JP2003185582A - 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 - Google Patents
照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法Info
- Publication number
- JP2003185582A JP2003185582A JP2002296999A JP2002296999A JP2003185582A JP 2003185582 A JP2003185582 A JP 2003185582A JP 2002296999 A JP2002296999 A JP 2002296999A JP 2002296999 A JP2002296999 A JP 2002296999A JP 2003185582 A JP2003185582 A JP 2003185582A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- detector
- individual
- spectrum
- signal
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 14
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 10
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 abstract 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 abstract 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 abstract 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 29
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 23
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 17
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 9
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 3
- 102100023882 Endoribonuclease ZC3H12A Human genes 0.000 description 2
- 101710112715 Endoribonuclease ZC3H12A Proteins 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- QGVYYLZOAMMKAH-UHFFFAOYSA-N pegnivacogin Chemical compound COCCOC(=O)NCCCCC(NC(=O)OCCOC)C(=O)NCCCCCCOP(=O)(O)O QGVYYLZOAMMKAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 101100321669 Fagopyrum esculentum FA02 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000801109 Homo sapiens Transmembrane protein 131 Proteins 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102100033700 Transmembrane protein 131 Human genes 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000002060 fluorescence correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 229910052743 krypton Inorganic materials 0.000 description 1
- DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N krypton atom Chemical compound [Kr] DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 238000001758 scanning near-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
- G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
- G01J3/28—Investigating the spectrum
- G01J3/2803—Investigating the spectrum using photoelectric array detector
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Spectrometry And Color Measurement (AREA)
Abstract
ペクトルにより分析される検出のために斬新な方法 【解決手段】スペクトル分解能は個別チャネルの数によ
って測定される。検出器の個別チャネルがすべて同時に
読取られるとは限らない場合、個別チャネルの一連の読
取りが多重化により従来技術に従って実行される。多重
化が試料のスキャンの間の画素滞留時間中に実行され
る。これには信号が検出される間の個別チャネル当たり
の積分時間が多重位置の数だけ低減されるという欠点が
ある。さらに、広域蛍光スペクトルが測定される場合、
信号が読取られない個別チャネルで失われる。別の多重
化方法では、個別チャネルの信号が緩和される。次に、
個別記憶装置が交互に読取られる。ただし、新しいデー
タは読取り中記録されない。従って、ライン検出器の読
取り速度がこの形式の多重化で低減されることになる。
Description
び装置に関し、さらに詳細には主として生物学上の試料
の検査、プレパラートおよび関連構成成分を検査するた
めのレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法、および走
査型近視野顕微鏡法に関するものである。これには蛍光
検出(ハイスループットスクリーニング)およびフロー
サイトメータに基づいた活性成分をスクリーニングする
方法が含まれる。
スペクトルの同時取得への移行により空間部分的構造に
対するほとんどの分析または機能的試料特性の特定、分
離および相関性または動的プロセスのための新たな可能
性が開けてくる。従って、蛍光スペクトルに重なること
で多数の蛍光体との試料の同時検査が厚い試料の3次元
でまたは空間的構造においても可能となる。検出ユニッ
トのスペクトル分解能は装置によって高められる。
微鏡の適用の代表的な利用分野は蛍光顕微鏡(ポウリー
著、「生物学的共焦点顕微鏡ハンドブック」、プレナム
出版、1995年(Pawley,Handbook of Biological Co
nfocal Microscopy),Plenum Press,1995)である。こ
の場合、測定色素は細胞部の特定標識付けをするために
使用される。
光子の吸収により基底状態から励起状態へ色素分子を励
起する。この励起は通常、一光子吸収と呼ばれる(図1
a)。この方法で励起された色素分子は各種形態で基底
状態へ戻ることができる。蛍光顕微鏡では、最も重要な
移行は蛍光光子の放射下でのものである。ストークス変
位のため、一般に、励起放射と比較して放射光子の波長
での赤色側へのずれが存在する、即ち、それはより長い
波長を有する。ストークス変位により励起放射から蛍光
放射を分離することが可能になる。
適当なダイクロイックビームスプリッタによって励起放
射から分離され、別々に観察される。これにより、種々
の色素により着色される個別細胞の描写が可能になる。
ただし、原理的には、プリパレートのいくつかの部分も
特定の方法で結合する種々の色素と同時に着色される
(多重蛍光)。特殊ダイクロイックビームスプリッタを
再び使用して個別色素によって放射された蛍光信号を区
別する。
(一光子吸収)の他に、複数の低エネルギ光子による励
起も可能である(図1b)。個々の光子のエネルギの和
が多数の高エネルギ光子にほぼ対応する。色素のこの形
式の励起は多光子吸収(コール、キーノ著、「共焦点走
査、光学顕微鏡および関連結像システム」、アカデミッ
クプレス、1996年(Corle,Kino,"Confocal Scannin
g,Optical Microscopyand Radiated Imaging System"、
Academic Press 1996)として知られている。
は影響されない、即ち、放射スペクトルは多光子吸収に
おける負のストークス変位を受ける、即ち、それは励起
放射と比較してより短い波長を有する。放射スペクトル
からの励起放射の分離が一光子吸収と同じ方法で実行さ
れる。
2)を参照し実施例を通して次に従来技術をより十分に
説明する。LSMは基本的に4つのモジュール、即ち、
光源、走査モジュール、検出ユニット、および顕微鏡か
ら構成される。これらのモジュールは以下に十分に説明
する。さらに、ドイツ特許第19702753A1号を
参照する。
定励起に対して種々の波長を有するレーザを使用する。
励起波長の選択は検査される色素の吸収特性によって管
理される。励起放射が光源モジュールから発生する。各
種レーザ(アルゴン、アルゴン/クリプトン、Ti:S
aレーザ)がこの目的のため使用される。さらに、波長
の選択および必要な励起波長の強度調整、例えば、音響
光学結晶を使用して光源モジュールで実行される。レー
ザ放射は続いてファイバまたは適当なミラー装置を介し
て走査モジュールに到達する。
ザビームは、スキャナ、走査光学系および円筒レンズを
介して対物レンズによって回折限界態様にてプレパラー
トで焦束される。焦点はx−y方向に点ラスタで試料を
スキャンする。試料全体にわたってスキャンする場合の
画素滞留時間は、ほとんどマイクロ秒から数秒未満の範
囲にある。
は、焦点面(試料)および後方の上下に配置された面か
ら放射された光がスキャナを介してダイクロイックビー
ムスプリッタ(MDB)に到達する。このダイクロイッ
クビームスプリッタは励起光から蛍光を分離する。続い
て、蛍光が焦点面に共役な面に精度よく配置された絞り
(共焦点絞り/ピンホール)上に焦束される。この方法
では、焦点外の蛍光成分が抑制される。顕微鏡の光分解
能は絞りの寸法を変えることにより調整可能である。励
起放射を再び抑制する別のダイクロイックブロックフィ
ルタ(EF)が絞りの背後に配置される。ブロックフィ
ルタを通過後、蛍光が点検出器(PMT)によって測定
される。
に高い色素蛍光の励起は少量で行われる。この領域は共
焦点装置を使用する場合、検出された領域とくらべて無
視できるほどわずかに大きいだけである。従って、共焦
点絞りは省略でき、かつ検出は対物レンズの直後で実行
される(ノンデスキャン検出)。多光子吸収によって励
起された色素蛍光を検出する別の装置では、デスキャン
検出が再び実行されるが、今度は対物レンズの瞳が検出
ユニットに結像される(非共焦点デスキャン検出)。
の焦点面に配置された面(光切片)のみが対応する一光
子吸収または多光子吸収と関連して2つの検出装置によ
って再生される。試料の様々な深さでxy平面方向に複
数の光切片を記録またはグラフにすることにより、引き
続いて試料の3次元画像がコンピュータでサポートされ
て発生される。
には適当である。励起波長はその特定の吸収特性を有す
る使用色素によって測定される。色素の放射特性に適合
したダイクロイックフィルタにより確実にそれぞれの色
素によって放射された蛍光のみが点検出器によって測定
される。
々な細胞領域が種々の色素(多重蛍光)によって同時に
標識付けられる。従来技術では、個別色素が種々の吸収
特性または放射特性(スペクトル)(図3a)に基づい
て別々に検出される。例えば、放射信号が種々の色素
(1〜4)について波長全体にわたってグラフにされ
る。
の追加分光が、2次ビームスプリッタ(DBS)により
実行され、かつ個別色素放射の別々の検出が、各種点検
出器(PMTx)で実行される。上記装置では、使用者
が対応する新しい色素特性に対する検出および励起に柔
軟に適合することが不可能である。それよりむしろ、新
しいダイクロイックビームスプリッタおよびブロックフ
ィルタを(新しい)色素毎に作成する必要がある。
スペクトルに分光される。本方法は使用したフィルタの
特性が調整可能である点においてのみダイクロイックフ
ィルタを有する上記装置とは異なる。ただし、点検出器
により色素の放射帯域を記録することはなお好ましい。
放射範囲の調整がダイクロイックフィルタおよび絞りの
機械的運動に拠っており、かつ従って最大スペクトル分
解能が約5nmに制限されるため、放射スペクトルの高
速局所測定は2つの装置を用いて条件付きでのみ可能で
ある。
うに重なっている場合、高いスペクトル分解能が必要で
ある。図3bでは2つの自然に生ずる色素CFPおよび
GFPの挙動を示す。これらの色素は、それらが検査さ
れる試料に毒性の影響を与えないため生きているプレパ
ラート検査に特に適当である。使用した色素の放射スペ
クトルの位置が既知でない場合または環境に依存する放
射スペクトルにシフトが生ずる場合(図3c)、色素蛍
光の高解像度検出が必要である。
ある。一般に、分光計もLSMと組合せて使用して試料
の放射スペクトルを測定する。その際、点検出器の代わ
りに、従来の通常の高分解能分光計が使用される(特
許、ディクソン(Dixon)他、米国特許番号第5,
192,980号)。ただし、これらの分光計は点毎に
または領域全体にわたる平均としてのみ放射スペクトル
を記録可能である。従って、これは一種の分光法であ
る。さらに、試料の通常の弱さの蛍光信号が分光計にお
ける大量の個別チャネル(通常、512または1024
の個別チャネル)に分配されるか、または狭い蛍光帯域
がスペクトル分解能に対応して検出される。従って、個
別チャネル当たりの信号は極めて小さくかつ場合によっ
ては検出不可能である。
ライン検出器を有する蛍光色素の効率的な、スペクトル
により分析される検出のために斬新な方法を提供するこ
とである。上記光学装置では、スペクトル分解能は個別
チャネルの数によって測定される。検出器の個別チャネ
ルがすべて同時に読取られるとは限らない場合、個別チ
ャネルの一連の読取りが多重化により従来技術に従って
実行される。多重化が試料のスキャンの間の画素滞留時
間中に実行される。これには信号が検出される間の個別
チャネル当たりの積分時間が多重位置の数だけ低減され
るという欠点がある。さらに、広域蛍光スペクトルが測
定される場合、信号が読取られない個別チャネルで失わ
れる。別の多重化方法では、個別チャネルの信号が緩和
される。次に、個別記憶装置が交互に読取られる。ただ
し、新しいデータは読取り中記録されない。従って、ラ
イン検出器の読取り速度がこの形式の多重化で低減され
ることになる。
がある。 1.試料のスペクトルにより分析される信号全体が種々
の個別チャネル全体にわたる調整可能な加算によって常
に検出される。 2.高い信号レベルのため加算チャネルの単純デジタル
化が個別チャネル全体にわたる加算によって可能にな
る。
テムで使用可能でなければならない。顕微鏡システムは
200nmまでの光空間分解能を有する、生物学的プレ
パラートの3次元検査に用いるレーザ走査型顕微鏡、1
0nmまでの分解能を有する、表面の高分解能検査に用
いる走査型近視野顕微鏡、分子濃度の定量的判定のため
のかつ分子拡散を測定するため用いる蛍光相関顕微鏡な
どの画像発生システムである。色素をスクリーニングす
るための蛍光検出に基づいた方法も含まれる。上記シス
テムのすべてにおいて、蛍光色素がプレパラートの特定
標識付けのため使用される。上記目的が独立クレームに
よる方法および装置によって達成される。好ましい別の
実施態様は従属クレームに表わされる。
トル成分全体にわたる加算である蛍光のスペクトル分光
検出に基づいている。この目的のため、ドイツ特許番号
第7346またはドイツ特許番号第7323によるメイ
ンカラースプリッタ(MDB)またはATOF(音響光
学フィルタ)などの、検出放射から励起放射を分離する
素子によって(多光子吸収により)走査モジュールまた
は顕微鏡における放射光が励起光から分光される。透過
光装置では、この形式の素子は完全に省略される。
図4に示す。共焦点検出器では、試料からの光Lは、結
像光学系POによって絞り(ピンホール)PHを通して
焦束され、その結果、焦点外で生ずる蛍光が遮断され
る。ノンデスキャン検出では、絞りは省略される。ここ
では、光が角分散素子DIによってそのスペクトル成分
に分割される。
えば、音響光学素子であってよい。分散素子によってそ
のスペクトル成分に分光される光はライン検出器DE上
で結像される。このライン検出器DEは波長の関数とし
て放射信号を測定し、それを電気信号に変換する。次に
より十分に説明する本発明によるビンニングプロセスに
よって、個別チャネルの接続、即ち、ライン検出器の個
別チャネル全体にわたる加算が実行される。さらに、励
起波長を抑制するラインフィルタが検出ユニットの前方
に配置される。
光ビーム経路の考えられる実施形態を図5に示す。構造
は基本的にチェルニーターナー(Czerny Tur
ner)構造である。共焦点検出では、試料の光Lはピ
ンホール光学系POによって共焦点絞りPHを通して焦
束される。多光子吸収の場合のノンデスキャン検出で
は、この絞りは省略される。第1結像ミラーM2は蛍光
を平行にする。続いて、光は線形格子G、例えば、1m
m当たり651ラインのライン数を有する格子に当た
る。回折格子はその波長に対応して様々な方向に光を曲
げる。第2結像ミラーM1により個別にスペクトル分光
された波長成分がライン検出器DEの対応チャネルに焦
束される。浜松製作所のH7260による第2電子増倍
管アレイが特に有益である。検出器には32チャネルが
ありかつ高感度を有する。
はほぼ350nmである。この装置では、重ならないス
ペクトル領域は、ほぼ10nmの光分解能をもたらすラ
イン検出器の32チャネルに均一に分配される。検出チ
ャネル当たりの信号が比較的広域検出スペクトルにより
なお比較的大きいため、画像発生システムにユニットを
使用することは有利である。蛍光スペクトルのシフトは
例えば、回折格子を回転するか、M1およびM2を角度
ファイ(phi)だけ回転するおよび/または分光され
た波長の検出においてdl(図面を参照)だけライン受
信器を変位させることによるかまたはそのシフトかによ
って実行される。
解能は個別チャネルの数によって測定される。上記実施
形態では、各個別チャネルがほぼ10nmのスペクトル
幅で放射スペクトルのスペクトル帯域を検出する。検出
器の個別チャネルがすべて同時に読取られるとは限らな
い場合、個別チャネル(多重化)の一連の読取りが従来
技術によって実行される。本発明によれば、加算が様々
なパターンまたはモデルでは、個別チャネル全体にわた
って実行される。例えば、8チャネルを同時に読取り可
能な場合、ここでは前記32チャネル検出器が使用され
ているが、どの場合にも、加算は4チャネル以上実行さ
れる。次に、合計N=32チャネルをn=4ステップで
読取られ、加算ウインドが個別チャネル((L/n)=
4/4=1)づつどの場合にもずらされる。
の種々の個別チャネルをラインにそれぞれ略図的に図6
に示す。個別チャネルの測定された信号はCk、j(図
6にブロックとして示した)によって指示される。ここ
で、k=1...Nはチャネル番号およびj=1...
n−1はシフトL/nの倍数である。信号が検出器のエ
ッジに当たらない場合は、図6の斜線で示した検出器の
最終個別チャネルはL/nの幅だけが測定のため使用可
能であるような方法で補われる(除外される)。これは
計算時に人為的な影響を防止する必要がある。
合は、個別チャネルの合計は次のアルゴリズムに従って
減算される。
S(中間値)を表示画像上に、例えば、スペクトルスキ
ャン中グラフによる表現で表わす。種々の個別チャネル
および、従ってCk、jの測定値全体にわたる加算を図
7に示す。個別チャネルの信号は増幅器Aによって電圧
信号に変換される。続いて、個別電圧信号は画素滞留時
間中積分器Iで積分される。積分器は積分された信号を
基準信号と比較する比較器Kに続く。
さい場合には、無蛍光信号、または小さ過ぎる蛍光信号
は対応個別チャネルで測定されることになる。このよう
な場合には、このチャネルは全信号に対する雑音成分に
寄与するだけであるため、個別チャネルの信号は別の処
理が行われることはない。この場合、比較器はスイッチ
を起動しかつ個別チャネルが測定を終了したばかりの画
素に対して除外される。従って、スイッチと組み合わさ
れ比較器によって、該当スペクトル領域が測定が終了し
たばかりの像点に対して自動的に選択される。
号がレジスタREG1によってスイッチレジスタRに接
続されたデマルチプレクサMPXによって種々の加算点
に切換えられる。8つの種々の加算点SPを図7に示
す。レジスタREG1がV1を通してコンピュータによ
って制御される。加算パターンまたはモデルが画素に正
確な形態で、即ち、数ミクロンの時間周期内で制御され
る。各加算点SPが選択個別チャネルの加算を実行する
加算増幅器SVの一部を形成する。図7は8つの加算増
幅器SVの合計を示す。和信号Ck、jは続いてアナロ
グ−デジタル変換器ADCによってデジタル信号に変換
されかつさらにコンピュータまたはDSPによって処理
される。加算増幅器SVは可変非線形特性でも動作可能
である。
信号を検出するため使用された。ただし、光子計数は包
含されたいかなる制限もなく個別チャネルでも行われ
る。制御線V1による加算パターンの変更は記録後、ま
たは像点、画像ラインまたは画像縦列の走査中、画像に
関して実行される。
度に関する要件は調整の形式に依存する。例えば、調整
が像点によって実行される場合、走査は像点の積分期間
内(即ち、数マイクロ秒)で実行する必要がある。調整
が画像によって実行される場合、走査は数マイクロ秒か
ら数秒内で実行する必要がある。個別チャネルの信号の
計算はCk、jを使用して上記アルゴリズムで実行され
る。
ネル信号を検出するため使用されることが好ましい。た
だし、いかなる制限も包含することなく光子計数も個別
チャネルで実行されかつ光子数が合算される。有利な方
法では、本発明によれば、検出された波長分布(λ−ス
タック)が格納中画像に関連してそれぞれの像点座標
X、YまたはZと相互に関連付けられるかおよび/また
は追加時間相関が測定された時間−可変シーケンスで実
行される。
Claims (12)
- 【請求項1】試料から後方散乱され、反射されおよび/
または蛍光が発せられ、および/または伝導される信号
が、試料からの放射がスペクトルにより分離されるよう
に検出器に結像される状態で複数チャネルの空間分解検
出器によって検出され、検出チャネルの結合が、読取ら
れてさらに処理される測定値数が検出チャネル数より少
ないように行われることを特徴とする照射試料の特性量
の光学的取得方法。 - 【請求項2】結合が加算であることを特徴とする請求項
1に記載の方法。 - 【請求項3】結合測定値のシフトが実行され、および/
または結合検出器チャネルの数が変更されることを特徴
とする請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】結合測定値のシフトが少なくともひとつの
検出器チャネルによって行われることを特徴とする前記
請求項の1項に記載の方法。 - 【請求項5】結合測定値のシフトの大きさが可変である
ことを特徴とする前記請求項の1項に記載の方法。 - 【請求項6】中間値が、検出器ラインの効率的な読取り
目的のためのアルゴリズムによって読取り測定値から測
定されることを特徴とする前記請求項の1項に記載の方
法。 - 【請求項7】ライン検出器に沿った加算パターンのシフ
トが、マルチプレクサによって実行されることを特徴と
する前記請求項の1項に記載の方法。 - 【請求項8】スペクトル、スペクトルにより分析される
測定が、検出器の前の分散素子によって実行されること
を特徴とする前記請求項の1項に記載の方法。 - 【請求項9】スペクトルにより分離される放射が検出器
を基準としてシフトされることを特徴とする前記請求項
の1項に記載の方法。 - 【請求項10】分散素子が少なくともひとつの軸の周り
に旋回可能であることを特徴とする前記請求項の1項に
記載の方法。 - 【請求項11】分散素子がその旋回軸の少なくともひと
つで静止したままの状態で、この軸における旋回の空間
変化効果が走査ユニットによっておよび/または検出器
の変位によって達成されることを特徴とする前記請求項
の1項に記載の方法。 - 【請求項12】検出された波長分布(λ−スタック)が
格納時それぞれの像点座標X、YまたはZと画像に関し
て相互に関連付けられおよび/または追加時間相関が測
定された時間−可変シーケンスで実行されることを特徴
とする前記請求項の1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10151216.3 | 2001-10-16 | ||
DE10151216A DE10151216A1 (de) | 2001-10-16 | 2001-10-16 | Verfahren zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen einer beleuchteten Probe |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005377505A Division JP2006098419A (ja) | 2001-10-16 | 2005-12-28 | 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003185582A true JP2003185582A (ja) | 2003-07-03 |
Family
ID=7702774
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002296999A Pending JP2003185582A (ja) | 2001-10-16 | 2002-10-10 | 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 |
JP2005377505A Pending JP2006098419A (ja) | 2001-10-16 | 2005-12-28 | 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005377505A Pending JP2006098419A (ja) | 2001-10-16 | 2005-12-28 | 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6703621B2 (ja) |
EP (1) | EP1302804A3 (ja) |
JP (2) | JP2003185582A (ja) |
DE (1) | DE10151216A1 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005116251A (ja) * | 2003-10-06 | 2005-04-28 | Nikon Corp | 受光器及び蛍光共焦点顕微鏡 |
JP2006125970A (ja) * | 2004-10-28 | 2006-05-18 | Nikon Corp | 分光装置および分光システム |
JP4818262B2 (ja) * | 2004-06-25 | 2011-11-16 | ライカ ミクロジュステムス ツェーエムエス ゲーエムベーハー | 光ビームの光のスペクトルを選択検出するための光学装置 |
JP2014172359A (ja) * | 2013-03-12 | 2014-09-22 | Sumitomo Heavy Ind Ltd | 光検出素子、マークセンサ及び光検出素子によるマーク判定方法 |
JP2019529999A (ja) * | 2016-09-16 | 2019-10-17 | ライカ マイクロシステムズ シーエムエス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングLeica Microsystems CMS GmbH | 光学顕微鏡 |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2264428B1 (en) | 1997-01-31 | 2017-05-03 | Xy, Llc | Optical apparatus with focussing reflector for converging radiation onto a flow of particles |
US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
US7208265B1 (en) | 1999-11-24 | 2007-04-24 | Xy, Inc. | Method of cryopreserving selected sperm cells |
BRPI0115792B1 (pt) | 2000-11-29 | 2020-05-05 | Colorado State Univ | sistema para separação de espermatozóides congelados/descongelados em populações portadoras de cromossomo-x e portadoras de cromossomo-y |
US7713687B2 (en) | 2000-11-29 | 2010-05-11 | Xy, Inc. | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
EP1269126A1 (en) * | 2000-12-08 | 2003-01-02 | Foundation For Research And Technology Hellas | An imaging method and apparatus for the non-destructive analysis of paintings and monuments |
NZ538265A (en) * | 2002-07-22 | 2008-12-24 | Xy Inc | Sperm cell process system |
US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
CN1674780A (zh) * | 2002-08-01 | 2005-09-28 | Xy公司 | 低压精子分离系统 |
AU2003265471B2 (en) | 2002-08-15 | 2009-08-06 | Xy, Llc. | High resolution flow cytometer |
US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
MX347048B (es) | 2003-03-28 | 2017-04-07 | Inguran Llc * | Aparato de muestreo digital y métodos para separar partículas. |
EP1625203B1 (en) * | 2003-05-15 | 2015-04-08 | Xy, Llc | Efficient haploid cell sorting for flow cytometer systems |
DE10343276A1 (de) * | 2003-09-18 | 2005-04-14 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Mehr-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie |
EP2151243B1 (en) | 2004-03-29 | 2012-10-24 | Inguran, LLC | Sperm suspensions for sorting into X or Y chromosome-bearing enriched populations |
JP2008507287A (ja) | 2004-07-22 | 2008-03-13 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 精子細胞の集団を富化する方法 |
JP4987233B2 (ja) * | 2005-01-06 | 2012-07-25 | オリンパス株式会社 | レーザ走査型顕微鏡 |
DE102005046510B4 (de) | 2005-09-29 | 2022-02-17 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Mikroskopsystem für FCS-Messungen |
JP5307629B2 (ja) * | 2009-05-22 | 2013-10-02 | オリンパス株式会社 | 走査型顕微鏡装置 |
US9182341B2 (en) * | 2012-06-13 | 2015-11-10 | Kla-Tencor Corporation | Optical surface scanning systems and methods |
EP3538941A4 (en) | 2016-11-10 | 2020-06-17 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | METHODS FOR FAST IMAGING OF HIGH RESOLUTION LARGE SAMPLES |
DE102021126145A1 (de) * | 2021-10-08 | 2023-04-13 | Heidelberg Engineering Gmbh | Anordnung mit einem Detektor |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2615280B1 (fr) * | 1987-05-11 | 1996-07-19 | Canon Kk | Dispositif de mesure de la distance en mouvement relatif de deux objets mobiles l'un par rapport a l'autre |
EP0411966B1 (en) * | 1989-08-04 | 1994-11-02 | Canon Kabushiki Kaisha | Position detection method and apparatus |
DE58904369D1 (de) * | 1989-11-02 | 1993-06-17 | Heidenhain Gmbh Dr Johannes | Positionsmesseinrichtung. |
GB9000740D0 (en) * | 1990-01-12 | 1990-03-14 | Univ Salford | Measurement of luminescence |
DE4017317C2 (de) * | 1990-05-30 | 2000-02-17 | Bodenseewerk Perkin Elmer Co | Anodnung zur Verbesserung der Auflösung eines Spektrometers |
DE4111903A1 (de) * | 1991-04-12 | 1992-10-15 | Bayer Ag | Spektroskopiekorrelierte licht-rastermikroskopie |
US6134003A (en) * | 1991-04-29 | 2000-10-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Method and apparatus for performing optical measurements using a fiber optic imaging guidewire, catheter or endoscope |
US5198816A (en) * | 1991-08-30 | 1993-03-30 | Eg&G, Inc. | General purpose system for digitizing an analog signal |
GB9320261D0 (en) * | 1993-10-01 | 1993-11-17 | Unicam Ltd | Spectrophotometer |
US5742389A (en) * | 1994-03-18 | 1998-04-21 | Lucid Technologies Inc. | Spectrophotometer and electro-optic module especially suitable for use therein |
US5673144A (en) * | 1994-09-14 | 1997-09-30 | International Business Machines, Corporation | Oblique viewing microscope system |
JP3095970B2 (ja) * | 1995-02-06 | 2000-10-10 | 日本分光株式会社 | デコンボリューション処理方法及び装置 |
US5627639A (en) * | 1995-06-06 | 1997-05-06 | Lockheed Missiles & Space Company, Inc. | Coded aperture imaging spectrometer |
US6151185A (en) * | 1996-09-05 | 2000-11-21 | Canon Kabushiki Kaisha | Position detecting apparatus, positioning apparatus, and information recording apparatus using the same |
US6167173A (en) * | 1997-01-27 | 2000-12-26 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Laser scanning microscope |
DE19707227A1 (de) * | 1997-02-24 | 1998-08-27 | Bodenseewerk Perkin Elmer Co | Lichtabtastvorrichtung |
JP2888813B2 (ja) * | 1997-08-29 | 1999-05-10 | 株式会社東芝 | 高解像度画素出力方法及び装置 |
US6097034A (en) * | 1998-02-12 | 2000-08-01 | Instrumentarium Oy | Radiation source assembly and transducer for analyzing gases or other substances |
US6053613A (en) * | 1998-05-15 | 2000-04-25 | Carl Zeiss, Inc. | Optical coherence tomography with new interferometer |
US6038023A (en) * | 1998-07-31 | 2000-03-14 | The Research Foundation Of State University Of New York | Sensors for detection and spectroscopy |
US6128078A (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-03 | Three Lc, Inc. | Radiation filter, spectrometer and imager using a micro-mirror array |
DE10004233B4 (de) * | 2000-02-01 | 2005-02-17 | Leica Microsystems Heidelberg Gmbh | Mikroskop-Aufbau |
DE10038528A1 (de) * | 2000-08-08 | 2002-02-21 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Erhöhung der spektralen und räumlichen Detektorauflösung |
DE10038526B4 (de) * | 2000-08-08 | 2004-09-02 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Erfassung des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe |
-
2001
- 2001-10-16 DE DE10151216A patent/DE10151216A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-01-16 US US10/051,205 patent/US6703621B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-25 EP EP02021433A patent/EP1302804A3/de not_active Withdrawn
- 2002-10-10 JP JP2002296999A patent/JP2003185582A/ja active Pending
-
2005
- 2005-12-28 JP JP2005377505A patent/JP2006098419A/ja active Pending
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005116251A (ja) * | 2003-10-06 | 2005-04-28 | Nikon Corp | 受光器及び蛍光共焦点顕微鏡 |
JP4818262B2 (ja) * | 2004-06-25 | 2011-11-16 | ライカ ミクロジュステムス ツェーエムエス ゲーエムベーハー | 光ビームの光のスペクトルを選択検出するための光学装置 |
JP2006125970A (ja) * | 2004-10-28 | 2006-05-18 | Nikon Corp | 分光装置および分光システム |
JP4720146B2 (ja) * | 2004-10-28 | 2011-07-13 | 株式会社ニコン | 分光装置および分光システム |
JP2014172359A (ja) * | 2013-03-12 | 2014-09-22 | Sumitomo Heavy Ind Ltd | 光検出素子、マークセンサ及び光検出素子によるマーク判定方法 |
JP2019529999A (ja) * | 2016-09-16 | 2019-10-17 | ライカ マイクロシステムズ シーエムエス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングLeica Microsystems CMS GmbH | 光学顕微鏡 |
JP7130628B2 (ja) | 2016-09-16 | 2022-09-05 | ライカ マイクロシステムズ シーエムエス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 光学顕微鏡 |
US11686928B2 (en) | 2016-09-16 | 2023-06-27 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Light microscope |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1302804A3 (de) | 2004-09-22 |
DE10151216A1 (de) | 2003-04-24 |
EP1302804A2 (de) | 2003-04-16 |
JP2006098419A (ja) | 2006-04-13 |
US6703621B2 (en) | 2004-03-09 |
US20030071227A1 (en) | 2003-04-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006098419A (ja) | 照射サンプルの特性寸法の光学的取得方法 | |
US7271897B2 (en) | Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors | |
JP4783931B2 (ja) | 検出器の分光学的及び空間分解能を増大させるための方法 | |
US6958811B2 (en) | Method for the detection of dyes in fluorescence microscopy | |
US6858852B2 (en) | Method and apparatus for rapid change of fluorescence bands in the detection of dyes in fluorescence microscopy | |
JP4509940B2 (ja) | 照明された試料の波長依存特性把握のための方法および装置 | |
US7009699B2 (en) | Method for investigating a sample | |
US7420674B2 (en) | Method and arrangement for analyzing samples | |
JP4452850B2 (ja) | 照明された試料の波長に依存する特徴的な特性値を光学的に把握するための方法および装置構成 | |
US7274446B2 (en) | Method and arrangement for the deep resolved optical recording of a sample | |
CA2316984C (en) | Spectral imaging apparatus and methodology | |
JP5746161B2 (ja) | 顕微鏡画像における蛍光の評価方法 | |
JP2004102274A (ja) | 照明光および/または試料光のスペクトル組成および/または強度を制御下で変更するための方法および配置 | |
US20030231825A1 (en) | Spectral microscope and method for data acquisition using a spectral microscope | |
Hibbs et al. | Practical confocal microscopy | |
CN116249891A (zh) | 探测发射光的方法、探测设备和激光扫描显微镜 | |
US7688442B2 (en) | Method to be used in fluorescence microscopy | |
CA2497775A1 (en) | Spectral imaging apparatus and methodology |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050112 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20050112 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20050126 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050208 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050502 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050510 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050906 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20051124 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051228 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20060316 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20060407 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080813 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080818 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081110 |