JP2002538427A - 光学式スキャナ較正装置 - Google Patents

光学式スキャナ較正装置

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JP2002538427A
JP2002538427A JP2000601421A JP2000601421A JP2002538427A JP 2002538427 A JP2002538427 A JP 2002538427A JP 2000601421 A JP2000601421 A JP 2000601421A JP 2000601421 A JP2000601421 A JP 2000601421A JP 2002538427 A JP2002538427 A JP 2002538427A
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シェーマー，マック
ベングッソン，ハンス
ウェーバー，マーカス
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    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
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    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/4785—Standardising light scatter apparatus; Standards therefor

Abstract

(57)【要約】 較正中、可変光学減衰器の種々の指数設定において、励起ビームの光学的出力を測定する電力計を含む光学式走査システムに関する。このシステムは、源衰器の指数設定に対して入射励起ビーム出力を関連させるルックアップテーブルを構成し、その後、特徴付けられた光学出力の励起ビームを試料に供給するために、このテーブルを使用して、減衰器に対する適切な設定を選択する。このシステムは、公知の強度の励起ビームを検出器に対して再度方向付けすること、もしくは反射することによって、検出器の利得を較正する。このシステムは、検出器の実際の利得に対して利得設定を関連させるルックアップテーブルを創り出し、その後、このテーブルを使用して、データ収集に関する適切な利得設定を選択し、及び／又はデータを規格化する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に光学式走査システムに関する。より詳細には、本発明は、走
査システムを較正する機構に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本質的に、光学式走査システムは、常駐光源から発生された光を試料に向けて
方向付け、試料によって発せられる光、もしくは反射される光を測定する。以下
において、我々は、蛍光結像において利用される走査レーザ顕微鏡に関して議論
する。しかしながら、本発明の機構は、走査レーザ顕微鏡の一部分として、又は
蛍光結像システムの一部分として使用されるに限定されない。
【０００３】 蛍光結像システムは、化学的に標識を付けられた、細胞、タンパク質、遺伝子
、DNA配列のような生物学的試料からの蛍光を試験する。試料は、単一の顕微鏡
用スライドガラス上の幾千もの検体を含み得るマイクロアレイとすることができ
る。各検体は、例えばスライドガラスの表面に化学的に結合されている「ターゲ
ット」DNAのスポットからなる。蛍光物質によって標識付けされた「プローブ」D
NA又は代替的にはRNAが、スライドガラスの表面に導かれ、ターゲットDNAと交雑
される。さらに試料は、それぞれの検体内の蛍光体が光を発するように、所望の
波長の光を利用して光学的に走査される。
【０００４】 所定の試料に関して、各検体は関連する蛍光体密度に対応する量の光を発する
。検体の蛍光体密度は、相補的な分子が無関係な分子よりも結合の可能性が高い
ことにより、特定のターゲットDNAとプローブDNAの類似性に依存する。検出器は
、試料内に含まれる各検体により発せられた光の強度を測定し、さらにシステム
は、ターゲットDNAとプローブDNAの間の相対的な類似の度合いを決定する。
【０００５】 試料に関連する測定は、検体の蛍光体密度だけではなく、システムの感度にも
依存する。そして、システムの感度は、入射励起ビームの出力及び検出器の利得
に依存する。蛍光結像システムは、感度を比較的広い範囲で調節することができ
、広い範囲の蛍光体密度に適応可能である。例えば、異なる４桁にわたって調節
可能である４桁のダイナミックレンジを有することが、当該システムでは一般に
知られている。感度は、入射励起ビームの出力及び／又は検出器の利得を調節す
ることによって設定される。
【０００６】 このように広い範囲で調節することができるシステムにおいて、再現性を維持
することは困難である。したがって、データが１つの試料の測定から次の試料の
測定と、又は１つのシステムから次のシステムと比較される用途では、システム
の感度設定の精度、及びシステムの全体にわたる較正が重要である。その変化が
定量化可能となるまで、所定の感度設定で予想される入射出力又は検出器利得の
変化はデータの規格化に否定的な影響を及ぼす。
【０００７】 本システムは、典型的にはレーザによって発生される入射励起ビームの出力を
、ビーム経路に可変減衰器を加えることによって制御する。この減衰器は、指数
−減衰特性曲線により特徴付けられる。しかしながら、それぞれの指数設定にお
ける減衰率と特性曲線の間に比較的大きな相違があることは珍しくない。したが
って、源衰器の設定に対して入射励起ビームの予想出力にしばしば不一致が生じ
る。さらに、レーザの動作特性が、減衰以前の励起ビームの公称出力を減少させ
るように、経時変化することがある。したがって、可変減衰器の各設定に関連す
る出力レベルを正確にかつ定期的に特徴付けること、もしくは較正することが望
ましい。
【０００８】 検出器の利得は、包含された測光装置の利得の大半に依存する。一般に、この
装置は、高感度であり、利得を調節することができる光電子増倍管すなわちPMT
である。検出器の利得は、PMTの電源に関して、基準であるDC電圧を調節するこ
とによって設定される。しかしながら、この基準電圧とPMT利得の伝達関数は、
全く非線形であり、かつ典型的には、別個のPMTの動作はその特性曲線と一致し
ない。さらに、PMTの動作は、異なる波長に応じて変化し、したがって複数チャ
ンネルシステムのチャンネル間で変化する。よって、PMTの指数設定は、PMT利得
の大ざっぱな予想に過ぎない。したがって、種々のPMT指数設定における検出器
の動作を正確に特徴付けること又は較正することが望ましい。
【０００９】 ある従来公知のシステムは、公知の蛍光の１以上の参照スポットを試料内又は
システムの視野内に含ませることによってシステムの感度を較正する。これらの
システムは、同じ測定操作において、参照スポットにより発せられた蛍光光を測
定するとともに、検体により発せられた光を測定し、参照スポットに関連するデ
ータを利用してシステムの感度を定量化する。
【００１０】 参照スポットは、蛍光染料又は固体状態の蛍光体により形成される。蛍光染料
によって形成されたスポットは、「退色」されやすく、したがって、このスポッ
トを利用するシステムは、損傷を受けたスポットに基づく不正確な較正測定を行
うことがあり、あるいは所定の試料に対する較正測定を行うことができないこと
がある。固体状態の蛍光体材料により形成される参照スポットの発光特性は、温
度変化のような周囲環境の変化により変化する。したがって、これらを利用する
システムは環境変化に対して補償されなければならず、これはシステムに複雑さ
を付加する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
光学式走査システムは、電力計を利用して、可変光学減衰器の設定に対して入
射励起ビーム出力を関連させるルックアップテーブルを構成する。入射励起ビー
ムの経路に置かれる電力計は、試料が適所にないときに、ビームにより照らされ
る。この電力計は、入射光の強度に比例する信号を発生するシリコンホトダイオ
ード含む。さらに、A/Dコンバータが、この信号に対応するデジタル値を発生す
る。システムは、光学減衰器の設定を変更し、関連するデジタル値に基づくルッ
クアップテーブルを創り出す。さらにシステムは、このルックアップテーブルを
利用して、特定の光学出力の励起ビームを試料に供給するために、減衰器に対す
る適切な設定を選択する。
【００１２】 光学式走査システムは、公知の強度のビームを検出器に方向付けることによっ
て、検出器の利得を較正する。検出器内の測光装置は、ビームの強度に比例する
信号を発生し、A/Dコンバータは、この信号に対応するデジタル値を発生する。
システムは、測光装置の利得を変更し、種々の利得設定での関連するデジタル値
を発生する。さらに、検出器の実際の利得、すなわちデジタル値の読みに対する
公知の入射出力の比に利得設定を関連させるルックアップテーブルを創り出す。
その後、システムはこのテーブルを利用して、データ収集に対して適切な利得設
定を選択し、及び／又はデータを規格化する。
【００１３】 より詳細には、システムは、入射励起ビームの経路の可変光学減衰器と、減衰
されたビームをピクセルの寸法に集束する対物レンズと、この対物レンズを介し
て試料の方向に入射励起ビームを方向付けるビームスプリッタとを含む。集束ビ
ームの経路と直列に並ぶホトダイオードの作用面を備える電力計が、試料の下方
に設けられる。較正の最中、試料は存在せず、集束入射励起ビームはホトダイオ
ードの作用面に当たる。議論したように、電力計は、種々の減衰器の設定におけ
る光学的入射出力を表すデジタル値を発生する。
【００１４】 ビームスプリッタは、試料によって発せられた蛍光光と、光の空間的な特性に
基づき試料によって反射されるレーザ光とを識別することが好ましい。例えば、
ビームスプリッタは、試料の方向に入射光を再度方向付けする入射励起ビームの
経路内の鏡を含む。試料が適所にある場合、試料の表面が、幅の狭いビームとし
て入射励起ビームを一部分反射し、試料の蛍光体が球面パターンの光を発する。
反射励起光は、試料から、入射ビームと同様の経路に沿って伝わって戻り、鏡に
よって光源の方に再度方向付けされる。対照的に、相対的に大きな直径のビーム
からなる放射蛍光光は、その全て又は一部分が鏡を通過して進み、したがって検
出器の方に進む。
【００１５】 検出器の利得の較正のために、システムは試料の場所で拡散反射器を使用する
。拡散反射器は、反射光の一部分がビームスプリッタを通過するように、集束励
起ビームを拡散パターンで反射する。公知の特性を持つ中性フィルタが、ビーム
スプリッタと検出器の間に配置され、所定の割合で反射光を減衰し、減衰器の線
形動作範囲内に光の強度を低減する。さらに、検出器は、種々のPMT利得設定と
関連する種々のデジタル値を発生する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、添付の図面を参照してさらに記載される。
【００１７】 図１を参照すると、本発明によって構成された蛍光結像システム10が、可変光
学減衰器14に平行励起ビームを方向付けるレーザ12を含んで示される。システム
10内の可変光学減衰器14は、ステップモータ16の各指数設定が所定の時間におい
て固有の減衰率となるように、ステップモータ16に設けられている連続的な楔中
性フィルタである。減衰されたビームが、減衰器14からビームスプリッタ18に進
み、ビームスプリッタは、図中点線で示される試料22の方向に入射ビームを再度
方向付けする。対物レンズ20は、ビームをピクセルの寸法の直径に集束し、測定
操作の間、この集束ビームが走査領域の各ピクセルを連続的に照らすように、試
料が移動される。
【００１８】 図２を参照すると、ここでは試料22が適所にあり、試料に含まれる検体内の蛍
光体が球面パターンで蛍光光を発し、試料表面が集束入射励起ビームからの光の
いくらかを反射し又は拡散する。レンズ20は、蛍光光及び反射、拡散された光の
一部分を集束し、この集束光をビームスプリッタ18に方向付ける。ビームスプリ
ッタ18は、集束放射光を検出器34の方向に通し、点線で示されているように、反
射、拡散光を再度方向付け又は除去する。ビームスプリッタ18と検出器34の間に
配置されている帯域通過フィルタ32は、検出器に放射光を通し、ビームスプリッ
タ18を通過する残留励起光を除去する。ビームスプリッタは、図３を参照して、
以下においてより詳細に議論される。
【００１９】 検出器34は、所定の検体によって発せられた光の強度に対応するデジタル値を
発生する。さらに、システムプロセッサ36は、関連するターゲットDNAとプロー
ブDNA間の類似の度合いでデジタル値をマッピングする。
【００２０】 再度図１を参照すると、試料22は較正のために適所に置かれていない。代わり
に、励起ビームはビーム経路に配置されている電力計24を照らす。電力計24は、
本質的に、ホトダイオード26及びA/Dコンバータ28からなる。その焦点を通過し
て拡がる励起ビームは、ホトダイオード26の作用面25に達する。それに応答して
、ホトダイオードは、光学的入射出力に比例する電流を発生する。A/Dコンバー
タ28は、この電流を対応するデジタル値に変換し、システムプロセッサ36にこの
デジタル値を供給する。試料が配置された場合に作用面25が試料によって覆われ
るように、ホトダイオード26を、測定操作の間、試料を保持する基板走査ステー
ジ32（図２）上に配置することができる。代替的には、ホトダイオード26を、ス
テージの一方の端部、通常の測定領域の外側に配置することができる。さらに、
このステージは、較正の間、測定領域を超えて移動し、ホトダイオードを励起ビ
ームの経路内に移動させる。
【００２１】 システムは、可変光学減衰器14の各設定において、入射励起ビームの光学出力
を測定する。したがって、モータ16は種々の指数設定にわたってステップし、電
力計24は関連するデジタル値を発生する。デジタル値に基づき、システムプロセ
ッサ36は、光学的入射出力を減衰器の設定に関連させるルックアップテーブルを
創り出す。さらに、ユーザは試料に供給する所望の光学出力を指定することがで
き、システムは、適切な設定で可変光学減衰器14を動作する。この方法での光学
的入射出力の較正は、ユーザが、出力レベルを退色するレベルの直下に設定する
ことを可能とし、したがって試料を損傷することなく最大限のデータ収集を可能
とする。
【００２２】 システム10において、ホトダイオード26は、おおよそ９桁のダイナミックレン
ジにわたって、適切な波長にわたって、線形の出力−電流特性曲線を示すシリコ
ンホトダイオードである。さらにシリコンホトダイオードは、時間及び温度の双
方に関して安定である。したがって、シリコンホトダイオードの操作は、同じ装
置及び別個の装置間において繰り返すことができる。
【００２３】 可変減衰器の設定における入射出力の較正が定期的に実施され、減衰器14及び
／又はレーザ12を経時変化に対して補償することが好ましい。例えば、典型的に
、ガスレーザは時間を経ることで出力が失われ、したがって、入射励起ビームの
出力は減衰器の設定毎に低下する。公称出力の低下に基づいて、またシステムは
レーザの機能停止を予告する。さらにレーザを交換し、測定操作の間の機能停止
を避けることができる。
【００２４】 上記で議論した入射ビーム較正操作は、固定光学系を備え、試料が移動するシ
ステムのような、入射ビームが走査領域にわたって一定に維持されるシステム内
で使用されることが好ましい。対照的に、走査ビームの出力は、入射角の変化に
ともなって、走査領域にわたって変化し、したがって走査領域の一点で示される
出力は、正確な較正情報をわずかしかもたらさない。代替的に、電力計は、走査
領域にわたって隔置された複数のシリコンダイオード26を使用することができ、
種々の関連する入射角における光学的入射出力を較正することができる。
【００２５】 システム10は、複数のチャンネルを有し、したがって異なる波長の光を発生す
る複数のレーザ12を含む。さらに、システムは、減衰器及びホトダイオードが異
なる波長に対して異なる応答をするので、出力対減衰器の設定は各チャンネルに
対して別個に較正される。
【００２６】 さらに図３を参照すると、システムは、公知の強度の反射ビームを検出器34に
方向付けることによって、検出器の利得を較正する。検出器は、ビームの強度に
比例する信号を発生するPMT 38及び、この信号に対応するデジタル信号を発生す
るA/Dコンバータ40を含む。較正操作の間、PMTは種々の利得設定で操作され、シ
ステムプロセッサ36は、PMTの利得設定を、検出器の利得、すなわちデジタル値
に対する入射ビームの出力の比に関連させるルックアップテーブルを創り出す。
【００２７】 検出器34にビームを方向付けるために、公知の特性の拡散反射器30が、集束入
射励起ビームの経路内に配置される。反射器30は、集束ビームを拡散パターンで
反射する。レンズ20は反射ビームの一部分を集光し、ビームスプリッタ18は反射
光の全て又は一部を通す。帯域通過フィルタ32（図１）の代わりをする中性フィ
ルタ33が、検出器34に光を通す前に、所定の割合で反射光を減衰する。したがっ
て、しばしば放射光の強度である反射光の強度は、検出器の線形の動作範囲内に
低減される。中性フィルタ33は、正確に制御された伝達特性を有し、したがって
検出器に達するビームの強度は公知である。
【００２８】 例えば、拡散反射器30を、測定操作の間、試料を保持する基板操作ステージ32
の一方の端部32aに配置することができる。このステージ32を、較正操作の間、
通常の測定領域の端部を超えて駆動することができ、集束ビームの経路に反射器
30を配置することができる。代替的には、拡散反射器30を較正のために走査され
る試料基板上に設けることができる。
【００２９】 図３に示されているシステムでは、ビームスプリッタ18が、光の異なる波長に
基づくのではなく光の空間的な特性に基づいて、反射励起ビームと放射蛍光を区
別することが好ましい。図に示されているように、ビームスプリッタ18は、入射
励起ビームの経路に配置されている直径が小さな鏡を含む。この鏡は、集束レン
ズ20を介して、試料22の方向に入射ビームを方向付ける。試料が適所にある場合
、試料は球面パターンの蛍光光を発し、直径を絞られたビームとして集束ビーム
の一部分を反射する。反射励起ビームは、入射励起ビームの経路に沿って戻る方
向に方向付けられ、したがって鏡18aは戻り経路内にある。鏡18aは、反射ビーム
をレーザ12の方に方向を変え、同時に、より大きな直径のビームからなる収集さ
れた放射光の大部分が鏡18aを素通りする。較正操作の間、入射励起ビームは拡
散パターン、したがって多くの部分が鏡18aを素通りする大きな直径のビームと
して反射される。
【００３０】 代替的には、ビームスプリッタは、孔を有する大きな直径の鏡（図示せず）を
含む。この鏡は、放射蛍光を検出器の方に反射し、集束励起ビーム及びその反射
光が孔を介して通過することを可能とする。
【００３１】 幾何学的ビームスプリッタが、固定光学系を備え、試料が移動するシステム、
もしくは放射光の相対的に多くの部分を収集する走査対物レンズ備えるシステム
のような、小さな直径の入射励起ビームと大きな直径の放射ビームを有するシス
テムにおいて、最も良く機能する。
【００３２】 より広い領域にわたって検出器を較正するために、幾つかの異なる中性フィル
タが使用され、種々の制御された割合で反射光を減衰する。さらにフィルタ33は
、較正操作の間、システムによって種々の中性フィルタを適切な時機に反射ビー
ムの経路に入れるように回転されるフィルタホイール（図示せず）に含まれる。
また、このフィルタホイールは、測定操作の間、適所に回転される帯域通過フィ
ルタ32（図１）を含む。
【００３３】 較正操作の間、システムはPMT 38の利得を変化させ、システムプロセッサ36は
、関連する検出器の読みを利用して、検出器の利得に対してPMT利得設定を関連
させるルックアップテーブルを創り出す。較正操作は、定期的に実施されること
が好ましく、それによって、システムはPMT動作における経時変化を補償するこ
とができる。複数チャンネルシステムでは、PMTの利得は、チャンネルのそれぞ
れに関して、すなわち異なる波長のそれぞれに関して別個に較正される。
【００３４】 測定操作の間、入射励起ビームに応答して発生する放射光は、わずか20〜40 n
mだけ励起光の波長から分離している。したがって、較正の間、反射励起ビーム
を有するPMTの動作は、ルックアップテーブルが正確な較正情報をもたらす測定
操作の間の動作と十分に近似している。さらに、各チャンネルの入射ビームの出
力を較正によって知ることができるので、反射レーザ光を使用することによって
、複数チャンネルシステムに関連する種々の波長にわたって較正することが可能
となる。対照的に、較正に蛍光光を利用するシステムは、蛍光光の出力の色分布
の経時変化及び周囲条件における変化に対処しなければならない。
【００３５】 代わりに、ビームスプリッタを通過する光の割合が各除去関心波長に対して知
られているのであれば、本システムは、反射光と放射光をその波長に基づいて区
別するビームスプリッタを利用することができる。さらに、検出器に達する反射
信号の減衰は、ビームスプリッタ18及び中性フィルタ33の双方を介する公知の減
衰に基づいている。しかしながら、典型的には、ビームスプリッタは、既定の除
去波長の光の所定の最大割合を超えて通過させることがないように製造されてい
る光学系を含む。光学系を実際に通過する所定の波長の光の割合は、別の方法で
制御されず、ビームスプリッタは、較正操作において可変となる。
【００３６】 また、上記で議論した較正機構は、所定の製造者により製造された計器の感度
を規格化するのに使用することができる。これは、計器が同じ場所又は異なる場
所にあるか、及び／又は計器が同じ研究者により又は異なる研究者により使用さ
れるかに関わらず、異なる計器によって実施される実験の補償を可能とする。規
格化較正を行うために、製造者は性能限界を選択する。例えば、製造者は、その
計器に対して最大動作範囲よりも狭い動作範囲を指定し、ユーザが選択動作範囲
を指定することができる調節機能を制約する。さらに、製造者は、全ての計器に
対して、選択範囲内で同様に出力及び利得設定を設定する。したがって、ユーザ
は、上記で議論した較正操作を使用する計器の寿命にわたって、設定の正確さを
維持し、これらの計器のそれぞれによって得られたデータは依然として矛盾しな
い。
【００３７】 図１及び２のシステムは、ユーザに確かで容易に実施される較正操作をもたら
す。減衰器の利得設定によって光学的入射出力を較正するために、ユーザは試料
を用いることなくシステムを動作し、常駐電力計24が適切な読みを創り出す。さ
らに、システムは較正された光学的出力に基づいて、測定領域を超えて試料ステ
ージ32を動かすことにより、必要であれば、適切な減衰フィルタをもたらすフィ
ルタホイール又はフィルタ33を反射ビームの経路内で回転することによって、検
出器24から値を読み取ることによって、検出器の利得を較正する。したがって、
ユーザによって適所に配置されなければならない特別な較正用サブシステム、及
び／又は試料に含まれなければならない特別な参照スポットは必要とされない。
【００３８】 上記記載は本発明の特定の実施態様を画定するものである。しかしながら、そ
の利益のいくらか又は全ての獲得とともに、可変光学減衰器、ビームスプリッタ
、反射器の異なる形式を使用すること、又は検出器の利得又は減衰器の利得の１
つを較正するための機構をシステム内に取り入れることのような、本発明になさ
れる変更又は改変は明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の記載の
目的は、全てのそのような変更及び改変を本発明の真の精神及び範囲の内に取り
入れるようにカバーすることである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 励起ビームの出力を較正するためのシステムの機能的なブロック図を示す。
【図２】 適所に試料を備えた、図１のシステムの機能的なブロック図を示す。
【図３】 検出器の利得を較正するために変更された図１のシステムの機能的なブロック
図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ベングッソン，ハンス アメリカ合衆国マサチューセッツ州01776， サドバリー，ベント・ロード・57 (72)発明者 ウェーバー，マーカス アメリカ合衆国マサチューセッツ州02476， アーリントン，ヒバート・ストリート・78 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 DA02 DA06 EA01 FA02 GA07 GB19 HA01 HA09 JA02 KA09 LA01 LA02 NA05 NA06 NA13 NA14 2G059 AA05 BB08 BB12 BB14 CC16 DD13 EE02 EE07 EE11 GG01 GG03 JJ11 JJ22 JJ25 KK01 MM05 MM09

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 光学式スキャナの感度を較正するためのシステムであって、 Ａ．公知の光学的出力の入射励起ビーム発生し、試料の方向にこの入射励起ビー
    ムを方向付ける光学手段と、 Ｂ．前記試料の方から方向付けられた光の光学的出力を測定する検出器と、 Ｃ．前記入射励起ビームを前記試料の方から前記検出器の方へ再度方向付けする
    拡散反射器と を含むシステム。
  2. 【請求項２】 さらに、前記反射器によって前記検出器に方向付けられた光
    を所定の割合減衰するフィルタを含む請求項１記載のシステム。
  3. 【請求項３】 前記検出器が、複数の利得設定を含み、その利得設定のそれ
    ぞれにおける光学的出力を測定する請求項１記載のシステム。
  4. 【請求項４】 さらに、前記検出器の利得設定を、前記検出器の出力測定値
    と前記入射励起ビームの公知の出力値の比に関連させるルックアップテーブル含
    む請求項３記載のシステム。
  5. 【請求項５】 前記反射器が、較正のためのシステム内に配置されている較
    正用試料に含まれている請求項３記載のシステム。
  6. 【請求項６】 さらに、前記試料を保持するためのステージを含み、前記反
    射器が該ステージ上かつ関連する走査領域の外側に配置され、較正の間、前記シ
    ステムが該走査領域を超えて前記反射器を走査する請求項１記載のシステム。
  7. 【請求項７】 前記光学手段が、公知の可変光学的出力を有する入射励起ビ
    ームを発生する請求項１記載のシステム。
  8. 【請求項８】 さらに、前記検出器の出力測定値と前記入射励起ビームの公
    知の出力値の比に対して前記検出器の利得設定を関連させるルックアップテーブ
    ルを含む請求項７記載のシステム。
  9. 【請求項９】 さらに、ａ．公知の減衰特性を有し、前記反射器によって再
    度方向付けられたビームを減衰する複数のフィルタと、 ｂ．前記ルックアップテーブルが前記比の前記減衰された光学的出力を利用する
    こととを含む請求項４記載のシステム。
  10. 【請求項１０】 前記光学手段が、 1.励起ビームを発生するための光源と、 2.前記励起ビームを減衰し、前記入射励起ビームを発生する可変光学減衰器と、 3.前記入射励起ビームを前記試料の方向に方向付けるための方向付け手段と、 4.前記方向付けされた入射励起ビームの光学的出力を測定するための計器とを含
    む請求項１記載のシステム。
  11. 【請求項１１】 前記計器が、前記方向付けされた入射励起ビームの経路内
    に配置されているホトダイオードを含む請求項１０記載のシステム。
  12. 【請求項１２】 前記方向付け手段が、前記入射励起ビームをピクセルの寸
    法の直径に集束するレンズを含む請求項１１記載のシステム。
  13. 【請求項１３】 前記光学手段が前記入射励起ビームをピクセルの寸法の直
    径に集束し、前記反射器が前記ビームを１以上の大きな直径のビームとして反射
    する請求項１記載のシステム。
  14. 【請求項１４】 前記光学手段が、大きな直径のビームを前記検出器の方に
    方向付け、小さな直径のビームを前記検出器から離れる方向に方向付けるビーム
    スプリッタを含む請求項１３記載のシステム。
  15. 【請求項１５】 前記光学手段が平行励起ビームを発生するためのレーザを
    含む請求項１記載のシステム。
  16. 【請求項１６】 前記光学手段が、複数のレーザと、各レーザによって発生
    された励起ビームに関連する測定値をもたらす検出器を含む請求項１５記載のシ
    ステム。
  17. 【請求項１７】 前記光学手段が、複数のレーザと、各レーザによって発生
    された光に関連する測定値をもたらす検出器を含む請求項１記載のシステム。
  18. 【請求項１８】 さらに、1.前記光学手段内の複数のレーザと、 2.前記検出器に対する複数の利得設定と、 3. それぞれのレーザに関連する波長に関して、検出器の測定値と前記入射励起
    ビームの公知の出力値との比に対して前記検出器の利得設定を関連させるルック
    アップテーブルとを含む請求項３記載のシステム。
  19. 【請求項１９】 試料を走査する光学式スキャナを較正するためのシステム
    であって、 Ａ．励起ビームを発生するための光源と、 Ｂ．前記励起ビームを減衰するための可変光学減衰器と、 Ｃ．前記試料の方向に、前記減衰された励起ビームを方向付けるための手段と、 Ｄ．測定操作の間、前記減衰された励起ビームが前記試料と衝突するおおよその
    場所で、前記減衰された励起ビームの光学的出力を測定するための計器と を含むシステム。
  20. 【請求項２０】 前記計器が前記減衰器の種々の設定での光学的出力を測定
    する請求項１９記載のシステム。
  21. 【請求項２１】 さらに、前記減衰されたビームの光学的出力に対して前記
    減衰器の設定を関連させるためのルックアップテーブルを含む請求項１９記載の
    システム。
  22. 【請求項２２】 前記計器が、試料が前記システム内の適所に配置されてい
    ない場合に、前記減衰されたビームを受容するように配置されている請求項１９
    記載のシステム。
  23. 【請求項２３】 1.前記ビームを方向付けるための手段が、前記ビームをピ
    クセルの寸法の直径に集束し、 2.前記計器が前記集束励起ビームの経路に配置されているホトダイオードを含む
    請求項２２記載のシステム。
  24. 【請求項２４】 さらに、1.複数の波長において励起ビームを発生するため
    の複数の光源と、 2.前記ルックアップテーブルが、前記複数の波長の各波長の減衰されたビームの
    光学的出力に対して前記減衰器の設定を関連させることとを含む請求項２１記載
    のシステム。
  25. 【請求項２５】 さらに、1.所定の空間的特性を有する再度方向付けされた
    光を前記検出器の方に戻し、さらに前記所定の空間的特性を有さない再度方向付
    けされた光を前記検出器から離れる方向に方向付けるためのビームスプリッタと
    、 2.前記反射器が、前記入射励起ビームの少なくとも一部分を、前記所定の空間的
    特性を有するパターンで反射することとを含む請求項１記載のシステム。
  26. 【請求項２６】 光学式スキャナの感度を較正するためのシステムであって
    、 Ａ．公知の光学的出力の入射励起ビームを発生し、試料の方にこのビームを方向
    付け、複数のレーザを備える光学手段と、 Ｂ．前記試料の方から方向付けられ、減衰されたビームの光学的出力を測定し、
    各レーザによって発生された光に関連する測定値をもたらす検出器と、 Ｃ．前記入射励起ビームを前記試料の方から前記検出器の方に再度方向付けるた
    めの反射器と を含むシステム。
  27. 【請求項２７】 さらに、1.前記検出器に対する複数の利得設定と、 2.それぞれのレーザに関連する波長に対して、前記検出器の測定値と前記入力励
    起ビームの公知の出力値の比に対する前記検出器の利得設定を関連させるルック
    アップテーブルとを含む請求項２６記載のシステム。
  28. 【請求項２８】 光学式スキャナの感度を較正するためのシステムであって
    、 Ａ．公知の光学的出力の入射励起ビームを発生し、試料の方にこの入射励起ビー
    ムを方向付け、この入射励起ビームをピクセルの寸法の直径に集束する光学手段
    と、 Ｂ．前記試料の方から方向付けられた光の光学的出力を測定するための検出器と
    、 Ｃ．前記入射励起ビームを前記試料の方から前記検出器の方に再度方向付け、１
    以上の大きな直径のビームとして前記入射励起ビームを反射する反射器と、 Ｄ．前記大きな直径のビームを前記検出器の方に方向付け、小さな直径のビーム
    を前記検出器から離れる方向に方向付けるビームスプリッタと を含むシステム。
  29. 【請求項２９】 光学式スキャナの感度を較正するためのシステムであって
    、 Ａ．公知の光学的出力の入射励起ビームを発生し、試料の方にこの入射励起ビー
    ムを方向付け、ための光学手段と、 Ｂ．前記入射励起ビームを前記試料の方から前記検出器の方に再度方向付ける反
    射器と、 Ｃ．公知の減衰特性を備え、前記再度方向付けられた励起ビームを減衰するフィ
    ルタと、 Ｄ．前記試料の方から方向付けられた減衰されたビームの光学的出力を測定する
    ための検出器と、 を含むシステム。
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