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Gebiet der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
das Gebiet bildgebender Verfahren. Insbesondere stellt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur hochauflösenden Abbildung
einer Probe bereit, die mit einem Material markiert worden ist,
das stark lichtstreuende und/oder lichtreflektierende Eigenschaften
aufweist, wie zum Beispiel Metallkolloidmarkierungen. Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden spezifische Bindeanalyte durch Ausführen eines
bildgebenden Verfahrens unter Verwendung von Lichtstreuungs- und
-reflexionsbeleuchtung detektiert.
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Die vorliegende Erfindung ist in
einer Vielzahl von Anwendungen nützlich,
in denen eine Detektion erforderlich ist. Eine nützliche Anwendung umfaßt zum Beispiel
die Verwendung mit Biopolymer-Arrays. Zum Beispiel ist ein Pionierverfahren
zur Erzeugung von Nukleinsäure-Arrays
hoher Dichte in US-Patent Nr. 5,445,934 beschrieben. Die vorliegende
Erfindung ist in jeder Anwendung von Nutzen, in der man eine Markierung
mit stark lichtstreuenden und lichtreflektierenden Eigenschaften
an einem interessierenden Molekül
anbringen kann.
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Hintergrund
der Erfindung
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WO 94/18643 A offenbart ein Verfahren
und eine Vorrichtung zur Abbildung der Oberfläche eines Objektes. Das Objekt
wird unter Verwendung von mindestens zwei Beleuchtungsarten beleuchtet,
zum Beispiel Licht für
Reflexionsmodus aus einer Quelle und Licht für Streuungsmodus aus einer
zweiten Quelle. Es wird ein integriertes Bild der Oberfläche des
Objektes erhalten.
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US-A-5,139,339 offenbart einen Medienunterscheidungs-
und Medienanwesenheitssensor, der Papier und transparentes Material
detektieren und zwischen ihnen unterscheiden kann und der eine lichtabstrahlende
Diode und zwei Detektoren verwendet, die so ausgestaltet sind, daß sie sowohl
das diffuse als auch das spiegelnde Reflexionsvermögen der
Medien messen. Die zwei Detektoren sind auf Schwellen eingestellt,
die der richtigen Antwort für entweder
Papier oder transparentes Material entsprechen.
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US-A-5,241,369 offenbart ein Detektorsystem
für optische
Scatterometer, bei denen von einem Probenpunkt spiegelnd reflektiertes
und gestreutes Licht verwendet wird, um eine zweidimensionale Intensitätsverteilung
zu erhalten und dadurch die Morphologie oder Mikrostruktur der Probe
in zwei Raumfrequenzdimensionen zu charakterisieren.
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US-A-4,750,140 offenbart ein Verfahren
und eine Vorrichtung, die den Glanz eines Körpers einstufen, wobei spiegelnde
Reflexionsintensitäten
und Gesamtreflexionsintensitäten
durch zwei Detektoren für
zwei bekannte Lichtflüsse
detektiert werden, die von zwei Lichtquellen in vorbestimmten Einfallswinkeln
projiziert werden. Die spiegelnden Reflexionsintensitäten werden
verarbeitet, und die Gesamtreflexionsintensitäten werden verarbeitet, um
dadurch den Glanz des zu messenden Werkstückes zu bestimmen.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren und ein Instrument zum Analysieren von Polymer-Assays
mit Nukleinsäure-Arrays, Protein-
oder Polypeptid-Arrays oder Kohlenhydrat-Arrays bereit. Darüber hinaus
kann die vorliegende Erfindung sowohl mit Proben verwendet werden,
die immobilisiert sind, als auch mit Proben, die sich in Lösung befinden.
Jede Anzahl möglicher
Proben kann mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es
sind verschiedene Arten von Abtasteinrichtungen verwendet worden,
um Informationen aus einer Probe zu gewinnen. Zum Beispiel haben
vorbekannte Instrumente zum Lesen von Proben Detektionsverfahren
eingesetzt, die auf Fluoreszenz reagieren, um spezifische Wechselwirkungen
oder Hybridisierungen aufzudecken.
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Es ist bekannt, statt eine fluoreszierende Markierung
zu verwenden, eine Lösung
von Teilchen zu verwenden, die Licht effektiv streuen, um Nukleinsäure-Arrays
zu markieren. Zum Beispiel könnte
eine Lösung
von Metallteilchen verwendet werden, die als ein Metallkolloid bezeichnet
werden. Es kann auch jedes andere Teilchen, das Licht streut, verwendet werden,
um eine Probe zu markieren. Genauer ist es bekannt, eine oder mehrere
Komponenten der Reaktion zwischen einem spezifischen Bindeprotein
und der entsprechenden bindbaren Substanz zu detektieren, bei der
eine oder mehrere markierte Komponenten verwendet werden, die erhalten
werden, indem Teilchen einer Dispersion eines Metalls, einer intermetallischen
Verbindung oder von Polymerkernen gekoppelt werden, wie es in US-Patent
Nr. 4,313,734 mit dem Titel "Metal
Sol Particle Immunoassay" offenbart
ist.
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Ferner ist es möglich, ein Detektionsverfahren
zu benutzen, das einen zweidimensionalen Lichtwellenleiter verwendet
und das eine Messung von Echtzeit-Bindung oder Echtzeit-Schmelzen
einer Lichtstreuungs- und -reflexionsmarkierung an Einfangzonen
auf einem DNA-Array erlaubt, wie es in "Real Time Detection of DNA Hybridization
and Melting on Oligonucleotide Arrays using Optical Wave Guides" von Don I. Stimpson,
Joanell V. Hoijer, Wangling Hsieh, Cynthia Jou, Julian Gordon, Tom Theriault,
Ron Gamble und John Baldeschwieler beschrieben ist.
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Das oben beschriebene Dokument benutzt ein
Verfahren zum Detektieren spezifischer Bindeanalyte und benutzt
typischerweise ein Abtastverfahren, das auf innerer Totalreflexion
beruht. Dieses Verfahren ist im Stand der Technik auch als Detektion abklingender
Wellen bekannt. Unter Bezugnahme auf 1 ist
zum Beispiel ein Querschnitt einer Oberfläche eines lichtdurchlässigen Array-Substrates
der Basis eines Nuklein säure-Arrays
gezeigt. Demgemäß muß sich der
innere Einfallswinkel von Licht aus der Abtasteinrichtung 90 Grad
annähern, um
eine innere Totalreflexion von der Grenzfläche des Glases und eines wäßrigen Puffers
zu erreichen, der in dem Nukleinsäure-Array verwendet wird. Weil sich die
beleuchtenden Strahlen zu senkrechtem Einfall hin krümmen, wenn
sie aus Luft in den dichten Glaschip eintreten, ist es nicht möglich, einen
solchen flachen inneren Einfallswinkel zu erreichen, indem einfach
nahezu parallel zu der Ebene des lichtdurchlässigen Array-Substrates beleuchtet
wird.
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Mit Technik unter Verwendung innerer
Totalreflexion ist es möglich,
die Probe durch den Rand des lichtdurchlässigen Array-Substrates zu beleuchten.
Diese Herangehensweise ist jedoch umständlich und teuer. Auch wenn
es möglich
sein kann, den Rand des lichtdurchlässigen Array-Substrates zu
beleuchten, wobei sich eine Probe in einer Kunststoffpatrone befindet,
würde eine
solche Anordnung darüber
hinaus erfordern, daß eine
Randfläche
des Substrates von einer ziemlich hohen optischen Qualität ist. Dies
würde höhere Verpackungskosten
zur Folge haben.
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Eine weitere mögliche Lösung, die den Einsatz von Techniken
unter Verwendung innerer Totalreflexion zum Lesen genetischer Information
aus Nukleinsäure-Arrays
erlaubt, umfaßt
die Verwendung eines Koppelprismas, das in der Nähe des Randes der planen Oberfläche befestigt
ist. Ein solches Koppelprisma gestattet, daß die Beleuchtung in das dichte
lichtdurchlässige
Array-Substrat unter einem Winkel eintritt, der senkrechtem Einfall
näher ist.
Ein Koppelprisma einsetzende Techniken unter Verwendung innerer
Totalreflexion erfordern, daß Raum
für das Koppelprisma
bereitgestellt wird, wodurch Raum für Sonden weggenommen wird.
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Auch wenn Techniken unter Verwendung
innerer Totalreflexion mit Proben verwendet werden können, bei
denen Waschen die Konzentration von Restmarkierungen auf praktisch
undetektierbare Niveaus verringert, erzeugen Techniken unter Verwendung
innerer Totalreflexion in solchen Anwendungen eine unerwünschte Hintergrundstreuung
von sowohl der Glas-/Wasser-Grenzfläche als auch der Glas-/Luft-Grenzfläche.
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Darüber hinaus neigen andere bekannte Techniken
zum Markieren mit Streuungsmarkierungen dazu, an ungeeigneten Stellen
auf dem Nukleinsäure-Array
zu binden oder zu reagieren. Zum Beispiel sind Metallkolloide in
Blot-Assays wie zum Beispiel Heim-Schwangerschaftstestkits verwendet
worden. Im allgemeinen verwenden solche Kits ein kolorimetrisches
Assay, bei dem sich Kolloidagglutination auf einem weißen Substrat
ereignet. Testergebnisse werden mittels Lichtabschwächung durch
das Metallkolloid bestimmt, das eine Farbe einführt.
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Es besteht ein Bedarf für eine Vorrichtung und
ein Verfahren zum Abbilden von Proben, die mit einer Streuungsmarkierung
mit einer hohen Streuungssignatur markiert worden sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zum Abtasten eines Biopolymer-Arrays durch Verwendung
eines neuen Lichtstreuungs- und -reflexionsverfahrens, wie es in
den Ansprüchen
1 und 3 definiert ist, und ein Instrument zur Ausführung solcher
Verfahren, wie es in den Ansprüchen
7 bzw. 8 definiert ist. Insbesondere hat sich herausgestellt, daß die kombinierte
Verwendung von Reflexionsabbildung und Abbildung durch diffuses
Streuen den dynamischen Bereich und die Detektionsgrenzen für Proben
maximiert, die mit Streuungsmarkierungen markiert und an Nukleinsäure-Arrays
gebunden sind. Das neue Lichtstreuungs- und -reflexionsverfahren kann
erfolgreich in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, weil
solche Anwendungen ein lichtdurchlässiges Array-Substrat verwenden,
das, wie unten beschrieben, bestimmte optische Eigenschaften aufweist.
Die Probe gemäß der vorliegenden
Erfindung ist mit einer Streuungsmarkierung markiert worden, die
stark licht streuende und lichtreflektierende Eigenschaften aufweist.
Ein Beispiel einer solchen Streuungsmarkierung ist ein Metallkolloid,
aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung eines
Metallkolloids beschränkt
und genau gesagt kann jedes Material mit stark lichtstreuenden und
lichtreflektierenden Eigenschaften verwendet werden. Die vorliegende
Erfindung ist nicht auf Techniken unter Verwendung abklingender
Wellen oder innerer Totalreflexion angewiesen. Das Lichtstreuungs-
und – reflexionsbeleuchtungsverfahren
der vorliegenden Erfindung liefert im Vergleich zu vorbekannten
Verfahren überlegene
optische Ergebnisse, jedoch mit wesentlich niedrigeren Kosten.
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Erfindungsgemäß wird eine Probe durch eine
neue Kombination von Abbildung im Reflexionsmodus und Abbildung
im Streumodus abgebildet. Der verwendete äußere Lichteinfallswinkel liegt,
gemessen in Bezug auf die Oberflächennormale,
typischerweise in einem Winkelbereich von nahe Null bis über 45 Grad,
aber jede Winkel können
verwendet werden.
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Darüber hinaus wird ein Instrument
offenbart, das eine Abbildung gemäß der oben beschriebenen neuen
Beleuchtungs- und Sammeltechnik liefert.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine graphische Querschnittsdarstellung eines lichtdurchlässigen Array-Substrats,
die das Detektionsverfahren unter Verwendung innerer Totalreflexion
veranschaulicht.
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2 ist
eine graphische Darstellung, die zwei Anregungswege zeigt, die Abbildungsverfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung wiederspiegeln.
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3 ist
eine graphische Darstellung, die zwei Detektionswege zeigt, die
Abbildungsverfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung wiederspiegeln.
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4 ist
eine graphische Darstellüng,
die mit Fluoreszenzabbildung, Abbildung im Streumodus und Abbildung
im Reflexionsmodus erhaltene Ergebnisse vergleicht.
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5a ist
eine graphische Darstellung, die Teilchen-Lichtstreuungs-/Lichtreflexionseigenschaften
zeigt, wenn Teilchen lose gepackt sind.
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5b ist
eine graphische Darstellung, die Teilchen-Lichtstreuungs-/Lichtreflexionseigenschaften
zeigt, wenn Teilchen dicht gepackt sind.
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6 ist
eine schematische graphische Darstellung, die ein Abtastinstrument
gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt.
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7 ist
eine graphische Darstellung, die den Unterschied zwischen Reflexion
im diffusen Streumodus und Abbildung im Reflexionsmodus zeigt.
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8 ist
ein Bild, das gemäß der vorliegenden
Erfindung aufgezeichnet wurde.
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9 ist
eine mit einer Kamera aufgenommene Photographie, die ein Gensonden-Array
zeigt, das mit Abbildung im diffusen Streumodus abgebildet worden
ist.
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10 demonstriert
Ergebnisse hinsichtlich der Anzahl von Teilchen, der Strukturgröße und des dynamischen
Bereichs.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird ein neues Verfahren und eine neue Vorrichtung zum Abbilden
von Biopolymer-Proben wie etwa Nukleinsäure-Arrays bereitgestellt,
bei denen Lichtstreuungs- und -reflexionsbeleuchtung verwendet wird.
Es wird eine Kombination von Abbildung im Reflexionsmodus und Abbildung
im Streumodus eingesetzt.
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Ein Abbildungsverfahren, das als
Abbildung im Reflexionsmodus bekannt ist, ist eines, bei dem Licht
von einer Probe gesammelt wird, mit dem die Probe beleuchtet und
das von der Probe reflektiert worden ist. Anders gesagt ist das
bei der Abbildung im Reflexionsmodus gesammelte Licht spiegelnd. Abbildung
im Reflexionsmodus verbessert die dynamische Reserve, indem Signale
von planaren Aggregaten von Streuungsmarkierungen hervorgehoben werden,
die eine starke Fähigkeit
haben, Licht zu streuen, wie etwa Metallsol-Markierungen. Als eine Folge
funktioniert die Abbildung im Reflexionsmodus am besten am hohen
Ende der Intensitätsskala.
Auf der anderen Seite wird bei der Abbildung im Streumodus jegliches
Licht mit Ausnahme des reflektierten gesammelt. Somit ist das bei
der Abbildung im Streumodus gesammelte Licht wiederabgestrahltes
Licht und ist nicht-spiegelnd. Die Abbildung im Streumodus verbessert
den dynamischen "Legroom", indem Hintergrundsignale
von der Glas/Wasser-Grenzfläche
minimiert werden. Somit funktioniert die Abbildung im Streumodus
am besten am unteren Ende der Intensitätsskala. Der Nachteil dieses
Verfahrens liegt in dem Verlust dynamischer Reserve aufgrund des
Verlustes von Streuungsisotropie bei hohen Teilchendichten. Die
Verwendung einer Kombination von Abbildung im Reflexions- und im
Streumodus schafft somit den größten theoretischen
dynamischen Bereich. Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden,
daß eine
solche einzigartige Kombination bildgebender Verfahren gute Ergebnisse
liefert.
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Teilchen, die stark lichtstreuende
und lichtreflektierende Eigenschaften aufweisen, die Streuungsmarkierungen
genannt werden, streuen sichtbares Licht selbst dann stark, wenn
ihr Durchmesser ziemlich klein ist, zum Beispiel so klein wie ein
Zehntel der gestreuten Wellenlänge.
Weil eine Probe, die gemäß der vorliegenden
Erfindung abgetastet wird, immer auf einem lichtdurchlässigen Array-Substrat positioniert
ist, das eine sehr hohe optische Qualität hat, und ferner weil das
lichtdurchlässige
Array-Substrat sich in Kontakt mit einem wässrigen Puffer befindet, der
nicht viel Licht streut, tritt bei der vorliegenden Erfindung nahezu
keine diffuse Lichtstreuung irgendwelcher Art als eine Folge der
Grenzfläche
des lichtdurchlässigen
Array-Substrats und des wässrigen
Puffers auf.
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Im diffusen Streuungsmodus ist der
Hintergrund von der Glas-/Wasser-Grenzfläche vernachlässigbar,
aber ist mit Reflexionsstreuung meßbar. Um jeglichen Streuungshintergrund
von der Glas-/Wasser-Grenzfläche
zu minimieren, der auftreten könnte,
ist es wesentlich, die spiegelnde Reflexion von der Glas/Wasser-Grenzfläche daran
zu hindern, in Sammeloptiken des Abtastinstruments einzutreten.
Die diffuse Streuungsgeometrie erlaubt die Detektion äußerst geringer
Oberflächendichten
von Steuungsmarkierungen wie etwa Metallsol-Markierungen. Ein Nachteil
einer solchen Herangehensweise besteht darin, daß bei zunehmend hohen Teilchendichten
die räumliche
Verteilung des gestreuten Lichtes weniger isotrop oder diffus wird.
In dem Grenzfall eines Füllungsgrades
von 100% verhält sich
die Schicht gebundener Goldteilchen zum Beispiel wie ein Goldspiegel,
wobei das gesamte "gestreute" Licht als eine rein
spiegelnde Reflexion aus der Probe austritt. Eine optische Anordnung,
die nur diffuse Streuung detektiert, kann daher das Vorhandensein
sehr hoher Metallteilchenbedeckungen nicht effizient detektieren
und verliert dynamische Reserve.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch Bezugnahme
auf die 2 und 3 veranschaulicht. Jeder
von zwei in 2 gezeigten
Anregungswegen oder von zwei in 3 gezeigten
Detektionswegen kann verwendet werden. Die nicht auf der Achse gelegenen
Lichtwege sind bei einem Einfallswinkel von 45 Grad dargestellt,
aber sie sind nicht auf diesen Wert beschränkt. Mit jeder dieser Konfigurationen kann
sowohl die diffuse Streuung ("S"-Modus) als auch
die spiegelnde Reflexion ("R"-Modus) abgebildet
werden. Die in dem S-Modus vorgefundene niedrige Hintergrundstreuung
optimiert die Detektion von Merkmalen mit niedrigen Teilchendichten.
In dem R-Modus ist zu erwarten, daß die beobachteten Signalpegel
sehr viel proportionaler zu Teilchendichten bei den höchsten erreichbaren
Dichten ist. Die R- und S-Detektionsmodi können daher als komplementär zueinander
angesehen werden und zusammen den dynamischen Bereich des Messungsprozesses
erhöhen.
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Bei der Zwei-Kanal-Methode können die Bilddaten
auf mindestens drei Wegen erfaßt
und analysiert werden. Zunächst
wird ein einziges Bild (solch ein Detektionsmodus wird in der vorliegenden
Anmeldung nicht beansprucht) mit gleichzeitiger Beleuchtung aus
R- und S-Quellen erzeugt (2).
In diesem Fall sollte die Intensität der R-Quelle wesentlich niedriger
als die der S-Quelle sein, um ihren Beitrag zur Hintergrundreflexion
zu minimieren. Der durch die R-Quelle erzeugte Hintergrund kann
weiter reduziert werden, indem sie in der Ebene polarisiert gemacht
wird. Bei der zweiten und dritten Methode werden unabhängige Bilder
in den S- und R-Modi erzeugt. Die R- und S-Bilder können aufeinanderfolgend mit
einem einzigen Detektor-Array
(2) oder parallel mit
zwei Detektor-Arrays (3)
erzeugt werden. Ein Algorithmus wählt die Intensitätsdaten aus
den zwei Bildern aus.
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Es sind Experimente unter Verwendung
von Abbildung im Reflexions- und Streuungsmodus durchgeführt worden.
Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, daß die Abbildung
im Reflexionsmodus sehr große
Verbesserungen bei Signalen erzeugt, sogar bei Teilchendichten,
die wesentlich niedriger als 5/Quadrat-Mikrometer sind. Diese Verbesserung
besteht bei Dichten fort, die deutlich unter 1 pro Quadrat-Mikrometer
liegen. Diese Beobachtungen stützen
die Vorstellung, daß eine
Zusammenlagerung der Streuungsmarkierungen sich sogar bei Dichten
in dem Bereich von 1 pro Quadrat-Mikrometer ereignet und daß dieses
Phänomen
ausgenutzt werden kann, um Signalpegel zu verstärken. Somit haben die vorliegenden
Erfinder herausgefunden, daß die
Abbildung im Reflexionsmodus alleine verwendet werden kann, um über den
vollen dynamischen Bereich des Assays ein adäquates Signal-Rauschverhältnis zu
erhalten. 4 liefert
graphische Daten, die zeigen, daß eine Abbildung im Reflexionsmodus
von Streuungsmarkierungen mit stark lichtstreuenden Eigenschaften
Ergebnisse liefert, die genauso gut sind wie eine mit fluoreszierender
Markierung durchgeführte
Abbildung.
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Die Spitzenstreuwellenlänge, die
mit der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, ist eine Funktion
der Teilchengröße. Für Teilchen
bis zu einem Durchmesser von ungefähr 50 nm sind die Streuquerschnitte
proportional zu dem Radius des Teilchens hoch 6 und sind sehr groß, d. h.
~105 mal größer als die Fluorophore des
Standes der Technik. Für
größere Teilchen
haben die vorliegenden Erfinder eine schwächere Abhängigkeit herausgefunden. Zum
Beispiel haben Messungen bestimmt, daß 100 nm Teilchen ungefähr zweimal
stärker
sind als 80 nm Teilchen.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung
haben festgestellt, daß gute
Ergebnisse erhalten werden, wenn die minimale Anzahl verwendeter
Teilchen 50 beträgt,
aber die Anzahl verwendeter Teilchen kann in Abhängigkeit von der Anwendung
in einem Bereich von 10 bis 100 Teilchen liegen. Ergebnisse, die
die Anzahl von Teilchen, die Strukturgröße und den dynamischen Bereich
in Beziehung setzen, sind in 10 zu
finden. Die am leichtesten herzustellenden Teilchen sind Goldteilchen.
Jedoch können
auch andere Metalle und Nichtmetalle verwendet werden. Das Mußkriterium
für die
Teilchen besteht darin, daß sie
eine starke Lichtstreuungs- und -reflexionssignatur aufweisen müssen. Gold
ist ein typisches Beispiel eines verwendeten Metalls. Beispiele
für Nichtmetalle,
die starke Lichtstreuungs- und – reflexionssignaturen
aufweisen, umfassen die meisten Halbleitermaterialien und Halbmetalle.
Weil das oben beschriebene durch Abtasten der Streuungsmarkierungen
erzeugte Signal gröber
ist als das mit fluoreszierender Markierung erzeugte Signal, kann
die vorliegende Erfindung unter Verwendung schwacher Lichtquellen
für die
Anregung verwendet werden, wie etwa zum Beispiel LEDs, Bogenlampen
und Laserdioden.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
können die
lichtstreuenden Teilchen anfänglich
nicht an der Probe befestigt sein. Stattdessen werden die lichtstreuenden
Teilchen zum Beispiel mit einem Antikörper markiert und die Targetprobe
wird mit einem Antigen markiert, das komplementär zu dem Antikörper ist.
Typischerweise wird das Target mit Biotin markiert. Das lichtstreuende
Teilchen wird kovalent mit Streptavidin oder Ziegen-Anti-Biotin
markiert.
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Allgemein gesagt neigen Teilchen
dazu, Licht gleichmäßig in alle
Richtungen zu streuen, wenn sie voneinander isoliert sind. Die vorliegenden Erfinder
haben jedoch festgestellt, daß Teilchen
dazu neigen, sich in den dichtesten Bereichen einer Probe aneinanderzulagern.
Die Aneinanderlagerung ist auch in Bereichen mit Dichten unter 1/μm2 zu finden. Diese Aneinanderlagerung von
Teilchen erzeugt Inseln in einem planen Array auf dem lichtdurchlässigen Array-Substrat,
die dazu neigen, eher wie ein Spiegel zu wirken, der, statt Licht
in alle Richtungen zu reflektieren, Licht in einer spiegelnderen
Weise streut, so daß das
auslaufende Licht reziprok zu dem einlaufenden Licht ist. Dieses
in den 5a und 5b dargestellte Phänomen hat
den dynamischen Bereich, der erhalten werden konnte, beträchtlich
eingeschränkt.
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Ferner haben die vorliegenden Erfinder
herausgefunden, daß die
Abbildung der Teilchen im Reflexionsmodus, bei der der Winkel des
einfallenden Lichtes derselbe ist wie der Detektionswinkel. Die Verwendung
der Abbildung im Reflexionsmodus gemäß der vorliegenden Erfindung
stellt einen verbesserten dynamischen Bereich bereit, der eine überlegene
Empfindlichkeit des Abtastinstruments sowie Benutzerfreundlichkeit
zur Folge hat. 7 ist
eine graphische Darstellung, die den Intensitätsunterschied zeigt, der erhalten
wird, wenn eine Abbildung unter Verwendung eines Beleuchtungswinkels
von 0 Grad in Bezug auf die Oberflächennormale (als Reflexion
im diffusen Streumodus bezeichnet) und eines Winkels von 30 Grad
(Abbildung im Reflexionsmodus) durchgeführt wird.
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Ein Farbmultiplexing kann durch Verwendung
von Teilchen unterschiedlicher Größen oder Zusammensetzungen
erreicht werden, die durch eine Lichtquelle angeregt werden, die
gewählt
ist, um der Spitzenstreuungswellenlänge jedes Teilchens zu entsprechen.
Die Streuungsbandbreiten sind breit und somit sollte, um Kreuzkopplung
zu minimieren, der spektrale Wellenlängenabstand zwischen Streuungsmaxima
bevorzugt das Doppelte der Breite des verwendeten Bandpaßfilters
betragen. Ein breiterer Bandpaß hat
ein erhöhtes
Signal zur Folge. Sammeldetektoren werden ebenfalls unter Verwendung
derselben Bandpaßfilter
gefiltert. Sphärische
Streuungsmarkierungen erhalten beim Streuen im wesentlichen die
Polarisation des einfallenden Lichtes, und die Polarisationsorientierung
hängt von
der Polarisation des einfallenden Photons ab, nicht von der Orientierung
des Teilchens. Daher kann jeder Anregungskanal orthogonal polarisiert
sein. Die orthogonalen Polarisationen verringern die Kreuzkopplung zwischen
Kanälen.
Defekte, Kratzer und Verunreinigungen auf dem Chip streuen ebenfalls
Licht und erzeugen Störsignale
in dem detektierten Signal. Jedoch ist das Streuungsspektrum eine
Funktion der Teilchengröße, und
Defekte sollten eine unterschiedliche Geometrie und folglich unterschiedliche
Streuungsspektren aufweisen. Daher können die in Detektionskanälen empfangenen
Signale korreliert werden, um Hintergrund-Streustörsignale
zu minimieren.
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Reflexionen von Glas-/Luft- und Glas-/Wasser-Grenzflächen können genauso
stark sein wie das gestreute Signal. Typischerweise ist die Reflexion von
der Glas-/Luft-Grenzfläche
am stärksten.
Darüber
hinaus tritt eine beträchtliche
Streuung von der Rückseite
der Patrone auf, die aus Kunststoff hergestellt ist. Diese Reflexionen
müssen
räumlich
unterdrückt
werden, indem das Anregungs- und/oder Sammelvolumen des optischen
Systems verringert wird. Bedeutsamerweise haben die vorliegenden Erfinder
herausgefunden, daß eine
Beleuchtung abseits der Achse diese Reflexionen effektiv unterdrückt. Die
Verwendung von Beleuchtung abseits der Achse verringert Hintergrundstörungen relativ
zu einem beliebigen Abbildungsverfahren drastisch, das Flutbeleuchtung
und Großfeldabbildung
verwendet wie etwa CCDs, Videokameras, Film usw.
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6 beschreibt
eine Ausführungsform
der Abtasteinrichtungsgeometrie der vorliegenden Erfindung. Die
vorliegenden Erfinder haben eine neue Kombination von Apparaturelementen
aufgefunden, die eine überlegene
Tiefenauflösung
bereitstellen. In der Vorrichtung sind zwei Lichtquellen vorgesehen, von
denen eine als eine Lichtquelle für Reflexionsmodus dient und
eine als eine Lichtquelle für
diffuse Streuung dient. Die Beleuchtung ist auf eine Linie fokussiert,
die schmal genug ist, um unerwünschte
Reflexionen von Grenzflächen
räumlich
zu unterdrücken.
Das Instrument der vorliegenden Erfindung kann auch ein Fokussierungssystem
und Strahlformungsoptiken zur Anregung umfassen.
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Gesteutes Licht wird gesammelt und
kollimiert und kann optional durch Polarisationsanalysatoren und
Bandpaßfilter
geleitet werden. Jedoch können
gute Ergebnisse ohne die Verwendung von Polarisatoren und Bandpaßfiltern
erhalten werden, die bloß eine
konstruktive Wahlmöglichkeit
darstellen. Die Sammeltiefe sollte bei weniger als 500 Mikrometern
FWHM gehalten werden, um Streuung und Reflexion von den Glas-/Luft-
und Kunststoff-/Wasser-Grenzflächen
zu unterdrücken.
Als eine Folge vermeidet das Instrument der vorliegenden Erfindung das
Sammeln von gestreutem Licht von anderen Grenzflächen, zum Beispiel von der Glas-/Luft-Grenzfläche, was
eine überlegene
Tiefenauflösung
zuläßt. Mit
der vorliegenden Erfindung wird Licht von der DNA-Oberfläche gesammelt
und gestreutes Licht von anderen Oberflächen wird unterdrückt, was
eine überlegene
Empfindlichkeit zur Folge hat.
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Ein einziges lineares Detektor-CCD-Array wird
verwendet, um das Bild aus gestreutem Licht in ein elektrisches
Signal umzuwandeln, und jede Filter-/Analysator-Anordnung kann durch
einen Translationstisch oder ein Rad in Position bewegt werden. Es
können
auch mehrfache lineare oder flächige CCD-Arrays
verwendet werden. Die markierte Oberfläche wird über den einfallenden Strahl
unter Verwendung eines Translationstisches abgetastet. Der Strom
von dem Detektor wird in eine Spannung umgewandelt, die durch einen
A/D-Wandler digitalisiert wird. Das digitale Signal wird dann in
einem Computer als ein Bild gespeichert. Der Computer steuert alle Funktionen
des Instruments.
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Es ist möglich, den dynamischen Bereich
zu verbessern, wenn Lichtstreuungs- und -reflexionsdetektion mit
dem Instrument der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Die Lichtstreuung
und – reflexion
durch 100 nm Goldteilchen ist annähernd isotrop, was es möglich macht,
einen Sammelwinkel zu wählen,
der die spiegelnde Reflexion von der Grenzfläche ausschließt, an die
die Teilchen gebunden sind, wodurch ein gutes Signal-Hintergrundverhältnis bei niedrigen
Teilchendichten bereitgestellt wird. Prototypinstrumente zum Detektieren
von kolloidalem Gold haben Beleuchtung bei 45 Grad von der Arrayoberflächennormalen
und Detektion entlang der Oberflächennormalen
oder umgekehrt eingesetzt.
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Durch Korrelation von Lichtstreuungsbildern unter
Verwendung eines Streuungswinkels von 45 Grad mit rasterelektronenmikroskopischen
Aufnahmen ist festgestellt worden, daß der effektive Streuquerschnitt
pro Teilchen bis zu ungefähr
5 Teilchen pro guadratmikrometer konstant ist und oberhalb davon
ziemlich scharf abfällt.
Elektronenmikroskopie hat offenbart, daß dieses Verhalten eine Konsequenz der
Bildung planarer Aggregate von Teilchen bei hohen Dichten ist. Mit
zunehmender Aggregatgröße ändert sich
die Richtungsabhängigkeit
der Streuung von der nahezu isotropen Streuungseigenschaft eines
isolierten Teilchens in die rein spiegelnde Reflexionseigenschaft
einer planaren Schicht aus Goldmetall. Das gestreute Licht wird
zunehmend in einen um den spiegelenden Reflexionswinkel zentrierten Kegel "konzentriert", was zu einer scheinbaren
Sättigung
in Bezug auf die Teilchendichte bei Beobachtungswinkeln weit entfernt
von dem spiegelnden Reflexionswinkel führt. Es hat sich herausgestellt,
daß diese
Sättigung
des dynamischen Bereiches durch Verwendung von Abbildung im Reflexionsmodus
beträchtlich
verringert wird.
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9 ist
ein mit Abbildung im Reflexionsmodus mit Flutbeleuchtung auf Film
aufgezeichnetes Bild und demonstriert, wie stark in der vorliegenden Erfindung
verwendete lichtstreuende Teilchen Licht streuen. 9 demonstriert auch, daß es möglich ist, die
räumliche
Verteilung von Teilchen mit einer einfachen Kamera aufzuzeichnen.
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Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden,
daß der
Einsatz von Beleuchtung bei gleichen und entgegengesetzten Winkeln,
d. h. gemäß dem Gesetz
von Reflexion und Sammeln, nahezu vollständige Wiedergewinnung von Signallinearität in Bezug
auf Fluoreszenzabbildung zeigt. Es ist auch möglich, das Beleuchtungsverfahren
individuell an die spezielle Anwendung anzupassen, zum Beispiel können Niedrigsignalanwendungen
wie etwa Genexpression den diffusen Modus bevorzugen und Hochsignalanwendungen
können
vom Reflexionsmodus profitieren.
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Wie vorstehend angemerkt, findet
die Analyse von Proben durch Hybridisierung mit Oligonukleotid-Arrays
in der Biologie breite Anwendung. Die Detektion von Nukleinsäure, die
an das Array bindet, ist üblicherweise
durch Fluoreszenzmarkierung der Analyten-DNA und konfokale Laser-Fluoreszenzmikroskopie
erreicht worden. Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Vorrichtung
und ein neues Verfahren zum Abbilden einer Probe bereit, die mit
einem Material markiert ist, das eine starke Fähigkeit aufweist, Licht zu
streuen.