JP2006098419A - 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ライン検出器を有する蛍光色素の効率的な、スペクトルにより分析される検出のために斬新な方法
【解決手段】スペクトル分解能は個別チャネルの数によって測定される。検出器の個別チャネルがすべて同時に読取られるとは限らない場合、個別チャネルの一連の読取りが多重化により従来技術に従って実行される。多重化が試料のスキャンの間の画素滞留時間中に実行される。これには信号が検出される間の個別チャネル当たりの積分時間が多重位置の数だけ低減されるという欠点がある。さらに、広域蛍光スペクトルが測定される場合、信号が読取られない個別チャネルで失われる。別の多重化方法では、個別チャネルの信号が緩和される。次に、個別記憶装置が交互に読取られる。ただし、新しいデータは読取り中記録されない。従って、ライン検出器の読取り速度がこの形式の多重化で低減されることになる。
【選択図】図５

Description

本発明は、蛍光顕微鏡法および装置に関し、さらに詳細には主として生物学上の試料の検査、プレパラートおよび関連構成成分を検査するためのレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法、および走査型近視野顕微鏡法に関するものである。これには蛍光検出（ハイスループットスクリーニング）およびフローサイトメータに基づいた活性成分をスクリーニングする方法が含まれる。

少数の広域スペクトル色素帯の検出から全スペクトルの同時取得への移行により空間部分的構造に対するほとんどの分析または機能的試料特性の特定、分離および相関性または動的プロセスのための新たな可能性が開けてくる。従って、蛍光スペクトルに重なることで多数の蛍光体との試料の同時検査が厚い試料の３次元でまたは空間的構造においても可能となる。検出ユニットのスペクトル分解能は装置によって高められる。

生物学的プレパラートを検査する光学顕微鏡の適用の代表的な利用分野は蛍光顕微鏡（ポウリー著、「生物学的共焦点顕微鏡ハンドブック」、プレナム出版、１９９５年（Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy）, Plenum Press,1995）である。この場合、測定色素は細胞部の特定標識付けをするために使用される。

測定エネルギを有する放射光子が、１個の光子の吸収により基底状態から励起状態へ色素分子を励起する。この励起は通常、一光子吸収と呼ばれる（図１ａ）。この方法で励起された色素分子は各種形態で基底状態へ戻ることができる。蛍光顕微鏡では、最も重要な移行は蛍光光子の放射下でのものである。ストークス変位のため、一般に、励起放射と比較して放射光子の波長での赤色側へのずれが存在する、即ち、それはより長い波長を有する。ストークス変位により励起放射から蛍光放射を分離することが可能になる。

蛍光は、ブロックフィルタと組み合わされ適当なダイクロイックビームスプリッタによって励起放射から分離され、別々に観察される。これにより、種々の色素により着色される個別細胞の描写が可能になる。ただし、原理的には、プリパレートのいくつかの部分も特定の方法で結合する種々の色素と同時に着色される（多重蛍光）。特殊ダイクロイックビームスプリッタを再び使用して個別色素によって放射された蛍光信号を区別する。

高エネルギー光子を有する色素分子の励起（一光子吸収）の他に、複数の低エネルギ光子による励起も可能である（図１ｂ）。個々の光子のエネルギの和が多数の高エネルギ光子にほぼ対応する。色素のこの形式の励起は多光子吸収（コール、キーノ著、「共焦点走査、光学顕微鏡および関連結像システム」、アカデミックプレス、１９９６年（Corle,Kino, "Confocal Scanning, Optical Microscopyand Radiated Imaging System"、Academic Press 1996）として知られている。

ただし、色素放射はこの種の励起によっては影響されない、即ち、放射スペクトルは多光子吸収における負のストークス変位を受ける、即ち、それは励起放射と比較してより短い波長を有する。放射スペクトルからの励起放射の分離が一光子吸収と同じ方法で実行される。

共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）（図２）を参照し実施例を通して次に従来技術をより十分に説明する。
ＬＳＭは基本的に４つのモジュール、即ち、光源、走査モジュール、検出ユニット、および顕微鏡から構成される。これらのモジュールは以下に十分に説明する。さらに、ドイツ特許第１９７０２７５３Ａ１号を参照する。

ＬＳＭ内ではプレパラートの種々色素の特定励起に対して種々の波長を有するレーザを使用する。励起波長の選択は検査される色素の吸収特性によって管理される。励起放射が光源モジュールから発生する。各種レーザ（アルゴン、アルゴン／クリプトン、Ｔｉ：Ｓａレーザ）がこの目的のため使用される。さらに、波長の選択および必要な励起波長の強度調整、例えば、音響光学結晶を使用して光源モジュールで実行される。レーザ放射は続いてファイバまたは適当なミラー装置を介して走査モジュールに到達する。

光源で生成されたレーザビームは、スキャナ、走査光学系および円筒レンズを介して対物レンズによって回折限界態様にてプレパラートで焦束される。焦点はｘ−ｙ方向に点ラスタで試料をスキャンする。試料全体にわたってスキャンする場合の画素滞留時間は、ほとんどマイクロ秒から数秒未満の範囲にある。

蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）では、焦点面（試料）および後方の上下に配置された面から放射された光がスキャナを介してダイクロイックビームスプリッタ（ＭＤＢ）に到達する。このダイクロイックビームスプリッタは励起光から蛍光を分離する。続いて、蛍光が焦点面に共役な面に精度よく配置された絞り（共焦点絞り／ピンホール）上に焦束される。この方法では、焦点外の蛍光成分が抑制される。顕微鏡の光分解能は絞りの寸法を変えることにより調整可能である。励起放射を再び抑制する別のダイクロイックブロックフィルタ（ＥＦ）が絞りの背後に配置される。ブロックフィルタを通過後、蛍光が点検出器（ＰＭＴ）によって測定される。

多光子吸収を使用する場合、励起強度が特に高い色素蛍光の励起は少量で行われる。この領域は共焦点装置を使用する場合、検出された領域とくらべて無視できるほどわずかに大きいだけである。従って、共焦点絞りは省略でき、かつ検出は対物レンズの直後で実行される（ノンデスキャン検出）。

多光子吸収によって励起された色素蛍光を検出する別の装置では、デスキャン検出が再び実行されるが、今度は対物レンズの瞳が検出ユニットに結像される（非共焦点デスキャン検出）。

３次元で照射された画像から、対物レンズの焦点面に配置された面（光切片）のみが対応する一光子吸収または多光子吸収と関連して２つの検出装置によって再生される。試料の様々な深さでｘｙ平面方向に複数の光切片を記録またはグラフにすることにより、引き続いて試料の３次元画像がコンピュータでサポートされて発生される。

従って、ＬＳＭは厚いプレパラートの検査には適当である。励起波長はその特定の吸収特性を有する使用色素によって測定される。色素の放射特性に適合したダイクロイックフィルタにより確実にそれぞれの色素によって放射された蛍光のみが点検出器によって測定される。

一般に、バイオ医学的適用では、多数の様々な細胞領域が種々の色素（多重蛍光）によって同時に標識付けられる。従来技術では、個別色素が種々の吸収特性または放射特性（スペクトル）（図３ａ）に基づいて別々に検出される。例えば、放射信号が種々の色素（１〜４）について波長全体にわたってグラフにされる。

別々に検出する場合は、複数の色素の蛍光の追加分光が、２次ビームスプリッタ（ＤＢＳ）により実行され、かつ個別色素放射の別々の検出が、各種点検出器（ＰＭＴｘ）で実行される。上記装置では、使用者が対応する新しい色素特性に対する検出および励起に柔軟に適合することが不可能である。それよりむしろ、新しいダイクロイックビームスプリッタおよびブロックフィルタを（新しい）色素毎に作成する必要がある。

既知の装置では、蛍光がプリズムによってスペクトルに分光される。本方法は使用したフィルタの特性が調整可能である点においてのみダイクロイックフィルタを有する上記装置とは異なる。ただし、点検出器により色素の放射帯域を記録することはなお好ましい。放射範囲の調整がダイクロイックフィルタおよび絞りの機械的運動に拠っており、かつ従って最大スペクトル分解能が約５ｎｍに制限されるため、放射スペクトルの高速局所測定は２つの装置を用いて条件付きでのみ可能である。

例えば、放射スペクトルが図３ｂに示すように重なっている場合、高いスペクトル分解能が必要である。図３ｂでは２つの自然に生ずる色素ＣＦＰおよびＧＦＰの挙動を示す。これらの色素は、それらが検査される試料に毒性の影響を与えないため生きているプレパラート検査に特に適当である。使用した色素の放射スペクトルの位置が既知でない場合または環境に依存する放射スペクトルにシフトが生ずる場合（図３ｃ）、色素蛍光の高解像度検出が必要である。

波長シフトは数回１０ｎｍに達することがある。一般に、分光計もＬＳＭと組合せて使用して試料の放射スペクトルを測定する。その際、点検出器の代わりに、従来の通常の高分解能分光計が使用される（特許、ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）他、米国特許番号第５,１９２,９８０号）。ただし、これらの分光計は点毎にまたは領域全体にわたる平均としてのみ放射スペクトルを記録可能である。従って、これは一種の分光法である。さらに、試料の通常の弱さの蛍光信号が分光計における大量の個別チャネル（通常、５１２または１０２４の個別チャネル）に分配されるか、または狭い蛍光帯域がスペクトル分解能に対応して検出される。従って、個別チャネル当たりの信号は極めて小さくかつ場合によっては検出不可能である。

従って、本発明の目的はライン検出器を有する蛍光色素の効率的な、スペクトルにより分析される検出のために斬新な方法を提供することである。
上記光学装置では、スペクトル分解能は個別チャネルの数によって測定される。検出器の個別チャネルがすべて同時に読取られるとは限らない場合、個別チャネルの一連の読取りが多重化により従来技術に従って実行される。多重化が試料のスキャンの間の画素滞留時間中に実行される。これには信号が検出される間の個別チャネル当たりの積分時間が多重位置の数だけ低減されるという欠点がある。さらに、広域蛍光スペクトルが測定される場合、信号が読取られない個別チャネルで失われる。別の多重化方法では、個別チャネルの信号が緩和される。次に、個別記憶装置が交互に読取られる。ただし、新しいデータは読取り中記録されない。従って、ライン検出器の読取り速度がこの形式の多重化で低減されることになる。

本発明による方法および装置には次の目的がある。
１．試料のスペクトルにより分析される信号全体が種々の個別チャネル全体にわたる調整可能な加算によって常に検出される。
２．高い信号レベルのため加算チャネルの単純デジタル化が個別チャネル全体にわたる加算によって可能になる。

この方法は画像発生および分析顕微鏡システムで使用可能でなければならない。顕微鏡システムは２００ｎｍまでの光空間分解能を有する、生物学的プレパラートの３次元検査に用いるレーザ走査型顕微鏡、１０ｎｍまでの分解能を有する、表面の高分解能検査に用いる走査型近視野顕微鏡、分子濃度の定量的判定のためのかつ分子拡散を測定するため用いる蛍光相関顕微鏡などの画像発生システムである。色素をスクリーニングするための蛍光検出に基づいた方法も含まれる。

上記システムのすべてにおいて、蛍光色素がプレパラートの特定標識付けのため使用される。上記目的が独立クレームによる方法および装置によって達成される。好ましい別の実施態様は従属クレームに表わされる。

本発明による方法は種々のスペクトル成分全体にわたる加算である蛍光のスペクトル分光検出に基づいている。この目的のため、ドイツ特許番号第７３４６またはドイツ特許番号第７３２３によるメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）またはＡＴＯＦ（音響光学フィルタ）などの、検出放射から励起放射を分離する素子によって（多光子吸収により）走査モジュールまたは顕微鏡における放射光が励起光から分光される。透過光装置では、この形式の素子は完全に省略される。

説明すべき検出器ユニットのブロック図を図４に示す。
共焦点検出器では、試料からの光Ｌは、結像光学系ＰＯによって絞り（ピンホール）ＰＨを通して焦束され、その結果、焦点外で生ずる蛍光が遮断される。ノンデスキャン検出では、絞りは省略される。ここでは、光が角分散素子ＤＩによってそのスペクトル成分に分割される。

角分散素子はプリズム、回折格子および例えば、音響光学素子であってよい。分散素子によってそのスペクトル成分に分光される光はライン検出器ＤＥ上で結像される。このライン検出器ＤＥは波長の関数として放射信号を測定し、それを電気信号に変換する。次により十分に説明する本発明によるビンニングプロセスによって、個別チャネルの接続、即ち、ライン検出器の個別チャネル全体にわたる加算が実行される。さらに、励起波長を抑制するラインフィルタが検出ユニットの前方に配置される。

図４のブロック図に示した検出ユニットの光ビーム経路の考えられる実施形態を図５に示す。
構造は基本的にチェルニーターナー（ＣｚｅｒｎｙＴｕｒｎｅｒ）構造である。共焦点検出では、試料の光Ｌはピンホール光学系ＰＯによって共焦点絞りＰＨを通して焦束される。多光子吸収の場合のノンデスキャン検出では、この絞りは省略される。第１結像ミラーＭ２は蛍光を平行にする。続いて、光は線形格子Ｇ、例えば、１ｍｍ当たり６５１ラインのライン数を有する格子に当たる。回折格子はその波長に対応して様々な方向に光を曲げる。第２結像ミラーＭ１により個別にスペクトル分光された波長成分がライン検出器ＤＥの対応チャネルに焦束される。浜松製作所のＨ７２６０による第２電子増倍管アレイが特に有益である。検出器には３２チャネルがありかつ高感度を有する。

上記実施形態の重ならないスペクトル領域はほぼ３５０ｎｍである。この装置では、重ならないスペクトル領域は、ほぼ１０ｎｍの光分解能をもたらすライン検出器の３２チャネルに均一に分配される。検出チャネル当たりの信号が比較的広域検出スペクトルによりなお比較的大きいため、画像発生システムにユニットを使用することは有利である。蛍光スペクトルのシフトは例えば、回折格子を回転するか、Ｍ１およびＭ２を角度ファイ（ｐｈｉ）だけ回転するおよび／または分光された波長の検出においてｄｌ（図面を参照）だけライン受信器を変位させることによるかまたはそのシフトかによって実行される。

上記に示した光学装置では、スペクトル分解能は個別チャネルの数によって測定される。上記実施形態では、各個別チャネルがほぼ１０ｎｍのスペクトル幅で放射スペクトルのスペクトル帯域を検出する。検出器の個別チャネルがすべて同時に読取られるとは限らない場合、個別チャネル（多重化）の一連の読取りが従来技術によって実行される。

本発明によれば、加算が様々なパターンまたはモデルでは、個別チャネル全体にわたって実行される。
例えば、８チャネルを同時に読取り可能な場合、ここでは前記３２チャネル検出器が使用されているが、どの場合にも、加算は４チャネル以上実行される。次に、合計Ｎ＝３２チャネルをｎ＝４ステップで読取られ、加算ウインドが個別チャネル（（Ｌ／ｎ）＝４／４＝１）づつどの場合にもずらされる。

Ｎ個の個別信号Ｃが対応するライン検出器の種々の個別チャネルをラインにそれぞれ略図的に図６に示す。
個別チャネルの測定された信号はＣ_ｋ、_ｊ（図６にブロックとして示した）によって指示される。ここで、ｋ＝１．．．Ｎはチャネル番号およびｊ＝１．．．ｎ−１はシフトＬ／ｎの倍数である。信号が検出器のエッジに当たらない場合は、図６の斜線で示した検出器の最終個別チャネルはＬ／ｎの幅だけが測定のため使用可能であるような方法で補われる（除外される）。これは計算時に人為的な影響を防止する必要がある。

ｎ個のスペクトル値Ｓ_ｍをＮ回計算する場合は、個別チャネルの合計は次のアルゴリズムに従って減算される。

続いて、この方法で計算したスペクトル値Ｓ（中間値）を表示画像上に、例えば、スペクトルスキャン中グラフによる表現で表わす。
種々の個別チャネルおよび、従ってＣ_ｋ、_ｊの測定値全体にわたる加算を図７に示す。個別チャネルの信号は増幅器Ａによって電圧信号に変換される。続いて、個別電圧信号は画素滞留時間中積分器Ｉで積分される。積分器は積分された信号を基準信号と比較する比較器Ｋに続く。

万一、積分された信号が比較器閾値より小さい場合には、無蛍光信号、または小さ過ぎる蛍光信号は対応個別チャネルで測定されることになる。このような場合には、このチャネルは全信号に対する雑音成分に寄与するだけであるため、個別チャネルの信号は別の処理が行われることはない。この場合、比較器はスイッチを起動しかつ個別チャネルが測定を終了したばかりの画素に対して除外される。従って、スイッチと組み合わされ比較器によって、該当スペクトル領域が測定が終了したばかりの像点に対して自動的に選択される。

続いて、個別チャネルの積分された電圧信号がレジスタＲＥＧ１によってスイッチレジスタＲに接続されたデマルチプレクサＭＰＸによって種々の加算点に切換えられる。８つの種々の加算点ＳＰを図７に示す。レジスタＲＥＧ１がＶ１を通してコンピュータによって制御される。加算パターンまたはモデルが画素に正確な形態で、即ち、数ミクロンの時間周期内で制御される。

各加算点ＳＰが選択個別チャネルの加算を実行する加算増幅器ＳＶの一部を形成する。図７は８つの加算増幅器ＳＶの合計を示す。和信号Ｃ_ｋ、_ｊは続いてアナログ−デジタル変換器ＡＤＣによってデジタル信号に変換されかつさらにコンピュータまたはＤＳＰによって処理される。加算増幅器ＳＶは可変非線形特性でも動作可能である。

上記装置では、積分器回路は個別チャネル信号を検出するため使用された。ただし、光子計数は包含されたいかなる制限もなく個別チャネルでも行われる。
制御線Ｖ１による加算パターンの変更は記録後、または像点、画像ラインまたは画像縦列の走査中、画像に関して実行される。

デマルチプレクサＭＰＸのスイッチング速度に関する要件は調整の形式に依存する。例えば、調整が像点によって実行される場合、走査は像点の積分期間内（即ち、数マイクロ秒）で実行する必要がある。調整が画像によって実行される場合、走査は数マイクロ秒から数秒内で実行する必要がある。個別チャネルの信号の計算はＣ_ｋ、_ｊを使用して上記アルゴリズムで実行される。

上記２つの装置では、積分回路は個別チャネル信号を検出するため使用されることが好ましい。ただし、いかなる制限も包含することなく光子計数も個別チャネルで実行されかつ光子数が合算される。

有利な方法では、本発明によれば、検出された波長分布（λ−スタック）が格納中画像に関連してそれぞれの像点座標Ｘ、ＹまたはＺと相互に関連付けられるかおよび／または追加時間相関が測定された時間−可変シーケンスで実行される。

一光子吸収（ａ）、多光子吸収（ｂ） 共焦点レーザ走査型顕微鏡 放射特性曲線 検出器ユニットブロック図 検出ユニットの光ビーム経路の実施形態 ライン検出器の種々の個別チャネル略図 個別チャネルの加算の実行

符号の説明

ＭＤＢ ダイクロイックビームスプリッタ
ＥＦ ダイクロイックブロックフィルタ
ＰＭＴ 点検出器
ＡＴＯＦ 音響光学フィルタ
ＰＯ 結像光学系
ＰＨ 絞り（ピンホール）
ＤＩ 角分散素子
ＤＥ ライン検出器
Ｍ 結像ミラー
Ｓ スペクトル値
Ａ 増幅器
Ｉ 積分器
Ｋ 比較器
Ｒｅｇ レジスタ
ＭＰＸ デマルチプレクサ
ＳＰ 加算点
ＳＶ 加算増幅器
ＡＤＣ アナログ−デジタル変換器

Claims (12)

1. 試料から後方散乱され、反射されおよび／または蛍光が発せられ、および／または伝導される信号が、試料からの放射がスペクトルにより分離されるように検出器に結像される状態で複数チャネルの空間分解検出器によって検出され、検出チャネルの結合が、読取られてさらに処理される測定値数が検出チャネル数より少ないように行われることを特徴とする照射試料の特性量の光学的取得方法。
2. 結合が加算であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 結合測定値のシフトが実行され、および／または結合検出器チャネルの数が変更されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 結合測定値のシフトが少なくともひとつの検出器チャネルによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 結合測定値のシフトの大きさが可変であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 中間値が、検出器ラインの効率的な読取り目的のためのアルゴリズムによって読取り測定値から測定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ライン検出器に沿った加算パターンのシフトが、マルチプレクサによって実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. スペクトル、スペクトルにより分析される測定が、前記検出器の前の分散素子によって実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. スペクトルにより分離される放射が前記検出器を基準としてシフトされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記分散素子が少なくともひとつの軸の周りに旋回可能であることを特徴とする前記請求項の８項に記載の方法。
11. 前記分散素子がその旋回軸の少なくともひとつで静止したままの状態で、この軸における旋回の空間変化効果が走査ユニットによっておよび／または前記検出器の変位によって達成されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
12. 検出された波長分布（λ−スタック）が格納時それぞれの像点座標Ｘ、ＹまたはＺと画像に関して相互に関連付けられおよび／または追加時間相関が測定された時間−可変シーケンスで実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。

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