JP2003185582A - 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 - Google Patents
照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法Info
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Classifications
-
- G—PHYSICS
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- G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
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- G01J3/2803—Investigating the spectrum using photoelectric array detector
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
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- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ライン検出器を有する蛍光色素の効率的な、ス
ペクトルにより分析される検出のために斬新な方法 【解決手段】スペクトル分解能は個別チャネルの数によ
って測定される。検出器の個別チャネルがすべて同時に
読取られるとは限らない場合、個別チャネルの一連の読
取りが多重化により従来技術に従って実行される。多重
化が試料のスキャンの間の画素滞留時間中に実行され
る。これには信号が検出される間の個別チャネル当たり
の積分時間が多重位置の数だけ低減されるという欠点が
ある。さらに、広域蛍光スペクトルが測定される場合、
信号が読取られない個別チャネルで失われる。別の多重
化方法では、個別チャネルの信号が緩和される。次に、
個別記憶装置が交互に読取られる。ただし、新しいデー
タは読取り中記録されない。従って、ライン検出器の読
取り速度がこの形式の多重化で低減されることになる。
ペクトルにより分析される検出のために斬新な方法 【解決手段】スペクトル分解能は個別チャネルの数によ
って測定される。検出器の個別チャネルがすべて同時に
読取られるとは限らない場合、個別チャネルの一連の読
取りが多重化により従来技術に従って実行される。多重
化が試料のスキャンの間の画素滞留時間中に実行され
る。これには信号が検出される間の個別チャネル当たり
の積分時間が多重位置の数だけ低減されるという欠点が
ある。さらに、広域蛍光スペクトルが測定される場合、
信号が読取られない個別チャネルで失われる。別の多重
化方法では、個別チャネルの信号が緩和される。次に、
個別記憶装置が交互に読取られる。ただし、新しいデー
タは読取り中記録されない。従って、ライン検出器の読
取り速度がこの形式の多重化で低減されることになる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光顕微鏡法およ
び装置に関し、さらに詳細には主として生物学上の試料
の検査、プレパラートおよび関連構成成分を検査するた
めのレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法、および走
査型近視野顕微鏡法に関するものである。これには蛍光
検出（ハイスループットスクリーニング）およびフロー
サイトメータに基づいた活性成分をスクリーニングする
方法が含まれる。
び装置に関し、さらに詳細には主として生物学上の試料
の検査、プレパラートおよび関連構成成分を検査するた
めのレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法、および走
査型近視野顕微鏡法に関するものである。これには蛍光
検出（ハイスループットスクリーニング）およびフロー
サイトメータに基づいた活性成分をスクリーニングする
方法が含まれる。
【０００２】少数の広域スペクトル色素帯の検出から全
スペクトルの同時取得への移行により空間部分的構造に
対するほとんどの分析または機能的試料特性の特定、分
離および相関性または動的プロセスのための新たな可能
性が開けてくる。従って、蛍光スペクトルに重なること
で多数の蛍光体との試料の同時検査が厚い試料の３次元
でまたは空間的構造においても可能となる。検出ユニッ
トのスペクトル分解能は装置によって高められる。
スペクトルの同時取得への移行により空間部分的構造に
対するほとんどの分析または機能的試料特性の特定、分
離および相関性または動的プロセスのための新たな可能
性が開けてくる。従って、蛍光スペクトルに重なること
で多数の蛍光体との試料の同時検査が厚い試料の３次元
でまたは空間的構造においても可能となる。検出ユニッ
トのスペクトル分解能は装置によって高められる。
【０００３】
【従来の技術】生物学的プレパラートを検査する光学顕
微鏡の適用の代表的な利用分野は蛍光顕微鏡（ポウリー
著、「生物学的共焦点顕微鏡ハンドブック」、プレナム
出版、１９９５年（Pawley,Handbook of Biological Co
nfocal Microscopy）,Plenum Press,1995）である。こ
の場合、測定色素は細胞部の特定標識付けをするために
使用される。
微鏡の適用の代表的な利用分野は蛍光顕微鏡（ポウリー
著、「生物学的共焦点顕微鏡ハンドブック」、プレナム
出版、１９９５年（Pawley,Handbook of Biological Co
nfocal Microscopy）,Plenum Press,1995）である。こ
の場合、測定色素は細胞部の特定標識付けをするために
使用される。
【０００４】測定エネルギを有する放射光子が、１個の
光子の吸収により基底状態から励起状態へ色素分子を励
起する。この励起は通常、一光子吸収と呼ばれる（図１
ａ）。この方法で励起された色素分子は各種形態で基底
状態へ戻ることができる。蛍光顕微鏡では、最も重要な
移行は蛍光光子の放射下でのものである。ストークス変
位のため、一般に、励起放射と比較して放射光子の波長
での赤色側へのずれが存在する、即ち、それはより長い
波長を有する。ストークス変位により励起放射から蛍光
放射を分離することが可能になる。
光子の吸収により基底状態から励起状態へ色素分子を励
起する。この励起は通常、一光子吸収と呼ばれる（図１
ａ）。この方法で励起された色素分子は各種形態で基底
状態へ戻ることができる。蛍光顕微鏡では、最も重要な
移行は蛍光光子の放射下でのものである。ストークス変
位のため、一般に、励起放射と比較して放射光子の波長
での赤色側へのずれが存在する、即ち、それはより長い
波長を有する。ストークス変位により励起放射から蛍光
放射を分離することが可能になる。
【０００５】蛍光は、ブロックフィルタと組み合わされ
適当なダイクロイックビームスプリッタによって励起放
射から分離され、別々に観察される。これにより、種々
の色素により着色される個別細胞の描写が可能になる。
ただし、原理的には、プリパレートのいくつかの部分も
特定の方法で結合する種々の色素と同時に着色される
（多重蛍光）。特殊ダイクロイックビームスプリッタを
再び使用して個別色素によって放射された蛍光信号を区
別する。
適当なダイクロイックビームスプリッタによって励起放
射から分離され、別々に観察される。これにより、種々
の色素により着色される個別細胞の描写が可能になる。
ただし、原理的には、プリパレートのいくつかの部分も
特定の方法で結合する種々の色素と同時に着色される
（多重蛍光）。特殊ダイクロイックビームスプリッタを
再び使用して個別色素によって放射された蛍光信号を区
別する。
【０００６】高エネルギー光子を有する色素分子の励起
（一光子吸収）の他に、複数の低エネルギ光子による励
起も可能である（図１ｂ）。個々の光子のエネルギの和
が多数の高エネルギ光子にほぼ対応する。色素のこの形
式の励起は多光子吸収（コール、キーノ著、「共焦点走
査、光学顕微鏡および関連結像システム」、アカデミッ
クプレス、１９９６年（Corle,Kino,"Confocal Scannin
g,Optical Microscopyand Radiated Imaging System"、
Academic Press 1996）として知られている。
（一光子吸収）の他に、複数の低エネルギ光子による励
起も可能である（図１ｂ）。個々の光子のエネルギの和
が多数の高エネルギ光子にほぼ対応する。色素のこの形
式の励起は多光子吸収（コール、キーノ著、「共焦点走
査、光学顕微鏡および関連結像システム」、アカデミッ
クプレス、１９９６年（Corle,Kino,"Confocal Scannin
g,Optical Microscopyand Radiated Imaging System"、
Academic Press 1996）として知られている。
【０００７】ただし、色素放射はこの種の励起によって
は影響されない、即ち、放射スペクトルは多光子吸収に
おける負のストークス変位を受ける、即ち、それは励起
放射と比較してより短い波長を有する。放射スペクトル
からの励起放射の分離が一光子吸収と同じ方法で実行さ
れる。
は影響されない、即ち、放射スペクトルは多光子吸収に
おける負のストークス変位を受ける、即ち、それは励起
放射と比較してより短い波長を有する。放射スペクトル
からの励起放射の分離が一光子吸収と同じ方法で実行さ
れる。
【０００８】共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）（図
２）を参照し実施例を通して次に従来技術をより十分に
説明する。ＬＳＭは基本的に４つのモジュール、即ち、
光源、走査モジュール、検出ユニット、および顕微鏡か
ら構成される。これらのモジュールは以下に十分に説明
する。さらに、ドイツ特許第１９７０２７５３Ａ１号を
参照する。
２）を参照し実施例を通して次に従来技術をより十分に
説明する。ＬＳＭは基本的に４つのモジュール、即ち、
光源、走査モジュール、検出ユニット、および顕微鏡か
ら構成される。これらのモジュールは以下に十分に説明
する。さらに、ドイツ特許第１９７０２７５３Ａ１号を
参照する。
【０００９】ＬＳＭ内ではプレパラートの種々色素の特
定励起に対して種々の波長を有するレーザを使用する。
励起波長の選択は検査される色素の吸収特性によって管
理される。励起放射が光源モジュールから発生する。各
種レーザ（アルゴン、アルゴン／クリプトン、Ｔｉ：Ｓ
ａレーザ）がこの目的のため使用される。さらに、波長
の選択および必要な励起波長の強度調整、例えば、音響
光学結晶を使用して光源モジュールで実行される。レー
ザ放射は続いてファイバまたは適当なミラー装置を介し
て走査モジュールに到達する。
定励起に対して種々の波長を有するレーザを使用する。
励起波長の選択は検査される色素の吸収特性によって管
理される。励起放射が光源モジュールから発生する。各
種レーザ（アルゴン、アルゴン／クリプトン、Ｔｉ：Ｓ
ａレーザ）がこの目的のため使用される。さらに、波長
の選択および必要な励起波長の強度調整、例えば、音響
光学結晶を使用して光源モジュールで実行される。レー
ザ放射は続いてファイバまたは適当なミラー装置を介し
て走査モジュールに到達する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】光源で生成されたレー
ザビームは、スキャナ、走査光学系および円筒レンズを
介して対物レンズによって回折限界態様にてプレパラー
トで焦束される。焦点はｘ−ｙ方向に点ラスタで試料を
スキャンする。試料全体にわたってスキャンする場合の
画素滞留時間は、ほとんどマイクロ秒から数秒未満の範
囲にある。
ザビームは、スキャナ、走査光学系および円筒レンズを
介して対物レンズによって回折限界態様にてプレパラー
トで焦束される。焦点はｘ−ｙ方向に点ラスタで試料を
スキャンする。試料全体にわたってスキャンする場合の
画素滞留時間は、ほとんどマイクロ秒から数秒未満の範
囲にある。
【００１１】蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）で
は、焦点面（試料）および後方の上下に配置された面か
ら放射された光がスキャナを介してダイクロイックビー
ムスプリッタ（ＭＤＢ）に到達する。このダイクロイッ
クビームスプリッタは励起光から蛍光を分離する。続い
て、蛍光が焦点面に共役な面に精度よく配置された絞り
（共焦点絞り／ピンホール）上に焦束される。この方法
では、焦点外の蛍光成分が抑制される。顕微鏡の光分解
能は絞りの寸法を変えることにより調整可能である。励
起放射を再び抑制する別のダイクロイックブロックフィ
ルタ（ＥＦ）が絞りの背後に配置される。ブロックフィ
ルタを通過後、蛍光が点検出器（ＰＭＴ）によって測定
される。
は、焦点面（試料）および後方の上下に配置された面か
ら放射された光がスキャナを介してダイクロイックビー
ムスプリッタ（ＭＤＢ）に到達する。このダイクロイッ
クビームスプリッタは励起光から蛍光を分離する。続い
て、蛍光が焦点面に共役な面に精度よく配置された絞り
（共焦点絞り／ピンホール）上に焦束される。この方法
では、焦点外の蛍光成分が抑制される。顕微鏡の光分解
能は絞りの寸法を変えることにより調整可能である。励
起放射を再び抑制する別のダイクロイックブロックフィ
ルタ（ＥＦ）が絞りの背後に配置される。ブロックフィ
ルタを通過後、蛍光が点検出器（ＰＭＴ）によって測定
される。
【００１２】多光子吸収を使用する場合、励起強度が特
に高い色素蛍光の励起は少量で行われる。この領域は共
焦点装置を使用する場合、検出された領域とくらべて無
視できるほどわずかに大きいだけである。従って、共焦
点絞りは省略でき、かつ検出は対物レンズの直後で実行
される（ノンデスキャン検出）。多光子吸収によって励
起された色素蛍光を検出する別の装置では、デスキャン
検出が再び実行されるが、今度は対物レンズの瞳が検出
ユニットに結像される（非共焦点デスキャン検出）。
に高い色素蛍光の励起は少量で行われる。この領域は共
焦点装置を使用する場合、検出された領域とくらべて無
視できるほどわずかに大きいだけである。従って、共焦
点絞りは省略でき、かつ検出は対物レンズの直後で実行
される（ノンデスキャン検出）。多光子吸収によって励
起された色素蛍光を検出する別の装置では、デスキャン
検出が再び実行されるが、今度は対物レンズの瞳が検出
ユニットに結像される（非共焦点デスキャン検出）。
【００１３】３次元で照射された画像から、対物レンズ
の焦点面に配置された面（光切片）のみが対応する一光
子吸収または多光子吸収と関連して２つの検出装置によ
って再生される。試料の様々な深さでｘｙ平面方向に複
数の光切片を記録またはグラフにすることにより、引き
続いて試料の３次元画像がコンピュータでサポートされ
て発生される。
の焦点面に配置された面（光切片）のみが対応する一光
子吸収または多光子吸収と関連して２つの検出装置によ
って再生される。試料の様々な深さでｘｙ平面方向に複
数の光切片を記録またはグラフにすることにより、引き
続いて試料の３次元画像がコンピュータでサポートされ
て発生される。
【００１４】従って、ＬＳＭは厚いプレパラートの検査
には適当である。励起波長はその特定の吸収特性を有す
る使用色素によって測定される。色素の放射特性に適合
したダイクロイックフィルタにより確実にそれぞれの色
素によって放射された蛍光のみが点検出器によって測定
される。
には適当である。励起波長はその特定の吸収特性を有す
る使用色素によって測定される。色素の放射特性に適合
したダイクロイックフィルタにより確実にそれぞれの色
素によって放射された蛍光のみが点検出器によって測定
される。
【００１５】一般に、バイオ医学的適用では、多数の様
々な細胞領域が種々の色素（多重蛍光）によって同時に
標識付けられる。従来技術では、個別色素が種々の吸収
特性または放射特性（スペクトル）（図３ａ）に基づい
て別々に検出される。例えば、放射信号が種々の色素
（１〜４）について波長全体にわたってグラフにされ
る。
々な細胞領域が種々の色素（多重蛍光）によって同時に
標識付けられる。従来技術では、個別色素が種々の吸収
特性または放射特性（スペクトル）（図３ａ）に基づい
て別々に検出される。例えば、放射信号が種々の色素
（１〜４）について波長全体にわたってグラフにされ
る。
【００１６】別々に検出する場合は、複数の色素の蛍光
の追加分光が、２次ビームスプリッタ（ＤＢＳ）により
実行され、かつ個別色素放射の別々の検出が、各種点検
出器（ＰＭＴｘ）で実行される。上記装置では、使用者
が対応する新しい色素特性に対する検出および励起に柔
軟に適合することが不可能である。それよりむしろ、新
しいダイクロイックビームスプリッタおよびブロックフ
ィルタを（新しい）色素毎に作成する必要がある。
の追加分光が、２次ビームスプリッタ（ＤＢＳ）により
実行され、かつ個別色素放射の別々の検出が、各種点検
出器（ＰＭＴｘ）で実行される。上記装置では、使用者
が対応する新しい色素特性に対する検出および励起に柔
軟に適合することが不可能である。それよりむしろ、新
しいダイクロイックビームスプリッタおよびブロックフ
ィルタを（新しい）色素毎に作成する必要がある。
【００１７】既知の装置では、蛍光がプリズムによって
スペクトルに分光される。本方法は使用したフィルタの
特性が調整可能である点においてのみダイクロイックフ
ィルタを有する上記装置とは異なる。ただし、点検出器
により色素の放射帯域を記録することはなお好ましい。
放射範囲の調整がダイクロイックフィルタおよび絞りの
機械的運動に拠っており、かつ従って最大スペクトル分
解能が約５ｎｍに制限されるため、放射スペクトルの高
速局所測定は２つの装置を用いて条件付きでのみ可能で
ある。
スペクトルに分光される。本方法は使用したフィルタの
特性が調整可能である点においてのみダイクロイックフ
ィルタを有する上記装置とは異なる。ただし、点検出器
により色素の放射帯域を記録することはなお好ましい。
放射範囲の調整がダイクロイックフィルタおよび絞りの
機械的運動に拠っており、かつ従って最大スペクトル分
解能が約５ｎｍに制限されるため、放射スペクトルの高
速局所測定は２つの装置を用いて条件付きでのみ可能で
ある。
【００１８】例えば、放射スペクトルが図３ｂに示すよ
うに重なっている場合、高いスペクトル分解能が必要で
ある。図３ｂでは２つの自然に生ずる色素ＣＦＰおよび
ＧＦＰの挙動を示す。これらの色素は、それらが検査さ
れる試料に毒性の影響を与えないため生きているプレパ
ラート検査に特に適当である。使用した色素の放射スペ
クトルの位置が既知でない場合または環境に依存する放
射スペクトルにシフトが生ずる場合（図３ｃ）、色素蛍
光の高解像度検出が必要である。
うに重なっている場合、高いスペクトル分解能が必要で
ある。図３ｂでは２つの自然に生ずる色素ＣＦＰおよび
ＧＦＰの挙動を示す。これらの色素は、それらが検査さ
れる試料に毒性の影響を与えないため生きているプレパ
ラート検査に特に適当である。使用した色素の放射スペ
クトルの位置が既知でない場合または環境に依存する放
射スペクトルにシフトが生ずる場合（図３ｃ）、色素蛍
光の高解像度検出が必要である。
【００１９】波長シフトは数回１０ｎｍに達することが
ある。一般に、分光計もＬＳＭと組合せて使用して試料
の放射スペクトルを測定する。その際、点検出器の代わ
りに、従来の通常の高分解能分光計が使用される（特
許、ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）他、米国特許番号第５,
１９２,９８０号）。ただし、これらの分光計は点毎に
または領域全体にわたる平均としてのみ放射スペクトル
を記録可能である。従って、これは一種の分光法であ
る。さらに、試料の通常の弱さの蛍光信号が分光計にお
ける大量の個別チャネル（通常、５１２または１０２４
の個別チャネル）に分配されるか、または狭い蛍光帯域
がスペクトル分解能に対応して検出される。従って、個
別チャネル当たりの信号は極めて小さくかつ場合によっ
ては検出不可能である。
ある。一般に、分光計もＬＳＭと組合せて使用して試料
の放射スペクトルを測定する。その際、点検出器の代わ
りに、従来の通常の高分解能分光計が使用される（特
許、ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）他、米国特許番号第５,
１９２,９８０号）。ただし、これらの分光計は点毎に
または領域全体にわたる平均としてのみ放射スペクトル
を記録可能である。従って、これは一種の分光法であ
る。さらに、試料の通常の弱さの蛍光信号が分光計にお
ける大量の個別チャネル（通常、５１２または１０２４
の個別チャネル）に分配されるか、または狭い蛍光帯域
がスペクトル分解能に対応して検出される。従って、個
別チャネル当たりの信号は極めて小さくかつ場合によっ
ては検出不可能である。
【００２０】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の目的は
ライン検出器を有する蛍光色素の効率的な、スペクトル
により分析される検出のために斬新な方法を提供するこ
とである。上記光学装置では、スペクトル分解能は個別
チャネルの数によって測定される。検出器の個別チャネ
ルがすべて同時に読取られるとは限らない場合、個別チ
ャネルの一連の読取りが多重化により従来技術に従って
実行される。多重化が試料のスキャンの間の画素滞留時
間中に実行される。これには信号が検出される間の個別
チャネル当たりの積分時間が多重位置の数だけ低減され
るという欠点がある。さらに、広域蛍光スペクトルが測
定される場合、信号が読取られない個別チャネルで失わ
れる。別の多重化方法では、個別チャネルの信号が緩和
される。次に、個別記憶装置が交互に読取られる。ただ
し、新しいデータは読取り中記録されない。従って、ラ
イン検出器の読取り速度がこの形式の多重化で低減され
ることになる。
ライン検出器を有する蛍光色素の効率的な、スペクトル
により分析される検出のために斬新な方法を提供するこ
とである。上記光学装置では、スペクトル分解能は個別
チャネルの数によって測定される。検出器の個別チャネ
ルがすべて同時に読取られるとは限らない場合、個別チ
ャネルの一連の読取りが多重化により従来技術に従って
実行される。多重化が試料のスキャンの間の画素滞留時
間中に実行される。これには信号が検出される間の個別
チャネル当たりの積分時間が多重位置の数だけ低減され
るという欠点がある。さらに、広域蛍光スペクトルが測
定される場合、信号が読取られない個別チャネルで失わ
れる。別の多重化方法では、個別チャネルの信号が緩和
される。次に、個別記憶装置が交互に読取られる。ただ
し、新しいデータは読取り中記録されない。従って、ラ
イン検出器の読取り速度がこの形式の多重化で低減され
ることになる。
【００２１】本発明による方法および装置には次の目的
がある。 １．試料のスペクトルにより分析される信号全体が種々
の個別チャネル全体にわたる調整可能な加算によって常
に検出される。 ２．高い信号レベルのため加算チャネルの単純デジタル
化が個別チャネル全体にわたる加算によって可能にな
る。
がある。 １．試料のスペクトルにより分析される信号全体が種々
の個別チャネル全体にわたる調整可能な加算によって常
に検出される。 ２．高い信号レベルのため加算チャネルの単純デジタル
化が個別チャネル全体にわたる加算によって可能にな
る。
【００２２】この方法は画像発生および分析顕微鏡シス
テムで使用可能でなければならない。顕微鏡システムは
２００ｎｍまでの光空間分解能を有する、生物学的プレ
パラートの３次元検査に用いるレーザ走査型顕微鏡、１
０ｎｍまでの分解能を有する、表面の高分解能検査に用
いる走査型近視野顕微鏡、分子濃度の定量的判定のため
のかつ分子拡散を測定するため用いる蛍光相関顕微鏡な
どの画像発生システムである。色素をスクリーニングす
るための蛍光検出に基づいた方法も含まれる。上記シス
テムのすべてにおいて、蛍光色素がプレパラートの特定
標識付けのため使用される。上記目的が独立クレームに
よる方法および装置によって達成される。好ましい別の
実施態様は従属クレームに表わされる。
テムで使用可能でなければならない。顕微鏡システムは
２００ｎｍまでの光空間分解能を有する、生物学的プレ
パラートの３次元検査に用いるレーザ走査型顕微鏡、１
０ｎｍまでの分解能を有する、表面の高分解能検査に用
いる走査型近視野顕微鏡、分子濃度の定量的判定のため
のかつ分子拡散を測定するため用いる蛍光相関顕微鏡な
どの画像発生システムである。色素をスクリーニングす
るための蛍光検出に基づいた方法も含まれる。上記シス
テムのすべてにおいて、蛍光色素がプレパラートの特定
標識付けのため使用される。上記目的が独立クレームに
よる方法および装置によって達成される。好ましい別の
実施態様は従属クレームに表わされる。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明による方法は種々のスペク
トル成分全体にわたる加算である蛍光のスペクトル分光
検出に基づいている。この目的のため、ドイツ特許番号
第７３４６またはドイツ特許番号第７３２３によるメイ
ンカラースプリッタ（ＭＤＢ）またはＡＴＯＦ（音響光
学フィルタ）などの、検出放射から励起放射を分離する
素子によって（多光子吸収により）走査モジュールまた
は顕微鏡における放射光が励起光から分光される。透過
光装置では、この形式の素子は完全に省略される。
トル成分全体にわたる加算である蛍光のスペクトル分光
検出に基づいている。この目的のため、ドイツ特許番号
第７３４６またはドイツ特許番号第７３２３によるメイ
ンカラースプリッタ（ＭＤＢ）またはＡＴＯＦ（音響光
学フィルタ）などの、検出放射から励起放射を分離する
素子によって（多光子吸収により）走査モジュールまた
は顕微鏡における放射光が励起光から分光される。透過
光装置では、この形式の素子は完全に省略される。
【００２４】説明すべき検出器ユニットのブロック図を
図４に示す。共焦点検出器では、試料からの光Ｌは、結
像光学系ＰＯによって絞り（ピンホール）ＰＨを通して
焦束され、その結果、焦点外で生ずる蛍光が遮断され
る。ノンデスキャン検出では、絞りは省略される。ここ
では、光が角分散素子ＤＩによってそのスペクトル成分
に分割される。
図４に示す。共焦点検出器では、試料からの光Ｌは、結
像光学系ＰＯによって絞り（ピンホール）ＰＨを通して
焦束され、その結果、焦点外で生ずる蛍光が遮断され
る。ノンデスキャン検出では、絞りは省略される。ここ
では、光が角分散素子ＤＩによってそのスペクトル成分
に分割される。
【００２５】角分散素子はプリズム、回折格子および例
えば、音響光学素子であってよい。分散素子によってそ
のスペクトル成分に分光される光はライン検出器ＤＥ上
で結像される。このライン検出器ＤＥは波長の関数とし
て放射信号を測定し、それを電気信号に変換する。次に
より十分に説明する本発明によるビンニングプロセスに
よって、個別チャネルの接続、即ち、ライン検出器の個
別チャネル全体にわたる加算が実行される。さらに、励
起波長を抑制するラインフィルタが検出ユニットの前方
に配置される。
えば、音響光学素子であってよい。分散素子によってそ
のスペクトル成分に分光される光はライン検出器ＤＥ上
で結像される。このライン検出器ＤＥは波長の関数とし
て放射信号を測定し、それを電気信号に変換する。次に
より十分に説明する本発明によるビンニングプロセスに
よって、個別チャネルの接続、即ち、ライン検出器の個
別チャネル全体にわたる加算が実行される。さらに、励
起波長を抑制するラインフィルタが検出ユニットの前方
に配置される。
【００２６】図４のブロック図に示した検出ユニットの
光ビーム経路の考えられる実施形態を図５に示す。構造
は基本的にチェルニーターナー（Ｃｚｅｒｎｙ Ｔｕｒ
ｎｅｒ）構造である。共焦点検出では、試料の光Ｌはピ
ンホール光学系ＰＯによって共焦点絞りＰＨを通して焦
束される。多光子吸収の場合のノンデスキャン検出で
は、この絞りは省略される。第１結像ミラーＭ２は蛍光
を平行にする。続いて、光は線形格子Ｇ、例えば、１ｍ
ｍ当たり６５１ラインのライン数を有する格子に当た
る。回折格子はその波長に対応して様々な方向に光を曲
げる。第２結像ミラーＭ１により個別にスペクトル分光
された波長成分がライン検出器ＤＥの対応チャネルに焦
束される。浜松製作所のＨ７２６０による第２電子増倍
管アレイが特に有益である。検出器には３２チャネルが
ありかつ高感度を有する。
光ビーム経路の考えられる実施形態を図５に示す。構造
は基本的にチェルニーターナー（Ｃｚｅｒｎｙ Ｔｕｒ
ｎｅｒ）構造である。共焦点検出では、試料の光Ｌはピ
ンホール光学系ＰＯによって共焦点絞りＰＨを通して焦
束される。多光子吸収の場合のノンデスキャン検出で
は、この絞りは省略される。第１結像ミラーＭ２は蛍光
を平行にする。続いて、光は線形格子Ｇ、例えば、１ｍ
ｍ当たり６５１ラインのライン数を有する格子に当た
る。回折格子はその波長に対応して様々な方向に光を曲
げる。第２結像ミラーＭ１により個別にスペクトル分光
された波長成分がライン検出器ＤＥの対応チャネルに焦
束される。浜松製作所のＨ７２６０による第２電子増倍
管アレイが特に有益である。検出器には３２チャネルが
ありかつ高感度を有する。
【００２７】上記実施形態の重ならないスペクトル領域
はほぼ３５０ｎｍである。この装置では、重ならないス
ペクトル領域は、ほぼ１０ｎｍの光分解能をもたらすラ
イン検出器の３２チャネルに均一に分配される。検出チ
ャネル当たりの信号が比較的広域検出スペクトルにより
なお比較的大きいため、画像発生システムにユニットを
使用することは有利である。蛍光スペクトルのシフトは
例えば、回折格子を回転するか、Ｍ１およびＭ２を角度
ファイ（ｐｈｉ）だけ回転するおよび／または分光され
た波長の検出においてｄｌ（図面を参照）だけライン受
信器を変位させることによるかまたはそのシフトかによ
って実行される。
はほぼ３５０ｎｍである。この装置では、重ならないス
ペクトル領域は、ほぼ１０ｎｍの光分解能をもたらすラ
イン検出器の３２チャネルに均一に分配される。検出チ
ャネル当たりの信号が比較的広域検出スペクトルにより
なお比較的大きいため、画像発生システムにユニットを
使用することは有利である。蛍光スペクトルのシフトは
例えば、回折格子を回転するか、Ｍ１およびＭ２を角度
ファイ（ｐｈｉ）だけ回転するおよび／または分光され
た波長の検出においてｄｌ（図面を参照）だけライン受
信器を変位させることによるかまたはそのシフトかによ
って実行される。
【００２８】上記に示した光学装置では、スペクトル分
解能は個別チャネルの数によって測定される。上記実施
形態では、各個別チャネルがほぼ１０ｎｍのスペクトル
幅で放射スペクトルのスペクトル帯域を検出する。検出
器の個別チャネルがすべて同時に読取られるとは限らな
い場合、個別チャネル（多重化）の一連の読取りが従来
技術によって実行される。本発明によれば、加算が様々
なパターンまたはモデルでは、個別チャネル全体にわた
って実行される。例えば、８チャネルを同時に読取り可
能な場合、ここでは前記３２チャネル検出器が使用され
ているが、どの場合にも、加算は４チャネル以上実行さ
れる。次に、合計Ｎ＝３２チャネルをｎ＝４ステップで
読取られ、加算ウインドが個別チャネル（（Ｌ／ｎ）＝
４／４＝１）づつどの場合にもずらされる。
解能は個別チャネルの数によって測定される。上記実施
形態では、各個別チャネルがほぼ１０ｎｍのスペクトル
幅で放射スペクトルのスペクトル帯域を検出する。検出
器の個別チャネルがすべて同時に読取られるとは限らな
い場合、個別チャネル（多重化）の一連の読取りが従来
技術によって実行される。本発明によれば、加算が様々
なパターンまたはモデルでは、個別チャネル全体にわた
って実行される。例えば、８チャネルを同時に読取り可
能な場合、ここでは前記３２チャネル検出器が使用され
ているが、どの場合にも、加算は４チャネル以上実行さ
れる。次に、合計Ｎ＝３２チャネルをｎ＝４ステップで
読取られ、加算ウインドが個別チャネル（（Ｌ／ｎ）＝
４／４＝１）づつどの場合にもずらされる。
【００２９】Ｎ個の個別信号Ｃが対応するライン検出器
の種々の個別チャネルをラインにそれぞれ略図的に図６
に示す。個別チャネルの測定された信号はＣｋ、ｊ（図
６にブロックとして示した）によって指示される。ここ
で、ｋ＝１．．．Ｎはチャネル番号およびｊ＝１．．．
ｎ−１はシフトＬ／ｎの倍数である。信号が検出器のエ
ッジに当たらない場合は、図６の斜線で示した検出器の
最終個別チャネルはＬ／ｎの幅だけが測定のため使用可
能であるような方法で補われる（除外される）。これは
計算時に人為的な影響を防止する必要がある。
の種々の個別チャネルをラインにそれぞれ略図的に図６
に示す。個別チャネルの測定された信号はＣｋ、ｊ（図
６にブロックとして示した）によって指示される。ここ
で、ｋ＝１．．．Ｎはチャネル番号およびｊ＝１．．．
ｎ−１はシフトＬ／ｎの倍数である。信号が検出器のエ
ッジに当たらない場合は、図６の斜線で示した検出器の
最終個別チャネルはＬ／ｎの幅だけが測定のため使用可
能であるような方法で補われる（除外される）。これは
計算時に人為的な影響を防止する必要がある。
【００３０】ｎ個のスペクトル値ＳｍをＮ回計算する場
合は、個別チャネルの合計は次のアルゴリズムに従って
減算される。
合は、個別チャネルの合計は次のアルゴリズムに従って
減算される。
【数１】
【００３１】続いて、この方法で計算したスペクトル値
Ｓ（中間値）を表示画像上に、例えば、スペクトルスキ
ャン中グラフによる表現で表わす。種々の個別チャネル
および、従ってＣｋ、ｊの測定値全体にわたる加算を図
７に示す。個別チャネルの信号は増幅器Ａによって電圧
信号に変換される。続いて、個別電圧信号は画素滞留時
間中積分器Ｉで積分される。積分器は積分された信号を
基準信号と比較する比較器Ｋに続く。
Ｓ（中間値）を表示画像上に、例えば、スペクトルスキ
ャン中グラフによる表現で表わす。種々の個別チャネル
および、従ってＣｋ、ｊの測定値全体にわたる加算を図
７に示す。個別チャネルの信号は増幅器Ａによって電圧
信号に変換される。続いて、個別電圧信号は画素滞留時
間中積分器Ｉで積分される。積分器は積分された信号を
基準信号と比較する比較器Ｋに続く。
【００３２】万一、積分された信号が比較器閾値より小
さい場合には、無蛍光信号、または小さ過ぎる蛍光信号
は対応個別チャネルで測定されることになる。このよう
な場合には、このチャネルは全信号に対する雑音成分に
寄与するだけであるため、個別チャネルの信号は別の処
理が行われることはない。この場合、比較器はスイッチ
を起動しかつ個別チャネルが測定を終了したばかりの画
素に対して除外される。従って、スイッチと組み合わさ
れ比較器によって、該当スペクトル領域が測定が終了し
たばかりの像点に対して自動的に選択される。
さい場合には、無蛍光信号、または小さ過ぎる蛍光信号
は対応個別チャネルで測定されることになる。このよう
な場合には、このチャネルは全信号に対する雑音成分に
寄与するだけであるため、個別チャネルの信号は別の処
理が行われることはない。この場合、比較器はスイッチ
を起動しかつ個別チャネルが測定を終了したばかりの画
素に対して除外される。従って、スイッチと組み合わさ
れ比較器によって、該当スペクトル領域が測定が終了し
たばかりの像点に対して自動的に選択される。
【００３３】続いて、個別チャネルの積分された電圧信
号がレジスタＲＥＧ１によってスイッチレジスタＲに接
続されたデマルチプレクサＭＰＸによって種々の加算点
に切換えられる。８つの種々の加算点ＳＰを図７に示
す。レジスタＲＥＧ１がＶ１を通してコンピュータによ
って制御される。加算パターンまたはモデルが画素に正
確な形態で、即ち、数ミクロンの時間周期内で制御され
る。各加算点ＳＰが選択個別チャネルの加算を実行する
加算増幅器ＳＶの一部を形成する。図７は８つの加算増
幅器ＳＶの合計を示す。和信号Ｃｋ、ｊは続いてアナロ
グ−デジタル変換器ＡＤＣによってデジタル信号に変換
されかつさらにコンピュータまたはＤＳＰによって処理
される。加算増幅器ＳＶは可変非線形特性でも動作可能
である。
号がレジスタＲＥＧ１によってスイッチレジスタＲに接
続されたデマルチプレクサＭＰＸによって種々の加算点
に切換えられる。８つの種々の加算点ＳＰを図７に示
す。レジスタＲＥＧ１がＶ１を通してコンピュータによ
って制御される。加算パターンまたはモデルが画素に正
確な形態で、即ち、数ミクロンの時間周期内で制御され
る。各加算点ＳＰが選択個別チャネルの加算を実行する
加算増幅器ＳＶの一部を形成する。図７は８つの加算増
幅器ＳＶの合計を示す。和信号Ｃｋ、ｊは続いてアナロ
グ−デジタル変換器ＡＤＣによってデジタル信号に変換
されかつさらにコンピュータまたはＤＳＰによって処理
される。加算増幅器ＳＶは可変非線形特性でも動作可能
である。
【００３４】上記装置では、積分器回路は個別チャネル
信号を検出するため使用された。ただし、光子計数は包
含されたいかなる制限もなく個別チャネルでも行われ
る。制御線Ｖ１による加算パターンの変更は記録後、ま
たは像点、画像ラインまたは画像縦列の走査中、画像に
関して実行される。
信号を検出するため使用された。ただし、光子計数は包
含されたいかなる制限もなく個別チャネルでも行われ
る。制御線Ｖ１による加算パターンの変更は記録後、ま
たは像点、画像ラインまたは画像縦列の走査中、画像に
関して実行される。
【００３５】デマルチプレクサＭＰＸのスイッチング速
度に関する要件は調整の形式に依存する。例えば、調整
が像点によって実行される場合、走査は像点の積分期間
内（即ち、数マイクロ秒）で実行する必要がある。調整
が画像によって実行される場合、走査は数マイクロ秒か
ら数秒内で実行する必要がある。個別チャネルの信号の
計算はＣｋ、ｊを使用して上記アルゴリズムで実行され
る。
度に関する要件は調整の形式に依存する。例えば、調整
が像点によって実行される場合、走査は像点の積分期間
内（即ち、数マイクロ秒）で実行する必要がある。調整
が画像によって実行される場合、走査は数マイクロ秒か
ら数秒内で実行する必要がある。個別チャネルの信号の
計算はＣｋ、ｊを使用して上記アルゴリズムで実行され
る。
【００３６】上記２つの装置では、積分回路は個別チャ
ネル信号を検出するため使用されることが好ましい。た
だし、いかなる制限も包含することなく光子計数も個別
チャネルで実行されかつ光子数が合算される。有利な方
法では、本発明によれば、検出された波長分布（λ−ス
タック）が格納中画像に関連してそれぞれの像点座標
Ｘ、ＹまたはＺと相互に関連付けられるかおよび／また
は追加時間相関が測定された時間−可変シーケンスで実
行される。
ネル信号を検出するため使用されることが好ましい。た
だし、いかなる制限も包含することなく光子計数も個別
チャネルで実行されかつ光子数が合算される。有利な方
法では、本発明によれば、検出された波長分布（λ−ス
タック）が格納中画像に関連してそれぞれの像点座標
Ｘ、ＹまたはＺと相互に関連付けられるかおよび／また
は追加時間相関が測定された時間−可変シーケンスで実
行される。
【図１】一光子吸収（ａ）、多光子吸収（ｂ）
【図２】共焦点レーザ走査型顕微鏡
【図３】放射特性曲線
【図４】検出器ユニットブロック図
【図５】検出ユニットの光ビーム経路の実施形態
【図６】ライン検出器の種々の個別チャネル略図
【図７】個別チャネルの加算の実行
ＭＤＢ ダイクロイックビームスプリッタ
ＥＦ ダイクロイックブロックフィルタ
ＰＭＴ 点検出器
ＡＴＯＦ 音響光学フィルタ
ＰＯ 結像光学系
ＰＨ 絞り（ピンホール）
ＤＩ 角分散素子
ＤＥ ライン検出器
Ｍ 結像ミラー
Ｓ スペクトル値
Ａ 増幅器
Ｉ 積分器
Ｋ 比較器
Ｒｅｇ レジスタ
ＭＰＸ デマルチプレクサ
ＳＰ 加算点
ＳＶ 加算増幅器
ＡＤＣ アナログ−デジタル変換器
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2G020 AA04 CA01 CB04 CB23 CC02
CC07 CC13 CC26 CC28 CC30
CC47 CC55 CC63 CD03 CD06
CD14 CD23
2G043 AA01 CA04 EA01 FA02 FA06
GA01 GB01 HA01 HA02 HA05
HA09 JA03 JA04 KA02 KA05
LA02 NA05
Claims (12)
- 【請求項１】試料から後方散乱され、反射されおよび／
または蛍光が発せられ、および／または伝導される信号
が、試料からの放射がスペクトルにより分離されるよう
に検出器に結像される状態で複数チャネルの空間分解検
出器によって検出され、検出チャネルの結合が、読取ら
れてさらに処理される測定値数が検出チャネル数より少
ないように行われることを特徴とする照射試料の特性量
の光学的取得方法。 - 【請求項２】結合が加算であることを特徴とする請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】結合測定値のシフトが実行され、および／
または結合検出器チャネルの数が変更されることを特徴
とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】結合測定値のシフトが少なくともひとつの
検出器チャネルによって行われることを特徴とする前記
請求項の１項に記載の方法。 - 【請求項５】結合測定値のシフトの大きさが可変である
ことを特徴とする前記請求項の１項に記載の方法。 - 【請求項６】中間値が、検出器ラインの効率的な読取り
目的のためのアルゴリズムによって読取り測定値から測
定されることを特徴とする前記請求項の１項に記載の方
法。 - 【請求項７】ライン検出器に沿った加算パターンのシフ
トが、マルチプレクサによって実行されることを特徴と
する前記請求項の１項に記載の方法。 - 【請求項８】スペクトル、スペクトルにより分析される
測定が、検出器の前の分散素子によって実行されること
を特徴とする前記請求項の１項に記載の方法。 - 【請求項９】スペクトルにより分離される放射が検出器
を基準としてシフトされることを特徴とする前記請求項
の１項に記載の方法。 - 【請求項１０】分散素子が少なくともひとつの軸の周り
に旋回可能であることを特徴とする前記請求項の１項に
記載の方法。 - 【請求項１１】分散素子がその旋回軸の少なくともひと
つで静止したままの状態で、この軸における旋回の空間
変化効果が走査ユニットによっておよび／または検出器
の変位によって達成されることを特徴とする前記請求項
の１項に記載の方法。 - 【請求項１２】検出された波長分布（λ−スタック）が
格納時それぞれの像点座標Ｘ、ＹまたはＺと画像に関し
て相互に関連付けられおよび／または追加時間相関が測
定された時間−可変シーケンスで実行されることを特徴
とする前記請求項の１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10151216A DE10151216A1 (de) | 2001-10-16 | 2001-10-16 | Verfahren zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen einer beleuchteten Probe |
| DE10151216.3 | 2001-10-16 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005377505A Division JP2006098419A (ja) | 2001-10-16 | 2005-12-28 | 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003185582A true JP2003185582A (ja) | 2003-07-03 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002296999A Pending JP2003185582A (ja) | 2001-10-16 | 2002-10-10 | 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 |
| JP2005377505A Pending JP2006098419A (ja) | 2001-10-16 | 2005-12-28 | 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 |
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|---|---|
| US (1) | US6703621B2 (ja) |
| EP (1) | EP1302804A3 (ja) |
| JP (2) | JP2003185582A (ja) |
| DE (1) | DE10151216A1 (ja) |
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