximal mögliche Signal-zu-Rauschen-Verhältnis (SNRmax) immer noch beschränkt auf: SNRmax =
S1/2. Obwohl das Fluoreszenzsignal S durch
Erhöhen
der Ausgangsleistung des Lasers erhöht werden kann, wird auch das
reflektierte Laser-Rauschen zunehmen, möglicherweise mit einer geringen
Verbesserung in dem resultierenden SNR.
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Ein Ziel der vorliegenden Erfindung
besteht darin, eine erhöhte
Probenanregung und Fluoreszenzemission vorzusehen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Das Ziel ist mittels eines Systems
gemäß Anspruch
1 und eines Verfahrens gemäß Anspruch
10 erreicht worden. Insbsondere schließt das Substrat eine starre
Unterlage mit einer spiegelglänzenden, reflektierenden
Oberfläche
ein. Der transparente Überzug
auf der oberen Oberfläche
der Unterlage besitzt eine Dicke, die so gewählt ist, dass für eine besondere
Anregungswellenlänge
des Lichtes der optische Pfad von der Oberseite des Überzugs
bis zur reflektierenden Oberfläche
der Unterlage im Wesentlichen ein ungrades Vielfaches (1, 3, 5 etc.)
eines Viertels der Wellenlänge
des Anregungslichtes beträgt.
Die optische Pfadlänge
des Materials ist defmiert durch die Wellenlänge des Lichts, den Brechungsindex
des Materials und den Ausbreitungswinkel durch das Material. Es
ist ebenfalls zu bemerken, dass die reflektierende Oberfläche der
Unterlage tatsächlich
geringfügig
unter ihrer physikalischen Oberfläche liegt, und zwar um einen
Betrag, gleich der Summe der Haut(oder Eindring)-Tiefe des reflektierenden
Oberflächenmaterials
und der optischen Tiefe einer beliebigen Oberflächenoxidation auf der Unterlage.
Eine schmale Anregungs-Frequenzlinienbreite wird bevorzugt.
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Die Unterlage kann vollständig aus
Metall hergestellt sein oder kann aus einer starren Bodenschicht
mit einer Metall-Oberseitenbeschichtung aufgebaut sein. Bei dem
Metall kann es sich um Aluminum, Silber, Gold oder Rhodium handeln.
Der transparente Überzug
kann eine Einzelschicht aus dielektrischen Material, wie Siliziumoxid,
Aluminiumoxid oder ein Fluoridmaterial (wie MgF2)
sein. Alternativ dazu kann die transparente Beschichtung ein Mehrfachschicht-Überzug sein,
wobei die Oberseiten schickt ein chemisch reaktives Material zur
Bindung eines spezifischen biologischen Proben-Bestandteils daran
ist.
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Indem die Probe auf der Überzugsschicht
an oder nahe den Schwingungsbauch des Anregungslichtes gebracht
wird, findet eine Maximum-Fluoreszenzanregung statt. Ein reflektierendes
Substrat verstärkt
die Fluoreszenzerfassung auch durch eine beinahe Verdopplung des
festen Einfangwinkels eines Fluoreszenzbilderzeugung-Milcroskopssystems.
Somit wird das Gesamtfluoreszenzsignal erhöht, was zu einem stark verbesserten
Signal-zu-Rauschen-Verhältnis
führt.
Da die Überzugsschicht
sehr dünn
ist, besteht des weiteren ein verringertes Fluoreszenz-Hintergrundrauschen
von diesem Material.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die 1 ist
ein schematischer Seiten-Plan eines Fluoreszenz-Mikroskopsystem
zur Anwendung mit dem Substrat der vorliegenden Erfindung.
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Die 2 ist
eine allgemeine perspektivische Ansicht eines Probensubstrates der
vorliegenden Erfindung, welches mit einem Fluoreszenzbilderzeugungssystem,
wie dem Mikroskop von 1, verwendet
wird.
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Die 3A und 4A sind seitliche Schnitt-Nahansichten
von zwei Probensubstraten, eines ohne einen transparenten Überzug (3A) und das andere, gemäß der Erfindung,
mit einer transparenten Überzugschicht
(4A)
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Die 3B und 4B sind Grafiken der elektrischen
Feldstärke
IEI gegen die Tiefe für
die Substrate von 3A bzw. 4A, wobei der Vorteil des
Substrates der Erfinung von 4A veranschaulicht
wird.
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Bester Weg
zur Ausführung
der Erfindung
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Das Probensubstrat der vorliegenden
Erfindung kann in einem beliebigen einer großen Anzahl von möglichen
Fluoreszenzmikroskopsystemen verwendet werden, einschließlich beispielsweise
denjenigen, welche in den U.S.-Patenten 4 284 897 von Sawamura et
al., 5 091 652 von Mathies et al., 5 296 700 von Kumagai, 5 381
224 von Dixon et al. und 5 504 336 von Noguchi, als auch den U.S.-Patent-Anmeldungen 08/595
355, 08/616 174 und 08/791 684 beschrieben wurden, welche alle an
den Patentinhaber der vorliegenden Erfindung zugewiesen wurden. Ein
bevorzugtes Fluoreszenzbilderzeugungssystem zur Verwendung mit der
vorliegenden Erfindung wird in der 1 veranschaulicht.
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Eine Lichtquelle 18, wie
ein Laser, erzeugt einen Lichtstrahl 19. Der Strahl ist
vorzugsweise ein kollimierter Strahl von monochromatischem kohärenten Licht.
Allerdings könnte
eine nicht-kohärente Quelle,
wie eine Licht-emittierende Diode (LED) verwendet werden, und eine
nicht-kollimierte Quelle könnte
an eine kollimierende Optik gekoppelt werden, um einen kollimierten
Strahl zu erzeugen. Wenn der Strahl 19 nicht monochormatisch
ist, kann er durch einen Filter 20 gelenkt werden, um jegliche
unerwünschten
Wellenlängen
zu reduzieren.
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Der Strahl 19 wird dann
durch einen Strahlen-Expander 21 geleitet und durch einen
Strahlenteiler 23 auf eine Scanner- hzw. Abtastvorrichung 25 reflektiert.
Jedweder Abtastmechanismus, welcher eine zweidimensionale Abtastung
erzeugt, kann verwendet werden. Zum Beispiel kann der Scanner 25 ein
erstes strahlenreflektierendes Element 43 aufweisen, wie
einen Galvanometerspiegel oder ein rotierendes Polygon, schwenkbar
oder rotierbar um eine erste Achse A und bewegt durch einen Motor 45,
und eine bewegliche Plattform oder Drehscheibe 47, rotiert
durch einen Schrittmotor 49 um eine zweite Achse B, welche
im rechten Winkel zur ersten Achse A steht, und auf welcher das
erste reflektierende 43 getragen wird. Der Reflektor 43 muss
keine planare reflektierende Oberfläche aufweisen, sondern könnte in
einer oder beiden Achsen konkav oder konvex sein, oder sogar eine
beugende Oberfläche
aufweisen.
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Der Abtaststrahl wird durch eine
Objektivlinse 27 gelenkt, um einen Punkt, eine Linie oder
eine Fläche
auf einer Probe 29 zu beleuchten. Das Objektiv 27 ist
vorzugweise telezentrisch (oder fast telezentrisch) in der Bildebene,
so dass der Hauptstrahl des Strahles stets in einem im wesentlichen
rechten Winkel zur Probenoberfläche,
ungeachtet der Abtast-Position, einfällt. In Bezug auf den einfallenden
Strahl sollte die Brennebene des Objektivs nahe zur Probe 29 liegen.
Das Objektiv 27 stellt eine koaxiale Beleuchtung und Sammlung
bereit. Um die Sammeleffizienz zu maximieren, wird es bevorzugt,
dass die Objektivlinse 27 eine große numerische Apertur aufweist.
Das Objektiv 27 besitzt vorzugweise eine äußere Pupille
welche mit den Abtast-Achsen A und B an der reflektierenden Oberfläche 43 zusammenfällt bzw.
koinzidiert, so dass das aufgeffangene Licht als ein Retro-Strahl
zurück
zum Strahlenteiler 23 gelenkt wird. Der beleuchtende Lichtstrahl 19 ist
ein Anregungsstrahl, welcher eine fluoreszente Lichtemission aus
der Probe 29 an dem beleuchteten Fleck stimuliert. Das
fluoreszente Licht wird dann durch die Objektivlinse 27,
welche als eine Kondensor wirkt, gesammelt und als ein Retro-Strahl
entlang des einfallenden Lichtpfades (aber in der entgegengesetzten Richtung)
zurück
gelenkt. Da das Fluoreszenzlicht im allgemeinen aus einem breiten
Band von Wellenlängen
besteht, welche von den Wellenlänge(n)
des einfallenden stimulierenden Strahls verschieden sind, und da
das System ausgelegt sein sollte, mit einer Vielzahl von Fluorochromen
zu arbeiten, ist das System, welches das Objektiv 27 einschließt, vorzugsweise
in großen
Maße achromatisch
und sieht eine Korrektur von chromatischen Abweichungen über einen
Bereich von Wellenlängen
hinweg vor.
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Der Retro-Strahl 31 kann
durch eine Apertur oder Pupille eines Raumfilters oder einer Blende 32 und
durch den Strahlenteiler 23 hindurch laufen. Der Strahlenteiler 23 kann
als ein dichroitischer Filter wirken, welcher die Einfallstrahl-Wellenlänge(n) reflektiert
und die Fluoreszenzwellenlängen
durchlässt (oder
umgekehrt), oder kann ein beliebiger anderer Typ von Strahlenteiler
sein, der in der Lage ist, das Licht der einfallenden und der Retro-Strahlen 19 und 31 zu
trennen (z. B. ein polarisationsempfindlicher Strahlenteiler in
Kombination mit einer Viertel-Wellen-Platte). Der Retrostrahl 31 kann
dann durch einen Bandpass-Filter 34 und eine Fokussierunglinse 33 auf
eine Begrenzungs-Apertur 35 gelenkt werden. Licht, welches
durch die Öffnung 35 hindurch
läuft, trifft
auf einen Photodetektor 39, wie ein Photomultiplier-Rohr
(PMT).
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Welches Bildgebungssystem auch immer verwendet
wird, es sollte vorzugweise in der Lage zum Abtasten bei hoher Geschwindigkeit über ein großes Abtastfeld
mit einer Hochauflösungs-Bilderzeugung
und minimalen optischen Abweichungen sein. Es sollte eine koaxiale
Beleuchtung und eine Erfassung mit hoher Einfangeffizenz vorsehen.
Ein achromatisches System mit hervoragender Farbkorrektur, sowie
ein System, ausgelegt zum Minimieren des Hintergrundrauschens (einschließlich Autofluoreszenz)
wird bevorzugt.
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Unter Bezugnahme auf die 2 weist ein Probensubstrat 51 der
vorliegenden Erfindung auf seiner oberen Oberfläche 53 eine fluoreszente
Probe 55 auf. Das Substrat 51 kann in einer Ausführungsform
montiert werden, um entlang der Linien 54 geneigt zu werden.
Der Schrägstellungswinkel
des Substrates 51 kann ausgewählt werden, wie nachstehend
erörtert.
Das Substrat 51 ist ausgelegt, um mit jedwedem Fluoreszenzbilderzeugungssystem, wie
demjenigen, gezeigt in 1,
zu arbeiten. Ein derartiges System wird schematisch in der 2 gezeigt, mit einem Laserlichtstrahl 57,
der einen fluoreszenzstimulierenden Strahl 59 einer Wellenlänge λ1 vorsieht,
welcher durch ein Objektiv 61 auf die Probe 55 auf
der Oberfläche 53 gelenkt
wird. Die Probe 55 emittiert Fluoreszenzlicht einer Wellenlänge λ2,
welche durch das Objektiv 61 gesammelt, durch einen Strahlenteiler 63 von
dem einfallenden Licht getrennt und auf einen PMT-Detektor 65 gerichtet
wird. Das verbesserte Substrat 51 ist konstruiert, um die
Fluoreszenzemission und -Erfassung zu maximieren, ohne dass die
Leistung des Laserstrahls 59 erhöht und ohne dass das Objektiv 61 oder
andere optische Elemente in dem System, welche verschieden von dem
Substrat 51 selbst sind, ausgetauscht werden müssen.
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Unter Bezugnahme auf die 3A–3B und 4A–4B wird
der Versuch unternommen, das Substrat, auf welchem die fluoreszente
Probe 55 abgeschieden wird, zu verspiegeln. Vom Standpunkt
der geometrischen oder "Strahlen"-Optik könnte man
davon ausgehen, dass ein derartiges Vorgehen die Anregung durch
das einfallende Licht verdoppeln sollte (weil Lichtstrahlen dann
die Probe sowohl direkt als auch nach Reflexion beleuchten würden) und
ebenfalls das Erfassen der emittierten Fluoreszenz verdoppeln sollte
(weil die von dem Objektiv abgestrahlten Fluoreszenzstrahlen zum
Objektiv zurückreflektiert
würden;
wodurch der Festwinkel der Sammlung effektiv verdoppelt wird). Es
ist allerdings festgestellt worden, dass dieses Vorgehen von sich
selbst aus nicht funktioniert. Wenn ein blankes reflektierendes Substrat 51' verwendet wird,
wie in der 3A ersichtlich,
dann wird festgestellt, dass die Probe 55 tatsächlich nur
eine vernachlässigbare
Anregung erfährt,
und es wird eine geringe Fluoreszenz, wenn überhaupt, beobachtet, trotz
der Tatsache, dass die beobachtete Reflektivität im Weitfeld erhöht ist,
wie erwartet.
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Um dieses unerwartete Phänomen zu
verstehen, müssen
wir uns einer Kombination aus physikalische Optik und der Wellentheorie
des Lichtes zuwenden. Im Jahre 1890 berichtete O. Wiener über seine
Experimente, welche stehende Wellen zeigten, die durch die Reflekion
von Licht bei normalen Einfall von einem polierten Spiegel erzeugt
wurden. Durch Anbringen eines dünnen
photographischen Films in einer Neigung zur Spiegeloberfläche und
danach Entwicklung des. exponierten Films wurde ein System von getrennten
dunklen Banden, auf dem Film produziert. Das Verringern des Neigungswinkels
verursachte, dass sich die Banden weiter auseinander bewegten. Das
Experiment wurde zwei Jahre später von P.
Drude und W. Nernst unter Anwendung von Fluoreszenz wiederholt,
um das Phänomen
unmittelbar ohne die Notwendigkeit für eine photographische Entwicklung
zu beobachten. Es versteht sich, dass dieses Phänomen aus der Überlagerung
von einfallenden und reflektierten Lichtwellen resultiert, wobei stehende
Wellen mit Schwingungsknoten und Schwingungsbäuchen bei verschiedenen Höhen über der
Spiegeloberfläche
erzeugt werden. Es gibt einen Knoten, lokalisiert an der reflektierenden
Oberfläche
(aufgrund der endlichen Leitfähigkeit
von realen Metallen liegt diese tatsächlich geringfügig unter der
physikalischen Oberfläche),
und die Knoten sind durch eine Distanz von einer halben Wellenlänge getrennt.
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Das Problem, dass dieses Phänomen verursacht,
wenn versucht wird, Fluoreszenz einer molekularen Probe auf einer
blanken Spiegeloberfläche hervorzurufen,
besteht darin, dass eine nur vernachlässigbare Anregung auftritt,
weil das Probenmaterial nahe einem Knoten in der stehenden Welle
des Anregungslichtes lokalisiert ist. Wie in der 3A ersichtlich, wird eine molekulare
Probe 55 auf der Oberseite der physikalischen Oberfläche 53' eines bloßen Metallsubstrates 51' lokalisiert.
Die reflektierende Oberfläche
liegt geringfügig
unterhalb der physikalischen Oberfläche 53', und zwar um eine Distanz 6,
entsprechend der Summe der Hauttiefe des Metallsubstrates 51' und der Tiefe
der gewöhnlichen Oberflächenoxidation.
Im Falle eines Aluminiumsubstrates ist die Hauttiefe etwa 13 nm
dick, und das Oberflächenoxid
ist etwa 2 bis 5,5 nm dick, was eine Distanz 6 von etwa 16,5 nm
ausmacht. Für
einfallendes Licht einer Wellenlänge
von 532 nm beträgt
diese Distanz 6 etwa 4% einer Wellenlänge. Wie in der 3B ersichtlich, ist die
Feldamplitude (für
Licht ist das elektrische Feld das hauptsächlich interessierende) an
der Stelle 63 der molekularen Probe nahezu null, da diese
nahe bei einem Knoten der stehenden Welle liegt, welche durch die
Reflektion erzeugt wird. Die von der Probe erfahrene Feldamplitude
wäre höchstens
nur etwa 23% der Maximum-Amplitude an der Stelle eines Schwingungsbauches.
(Die Intensität,
welche als das Quadrat der Amplitude vorliegt, beläuft sich
auf nur 5%, des Maximums). Die Probe erfährt eine geringe Anregung,
obwohl sie über
einer reflektierenden Oberfläche
lokalisiert ist, und erzeugt als Ergebnis sehr wenig Fluoreszenz.
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Unter Bezugnahme auf die 4A löst das Probensubstrat 51 der
vorliegenden Erfindung nun dieses Problem durch Erkennen, dass die
Hinzufügung
eines transparenten Überzugs 53 der
geeigneten Dicke auf der reflektierenden Unterlage ein Substrat 51 erzeugen
kann, welche eine molekulare Probe an oder nahe-zum Schwingungsbauch
der stehenden Welle des Anregungslichtes bringt, wodurch die Anregung
und die resultierende Fluoreszenzemission signifikant erhöht werden.
Der Überzug 53 auf
dem Substrat 51 sollte so beschaffen sein, dass die optische
Pfadlänge
von der Probe-Überzug-Grenzfläche zu der
Hauttiefe innerhalb der reflektierenden Unterlage im wesentlichen
gleich einer Viertel der Wellenlänge
ist.
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Um die richtige Überzugsdicke korrekt zu bestimmen,
müssen
der Einfallswinkel des Anregungslichtes und die Brechungsindizes
des Überzugsmaterials
und die Oxidation der Oberfläche
der reflektierenden Unterlage berücksichtigt werden. Für einen normalen
Einfall ist die optische Pfadlänge
(OPL) gleich der Summe der Hauttiefe, der effektiven Oxidationsdicke
und der effektiven Überzugsdicke.
Für eine
Aluminumunterlage beträgt
die Hautdicke etwa 13,1 nm. Das Aluminumoxid ist etwa 3,5 mit dick
und besitzt einen Brechungsindex bei einer Wellenlänge von
532 nm von etwa 1,772 für
ein effektive optische Dicke von etwa 6,2 nm. Für Laseranregungslicht von 532
nm beträgt
eine viertel Wellenlänge
133 nm. So, muss der Überzug
eine effektive optische Dicke von 114 nm aufweisen. Wenn wir einen
Silica-Überzug 53 mit
einem Brechungsindex von 1,547 bei einer Wellenlänge von 532 nm wählen, benötigen wir
eine Überzugsdicke
von etwa 73,5 nm. Wenn wir eine andere Anregungsquelle mit einer
unterschiedlichen Lichtwellenlänge
oder eine andere reflektierende Unterlage oder anderes transparentes Überzugsmaterial
oder einen unterschiedlichen Einfallwinkel verwenden, wird die Überzugsdicke
abweichen, sollte aber wiederum berechnet werden, um eine optische
Dicke von einer viertel Wellenlänge
vorzusehen.
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Wie in der 4B ersichtlich, wird, wenn die richtige
bzw. geeignete Überzugsdicke
vorgesehen wird, das Probenrnaterial 55 bei oder nahe einem Schwingungsbauch
der stehenden Welle des Anregungslichtes liegen, d. h. nahe der
Position 61, wo die Elektronenfeldamplitude (und Intensität) bei einem
Gipfel vorliegt. Bei einer Maximum-Anregung tritt eine Maximumfluoreszenz
auf. Selbst wenn die Überzugsdicke
nicht exakt korrekt für
die Anregungswellenlänge
ist, wenn die Intensität
nur 90% oder 95% der Peak-Intensität beträgt, wird das Fluoreszenzsignal
noch signifikant gegenüber
früheren
Probensubstraten verbessert sein. Abweichungen von der Idealdicke
können
noch eine signifikante Verbesserung gegenüber früheren Probensubstraten zeigen.
Abweichungen von der Idealdicke können aufgrund von Ungenauigkeiten
in der Hauttiefe, der Probe-zu-Probe-Varation hinsichtlich der Metalloxidation der
Unterlage vor der Beschichtung, und Beschichtungsvariationen auftreten.
Wenn zwei oder mehr unterschiedliche Wellenlängen mit dem gleichen Substrat
verwendet werden sollen, kann ferner eine Kompromiß-Dicke
gewählt
werden, welche für
alle diese Wellenlängen
angemessen, aber möglicherweise
für keine
ideal ist. D. h., das Fluoreszenzbilderzeugungssystem von 1 könnte eine oder mehrere Lichtquellen
aufweisen, welche mehrere Fluoreszenz-Anregungswellenlängen, entweder
gleichzeitig oder wählbar,
für verschiedene
fluoreszierende Probenbestandteile vorsehen, und die nominelle optische
Dicke des Probensubstrates kann gewählt werden, um ungefähr eine
viertel Wellenlänge
(oder ein ungrades Vielfaches) für
jede der unterschiedlichen Anregungswellenlängen zu betragen. Ferner könnte das
Probensubstrat auf einen neigbaren Träger montiert werden, um den
Neigungswinkel oder die Orientierung so zu varieren, dass ein Lichteinfallwinkel
gewählt
wird, welcher gestattet, dass der optische Pfad im wesenlichen der
Viertel-Wellenlängen-Bedingung für eine gewählte der
verschiedenen. Wellenlängen entspricht.
Wenn eine unterschiedliche Wellenlänge ausgewählt wird, könnte das Substrat entsprechend reorientiert
werden.
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Unterlagenmetalle können Aluminium,
Silber, Gold, Rhodium usw. einschließen. Es kann sich sogar um
eine reflektierende Überzugsschicht
auf einem Glasobjektträger
oder einer anderen starren Bodenschicht handeln. Der transparente Überzug kann Silica
(SiO2), Aluminiumoxid (Al2O3), Magnesiumfluorid (MgF2)
oder ein beliebiges anderes dielektrisches Material sein. Es könnte sich
auch um Mehrfachschichten handeln. Die Schicht, oder Oberseitenschicht,
ist nicht notwendigerweise ein inertes Mate rial, sondern könnte biologisch
aktiv sein, so dass sie mit dem Probenmaterial oder einem besonderen
Bestandteil der Probe bindet.