DE60037184T2

DE60037184T2 - Abbildungssystem für optischen bildabtaster

Info

Publication number: DE60037184T2
Application number: DE60037184T
Authority: DE
Inventors: Avery Bellingham OSGOOD; Mack Belmont SCHERMER
Original assignee: PerkinElmer Life Sciences Inc
Current assignee: PerkinElmer Health Sciences Inc
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2008-10-02
Anticipated expiration: 2020-02-26
Also published as: DE60037184D1; US20020036271A1; US6355934B1; US6441379B1

Description

Die Erfindung betrifft im Allgemeinen optische Abtastsysteme und insbesondere Abtastsysteme wie Fluoreszenz-Mikroarray-Leser, DNA-Mikroarray-Leser oder "Bio-Chip" Leser, bei denen eine Anregungsstrahlung von verschiedenen Wellenlängen verwendet werden, um Fluoreszenz in einer abgetasteten Probe zu erzeugen.
Das Dokument JP 10 096 862 A offenbart ein Fluoreszenzmikroskop, welches zum empfindlichen Erfassen von Fluoreszenzlicht geeignet ist, das von einer Probe ausgestrahlt wird.
Das Dokument US 5,399,866 A offenbart ein Abbildungssystem, welches auf fokussiertes Laserlicht anspricht. Das herkömmliche Abbildungssystem weist eine fokussierende Linse zum Fokussieren des Laserlichtes und einen Spiegel mit einer reflektierenden Seite, einer nicht-reflektierenden Seite und ein Loch zum Durchlassen eines vorbestimmten Teils des Laserlichtes von der fokussierenden Linse durch die nicht-reflektierende Seite auf. Eine Fasersonde regt an und koppelt Fluoreszenz von einem Analyt bzw. einem zu analysierenden Stoff. Die Fasersonde weist eine vordere Faserfläche zum Empfangen von Laserlicht durch das Loch und zum Leiten der Fluoreszenz zu der reflektierenden Seite des Spiegels auf. Optische Geräte zum Abbilden des Teils der Fluoreszenz, der von dem Spiegel reflektiert wird, um ein Bild der vorderen Faserfläche zu bilden, sowie eine optische Sperre mit einer Apertur in der Bildebene der Abbildungseinrichtung zum Reduzieren unerwünschten Lichtes von der Abbildungseinrichtung vor dem Erreichen des Erfassers bzw. Detektors sind vorgesehen. Der Spiegel ist winklig zum Leiten der im Wesentlichen gesamten Fluoreszenz von der Fasersonde in die Abbildungseinrichtung als zurück an die Fasersonde vorgesehen.
Das Dokument EP 1 031 055 A (veröffentlicht am 23. März 2000) offenbart ein optisches System in dem Strahlengang eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops, welches zumindest eine Laserlichtquelle, eine Vorrichtung, die in dem Belichtungs-/Erfassungsstrahl angeordnet ist, zum Separieren des Anregungslichtes von dem Fluoreszenzlicht, ein Objektiv, das zwischen der Vorrichtung und dem Objekt angeordnet ist, und einen Erfasser umfasst, welcher strahlabwärts der in dem Erfassungsstrahl aufgestellten Vorrichtung angeordnet ist.
Das Dokument DE 43 43 076 A1 offenbart eine Vorrichtung zum fotothermischen Prüfen eine Oberfläche einer bewegten Prüfprobe. Ein Anregungsstrahl passiert durch eine Apertur in einer Sammellinse, die die thermische Strahlung reproduziert, die in einem Messbereich erzeugt wird, so dass die Sammellinse an eine Wellenlänge eines Anregungsstrahles angepasst werden kann, welcher zu einem Erfasser passiert. Ein Kopplungsspiegel, der in dem Strahlengang des Anregungsstrahls befestigt ist, weist praktisch eine vollkommene Reflektivität für die Wellenlänge des Anregungsstrahles auf und ist in einer solchen Weise angeordnet, dass er sich sehr nah des Fokusbereiches bzw. der Brennebene des Anregungsstrahles befindet, so dass er zusammen mit der Apertur der Sammellinse nur einen geringen Teil der thermischen Strahlung abdeckt, die zu dem Erfasser passiert. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel fällt der Anregungsstrahl direkt auf die Oberfläche durch eine Apertur in dem Entkopplungsspiegel, der die thermische Strahlung ablenkt, wohingegen die thermische Strahlung mit praktisch der gesamten Intensität zu dem Erfasser durch den Entkopplungsspiegel mit einer geeigneten Reflektivität hindurch passiert.
Die Verwendung von Anregungsstrahlung, um Fluoreszenz bei einer abgetasteten Probe zu erzeugen, ist bekannt. Das US-Patent Nr. 5,381,224 , das für Dixon et al. ausgestellt ist, offenbart abtastende, optische Abbildungssysteme für makroskopische Proben. Das System ermöglicht sowohl konfokales als auch nicht-konfokales Abbilden, das im reflektierten Licht ausgeführt werden kann. Fluoreszenzabbilder werden verwendet, um Daten bei Experimenten zu erhalten, die Fluoreszenzkennzeichen nutzen, um den Zustand einer Probe zu identifizieren, die zu prüfen ist. In einigen Fällen bestimmt das Vorhandensein oder das Fehlen von fluoreszierenden Stoffen in der Probe das experimentelle Ergebnis. In anderen Fällen ist die Dichte der fluoreszierenden Stoffe, eine Funktion der Intensität der Strahlung, die von der Probe emittiert wird, das Messinteresse und das experimentelle Ergebnis kann durch Messen der Intensität der erfassten Strahlung gefolgert werden.
Ein Beispiel eines Vorganges, der Fluoreszenzkennzeichen verwendet, ist der Mikroarray. Ein Mikroarray ist eine Serie von Experimenten, bei der DNA (oder RNA) beteiligt ist, die an einem Glassubstrat gebunden ist. Referenz- oder "Ziel-"DNA wird an einem Glassubstrat – üblicherweise ein 2,54 cm bis 7,62 cm (1 bis 3 Zoll) Mikroskopobjektträger aus Glas – in Flecken vorgesehen, wo sie chemisch an der Oberfläche sich bindet. Jeder Fleck oder jede Probe von DNA bildet ein separates Experiment. "Prüf"-DNA oder -RNA, die mit einem Fluorogen bzw. Fluorophor gekennzeichnet wurde, wird dann der Oberfläche des Objektträgers zugeführt und ein Kreuzen mit der Ziel-DNA wird ermöglicht. Überschüssige Prüf-DNA, die sich nicht mit der Ziel-DNA bindet, wird von der Oberfläche des Objektträgers in einem anschließenden Waschvorgang entfernt.
Das Experiment ermöglicht es, die Bindungsaffinität zwischen der Prüf- und der Ziel-DNA zu messen, um die Gleichartigkeit von deren molekularen Strukturen zu bestimmen; komplementäre Moleküle weisen eine viel größere Bindungsfähigkeit auf als nicht verwandte Moleküle. Die Prüf-DNA wird mit Fluoreszenzkennzeichen gekennzeichnet, die eine Bandbreite von Strahlungsenergie emittieren, die sich um eine Wellenlänge λ_Emission zentriert und diese einschließt, wenn sie von einer externen Strahlungsquelle einer kürzeren Wellenlänge λ_Anregung angeregt werden. Die Helligkeit der emittierten Strahlung ist eine Funktion der Dichte der fluoreszierenden Stoffe in der beleuchteten Probe. Da die Dichte der fluoreszierenden Stoffe eine Funktion der Bindungsaffinität oder Gleichartigkeit des Prüfmoleküls des Zielmoleküls ist, kann die Helligkeit von jeder Probe als ein Grad der Ähnlichkeit zwischen der Prüf-DNA und der vorliegenden Ziel-DNA übertragen werden. An einem üblichen Mikroarray können bis zehntausende Experimente gleichzeitig an der Prüf-DNA durchgeführt werden, was eine detaillierte Charakterisierung von komplexen Molekülen ermöglicht.
Ein abtastender Fluoreszentabbilder unterteilt den Bereich des Interesses in einen Satz diskreter Bildelemente, die als Pixels bezeichnet werden. Jeder Pixel wird unabhängig adressiert und für das Vorhandensein von fluoreszierenden Stoffen vermessen. Die fluoreszierenden Stoffe werden durch einen einfallenden Anregungsstrahl angeregt und ein Teil der resultierenden, emittierten Fluoreszenzstrahlung wird gesammelt und durch einen Erfassungsapparat gemessen. Jede Messung führt zu einem Datenpunkt, der die relative Dichte fluoreszierender Stoffe des vermessenen Pixels abbildet. Die Pixeldaten werden dann rekonstruiert, um eine quantifizierte Abbildung des abgetasteten Bereiches herzustellen.
Bei einem Rastermikroskop wird jeder Pixel unabhängig beleuchtet, während er adressiert wird. Die Lichtquelle ist üblicherweise eine Laservorrichtung mit einer Wellenlänge, die herunter fokussiert wird, um einen Lichtfleck einer gewünschten Größe zu bilden. Strahlung wird von den fluoreszierenden Stoffen in einem nach außen gerichteten, hemispärischen Muster emittiert. Ein Teil dieser emittierten Strahlung wird durch Strahlsammeloptiken gesammelt und zu einem Erfassungsapparat geführt. Zusätzlich gesammelte Strahlung ist Strahlung von der einfallenden Anregungsstrahlung, die von der Oberfläche der Probe reflektiert oder gestreut wird. Die Abbilderoptiken müssen zwischen den beiden Strahlungswellenlängen durch Zurückweisen der Anregungsstrahlung und Durchlassen der Fluoreszenzstrahlung unterscheiden. Optische Filterkomponenten, beispielsweise dichroitische oder Bandpassfilter, stellen die Unterscheidung in herkömmlichen Systemen bereit.
Laserfluoreszenz-Mikroarrayabtaster schließen die Fähigkeit ein, mehrere Laseranregungswellenlängen abzugeben, so dass Fluoreszenzdaten von der Probe bei zwei oder mehreren Emissionswellenlängen durch Erfassen von zwei oder mehreren Fluoreszenzfarben erhalten werden können. Ein derart einzigartiges Anregungs- und Emissionswellenlängenpaar wird üblicherweise als ein "Kanal" bezeichnet. Viele DNA-Mikroarrayabtaster verwenden ein Abtast-/Rasterverfahren mit zwei Wellenlängen, bei dem die Ergebnisse von einer Wellenlängenabtastung als Kontrollwerte verwendet werden und die Ergebnisse der anderen Wellenlängenabtastung das gewünschte experimentelle Ergebnis darstellen, wie bei der Differential-Gen-Expression. Wenn sich der Markt und die Anwendung weiter entwickeln und eine größere Vielzahl geeigneter Farben erhältlich ist, wird sich der Bedarf an alternativen Anregungswellenlängen und Emissionsbändern erhöhen.
Die meisten konfokalen Rastermikroskope verwenden einen dichroitischen oder multichroitischen Strahlteiler zur Farbseparation zwischen der Wellenlänge der Anregungsstrahlung λ_Anregung und der Wellenlänge der Emission λ_Emission. Das US-Patent Nr. 5,672,880 , ausgestellt für Kain, offenbart beispielsweise ein Fluoreszenzabbildungssystem, bei dem Fluoreszenzlicht, das von einer Probe emittiert wird, durch ein Objektiv gesammelt wird und durch ein dichroitisches Filter passiert, das entlang der optischen Achse zwischen einem Laser und dem Objektiv angeordnet ist, um das Fluoreszenzlicht auf einen Fotodetektor zu leiten. Dichroitische Strahlteiler werden unter Verwendung eines Vakuum-Abscheidungsvorganges hergestellt, bei dem anorganische Kristallmaterialien mit variierenden optischen Brechungsindizes in Schichten auf optische Substrate abgeschieden werden, um optische Filter mit spezifischen Bandpass- und/oder Bandsperreigenschaften zu erzeugen.
In der Praxis kann ein optisches Rastersystem betrieben werden, das fünf oder mehr Strahlungsvorrichtungen mit einer Wellenlänge verwendet, die zehn oder mehr einzigartige aber variable Emissionsbänder erzeugen. Diese Betriebsparameter bürden eine Spezifikationsanforderung auf, dass die Komponente des multichroitischen, optischen Elementes derart ausgebildet ist, dass es alle fünf Wellenlängen reflektiert und die Emissionswellenlängen durchlässt. Ein erster Nachteil dieser Näherung ist, dass eine derartige Spezifikation in der Praxis sehr schwierig zu erreichen sein kann. Darüber hinaus können zukünftige Verbesserungen und Entwicklungen bei optischen Rastersystemen es verlangen, dass die Systeme auch mit mehreren Anregungs- und Emissionswellenlängen arbeiten, was einen multichroitischen Strahlteiler erfordert, der auch anspruchsvollere Spezifikationsanforderungen aufweist.
Ein anderer Nachteil herkömmlicher optischer Raster- bzw. Abtastsysteme ist die Designkomplexität, die durch die Verwendung von Strahlungsvorrichtungen mit einer Wellenlänge verursacht wird. Bei der Verwendung von Strahlungsvorrichtungen mit einer oder mehreren Vielfachwellenlängen mit einer geeigneten Wellenlängenauswahlvorrichtung kann ein kompakteres, robusteres optisches Raster- bzw. Abtastsystem erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Abbildungssystem, das eine Strahlungsvorrichtung, die Anregungsstrahlung von unterschiedlichen Wellenlängen bereit stellt, eine Linse zum Abbilden einer oder mehrerer der Anregungsstrahlungsquellen auf einer Probenoberfläche, um eine Fluoreszenzemission zu erzeugen, und einen Spiegel umfasst, der als ein geometrischer Strahlteiler ausgebildet ist und der in dem Übertragungspfad der Emissionsstrahlung und der Anregungsstrahlung im Anschluss an die Reflektion von der Probe und parallel Ausrichtung durch die Linse angeordnet ist, wobei der Spiegel die parallel gerichtete Emissionsstrahlung reflektiert, so dass die Emissionsstrahlung zu einem Erfassen bzw. Detektor geleitet wird und die Anregungsstrahlung von dem Erfasser fort geleitet wird. Andere Merkmale der Erfindung werden ohne weiteres offensichtlich, wenn die nachfolgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen gelesen wird.
Der Aufbau und der Betrieb der Erfindung können zusammen mit anderen Aufgaben und Vorteilen derselben am besten durch Lesen der detaillierten Beschreibung, die folgt, in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen verstanden werden, von denen:
1 eine schematische Darstellung eines Abbildungssystems ist, das eine Anregungsstrahlungsvorrichtung, eine Objektivlinse und einen Spiegel umfasst, der zum Reflektieren der Anregungsstrahlung zu und von der Probe und fort von dem Erfasser verwendet wird;
2 ein Querschnittsdiagramm der Objektivlinse und des Spiegels aus 1 ist, das die Beziehung zwischen der Emissionsstrahlbreite, der Anregungsstrahlbreite und der Größe des Spiegels zeigt; und
3 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines Abbildungssystems gemäß der vorliegenden Erfindung ist, die einen Spiegel mit einer zentral angeordneten Öffnung umfasst, wobei der Spiegel zum Reflektieren der Strahlung, die von der Probe emittiert wird, auf einen Erfasser verwendet wird.
In 1 ist eine schematische Darstellung eines Abbildungssystems 10 gezeigt, das bei der Analyse einer Probe 55 verwendet werden kann. Das Abbildungssystem 10 weist einen Belichtungskopf 20 auf, der eine Blenden- bzw. Verschlussanordnung 30 und eine Anregungsstrahlungsvorrichtung 21 umfasst. Die Anregungsstrahlungsvorrichtung 21 kann zwei oder mehrere monochromatische optische Quellen (beispielsweise Einzel-Wellenlängenlaservorrichtungen), eine Dual-Wellenlängenlaservorrichtung, eine Breibandstrahlungsvorrichtung oder eine Multi-Wellenlängenlaservorrichtung sein, beispielsweise veranschaulicht durch das Spectra-Physics Modell 161C-Laser, der Ausgangsstrahlung bei 514 nm, 488 nm und 458 nm bereit stellt. Die Anregungsstrahlungsvorrichtung stellt Strahlung, die zwei Wellenlängen λ₁ und λ₂, beispielsweise 514 nm und 488 nm, der Verschlussanordnung 30 über eine optische Faserleitung 23 bereit. Die Verschlussanordnung 30 wählt immer nur eine der Anregungswellenlängen zur Belichtung der Probe 55 aus. Aus Gründen der Veranschaulichung wird die Strahlung der Wellenlänge λ₁ als Ausgabe an die Verschlussanordnung 30 ausgewählt. Die der Probe 55 bereitgestellte Belichtung kann durch Anstellen lediglich der gewünschten Strahlungsquelle ausgewählt werden. Alternativ können alle Strahlungsquellen in einem angestellten Zustand verbleiben und ein oder mehrere Verschlüsse (nicht dargestellt) können in die Übertragungspfade des Anregungsstrahls hinein oder aus diesen heraus bewegt werden, um so Strahlung der gewünschten Wellenlänge zuzulassen und andere Wellenlängen zu sperren.
Die Verschlussanordnung 30 umfasst einen ersten Strahlteiler 31, der hochreflektierend für die Strahlung der Wellenlänge λ₁ und hochdurchlassend für die Strahlung der Wellenlänge λ₂ ist. Die Strahlung der Wellenlänge λ₁ wird von dem ersten Strahlteiler 31 reflektiert, um einen ersten Übertragungspfad durch einen ersten Verschluss 41 zu folgen, und Strahlung der Wellenlänge λ₂ wird durch den ersten Strahlteiler 31 übertragen, um einem zweiten Übertragungspfad durch einen zweiten Verschluss 43 zu folgen. Die Strahlung der Wellenlänge λ₂, die dem ersten Übertragungspfad folgt, wird wieder an einem ersten Spiegel 33 reflektiert, der hochreflektierend für die λ₁-Strahlung ist. Die λ₁-Strahlung, die von dem ersten Spiegel 33 reflektiert wird, passiert den ersten Verschluss 41, hier geöffnet dargestellt, passiert durch ein erstes Engpassfilter 45, wird an einem zweiten Spiegel 35 reflektiert und wird an einem zweiten Strahlteiler 37 reflektiert. Der zweite Strahlteiler 37 ist hochreflektierend für λ₁-Strahlung und hochdurchlassend für λ₂-Strahlung. Nach der Reflektion an dem zweiten Strahlteiler 37 wird die λ₁-Strahlung von der Verschlussanordnung 30 als Anregungsstrahlung 39 ausgegeben.
Die Strahlung der Wellenlänge λ₂ wird entlang des zweiten Übertragungspfades durch den ersten Strahlteiler 31 zu dem zweiten Verschluss 43 übertragen, der hier geschlossen dargestellt ist. Wenn der zweite Verschluss offen ist, passiert die λ₂-Strahlung durch ein zweites Engpassfilter 47 und den zweiten Strahlteiler 37. Wenn der erste Verschluss 41 geschlossen ist, wird λ₂-Strahlung von der Verschlussanordnung 30 als Anregungsstrahlung 39 ausgegeben (nicht dargestellt).
Die Anregungsstrahlung 39 wird von der Verschlussanordnung 30 emittiert und zu der Oberfläche der Probe 55 durch einen Anregungsspiegel 51 reflektiert. Eine Objektivlinse 53 ist zwischen dem Anregungsspiegel 51 und der Oberfläche der Probe 55 angeordnet, so dass der Anregungsstrahl 39 auf eine gewünschte Fleckgröße 63 an der Oberfläche der Probe 55 fokussiert wird. Die effektive Brennweite der Objektivlinse 53 beträgt annähernd 6 Millimeter. Dies stellt eine Fleckgröße von etwa 5 μm bei einer Anregungsstrahlungsstrahl mit einem Durchmesser von 0,6 Millimeter bereit.
Wenn sie auf die Oberfläche der Probe 55 projiziert wird, erzeugt die Anregungsstrahlung 39 drei Strahlungsarten, die von der Oberfläche der Probe 55 ausstrahlen. Die erste Strahlungsart, ein gespiegelter Reflektionsstrahl 65 mit einer Wellenlänge von λ₁, rührt von der Reflektion eines Teils der einfallenden Anregungsstrahlung 39 entlang eines zu der Oberfläche der Probe 55 senkrechten Pfades her (d. h. zurück entlang des Einfallpfades der Übertragung). Die zweite Strahlungsart, eine diffuse Reflektion 67 ebenfalls der Wellenlänge λ₁, ist der Teil der Anregungsstrahlung 39, der von der Oberfläche der Probe 55 in einer anderen als der senkrechten Richtung reflektiert wird. Der Reflektionspfad der diffusen Reflektion 67 ist nicht auf den Durchmesser des Einfallpfades der Übertragung der Anregungsstrahlung 39 eingeschränkt, da die diffuse Reflektion 67 im Wesentlichen durch die Oberfläche gestreut ist.
Die dritte Strahlungsart, eine Emissionsstrahlung 69, wird durch die Belichtung der fluoreszierenden Stoffe in der Probe 55 in Ansprechung auf die einfallende Anregungsstrahlung 39 erzeugt. Es ist im einschlägigen Stand der Technik bekannt, dass derartige fluoreszierende Stoffe emittieren, wenn sie von Strahlung der geeigneten Wellenlänge angeregt werden. Wenn sie durch Strahlung der Wellenlänge λ₁ belichtet werden, erzeugen die fluoreszierende Stoffe in der Probe 55 eine Strahlung der Wellenlänge λ_emit1, üblicherweise 20 bis 40 nm länger als die Wellenlänge λ₁ der Anregungsstrahlung 39. Zum Vergleich ist die Energie der Anregungsstrahlung 39 an der Oberfläche der Probe 55 in der Größenordnung von 1 mW und die Energie der Emissionsstrahlung 69 ist in der Größenordnung von 10^–11 Watt. Wie von einem Fachmann klar erkannt wird, vermindert sich das Signal-Rausch-Verhältnis der emittierten Leistung zu der Anregungsleistung wie die Größe des gespiegelten Reflektionsstrahles 65 ansteigt und wie die Menge der diffusen Reflektion 67 ansteigt, die von der Oberfläche der Probe 55 ausstrahlt.
Der gespiegelte Reflektionsstrahl 65 und diese Teile der diffusen Reflektion 67 und die Emissionsstrahlung 69, die auf der Probenseite der Objektivlinse 53 einfallen, werden zu einem zusammengesetzten Emissionsstrahl 72 parallel gerichtet, der Strahlung der Wellenlängen λ₁ und λ_emit1 umfasst. Die numerische Apertur (NA) der Objektivlinse 53 beträgt zumindest 0,5 und ist so groß wie praktikabel vorgesehen, um den größten Teil der Emissionsstrahlung 69 aufzufangen, um die Genauigkeit des Erfassungsvorganges zu verbessern, wie es nachfolgend im größeren Detail beschrieben wird. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist die Objektivlinse 53 eine numerische Apertur von etwa 0,75 auf.
Der zusammengesetzte Emissionsstrahl 71 wird zu einem Detektor bzw. Erfasser 81 übertragen. Ein optischer Breitbandspiegel 73 kann verwendet werden, um einen gefalteten Übertragungspfad durch Reflektion des einfallenden zusammengesetzten Emissionsstrahles 71 bereit zu stellen. Durch Verwendung des Breitbandspiegels 73 kann das Querschnittsprofil des Abbildungssystems 10 in vorteilhafter Weise reduziert werden. Der Er fasser 81 ist bevorzugt eine Fotovervielfacher-Röhre, eine Lawinen-Fotodiode oder ein Festkörper-Optikerfasser können jedoch alternativ verwendet werden. Die Fotovervielfacher-Röhre ist aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und einstellbaren Verstärkung bevorzugt. Weiterhin umfasst die Ausgabe der Fotovervielfacher-Röhre einen Strom, der proportional zu der erfassten Strahlungsleistung ist. Dieses Stromsignal kann gefiltert und anschließend in einen digitalen Wert unter Verwendung eines Analog-Digital-Wandlers umgewandelt werden.
Ein Erfasserfilter 75, das im Wesentlichen durchlässig für die Emissionsstrahlung 69 und im Wesentlichen undurchlässig für die Anregungsstrahlung 39 ist, kann in dem Übertragungspfad der zusammengesetzten Emissionsstrahlung 71 zwischen der Objektivlinse 53 und dem Erfasser 81 angeordnet werden. Das Erfasserfilter 75 kann entweder ein Bandpassfilter oder ein Langpassfilter umfassen. Das Erfasserfilter 75 dient dazu, das meiste oder alles der diffusen Reflektion 67 zu vermindern, so dass ein gefilterter Emissionsstrahl 71', der primär die Emissionsstrahlung 69 der Wellenlänge λ_emit1 umfasst, zu dem Erfasser 81 übertragen wird. Bei einer alternativen Anordnung können eine fokussierende Linse 77 und eine Apertursperre 79 in dem Übertragungspfad des gefilterten Emissionsstrahles 71' angeordnet werden, wie es dargestellt ist. Wenn sie in dem Abbildungssystem 10 verwendet wird, bildet die fokussierende Linse 77 ein konfokales System mit der Objektivlinse 53 und bildet den gefilterten Emissionsstrahl 71' auf den Erfasser 81 ab. Wie es von einem Fachmann klar erkannt werden kann, können dort zusätzliche Bandpass- oder Langpassfilter für jedes Anregungs- und Emissionswellenlängenpaar bereitgestellt werden, das in dem Abbildungssystem 10 verwendet wird.
Die offenbarten Anordnungen verwenden geometrische Strahlteiler und demonstrieren dadurch einen Vorteil gegenüber herkömmlichen dichroitischen und multichroitischen Strahlteilverfahren und -apparaten. Wenn dichroitische Elemente ein Glaselement umfassen, um bestimmte Wellenlängen zu reflektieren und andere durchzulassen, umfasst der geometrische Strahlteiler, wie er in dem offenbarten Abbildungssystem 10 verwendet wird, den Anregungsspiegel 51. Der Anregungsspiegel 51 ist ausgebildet, um die Anregungsstrahlung 39 zu der Oberfläche der Probe 55 zu reflektieren und um den gespiegelten Reflektionsstrahl 65 von der Oberfläche der Probe 55 zu reflektieren, und er ist physisch dimensioniert, um den Erfasser 81 zu ermöglichen, die Maximalmenge der Emissionsstrahlung 69 zu empfangen. Der Anregungsspiegel 51 weist eine Hauptdimension größer als die Breite des Anregungsstrahles 39 auf und ist um etwa 45° in Bezug auf den Übertragungspfad des Anregungsstrahles 39 versetzt. Der Anregungsspiegel 51 kann von einer kugelförmigen Befestigung (nicht dargestellt) getragen werden, beispielsweise um mehrere Grade der Einstellung während der Ausrichtung des Abbildungssystems 10 zu ermöglichen. Wenn er richtig ausgerichtet ist, wird der Anregungsspiegel 51 im Wesentlichen die gesamte gespiegelte Reflektion 65 auffangen und zu der Verschlussanordnung 30 zurück und von dem Erfasser 81 fort leiten, und somit das Signal-Rausch-Verhältnis des Systems verbessern.
Die Beziehung der numerischen Apertur der Objektivlinse 53 zu einen geometrischen Emissionsübertragungsfaktor (GETF – geometric emission transmission factor) kann am besten mit Bezug auf 2 erläutert werden. GETF ist definiert als das Verhältnis von i) der Blockade bzw. Sperre des zusammengesetzten Emissionsstrahls 71, die von der Anordnung des Spiegels 51 (und zugehöriger Befestigungskomponenten) in dem Übertragungspfad herrührt, und ii) dem gesamten Pfaddurchmesser des zusammengesetzten Emissionsstrahls 71. Es kann anhand der nachfolgenden zwei Beispiele gezeigt werden, dass eine größere numerische Apertur den GETF eines bestimmten Abbildungssystems verbessern wird.
Bei dem ersten Beispiel spezifizieren wir eine Fleckgröße 63 von annähernd 5 μm an der Oberfläche der Probe 55, wobei die Anregungsstrahlung 39 einen Strahldurchmesser von 0,6 Millimeter aufweist. Dies kann erreicht werden, wenn die Objektivlinse 53 eine effektive Brennweite von etwa 6 Millimeter aufweist. Für eine NA von 0,75 ist der Aperturdurchmesser etwa 13,6 Millimeter, um eine Aperturfläche von etwa 145,26 mm² zu ergeben. Wenn der Anregungsspiegel 51 und jegliche zugehörigen Befestigungen (nicht dargestellt) einen Durchmesser von 3,17 mm aufweisen und mit einem Winkel von 45° in Bezug auf den Übertragungspfad des zusammengesetzten Emissionsstrahls 71 eingestellt sind, beträgt die Querschnittsfläche der Sperre etwa 5,57 mm². Bei dieser Konfiguration kommt für den GETF heraus:
Bei dem zweiten Beispiel weist die Objektivlinse 53 eine effektive Brennweite von 10 Millimeter und eine NA von 0,30 auf. Der Aperturdurchmesser beträgt etwa 6,2 Millimeter, um eine Aperturfläche von etwa 30,19 mm² zu ergeben. Um einen 5 μm Anregungsfleck zu erzeugen, sollte die Eingangsanregungsstrahlung 39 einen Strahl von etwa 1,0 Millimeter im Durchmesser umfassen. Wenn der Anregungsspiegel 51 einen Durchmesser von 20 Millimeter aufweist, wird die Anregungsstrahlung 39 vollständig aufgefangen und es wird sogar etwas Toleranz in der Position ermöglicht. Wenn der Anregungsspiegel 51 mit ei fern 45°-Winkel in Bezug auf den Übertragungspfad eingestellt ist, beträgt die Fläche der Sperre etwa 2,22 mm². Bei dieser Konfiguration kommt für den GETF heraus:
Das heißt, der GETF ist um den Faktor Zwei in der zweiten Konfiguration vermindert, was demonstriert, dass der GETF eine Funktion sowohl der NA der Linse als auch der effektiven Brennweite ist. Die Anregungsfleckgröße steht in Beziehung zu der effektiven Brennweite und die Emissionsapertur steht in Beziehung zu der NA.
Bei einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung, die in 3 gezeigt ist, wird die Anregungsstrahlung 39 durch den Belichtungskopf 20 zu der Oberfläche der Probe 55 durch eine zentral angeordnete Öffnung 93 in einem ringförmigen Spiegel 91 übertragen. Bei dem gegebenen Beispiel erzeugt die Anregungsvorrichtung 21 eine Strahlungsausgabe mit Wellenlängen λ₁ und λ₂. Die Anregungsstrahlung 39 weist eine Wellenlänge von λ₂ auf, wenn der erste Verschluss 41 geschlossen und der zweite Verschluss 43 geöffnet ist. Folglich erzeugen die fluoreszierenden Stoffe von Interesse in der Probe 55 eine Emissionsstrahlung mit der Wellenlänge von λ_emit2. Die Öffnung 93 ist in dem Übertragungspfad von sowohl der Anregungsstrahlung 39 und des gespiegelten Reflektionsstrahls 65 angeordnet. Der ringförmige Spiegel 91 weist eine Reflektionsfläche 95 auf, die im Wesentlichen für Strahlung der Wellenlänge λ_emit2 reflektierend ist. Ein Teil des zusammengesetzten Emissionsstrahls 71 wird zu dem Erfasser 81 durch den ringförmigen Spiegel 91 reflektiert. Bevorzugt ist die Breite der Öffnung 93 geringer als die Breite des zusammengesetzten Emissionsstrahls 71 und zumindest so groß wie der Durchmesser des gespiegelten Reflektionsstrahls 65. Die Öffnung 93 sorgt dafür, dass das meiste oder alles des gespiegelten Reflektionsstrahls 65 zurück zu der Verschlussanordnung 30 passiert als dass es zu dem Erfasser 81 übertragen wird.
Bei der vorliegenden Erfindung wird die einfallende Anregungsstrahlung 39 über der Oberfläche der Probe 55 durch eines von drei Verfahren gerastert bzw. abgetastet. Bei dem ersten Verfahren wird die Verschlussanordnung 30 innerhalb des Abbildungssystems 10 bewegt, wie es durch den Pfeil 83 angezeigt wird. Bei dem zweiten Verfahren wird die Objektivlinse 53 in Bezug auf die Oberfläche der Probe versetzt, wie es durch den Pfeil 85 angezeigt wird. Bei dem dritten Verfahren wird die Probe 55 in Bezug auf das Abbildungssystem 10 seitlich versetzt, wie es durch den Pfeil 87 angezeigt wird.
Obwohl die Erfindung unter Bezug auf eine bestimmte Ausführungsform beschrieben wurde, ist es wohlverstanden, dass die vorliegende Erfindung auf keinen Fall auf bestimmte Konstruktionen und Verfahren eingeschränkt ist, die hierin offenbart und/oder in den Zeichnungen gezeigt sind, sondern auch jegliche Modifikationen oder Äquivalente innerhalb des Umfangs der Ansprüche umfasst.

Claims

Abbildungssystem (10), welches zur Verwendung bei einem optischen Abtasten von einer Probe (55) geeignet ist, wobei das Abbildungssystem (10) enthält: A) eine oder mehrere Strahlungsquellen (21), welche eine Strahlung bei zumindest zwei unterschiedlichen Wellenlängen λ_i bereitstellen, und ein Mittel (30) zum Auswählen von einer der Wellenlängen λ_i zur Übertragung als ein Anregungsstrahl (39) an die Probe (55); B) eine Objektivlinse (53), welche zwischen den Strahlungsquellen (21) und der Probe (55) angeordnet ist, so dass der Anregungsstrahl (39) der Wellenlängen λ_i durch die Objektivlinse (53) passiert und die Probe (55) bestrahlt, wobei ein Abschnitt des Anregungsstrahls der Wellenlänge λ_i, welcher auf die Probe (55) einfällt, in eine Emissionsstrahlung (69) der Wellenlänge λ_i' umgewandelt und nachfolgend als diese emittiert wird, und ein Abschnitt (65) des Anregungsstrahls spiegelnd durch die Probe (55) reflektiert wird, wobei die Objektivlinse (53) ferner derart angeordnet ist, dass sie das spiegelnd reflektierte Licht (65) und jene Abschnitte der Emissionsstrahlung (69), welche auf die Proben-Seite von der Objektivlinse (53) einfällt, im wesentlichen parallel richtet, wodurch ein zusammengesetzter Emissionsstrahl (71) ausgebildet wird; C) einen Erfasser (81), welcher auf eine Strahlung der Wellenlänge λ_i' anspricht; und D) einen Spiegel (91), welcher als ein geometrischer Strahlteiler konfiguriert ist, welcher im Übertragungspfad des Anregungsstrahls (39) zwischen den Strahlungsquellen (21) und der Objektivlinse (53) angeordnet ist, wobei der Spiegel (91) eine Hauptdimension enthält, welche zumindest so groß ist wie die Breite des zusammengesetzten Emissionsstrahls (71), und eine eingeschlossene Öffnung (93) im Übertragungspfad des zusammengesetzten Emissionsstrahls (71) enthält, wobei die Breite von der Öffnung (93) kleiner als die Breite des zusammengesetzten Emissionsstrahls (71) und zumindest so groß wie der Durchmesser des parallel gerichteten, spiegelnd reflektierten Lichts (65) ist, wodurch es ermöglicht wird, dass der Anregungsstrahl (39) und das parallel gerichtete, spiegelnd reflektierte Licht (65) durch die Öffnung (93) passieren und zumindest einen Abschnitt der Emissionsstrahlung (69) in eine Richtung zum Erfasser (81) reflektieren.
Abbildungssystem nach Anspruch 1, bei welchem die Strahlungsquellen (21) Laservorrichtungen enthalten.
Abbildungssystem nach Anspruch 2, bei welchem die Objektivlinse (53) eine numerische Apertur von zumindest 0,5 enthält.
Abbildungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem der Erfasser (81) ein elektrisches Signal in Ansprechen auf eine einfallende Strahlung der Wellenlänge λ_i' erzeugt.
Abbildungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches ferner ein Mittel zum Abtasten des Anregungsstrahls (39) der Wellenlänge λ_i über die Probe (55) hinweg enthält.
Abbildungssystem nach Anspruch 5, bei welchem das Mittel zum Abtasten ein Mittel zum selektiven Richten des Anregungsstrahls (39), welcher durch die Strahlungsquellen (21) erzeugt wird, innerhalb des Abbildungssystems (10) durch ein Bewegen von einer Verschlussanordnung (30) enthält.
Abbildungssystem nach Anspruch 5, bei welchem das Mittel zum Abtasten ein Mittel zum Versetzen der Objektivlinse (53) in Relation zur Probe (55) enthält.
Abbildungssystem nach Anspruch 5, bei welchem das Mittel zum Abtasten ein Mittel zum Versetzen der Probe (55) in Relation zum Abbildungssystem (10) enthält.
Abbildungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches ferner ein Mittel (30) zum selektiven Blockieren des Anregungsstrahls (39) enthält, so dass lediglich eine Anregungs-Wellenlänge λ_i (39) die Probe zu einer vorgegebenen Zeit bestrahlt.
Abbildungssystem nach Anspruch 9, bei welchem das Mittel (30) zum selektiven Blockieren einen Verschluss (41, 43) enthält.
Abbildungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, welches ferner einen Filter (75) enthält, welcher im Übertragungspfad von denn Emissionsstrahl (71) angeordnet ist, wobei der Filter (75) im wesentlichen bei einer Strahlung der Wellenlänge λ_i' durchlässig ist und im Wesentlichen bei einer Strahlung der Wellenlänge λ_i undurchlässig ist.
Abbildungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei welchem der Erfasser (81) zumindest ein Teil von der Gruppe enthält, welche eine Fotovervielfacher-Röhre, eine Lawinen-Fotodiode und einen Festkörper-Optikerfasser enthält.
Abbildungssystem nach Anspruch 1, bei welchem die eine oder die mehreren Strahlungsquellen (21) eine oder mehrere Laservorrichtungen enthalten, wobei die Laservorrichtungen Anregungsstrahlen (39) bereitstellen, welche jeweils eine Strahlung der Wellenlänge λ₁, λ₂, λ₃, λ₄ ... λ_i enthalten, und wobei das System ferner ein Mittel (30) zum Auswählen eines der Anregungsstrahlen (39) enthält, um somit eine Strahlung bereitzustellen, welche eine Wellenlänge von λ_i, 1 ≤ j ≤ i hat.
Abbildungssystem nach Anspruch 13, bei welchem die Objektivlinse (53) eine Brennweite von ungefähr 6 mm enthält.
Abbildungssystem nach Anspruch 13, bei welchem die Objektivlinse (53) eine numerische Apertur von ungefähr 0,75 enthält.
Abbildungssystem nach einem der Ansprüche 13 bis 15, welches ferner einen Filter (75) enthält, welcher im Übertragungspfad von dem Emissionsstrahl (71) angeordnet ist, wobei der Filter (75) im Wesentlichen bei einer Strahlung einer Wellenlänge λ₁' durchlässig ist und im Wesentlichen bei einer Strahlung einer Wellenlänge λ₁ undurchlässig ist.
Verfahren zum optischen Abtasten von einer Probe (55), welche eine fluorophore Substanz enthält, wobei das Verfahren die Schritte enthält: Bereitstellen von einer oder mehreren Strahlungsquellen (21), welche zur Emission von einer Strahlung bei zumindest zwei unterschiedlichen Wellenlängen λ_i geeignet sind; Auswählen von einer der Wellenlängen, und Fokussieren der entsprechenden Strahlung als einen Anregungsstrahl (39) der Wellenlänge λ_i auf die Probe (55) mittels einer Objektivlinse (53), so dass zumindest ein Abschnitt des Anregungsstrahls in eine Strahlung der Wellenlänge λ_i' umgewandelt wird, wobei die umgewandelte Strahlung von der Probe (55) als eine Emissionsstrahlung (69) der Wellenlänge λ_i' emittiert wird, und ein Abschnitt des Anregungsstrahls von der Probe (55) als eine spiegelnd reflektierte Strahlung (65) emittiert wird; Zusammensetzen von zumindest einem Abschnitt der Emissionsstrahlung (69) der Wellenlänge λ_i' und der spiegelnd reflektierten Strahlung (65) der Wellenlänge λ_i; Parallelrichten der zusammerlgesetzten Strahlung durch die Objektivlinse (53), um einen zusammengesetzten Emissionsstrahl (71) auszubilden, und Übertragen des zusammengesetzten Emissionsstrahls (71) entlang eines Übertragungspfades an einen Spiegel (91), welcher zwischen der Strahlungsquelle (21) und der Objektivlinse (53) positioniert ist, und als ein geometrischer Strahlteiler konfiguriert ist, wobei der Spiegel (91) bei einem Winkel zum Übertragungspfad des zusammengesetzten Emissionsstrahls (71) angeordnet ist; und Übertragen von zumindest einem Abschnitt der Emissionsstrahlung (69), welche in dem zusammengesetzten Emissionsstrahl (71) enthalten ist, an einen Erfasser (81), wobei der Abschnitt von der Emissionsstrahlung (69) von dem Spiegel (91) in eine Richtung zum Erfasser (81) reflektiert wird, wobei die spiegelnd reflektierte Strahlung (65), welche in dem zusammengesetzten Emissionsstrahl (71) enthalten ist, in eine Richtung von dem Erfasser (81) weg durch eine Öffnung (93) in dem Spiegel (91) passiert, wobei die Öffnung (93) kleiner als die Breite des zusammengesetzten Emissionsstrahls (71) und zumindest so groß wie der Durchmesser des parallel gerichteten, spiegelnd reflektierten Lichts (65) ist, und der Anregungsstrahl (39) durch die Öffnung (93) passiert.