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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft allgemein optische Abtastsysteme und insbesondere
Mechanismen zum Kalibrieren der Abtastsysteme.
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Hintergrund der Erfindung
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Optische
Abtastsysteme richten im Wesentlichen durch eine eingebaute Lichtquelle
erzeugtes Licht auf eine Probe und messen das von der Probe emittierte
oder reflektierte Licht. Nachstehend werden Scanner in Zusammenhang
mit in der Fluoreszenzbildgebung verwendeten Laserrastermikroskopen
erläutert.
Der Mechanismus der Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung
als Teil eines Laserrastermikroskops oder als Teil eines Fluoreszenzbildgebungssystems
beschränkt.
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Ein
Fluoreszenzbildgebungssystem untersucht Fluoreszenz von chemisch
markierten biologischen Proben wie z. B. Zellen, Proteinen, Genen
und DNS-Sequenzen. Die Proben können
Mikromatrizen sein, die Tausende von Experimenten auf einem einzigen
Objektträger
aus Glas enthalten können.
Jedes Experiment besteht aus einem Punkt aus beispielsweise "Ziel"-DNS, die chemisch
an eine Oberfläche des
Objektträgers
gebunden ist. Mit einem Fluorophor markierte "Sonden"-DNS oder alternativ -RNS wird in die
Oberfläche
des Objektträgers
eingebracht, so dass die Hybridisierung mit der Ziel-DNS möglich ist.
Anschließend
wird die Probe mit Licht einer gewünschten Wellenlänge optisch
abgetastet, so dass der Fluorophor in den jeweiligen Experimenten
Licht emittiert.
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Bei
einer bestimmten Probe emittiert jedes Experiment eine Lichtmenge,
die der zugehörigen Fluordichte
entspricht. Die Fluordichte eines Experiments hängt von der Ähnlichkeit
der speziellen Ziel-DNS und der Sonden-DNS ab, da die komplementären Moleküle eine
größere Bin dungswahrscheinlichkeit
aufweisen als beziehungslose Moleküle. Ein Detektor misst die
Stärke
des von jedem in der Probe enthaltenen Experiment emittierten Lichts,
und das System kann dann die relativen Ähnlichkeitsgrade zwischen der
Ziel-DNS und der Sonden-DNS bestimmen.
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Die
zur Probe gehörenden
Messungen hängen
nicht nur von den Fluordichten der Experimente ab, sondern auch
von der Empfindlichkeit des Systems. Die Empfindlichkeit des Systems
hängt wiederum
von der Leistung des einfallenden Anregungsstrahls und dem Verstärkungsfaktor
des Detektors ab. Die Fluoreszenzbildgebungssysteme haben relativ
große
einstellbare Empfindlichkeitsbereiche, um die umfassenden Fluordichtebereiche
abzudecken. Es ist beispielsweise üblich, dass die Systeme einen Dynamikbereich
von vier Größenordnungen
haben, der über
weitere vier Größenordnungen
einstellbar ist. Die Empfindlichkeit wird durch Einstellen der Leistung
des einfallenden Anregungsstrahls oder des Verstärkungsfaktors des Detektors
oder beides eingestellt.
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Bei
Systemen mit solchen großen
Einstellbereichen ist es schwierig, die Wiederholgenauigkeit aufrechtzuerhalten.
Bei Anwendungen, bei denen Daten von einer Probenmessung zur nächsten oder von
einem System zum nächsten
verglichen werden, sind folglich die Genauigkeit der Empfindlichkeitseinstellung
des Systems und der Gesamtkalibrierung des Systems wichtig. Änderungen
der einfallenden Leistung oder des Verstärkungsfaktors des Detektors gegenüber dem,
was bei einer bestimmten Empfindlichkeitseinstellung erwartet wird,
beeinflussen nachteilig die Normalisierung der Daten, es sei denn,
die Änderungen
können
quantifiziert werden.
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Das
System steuert die Leistung des einfallenden Anregungsstrahls, der
typischerweise von einem Laser erzeugt wird, indem es ein variables Dämpfungsglied
im Strahlweg enthält.
Das Dämpfungsglied
ist durch eine Index-zu-Dämpfung-Transferkurve
gekennzeichnet. Es ist jedoch nicht ungewöhnlich, dass es eine relativ
große
Diskrepanz zwischen dem Prozentsatz der Dämpfung bei den jeweiligen Indexeinstellungen
und der Transferkurve gibt. Demgemäß gibt es oft eine Diskrepanz
bei der erwarteten Leistung des einfallenden Anregungsstrahls bezüglich der
Einstellung des Dämpfungsglieds.
Ferner können
die Betriebseigenschaften des Lasers im Laufe der Zeit schwanken,
so dass es eine Verringerung der Nennleistung des Anregungsstrahls
vor der Dämpfung
gibt. Daher ist es wünschenswert,
den jeder Einstellung des variablen Dämpfungsglieds zugeordneten
Leistungspegel genau und regelmäßig zu charakterisieren
oder kalibrieren.
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Der
Verstärkungsfaktor
des Detektors hängt zum
großen
Teil vom Verstärkungsfaktor
der enthaltenen photometrischen Vorrichtung ab. Im Allgemeinen ist
die Vorrichtung eine Fotovervielfacherröhre, oder PMT (photo-multiplier
tube), die eine hohe Empfindlichkeit und einen verstellbaren Verstärkungsfaktor
aufweist. Der Verstärkungsfaktor
des Detektors wird durch Verstellen einer Gleichspannung eingestellt,
die der Bezug für
die Spannungsversorgung der PMT ist. Die Transferfunktion des Referenzspannung-zu-PMT-Verstärkungsfaktors
ist jedoch stark nicht linear und die Operationen der einzelnen
PMT's schwanken
typischerweise gegenüber
der Transferkurve. Ferner schwanken die Operationen der PMTs mit
unterschiedlichen Wellenlängen,
und daher schwanken sie zwischen Kanälen bei einem Mehrkanalsystem.
Folglich sind die PMT-Indexeinstellungen nur Rohschätzungen
des PMT-Verstärkungsfaktors. Daher
ist es wünschenswert,
die Operationen des Detektors bei den verschiedenen PMT-Indexeinstellungen
genau zu charakterisieren oder kalibrieren.
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Bestimmte
bekannte frühere
Systeme kalibrieren die Systemempfindlichkeit durch Einfügen eines
oder mehrerer Referenzpunkte mit bekannter Fluoreszenz in eine Probe
oder in das Blickfeld des Systems. Diese Systeme messen das von
den Referenzpunkten emittierte Fluoreszenzlicht und das von den
Experimenten emittierte Licht in derselben Messoperation und verwenden
die den Referenzpunkten zugeordneten Daten zum Quantifizieren der
Empfindlichkeit des Systems.
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Die
Referenzpunkte können
mit Fluoreszenzfarben oder Festkörperfluoreszenz
hergestellt werden. Die mit Fluoreszenzfarben hergestellten Punkte
sind anfällig
für "Fotobleichen", und daher können die
diese Punkte verwendenden Systeme ungenaue Kalibriermessungen aufgrund
schadhafter Punkte durchführen,
oder sie können
außer
Stande sein, Kalibriermessungen für eine bestimmte Probe durchzuführen. Die
Emissionscharakteristiken der aus Festkörper-Fluoreszenzmaterial hergestellten Referenzpunkte
schwanken mit den Änderungen
der Umgebungsbedingungen wie z. B. Temperaturänderungen. Folglich müssen die
sie benutzenden Systeme die Änderungen
der Umgebungsbedingungen ausgleichen, wodurch das System komplexer
wird.
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Das
dem Stand der Technik entsprechende Dokument
US 5,108,176 offenbart ein System
zum Kalibrieren der Empfindlichkeit eines optischen Scanners. Das
System umfasst optische Mittel zum Erzeugen eines einfallenden Strahls
bekannter Leistung und zum Richten dieses Strahls auf eine Probe, einen
Detektor zum Messen der Leistung des von der Probe emittierten oder
reflektierten Lichts; und einen diffusen Reflektor zum Zurückleiten
des einfallenden Strahls aus der Position der Probe zum Detektor. Durch
dieses herkömmliche
System wird jedoch die Leistung eines einfallenden Anregungsstrahls
an der Position der Probe nicht direkt gesteuert und eingestellt.
Deshalb ist das System vom Stand der Technik nicht zum Kalibrieren
von z. B. einem Fluoreszenz-Bildgebungssystem verwendbar, weil eine
Fluoreszenzfarbe als Probe äußerst anfällig für Fotobleichen
und nicht umkehrbare Fotoverschlechterungswirkungen ist.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ein
erfindungsgemäßes System
umfasst optische Mittel zum Erzeugen eines eingehenden Anregungsstrahls
bekannter optischer Leistung und Richten des Strahls in Richtung
einer Probe, einen Detektor zum Messen der optischen Leistung des
aus der Richtung der Probe gerichteten Lichtes, einen diffusen Reflektor
mit bekannten Reflexionseigenschaften, der so angeordnet ist, dass
er den eingehenden Anregungsstrahl während der Kalibrieroperationen von
der Richtung der Probe zurück
zum Detektor leitet, und einen Leistungsmesser, der zum Messen der optischen
Leistung des eingehenden Anregungsstrahls an einer geeigneten Stelle
positioniert ist, wo der Strahl während der Messoperationen auf
die Probe trifft.
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Der
Leistungsmesser wird zur Erstellung einer Nachschlagetabelle verwendet,
die die Leistung des einfallenden Anregungsstrahls zu den Einstellungen
eines variablen optischen Dämpfungsglieds
in Beziehung setzt. Der im Weg des einfallenden Anregungsstrahls
befindliche Leistungsmesser wird durch den Strahl beleuchtet, wenn
die Probe nicht am Platze ist. Der Messer enthält eine Siliziumfotodiode,
die ein zur Stärke
des einfallenden Lichts proportionales Signal erzeugt. Ein A/D-Wandler
erzeugt dann einen dem Signal entsprechenden digitalen Wert. Das
System variiert die Einstellungen des optischen Dämpfungsglieds
und erzeugt die Nachschlagetabelle auf der Grundlage der zugehörigen digitalen
Werte. Das System verwendet dann die Tabelle zum Auswählen der
geeigneten Einstellung für
das Dämpfungsglied, um
einen Anregungsstrahl mit einer vorgeschriebenen optischen Leistung
an die Probe zu liefern.
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Das
optische Abtastsystem kalibriert den Verstärkungsfaktor eines Detektors
durch Richten eines Strahls bekannter Stärke auf den Detektor. Die photometrische
Vorrichtung im Detektor erzeugt ein zur Stärke des Strahls proportionales
Signal, und ein A/D-Wandler erzeugt einen dem Signal entsprechenden
digitalen Wert. Das System variiert den Verstärkungsfaktor der photometrischen
Vorrichtung und erzeugt bei den verschiedenen Verstärkungsfaktor-Einstellungen
die zugehörigen
digitalen Werte. Dann erzeugt es eine Nachschlagetabelle, die die
Verstärkungsfaktor-Einstellungen
zum tatsächlichen
Verstärkungsfaktor
des Detektors in Beziehung setzt, d. h. zum Verhältnis der bekannten einfallenden
Leistung zu den digitalen Messwerten. Danach verwendet das System
die Tabelle zum Auswählen
der geeigneten Verstärkungsfaktor-Einstellung zur Datenerfassung
und/oder zum Normalisieren der Daten.
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Insbesondere
enthält
das System im Weg des eingehenden Anregungsstrahls das variable
optische Dämpfungsglied,
eine den gedämpften
Strahl auf die Größe eines
Bildpunkts fokussierende Objektivlinse und einen Strahlteiler, der
den eingehenden Anregungsstrahl durch die Linse in Richtung der
Probe richtet. Der Leistungsmesser sitzt unterhalb der Probe, wobei
der aktive Bereich der Fotodiode mit dem Weg des fokussierten Strahls übereinstimmt. Während der
Kalibrierung ist die Probe nicht vorhanden, und der fokussierte
einfallende Anregungsstrahl trifft auf den aktiven Bereich der Fotodiode.
Wie erläutert
erzeugt der Leistungsmesser die digitalen Werte, die die einfallende
optische Leistung bei den verschiedenen Einstellungen des Dämpfungsglieds repräsentieren.
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Der
Strahlteiler unterscheidet vorzugsweise aufgrund der räumlichen
Eigenschaften des Lichts zwischen dem von der Probe emittierten
Fluoreszenzlicht und dem von der Probe reflektierten Laserlicht.
Der Strahlteiler enthält
z. B. im Weg des eingehenden Anregungsstrahls einen Spiegel, der
den eingehenden Strahl zur Probe umleitet. Wenn die Probe am Platze
ist, reflektiert die Oberfläche
der Probe den einfallenden Anregungsstrahl teilweise als einen Strahl
kleinen Durchmessers, und die Fluorophore in der Probe emittieren
Licht in einem sphärischen
Muster. Das reflektierte Anregungslicht wandert denselben Weg wie
der eingehende Strahl von der Probe zurück und wird vom Spiegel zur
Lichtquelle zurückgeleitet.
Das aus Strahlen relativ großen
Durchmessers bestehende emittierte Fluoreszenzlicht wandert dagegen
ganz oder teilweise am Spiegel vorbei und somit zum Detektor.
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Für die Kalibrierung
des Verstärkungsfaktors des
Detektors verwendet das System einen diffusen Reflektor an Stelle
der Probe. Der diffuse Reflektor reflektiert den fokussierten Anregungsstrahl
in einem diffusen Muster, so dass ein Teil des reflektierten Lichts
durch den Strahlteiler fällt.
Ein Neutralfilter mit bekannten Eigenschaften ist zwischen dem Strahlteiler
und dem Detektor positioniert, um das reflektierte Licht um einen
vorgegebenen Prozentsatz zu dämpfen
und die Stärke
des Lichts so zu verringern, dass sie innerhalb des linearen Betriebsbereichs
des Detektors liegt. Dann erzeugt der Detektor die verschiedenen
den verschiedenen PMT-Verstärkungsfaktor-Einstellungen
zugeordneten digitalen Werte.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Die
unten stehende Beschreibung der Erfindung bezieht sich auf die beiliegenden
Zeichnungen; es zeigen:
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1 ein Funktionsblockschaltbild
eines Systems zum Kalibrieren der Leistung im Anregungsstrahl;
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2 ein Funktionsblockschaltbild
des Systems von 1 mit
einer Probe am Platze; und
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3 ein Funktionsblockschaltbild
des Systems von 1, das
zum Kalibrieren des Verstärkungsfaktors
des Detektors modifiziert ist.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
EINER BEISPIELHAFTEN AUSFÜHRUNGSFORM
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Wie
aus 1 ersichtlich ist,
enthält
ein erfindungsgemäß aufgebautes
Fluoreszenz-Bildgebungssystem 10 einen Laser 12,
der einen kollimierten Anregungsstrahls auf ein variables optisches Dämpfungsglied 14 richtet.
Das variable optische Dämpfungsglied 14 im
System 10 ist ein Graukeil-Neutralfilter, der auf einem
Schrittmotor 16 angebracht ist, so dass zu jeder gegebenen
Zeit jede Indexeinstellung des Schrittmotors 16 einem eindeutigen
Dämpfungsfaktor
zugeordnet ist. Der gedämpfte Strahl
geht vom Dämpfungsglied 14 zu
einem Strahlteiler 18, der den eingehenden Strahl in Richtung
einer Probe 22 umleitet, die auf der Zeichnung durch gestrichelte
Linien dargestellt ist. Eine Objektivlinse 20 fokussiert
den Strahl auf einen Durchmesser von Bildpunktgröße, und während der Messoperationen wird
die Probe 22 so bewegt, dass der fokussierte Strahl nacheinander
jeden Bildpunkt in einem Abtastbereich beleuchtet.
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Wenn
die Probe 22 am Platze ist, emittieren die Fluorophore
in den darin enthaltenen Experimenten Fluoreszenzlicht in einem
sphärischen
Muster, und eine Oberfläche
der Probe reflektiert und streut einen Teil des Lichts vom fokussierten
einfallenden Anregungsstrahl, wie aus 2 ersichtlich
ist. Die Linse 20 sammelt Teile des Fluoreszenzlichts und des
reflektierten und gestreuten Lichts und richtet das gesammelte Licht
auf den Strahlteiler 18. Der Strahlteiler 18 lässt das
gesammelte emittierte Licht in Richtung des Detektors 34 durch
und leitet das reflektierte und gestreute Licht um oder weist es
zurück,
wie durch die gestrichelten Linien dargestellt. Ein zwischen dem
Strahlteiler 18 und dem Detektor 34 positionierter
Bandpassfilter 32 lässt
das emittierte Licht zum Detektor durch und weist jegliches durch den
Strahlteiler 18 fallendes Anregungslicht zurück. Der
Strahlteiler wird nachstehend unter Bezugnahme auf 3 detaillierter erläutert.
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Der
Detektor 34 erzeugt einen der Stärke des von einem bestimmten
Experiment emittierten Lichts entsprechenden digitalen Wert. Dann
bildet ein Systemprozessor 36 den digitalen Wert in einen
Grad der Ähnlichkeit
zwischen der zugeordneten Ziel-DNS und der Sonden-DNS ab. Die Operationen
des Detektors werden ebenfalls nachstehend unter Bezugnahme auf 3 detaillierter erläutert.
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Wie
aus 1 ersichtlich ist,
ist die Probe 22 zum Kalibrieren nicht am Platze. Der Anregungsstrahl
beleuchtet stattdessen einen im Strahlweg positionierten Leistungsmesser 24.
Der Leistungsmesser 24 besteht im Wesentlichen aus einer
Fotodiode 26 und einem A/D-Wandler 28. Der sich
hinter seinen Brennpunkt hinaus ausbreitende Anregungsstrahl trifft
auf einen aktiven Bereich 25 der Fotodiode 26. Als
Reaktion erzeugt die Fotodiode einen zur einfallenden optischen
Leistung proportionalen Strom. Der A/D-Wandler 28 wandelt
den Strom in einen entsprechenden digitalen Wert um und stellt den
digitalen Wert dem Systemprozessor 36 bereit.
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Die
Fotodiode 26 kann auf einem Substratabtast-Mikroskoptisch 31 (3) positioniert sein, der
die Probe während
der Messoperationen aufnimmt, so das der aktive Bereich 25 von
der Probe bedeckt ist, wenn die Probe am Platze ist. Alternativ kann
die Fotodiode 26 an einem Ende des Mikroskoptisches und
außerhalb
des normalen Messbereichs positioniert sein. Der Mikroskop tisch
wird dann während
der Kalibrierung über
den Messbereich hinaus bewegt, um die Fotodiode in den Weg des Anregungsstrahls
zu bringen.
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Das
System misst die optische Leistung des einfallenden Anregungsstrahls
bei jeder Einstellung des variablen optischen Dämpfungsglieds 14.
Demgemäß schaltet
der Motor 16 schrittweise durch seine verschiedenen Indexeinstellungen
und der Leistungsmesser 24 erzeugt zugeordnete digitale
Werte. Der Systemprozessor 36 erzeugt auf der Grundlage der
digitalen Werte eine Nachschlagetabelle, die die einfallende optische
Leistung zu den Einstellungen des Dämpfungsglieds in Beziehung
setzt. Ein Benutzer kann dann die an eine Probe zu liefernde gewünschte optische
Leistung vorgeben und das System betreibt das variable optische
Dämpfungsglied 14 mit
der entsprechenden Einstellung. Die Kalibrierung der einfallenden
optischen Leistung auf diese Weise erlaubt einem Benutzer, den Leistungspegel auf
unmittelbar unter den Fotobleichungspegel einzustellen und somit
die Datenerfassung ohne Beschädigung
der Probe zu maximieren.
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Beim
System 10 ist die Fotodiode 26 eine Siliziumfotodiode,
die über
ungefähr
neun Dekaden Dynamikbereich und über
anwendbare Wellenlängen hinweg
eine lineare Leistung-zu-Strom-Transferkurve
aufweist. Ferner ist die Siliziumfotodiode sowohl über die
Zeit als auch über
die Temperatur stabil. Folglich sind die Operationen der Siliziumfotodiode
in derselben Vorrichtung und zwischen einzelnen Vorrichtungen wiederholgenau.
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Die
Kalibrierung der einfallenden Leistung bei den verschiedenen Einstellungen
des Dämpfungsglieds
wird vorzugsweise regelmäßig durchgeführt, um
Veränderungen
der Operationen des Dämpfungsglieds 14 und/oder
des Lasers 12 im Laufe der Zeit auszugleichen. Gaslaser
verlieren z. B. typischerweise im Laufe der Zeit Leistung, und daher nimmt
die Leistung im einfallenden Anregungsstrahl mit jeder Einstellung
des Dämpfungsglieds
ab. Aufgrund der Verringerung der Nennleistung kann das System auch
vorhersagen, wann der Laser ausfallen wird. Der Laser kann dann
ausgetauscht werden, um einen Ausfall während der Messoperationen zu
vermeiden.
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Die
oben erläuterten
Operationen zur Kalibrierung des einfallenden Strahls werden vorzugsweise
bei einem System angewendet, bei dem die Leistung im einfallenden
Strahl über
das abge tastete Feld hinweg konstant bleibt, wie z. B. einem System
mit feststehender Optik und einer sich bewegenden Probe. Die Leistung
in einem abgetasteten Strahl variiert dagegen über das abgetastete Feld hinweg
wie der Einfallswinkel variiert, und daher liefert ein Leistungsmesswert
an einem Punkt im abgetasteten Feld weniger genaue Kalibrierungsinformationen.
Alternativ kann der Leistungsmesser eine Mehrzahl über das Abtastfeld
beabstandeter Siliziumdioden 26 verwenden, um die einfallende
optische Leistung bei verschiedenen zugehörigen Einfallswinkeln zu kalibrieren.
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Das
System 10 kann mehrere Kanäle haben und daher eine Mehrzahl
Laser 12 enthalten, die Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen erzeugen. Das
System kalibriert dann die Leistung gegenüber der Einstellung des Dämpfungsglieds
für jeden
Kanal getrennt, da die Reaktion von Dämpfung und Fotodiode bei unterschiedlichen
Wellenlängen
abweichen kann.
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Wie
aus 3 ersichtlich ist,
kalibriert das System den Verstärkungsfaktor
des Detektors durch Richten reflektierter Strahlen mit bekannten
Stärken auf
den Detektor 34. Der Detektor enthält eine PMT 38, die
zu den Stärken
der Strahlen proportionale Signale erzeugt, und einen A/D-Wandler 40,
der den Signalen entsprechende digitale Werte erzeugt. Während der
Kalibrieroperationen wird die PMT bei ihren verschiedenen Verstärkungsfaktor-Einstellungen
betrieben, und der Systemprozessor 36 erzeugt eine Nachschlagetabelle,
die die Verstärkungsfaktor-Einstellung
der PMT zum Verstärkungsfaktor
des Detektors in Beziehung setzt, d. h. zum Verhältnis der Leistung des einfallenden
Strahls zu den digitalen Werten.
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Zum
Richten der Strahlen auf den Detektor 34 ist ein diffuser
Reflektor 30 mit bekannten Eigenschaften im Weg des fokussierten
einfallenden Anregungsstrahls platziert. Der Reflektor 30 reflektiert
den fokussierten Strahl in einem diffusen Muster. Die Linse 20 sammelt
einen Teil des reflektierten Strahls, und der Strahlteiler 18 lässt das
gesamte reflektierte Licht oder einen Teil davon durch. Ein Neutralfilter 33, der
den Platz des Bandpassfilters 32 (1) einnimmt, dämpft das reflektierte Licht
um einen vorgegebenen Prozentsatz, bevor er das Licht zum Detektor 34 durchlässt. Die
Stärke
des reflektierten Lichts, die ein Vielfaches derjenigen des emittierten
Lichts beträgt,
wird folglich so verringert, dass sie innerhalb des linearen Betriebsbereichs
des Detektors liegt. Der Neutralfilter 33 hat genau gesteuerte
Durchlässigkeitseigenschaften
und folglich ist die Stärke
des den Detektor erreichenden Strahls bekannt.
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Der
diffuse Reflektor 30 kann sich z. B. auf einem Ende 31a eines
Substratabtast-Mikroskoptisches 31 befinden, der die Probe
während
der Messoperationen aufnimmt. Der Mikroskoptisch 31 wird während der
Kalibrieroperationen über
das Ende des normalen Messbereichs hinaus verfahren, um den Reflektor 30 im
Weg des fokussierten Strahls zu positionieren. Alternativ kann der
diffuse Reflektor 30 auf einem Probensubstrat angebracht
sein, das zum Kalibrieren abgetastet wird.
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Bei
dem in 3 dargestellten
System unterscheidet der Strahlteiler 18 zwischen dem reflektierten
Anregungsstrahl und der emittierten Fluoreszenz vorzugsweise aufgrund
der räumlichen
Eigenschaften des Lichts statt aufgrund der unterschiedlichen Wellenlängen des
Lichts. Wie in der Zeichnung dargestellt enthält der Strahlteiler 18 einen
Spiegel 18a kleinen Durchmessers, der im Weg des eingehenden
Anregungsstrahls positioniert ist. Der Spiegel richtet den eingehenden
Strahl durch die Fokussierlinse 20 und in Richtung der
Probe 22. Wenn die Probe am Platze ist, emittiert die Probe
Fluoreszenzlicht in einem sphärischen
Muster und reflektiert einen Teil des fokussierten Strahls als Strahl
kleinen Durchmessers. Der reflektierte Anregungsstrahl wird entlang
des Wegs des eingehenden Anregungsstrahls zurück gerichtet, und der Spiegel 18a befindet
sich somit im Rückweg.
Der Spiegel 18a leitet den reflektierten Strahl zum Laser 12 zurück, während das meiste
gesammelte emittierte Licht, das aus Strahlen größeren Durchmessers besteht,
vom Spiegel 18a durchgelassen wird. Während der Kalibrieroperationen
wird der einfallende Anregungsstrahl in einem diffusen Muster und
somit als Strahlen großen
Durchmessers, die zum großen
Teil vom Spiegel 18a durchgelassen werden, reflektiert.
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Alternativ
kann der Strahlteiler einen Spiegel großen Durchmessers (nicht gezeigt)
mit einem Loch darin enthalten. Der Spiegel reflektiert die emittierte Fluoreszenz
zum Detektor und lässt
den fokussierten Anregungsstrahl und seine Reflexion durch das Loch treten.
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Der
geometrische Strahlteiler arbeitet am besten bei Systemen, die einfallende
Anregungsstrahlen kleineren Durchmessers und emittierte Strahlen
größeren Durchmessers
haben, wie z. B. bei einem System mit feststehender Optik und einer sich
bewegenden Probe oder einem System mit einer abgetasteten Objektivlinse,
die einen relativ großen Teil
des emittierten Lichts sammelt.
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Um
den Detektor über
einen weiteren Bereich zu kalibrieren, können mehrere unterschiedliche
Neutralfilter benutzt werden, um das reflektierte Licht um verschiedene
gesteuerte Prozentsätze
zu dämpfen.
Dann kann das Filter 33 in ein Filterrad (nicht gezeigt)
eingefügt
werden, das während
der Kalibrieroperationen vom System gedreht wird, um die verschiedenen
Neutralfilter zu geeigneten Zeiten in den Weg des reflektierten
Strahls zu bringen. Das Filterrad kann auch das Bandpassfilter 32 (1) enthalten, das während der
Messoperationen in Position gedreht wird.
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Während der
Kalibrieroperationen variiert das System den Verstärkungsfaktor
der PMT 38 und der Systemprozessor 36 verwendet
die zugehörigen Detektor-Messwerte
zum Erzeugen einer Nachschlagetabelle, die PMT-Verstärkungsfaktor-Einstellungen zum
Verstärkungsfaktor
des Detektors in Beziehung setzt. Die Kalibrieroperationen werden
vorzugsweise regelmäßig durchgeführt, so
dass das System Veränderungen
der PMT-Operationen im Laufe der Zeit ausgleichen kann. Bei Mehrkanalsystemen
wird der Verstärkungsfaktor
der PMT für
jeden Kanal getrennt kalibriert, d. h. für jede der unterschiedlichen
Wellenlängen.
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Das
als Reaktion auf den einfallenden Anregungsstrahl während der
Messoperationen erzeugte emittierte Licht ist von der Wellenlänge des
Anregungsstrahls um nur 20 bis 40 nm getrennt. Folglich sind die
Operationen der PMT während
der Kalibrierung mit dem reflektierten Anregungsstrahl ausreichend
nahe bei denen während
der Messoperationen, so dass die Nachschlagetabelle genaue Kalibrierinformationen
liefert. Ferner erlaubt die Verwendung des reflektierten Laserlichts
die Kalibrierung über
die verschiedenen den Mehrkanalsystemen zugeordneten Wellenlängen hinweg,
da die Leistung des einfallenden Strahls in jedem Kanal durch Kalibrierung
bekannt ist. Dagegen müssen
die für
die Kalibrierung Fluoreszenzlicht verwendenden Systeme mit Schwankungen
der chromatischen Verteilung der Leistung im Fluoreszenzlicht im
Laufe der Zeit und mit Veränderungen
der Umgebungsbedingungen kämpfen.
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Das
System kann stattdessen einen Strahlteiler verwenden, der zwischen
dem reflektierten Licht und dem emittierten Licht aufgrund ihrer Wellenlängen unterscheidet,
falls der Prozentsatz des vom Strahlteiler durchgelassenen Lichts
für jede interessierende
zurückgewiesene
Wellenlänge
bekannt ist. Die Dämpfung
des reflektierten den Detektor erreichenden Signals würde dann
auf der bekannten Dämpfung
durch dem Strahlteiler 18 und dem Neutralfilter 33 basieren.
Typi scherweise enthalten Strahlteiler jedoch eine Optik, die so
hergestellt ist, dass sie nicht mehr als einen vorgegebenen maximalen
Prozentsatz des Lichts einer bestimmten zurückgewiesenen Wellenlänge durchlässt. Der
Prozentsatz des Lichts der bestimmten Wellenlänge, das tatsächlich durch
die Optik tritt, wird nicht anderweitig gesteuert, und der Strahlteiler
wird dann eine Variable in den Kalibrieroperationen.
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Die
oben erläuterten
Kalibriermechanismen können
auch zum Normalisieren der Empfindlichkeit von Instrumenten verwendet
werden, die von einem bestimmten Hersteller produziert wurden. Dies
würde es
erlauben, von verschiedenen Instrumenten durchgeführte Experimente
zu vergleichen, gleichgültig
ob sich die Instrumente am selben Standort oder an verschiedenen
Standorten befinden und/oder von den selben oder verschiedenen Forschergruppen
verwendet werden. Zum Erreichen einer normalisierten Kalibrierung
wählt der
Hersteller Leistungsgrenzen. Zum Beispiel spezifiziert der Hersteller
einen Arbeitsbereich für
seine Instrumente, der kleiner ist als der maximale Betriebsbereich,
und er schränkt
die vom Benutzer durchführbaren
Einstellungen auf innerhalb des gewählten Arbeitsbereichs ein.
Dann stellt der Hersteller die Leistungs- und Verstärkungsfaktor-Einstellungen
innerhalb des gewählten
Bereichs für
jedes Instrument identisch ein. Danach erhält der Benutzer die Genauigkeit
der Einstellungen über
die Lebensdauer der Instrumente unter Anwendung der oben besprochenen
Kalibrieroperationen aufrecht, und die durch jedes dieser Instrumente
abgenommenen Daten bleiben konstant.
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Das
System der 1 und 2 stellt einem Benutzer zusätzliche
und leicht durchführbare
Kalibrieroperationen bereit. Zum Kalibrieren der einfallenden optischen
Leistung durch Verstärkungsfaktor-Einstellungen
des Dämpfungsglieds
betreibt der Benutzer das System ohne die Probe, und der eingebaute Leistungsmesser 24 erzeugt
die entsprechenden Messwerte. Dann kalibriert das System den Verstärkungsfaktor
des Detektors auf der Grundlage der kalibrierten optischen Leistung
durch Bewegen des Proben-Mikroskoptisches 31 über den
Messbereich hinaus, wobei es das Filterrad dreht, um den oder die entsprechenden
Dämpfungsfilter 33 wie
erforderlich in den Weg des reflektierten Strahls zu bringen, und Messwerte
vom Detektor 24 erfasst. Es gibt daher keine besonderen
vom Benutzer zu platzierenden Kalibrierungs-Untersysteme und/oder
besondere Referenzpunkte, die in den Proben enthalten sein müssen.
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Die
obenstehende Beschreibung wurde auf eine bestimmte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschränkt. Es ist jedoch klar, dass
innerhalb des Gültigkeitsbereichs
der beiliegenden Ansprüche
Variationen und Modifikationen bei der Erfindung vorgenommen werden
können,
wie z. B. die Verwendung unterschiedlicher Arten variabler optischer
Dämpfungsglieder,
Strahlteiler und/oder Reflektoren oder Aufnahme des Mechanismus
zum Kalibrieren des Verstärkungsfaktors
des Detektors oder des Verstärkungsfaktors
des Dämpfungsglieds
in das System.